Recherche fondamentale

Rasées et greffées sous la peau du flanc avec des cellules de mélanome, 392 souris reçoivent au quatrième puis au dixième jour des anticorps qui lèvent le frein immunitaire, avant de subir au douzième jour l'ablation chirurgicale de la greffe et de la peau au-dessus. Une dépigmentation apparaît vers le trente-cinquième jour, et le suivi se poursuit par une anesthésie gazeuse hebdomadaire pendant seize semaines pour peser, mesurer et photographier, avec quatre prises de sang. 400 souris au total sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées entre un et neuf mois pour les prélèvements. Le porteur décrit un arbre décisionnel dont les points limites comprennent la prostration, la taille maximale de la greffe, la nécrose et le saignement.

Objectifs

Les cytokines sont des petites protéines ayant un rôle essentiel dans la régulation du système immunitaire, lors des infections ou lors de maladies auto-immunes. L'équipe est reconnue pour avoir étudié le rôle d'une cytokine produite par les cellules de l'épiderme dans différentes maladies inflammatoires de la peau. Le vitiligo est une maladie auto-immune, caractérisée par l’apparition de taches blanches sur la peau. La prévalence de cette maladie est estimée à 1 % de la population mondiale et il n'existe actuellement aucun traitement pour la guérir. En effet, le vitiligo est une maladie complexe faisant intervenir de nombreux facteurs combinés : prédisposition génétique, stress, frottements. Avec une diminution de cette cytokine dans la peau chez le patient humain, il nous parait important d’étudier la fonction des voies de signalisation de cette cytokine dans la pathogenèse du vitiligo. En utilisant des modèles, nous pourrons développer de nouvelles thérapies. Le projet utilisera les souris initialement développées dans notre laboratoire où sont inactivées les gènes de la cytokine et d’un acteur de sa voie de signalisation dans un modèle d’induction du vitiligo décrit récemment dans les publications. Ce modèle est médié par une réaction auto-immune qui induit une dépigmentation de la peau. On greffe sous la peau des cellules d'une lignée cellulaire de mélanocytes générée à partir d’un mélanome de souris, qui vont induire une réponse immune par la production de lymphocytes T tueurs. Ceux-ci étant réprimés par des lymphocytes T régulateurs (Treg) qui seront bloqués par deux injections d’anticorps neutralisants, ces cellules T tueuses pourront provoquer une réaction auto-immune dirigée contre les cellules de la peau pigmentaires entrainant la décoloration : le vitiligo. Au bout de 12 jours, on retire les cellules greffées et la peau au-dessus de cette greffe. Au bout de 1 mois, on arrive à voir les modifications des populations de lymphocytes T. Au bout de 35 jours, on peut voir la dépigmentation se mettre en place. Entre un mois et 9 mois, nous euthanasierons les souris et effectuerons les prélèvements pour analyser le développement de cette maladie et son impact sur le système immunitaire.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les phénomènes biologiques mis en place lors du développement du vitiligo, d’expliciter le rôle de la cytokine étudiée et de sa voie de signalisation et de proposer de nouvelles thérapies à cette maladie auto-immune très invalidante.

Procédures

392 souris seront anesthésiées, puis rasées et injectées en sous-cutanée sur un des flancs, avec des cellules de mélanome (durée : 5min). Au jour 4 et 10 post-greffe, ces souris vont être pesées puis injectées sans anesthésie en intrapéritonéale par des anticorps neutralisants (durée : 1min). 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi), les souris vont être anesthésiées par voie gazeuse légère pour pouvoir les peser, mesurer et photographier le développement de la greffe (durée 5x3min). Au jour 12, elles vont subir une opération sous anesthésie générale pour réséquer la greffe (durée = 10min). Puis, 1 fois par semaine, les souris vont être anesthésiées par voie gazeuse légère pour pouvoir les peser, mesurer et photographier le développement du vitiligo autour de la cicatrice et sur la queue (durée : 16 semaines x 3min). Entre 1 et 4 mois, en plus du suivi visuel, nous prélèverons 3 fois 100µl de sang pour analyser les cellules circulantes du système immunitaire ( 3x1min). Puis, à la fin de l'expérience (de 4 à 9 mois), nous pourrons encore prélever une 4ème fois 100µl de sang pour nos analyses.

Impact sur les animaux

La piqure d’injection des cellules en intradermique dans le flanc gauche sous anesthésie légère gazeuse peut entrainer une rougeur. 392 animaux développeront une masse cellulaire localisée sur le flanc, uniquement au niveau du point d’injection des cellules. La résection par chirurgie, d’une durée de 5 à 8 minutes, entraine au réveil un état de stress lié à un léger manque de mobilité de la patte arrière à cause de la pose de 2 points de suture et des 4 à 5 agrafes le long des berges de la plaie. Durant les premières minutes après le réveil, une douleur est ressentie par les animaux qui présentent des signes (dos vouté, raideur de la patte postérieure gauche, marche avec les pattes postérieures écartées). Après 10min, les souris retrouvent leur mobilité et un comportement normal (grooming, activité exploratoire, interaction sociale). Les sites d’injections d'analgésique en sous-cutanée sous anesthésie gazeuse légère peuvent présenter une rougeur. Les prises de sang effectuées à la joue nécessitent une contention stressante pour l’animal pendant 30s. La pression sur la joue pour arrêter le saignement ajoute du stress.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés pour effectuer les prélèvements qui seront analysés.

Remplacement

Les cibles (cytokines, récepteurs et cellules) étudiées dans ce projet ont été identifiées grâce à des travaux menés in vitro et in silico par notre équipe et par d'autres laboratoires. L'étude de la réponse immunitaires met en jeu plusieurs organes et réseaux complexes impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre le type d’interaction et les différentes voies de signalisation impliquées dans ces réponses immunitaires ainsi que le processus de pathogenèse du vitiligo.

Réduction

Ce protocole sera appliqué à un maximum de 400 souris. Elles seront utilisées afin de caractériser le rôle de la cytokine étudiée ainsi que des acteurs de sa voie de signalisation dans la pathogenèse du vitiligo. Nous réaliserons une expérience pilote avec un nombre limité d’animaux sauvages pour mettre en place et valider le protocole expérimental publié récemment et déterminer le meilleur moment pour faire nos analyses. Les groupes comporteront 40 souris pour avoir un effectif minimal de 24 (60% à 80% des souris traitées développent un vitiligo d’après la publication) pour obtenir, au meilleur moment choisi lors de l’étude pilote, des résultats statistiquement interprétables pour les paramètres étudiés (fréquences des Treg et des autres populations de lymphocytes T). Nous allons tout d'abord étudier 2 lignées de souris dans laquelle le gène d'intérêt est absent dans tout l'organisme, puis, si des résultats intéressants sont produits, d'étudier ensuite les lignées de souris dans laquelle les gènes étudiés sont absents dans un type cellulaire donné (les cellules dendritiques).

Raffinement

Les souris seront maintenues en groupe pour préserver les interactions sociales. La prise de photos et le suivi nécessitent une anesthésie gazeuse légère de courte durée. Les souris seront remises dans leur cage avec une courte exposition à la lampe chauffante. En plus de la surveillance journalière, le suivi de la croissance de la greffe (pesée, photos, mesure de la taille) sera réalisé 3 fois par semaine (lundi, mercredi, vendredi). La chirurgie se fera sous anesthésie totale et sous antalgique, par des personnes ayant suivies la formation correspondante. La chirurgie, les médicaments utilisés et leurs doses seront validés par notre vétérinaire. Les observations faites lors des suivis permettront de situer l'état des animaux dans l'arbre décisionnel et d'appliquer ces points limites. L’arbre décisionnel mis en place pour ce projet tient compte de l’apparence physique ("Grimace Scaling"), du comportement (observation de la continuité des activités comportementales normales des animaux), de l’absence de signes d’infection aux lieux de piqures ou de traitements, du développement de la greffe qui ne doivent pas être invalidantes pour nos animaux. Ces critères sont assortis de points limites ou points d’arrêt, définis pour éviter des douleurs entrainant un changement dans les comportements des animaux et des blessures qui impactent nos résultats : prostration, taille maximale de la greffe, signe d’infection au point d’injection, nécrose, saignement.

Choix des espèces

La réponse immunitaire dans le contexte du vitiligo met en jeu différents organes comme la peau, les ganglions lymphatiques, le thymus, rendant nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse. Le modèle animal choisi pour étudier le mélanome est la souris car son système immunitaire est proche de celui de l'Homme avec une immunité innée et une immunité adaptative. De plus, la peau des souris présente des similitudes avec la peau humaine, rendant ce modèle pertinent pour l'étude du vitiligo. D'après la publication de référence, nous utiliserons des souris adultes âgées de 7 à 9 semaines car l'induction du vitiligo est maximal à cette période et les injections ne sont pas génées par le stade anagène du développement du système pileux.

Huit à dix heures d'anesthésie gazeuse pour une seule séance d'imagerie, après la pose chirurgicale d'une fenêtre d'observation sur le muscle : 432 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit quatre injections sous la peau, cinq gavages sur cinq jours, une injection intrapéritonéale et une injection de toxine dans le muscle pour le blesser. Le projet filme la réparation du muscle chez des souris normales et chez des souris porteuses de la mutation qui sert de modèle à la myopathie de Duchenne. Le porteur écrit que le réveil après cette longue anesthésie serait en théorie possible, qu'il n'a pas d'expérience sur ce point, et que toutes les souris seront donc tuées à la fin de la procédure.

Objectifs

L’ensemble du projet vise à apporter de nouvelles connaissances fondamentales visant à la compréhension des mécanismes cellulaires de la régénération musculaire normale et pathologique, afin à terme de développer de meilleurs traitements pour les patients atteints de dystrophies. Les muscles squelettiques représentent 40% de la masse corporelle et assurent des fonctions essentielles (locomotion, respiration, métabolisme, etc.). Ils ont une capacité remarquable à se régénérer après blessure, notamment via l’intervention de cellules souches spécialisées. Cependant, ces capacités de maintien et de régénération sont amoindries en cas de pathologies telles que les dystrophies musculaires, affectant grandement la qualité de vie des patients voire leur espérance de vie. Il est donc essentiel de comprendre les mécanismes qui contrôlent la prolifération, différentiation et auto-renouvèlement des cellules souches musculaires en conditions normales, ainsi que leur dérégulation en conditions pathologiques. La régénération musculaire est un processus dynamique complexe faisant intervenir de nombreux types cellulaires différents (cellule souches, cellules immunitaires, cellules interstitielles, fibres musculaires, etc.). Cependant, nos connaissances actuelles proviennent de modèles in vitro ou d’analyses statiques in vivo, qui ne reflètent que partiellement la dynamique in vivo. Notre projet vise donc à caractériser la dynamique des cellules souches musculaires et leurs interactions avec leur microenvironnement par imagerie dynamique in vivo directement chez l’animal vivant, en conditions normales et dystrophiques (modèle de myopathie de Duchenne). Pour cette étude, il est essentiel de recourir à des modèles murins génétiquement modifiés qui nous permettent de marquer et suivre spécifiquement les cellules souches et autres cellules musculaires pour comprendre leurs dynamiques et leurs interactions. Nos analyses seront réalisées in vivo car aucun système in vitro ne permet à ce jour de reproduire fidèlement les conditions dynamiques et complexes d’un tissu en cours de régénération.

Bénéfices attendus

Les capacités de maintien et de régénération des muscles squelettiques sont amoindries en cas de pathologies telles que les dystrophies musculaires, affectant grandement la qualité de vie des patients voire leur espérance de vie. Il est donc essentiel de comprendre les mécanismes qui contrôlent la prolifération, différentiation et auto-renouvèlement des cellules souches musculaires en conditions normales, ainsi que leur dérégulation en conditions pathologiques. En visant à caractériser la dynamique des cellules souches musculaires et leurs interactions avec leur microenvironnement par imagerie directement in vivo en conditions normales et dystrophiques (modèle de myopathie de Duchenne), notre projet apportera des informations nouvelles sur les mécanismes cellulaires de la régénération musculaire et de ce fait, des informations essentielles pour les thérapies à développer en cas de myopathies.

Procédures

Le projet comporte une seule procédure, qui regroupe en tout quatre injections sous-cutanées (quelques secondes), un acte chirurgical (sous anesthésie, une heure), cinq injections intragastriques (gavage, quelques secondes, une fois par jour sur 5 jours), une injection intrapéritonéale (quelques secondes), une injection intramusculaire (quelques secondes, sous anesthésie gazeuse 30 minutes), et une session d’imagerie sur animal anesthésié (anesthésie gazeuse, 8 - 10 heures) avant mise à mort.

Impact sur les animaux

Nous veillerons dans nos expériences à impacter le moins possible le bien-être des souris. À la suite de la chirurgie permettant l’installation de la fenêtre d’observation, des douleurs post-opératoires et une perte de poids peuvent apparaitre dans la semaine suivante. La blessure musculaire par injection de toxine peut induire une boiterie pendant une heure. L’imagerie en elle-même est indolore mais nécessite une anesthésie générale pour permettre la contention de l’animal.

Devenir

La procédure s’achève par une session d’imagerie longue (8 – 10 heures) sous anesthésie gazeuse profonde. Bien que le réveil des animaux soit en théorie possible, nous n’avons pas d’expérience sur ce point et ne pouvons pas anticiper leur état après réveil. Nous ne pouvons ainsi pas garantir le bien-être des animaux qui seraient ainsi réveillés. Tous les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Les cellules souches musculaires peuvent être cultivées in vitro, seules ou avec d’autres cellules musculaires. Cependant, il n’existe actuellement pas de système in vitro suffisamment élaboré pour rendre compte de la dynamique cellulaire existant in vivo lors de la régénération musculaire. Par ailleurs, les cellules souches musculaires perdent rapidement leurs capacités souches in vitro, soulignant l’importance du microenvironnement tissulaire. Ce projet vise à déterminer cette dynamique et complexité cellulaire in vivo en contextes normal et pathologique. Le recours à l’animal est donc ici essentiel et ne peut être remplacé.

Réduction

Les effectifs des groupes expérimentaux ont été ajustés : - en tenant compte de notre expérience, - en fonction de la nature de l'expérience et des paramètres mesurés, - de la variabilité de ces paramètres, - de façon à produire des résultats interprétables, permettant d'atteindre une signification statistique (tests : comparaison de deux moyennes sur données appariées). Par ailleurs, des schémas de reproduction des souris transgéniques sont réalisés afin d’obtenir efficacement les cohortes de souris appropriées.

Raffinement

Les animaux sont manipulés le moins possible et un suivi régulier des animaux inclus dans le projet selon leur état général de santé est prévu. Pour l’installation de la fenêtre d’imagerie, les animaux seront opérés dans une pièce dédiée, calme, bien éclairée, avec peu de passage. Un cocktail analgésique et antibiotique sera injecté en pré-opératoire et post-opératoire. De la nourriture gélifiée est ajoutée dans la cage pour faciliter l’accès de l’animal à la nourriture après la chirurgie. Les cages sont chauffées en post-opératoire (2 heures après réveil) pour limiter l’hypothermie éventuelle des animaux. Les animaux sont placés sur une litière douce (cellulose) pendant une semaine après la chirurgie pour limiter l’irritation de la zone opérée. L’effet local de l’injection intramusculaire de toxines peut être une paralysie transitoire du muscle injecté. Au réveil de l’anesthésie, l’animal présente une boiterie transitoire (

Choix des espèces

L’utilisation de la souris repose sur plusieurs critères : • Les souris sont des petits Mammifères. Ils partagent donc de nombreuses similarités avec l’homme. • Elles constituent un modèle très maîtrisé par l’ensemble des équipes de recherche. • Leur temps de génération est court et les effectifs des portées élevés, ce qui permet d’avoir rapidement accès à un grand nombre d’animaux. • De nombreuses lignées existent (souris génétiquement modifiées) pour étudier les acteurs de la régénération musculaire. • Modèles de pathologies humaines : l’accès à des souris « modèles de pathologies humaines » que nous étudions est un avantage considérable pour développer des thérapies (ex : souris mutante « mdx » comme modèle de la myopathie de Duchenne). Nous utiliserons des adultes de plus de 8 semaines. La myopathie de Duchenne se manifeste par une dégénération/régénération chronique du muscle, bien établie et donc facilement observable chez des souris modèle « mdx » (modèles de la pathologie) adultes de plus de 8 semaines.

5 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour prélever dans leur sang des anticorps destinés à la recherche. Chacun reçoit huit injections d'antigène réparties sur cinq mois et subit dix-sept prélèvements sanguins à l'oreille entre le deuxième et le cinquième mois, sur animal vigile. Le porteur qualifie ces anticorps d'outils "indispensables" pour étudier la maturation des ovocytes de xénope, et indique vouloir tester leur production par culture cellulaire. Deux lapins sont proposés à l'adoption après évaluation de leur état, les autres sont tués si la procédure a altéré leur état général.

Objectifs

Notre laboratoire étudie les mécanismes moléculaires régulant les deux divisions cellulaires qui définissent la maturation des ovocytes de xénope. Nous nous intéressons en particulier aux protéines qui contrôlent le bon déroulement de la méiose et à leurs modifications. Pour une étude en profondeur de ces mécanismes, des outils comme des anticorps spécifiques de ces régulateurs sont indispensables. Notre modèle d’étude est tel que nous ne disposons pas dans le commerce d’une large gamme d’anticorps spécifiques de protéines en général et de nos protéines d’intérêt en particulier. Ce projet se déroulera sur 5 ans et nous permettra d’obtenir des anticorps dirigés contre les régulateurs protéiques de la méiose. L’objectif in fine sera de répondre aux questions qui restent en suspens sur le déroulement de la méiose avec des outils biologiques adaptés.

Bénéfices attendus

La compréhension des mécanismes gouvernant la maturation des ovocytes est un enjeu majeur de la recherche fondamentale. De plus, le modèle de xénope palie l’absence de connaissances quasi totales en recherche sur nos thématiques à partir d’ovocyte humain. Les résultats obtenus grâce à ces outils-anticorps devraient permettre à court terme d’avoir une vision plus précise du fonctionnement de ces acteurs protéiques, des voies de signalisation qu’ils contrôlent et des régulations qui en résultent. A plus long terme, ils pourraient contribuer au développement de connaissances des mécanismes qui régissent la maturation des ovocytes humains.

Procédures

Le projet comporte deux interventions permettant l’obtention d’anticorps présents dans le sang de l’animal. Ces interventions se dérouleront sur animaux vigiles qui pourront recevoir un analgésique. Il y a l’administration de l’antigène qui compte 8 injections réparties sur 5 mois. La seconde intervention consiste en des prélèvements sanguins qui seront au nombre de 17 répartis du 2ème au 5ème mois de procédure. La phase d'administration de l'antigène dure environ 10 minutes (immobilisation de l'individu, injection de l'antigène et soin). La phase de prélèvement s'effectue aussi en 10 minutes (immobilisation de l'individu, prélèvement sanguin et soin).

Impact sur les animaux

Les nuisances pour injection d'antigènes peuvent être la peur et le stress. Il peut aussi exister une douleur au point d'injection qui peut persister si une infection survenait. En ce qui concerne le prélèvement sanguin à l'oreille, il peut y avoir une légère douleur au point de prélèvement et un stress si l'animal a eu mal lors des prélèvement précédents.

Devenir

Les lapins hébergés dans l'animalerie et ayant suivi un protocole expérimental seront soit mis à mort si leur état général s'avère altéré par la procédure expérimentale soit proposé à l'adoption. Dans ce dernier cas, l'analyse des paramètres comportementaux et biologiques seront effectués pour connaitre l'état de santé de l'individu avant l'adoption.

Remplacement

Les anticorps polyclonaux obtenus après injection d’un antigène sont des outils indispensables pour effectuer notre recherche et pour répondre aux questions que nous nous posons et pour lesquelles nous avons obtenu un financement. En travaillant sur le modèle des ovocytes de xénope, il n’existe que très peu d’anticorps disponibles dans le commerce qui détectent les protéines endogènes présentes dans ces ovocytes. Toutefois, nous souhaitons trouver un moyen de remplacer l'animal pour obtenir ces anticoprs. Pour cela, la préparation d'anticorps via la culture cellulaire est une alternative intéressante que nous souhaitons tester et mettre en place.

Réduction

Ce projet a été conçu pour utiliser un nombre minimum d’animaux tout en garantissant l’obtention d’anticorps suffisants pour la réalisant des projets de recherche développés par l’équipe. Ainsi, les besoins des utilisateurs en anticorps seront soigneusement étudiés pour limiter le nombre d’animaux en expérimentation. Notre protocole propose d’utiliser un seul lapin par antigène contrairement à la plupart des fournisseurs privés qui, pour augmenter la possibilité de succès engagent 2 lapins par antigène. Nous pensons, par expérience, que le taux de succès provient de la qualité et/ou des propriétés antigéniques de la protéine que l’on injecte, ce qui justifie le rapport un lapin par antigène. Aucune approche statistique ne sera réalisée car inutile ici pour ce projet qui utilise un anticorps dirigé contre une protéine spécifique. .

Raffinement

Toutes les mesures de raffinement appropriées seront prises pour favoriser le bien-être des animaux dans le cadre de ce projet. Les lapins sont élevés (maintenus) dans une animalerie agréée où ils bénéficieront d’un environnement social et physique enrichi en étant regroupés par deux dans une animalerie hébergeant plusieurs individus visibles les uns des autres. Cet agencement favorise une surveillance individuelle de chaque animal tout en préservant leur tranquillité. Une phase de training (2/3 semaines) à la contention/manipulation sera effectuée avant le démarrage des procédures. Lors de la phase d’injection des antigènes, l’animal est pris dans les bras et tranquillisé. Il est ensuite disposé dans une cage à contention pour lui éviter tout risque de blessure. L’injection est réalisée en sous cutané (SC). Une surveillance quotidienne sera effectuée afin de vérifier l’évolution de la réaction au niveau du point d’injection. Il en sera de même pour suivre l’état général de l’animal qui sera comparé avec son comportement avant son entrée en expérimentation. Lors de cette phase expérimentale, la manipulation des animaux est minimale et tout sera fait pour leur permettre une phase post injection sans stress. Lors de la phase de prélèvement sanguin à l’oreille, l’animal sera à nouveau disposé dans une cage à contention. Les prélèvements seront réalisés par alternance sur l’une des deux oreilles afin d’éviter une répétition trop rapprochée entre deux prélèvements. Nous disposerons 2 individus par cage. Une attention particulière sera effectuée afin de vérifier la compatibilité et la bonne entente entre eux. Si ce n'était pas le cas, nous ferons constater la situation par notre vétérinaire référent afin de valider un isolement. Une augmentation des enrichissements dans la cage dans ce cas mise en place (Balles, blocs à ronger..)

Choix des espèces

Le lapin est connu pour être un modèle de choix pour l’obtention d’anticorps polyclonaux dans des quantités optimales pour les projets de recherche. En d’autres termes, l’obtention de sérum, plusieurs dizaines de millilitres, est à comparer avec quelques millilitres pour la souris et le rat. Pour pouvoir réaliser l’injection d’antigènes et le prélèvement de sang, les lapins seront âgés de 3 mois et plus pour un poids de 2,5-3Kgs.

64 souris privées de système immunitaire reçoivent chacune une greffe de cellules de glioblastome humain directement dans le cerveau, au cours d'une chirurgie de trente minutes. S'ajoutent trois injections de chimiothérapie sur trois jours consécutifs, trois séances d'irradiation de 4 Gy, des IRM de suivi et, pour 48 d'entre elles, jusqu'à vingt-cinq injections de la molécule testée sur cinq semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur attend une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les souris dont la tumeur se développe, ainsi qu'une dégradation de l'état général après l'irradiation du cerveau, avec sécrétions au museau et pelades sur la tête. Ces mêmes signes constituent les points limites du protocole, leur apparition déclenchant la mise à mort de l'animal, et le porteur annonce avoir adapté le suivi pour éviter d'y arriver.

Objectifs

L'étude a les objectifs suivants : • Déterminer l'efficacité in vivo de la molécule vasodilatatrice en présence de radiochimiothérapie en tant que composé candidat dans deux modèles de xénogreffes murines de glioblastome humain, déterminée par la survie des animaux et la charge tumorale. • Déterminer l'effet de la molécule vasodilatatrice sur l'hypoxie tumorale telle que déterminée par immunomarquage, afin de déterminer si elle peut augmenter la sensibilité tumorale aux rayonnements ionisants.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est une amélioration des stratégies thérapeutiques actuelles sur le glioblastome (RT+CT)

Procédures

Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - Chirurgie (implantation cérébrale de cellules tumorales sous anesthésie générale) : 30 minutes maximum par animal, réalisée une seule fois sur chaque animal, 64 animaux sont concernés. - Injection intrapéritonéale de la chimiothérapie(animal vigile) : 3 fois sur 3 jours consécutifs ; 5 minutes maximum par animal, 64 animaux sont concernés. - Injection intrapéritonéale de la molécule (animal vigile) : 5 fois consécutifs par semaine pendant 5 semaines post radiothérapie au maximum ; 5 minutes maximum par animal, 48 animaux sont concernés. - Irradiation (sous anesthésie générale) : 3 séances de 4 Gy sur 3 jours consécutifs : 10 minutes maximum par animal, 64 animaux sont concernés. - Injection sous-cutanée de buprénorphine (animal vigile) : 1 fois avant la mise à mort pour tous les animaux ; 2 minutes maximum par animal, tous les animaux sont concernés. - Imagerie IRM pour suivi de croissance tumorale

Impact sur les animaux

Suivant l’expérience du laboratoire concernant les procédures expérimentales, nous nous attendons à avoir une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux qui auront un développement de tumeur. Toutefois, ces critères représentent les points limites de l’étude et ainsi, si l’un ou plusieurs de ces éléments apparaissaient, alors les animaux seraient mis à mort. Nous nous attendons également à une fatigue et une dégradation de l’état général (porphyrine autour des yeux et de la bouche, sécrétions au niveau du museau, pelades sur la tête) induit par l'irradiation cérébrale jusqu’à une semaine après l’irradiation. Nous avons adapté en conséquence le suivi des animaux, le raffinement des conditions expérimentales et le scoring afin d’anticiper et d’éviter l’exclusion des animaux par atteinte de points limites.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort dans le but de récupérer différents organes pour analyses post-mortem.

Remplacement

Les tumeurs sont connues pour être multi-compartimentales, c'est-à-dire qu’au-delà du simple compartiment de la cellule tumorale existent la vascularisation, l’hypoxie et l’inflammation qui influent fortement sur la croissance tumorale. L’utilisation de modèles in vivo permet d’intégrer ces différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et de réponses aux différents traitements. Dans ce projet, nous nous intéressons aux phénomènes de vasodilatation, impossibles à appréhender in vitro.

Réduction

L’utilisation des méthodes d’imagerie non invasive se conforme à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux car elles permettent de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur chez le même animal sans nécessité d’euthanasier plusieurs animaux à chacun des temps. Chaque animal est, dans ce cas, son propre contrôle et permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. . Afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques, nous estimons qu’au minimum, 12 animaux par groupe au départ sont nécessaires afin de réaliser des tests statistiques puissants , et ainsi comparer les effets des différents traitements et ce, en fonction du temps. Ces 12 animaux sont calculés sur la base d’un test de puissance connaissant la variabilité intrinsèque des modèles tumoraux (environ 25%) basés sur nos travaux antérieurs et en espérant une valeur statistique de 5% pour une puissance de 80%. De plus, 4 animaux par groupe sont nécessaires pour évaluer le niveau d’hypoxie cérébral juste après la RT par une étude immuno-histochimique.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux (4 souris par cage) dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation avant toute expérimentation et bénéficieront également d’enrichissement (roue d’activité, stimulation sensorielle par différents objets). Les animaux seront surveillés de leur arrivée à la fin du protocole par un personnel compétent afin de déterminer leur état (poids, apparence physique) et la mise en place, si nécessaire, de mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera réalisée quotidiennement pendant les phases critiques (implantation, irradiation) et 3 fois par semaine par la suite. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés et par le choix de points limites cohérents. Il est à noter que les animaux étant immunodéprimés, ils sont placés dans des cages ventilées individuellement par des portoirs spécifiques (portoirs Innovive), ces deniers étant eux-mêmes dans une zone spécifique et dédiée à la manipulation des animaux immunodéprimés pour la recherche en cancérologie.

Choix des espèces

La souris immunodéprimée est une espèce de choix pour évaluer l’évolution du volume tumoral dans le temps dès lors que les cellules tumorales utilisées sont d’origine humaine. Notre expertise des différents modèles de tumeurs cérébrales, nous a permis d’établir que suivant le type cellulaire, nous obtenons des tumeurs plus ou moins hypoxiques et plus ou moins vascularisés. Ces deux composantes, influençant la croissance tumorale et l’efficacité des traitements actuels, il est nécessaire de travailler avec ces différents modèles in vivo, afin de se rapprocher de la situation clinique. 3.4.11. Indiquez à quels stades de développement les animaux seront utilisés et le justifier : L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes, âgés de 8 à 12 semaines en début de protocole. Cela permettra le développement de tumeurs plus reproductibles. De plus, à ce stade, le cerveau est mature et il est possible de suivre l’évolution des animaux sur des temps longs. Cet âge leur confère également une résistance aux protocoles expérimentaux utilisés.

20 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, l'anosmie leur étant provoquée au cours du projet. Dix d'entre elles subissent une chirurgie de deux heures pour la pose d'une électrode dans les bulbes olfactifs, un test de stimulation de trente minutes sur animal vigile et une IRM fonctionnelle d'une heure sous anesthésie. Les dix autres passent vingt séances d'entraînement à associer une odeur à une récompense, puis trois interventions chirurgicales, et portent une muselière rotative sur laquelle est fixée la partie externe de l'implant. Le porteur décrit des essais menés en laboratoire, un capteur de gaz exposé à un flux d'air odorant et une stimulation électrique enregistrée dans un verre d'eau, puis conclut que le recours aux animaux est "irremplaçable" pour évaluer la tolérance et l'efficacité du dispositif.

Objectifs

L’anosmie est une perte totale et irréversible de l’odorat. Les données épidémiologiques estiment que 10 à 15% de la population mondiale souffre d’une altération de l’odorat, et que 5% de la population mondiale est totalement anosmique. C’est un symptôme fréquent de la Covid-19, mais qui survient aussi après d’autres infections virales, ou après un traumatisme, ou qui peut être lié à des maladies neurodégénératives (Parkinson, Alzheimer) ou à des tumeurs cérébrales. La plupart des anosmies sont liées à un déficit de détection des odeurs dans la cavité nasale au niveau de l’épithélium olfactif, qui a tendance à dégénérer pendant le vieillissement et dont la fonction peut être altérée dans le cas d’infections. A terme l’anosmie altère le plaisir de manger, entraîne une perte d’appétit et de poids et réduit également la capacité à détecter des dangers. Elle affecte l’humeur, la santé, le travail et le bien-être. Elle est fréquemment associée à une détérioration de la qualité de vie perturbant la relation des patients à eux-mêmes et aux autres, menant très souvent à la dépression. Et il n'existe à ce jour aucun traitement pour corriger l’anosmie. Dans la plupart des cas d’anosmie, la première structure cérébrale recevant les informations olfactives, localisée au niveau des bulbes olfactifs (BO), reste fonctionnelle. La solution thérapeutique que nous proposons, consiste en un implant olfactif combinant un nez électronique (capteur olfactif externe) et un réseau d’électrodes, placé au niveau des bulbes olfactifs pour une stimulation électrique directe mimant l’information olfactive qui arrive au niveau du système nerveux central lorsque le système olfactif est fonctionnel. L’implant olfactif est une solution prometteuse pour les patients anosmiques. Notre objectif est de développer un implant qui serait à l’olfaction ce que l’implant cochléaire est à l’audition. Une étude pré-clinique sur l’animal est un prérequis indispensable avant d’envisager une implantation olfactive chez des patients. Ce projet consiste donc à fournir une preuve de la faisabilité chez le mouton, choisi pour ses similitudes d’organisation et de taille du système olfactif par rapport à l’humain. Pour la première fois, des tests de stimulations et de comportements olfactifs générés via un implant seront réalisés sur un animal éveillé. Ce projet se déroulera dans 4 établissements utilisateurs qui y collaborent.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour ambition de développer un implant olfactif qui aidera les patients anosmiques à retrouver des sensations olfactives, et d’apporter la preuve que cette stratégie produirait effectivement des sensations reconnues comme des odeurs. Ce projet constitue une étape clé dans l'amélioration de la qualité de vie et de la sécurité de nombreux patients anosmiques qui ne récupèrent pas leurs sensations olfactives. L’impact médical attendu est la réduction des complications associés à l'anosmie (malnutrition, dépression, accidents domestiques). En outre, les modèles animaux d'anosmie montrent qu'en l'absence d'apport olfactif, les signaux nerveux liés à la respiration (et aux émotions) disparaissent. Nous souhaitons développer un nez électronique capable de rétablir à la fois la détection des odeurs la perception des saveurs et l’apport respiratoire dans le bulbe olfactif imitant la détection naturelle du flux respiratoire par les neurones olfactifs. Cette restauration aurait un impact thérapeutique sur les états dépressifs, apportant un réel bénéfice aux patients anosmiques. Le projet permettra d’évaluer une approche chirurgicale originale pour la stimulation électrique du cerveau qui pourrait en outre promouvoir la régénération des neurones olfactifs. Cela pourrait aider les patients souffrant d'un dysfonctionnement olfactif, comme lors de maladies neurodégénératives (Alzheimer, accidents vasculaires cérébraux). L’impact scientifique attendu est une meilleure compréhension de l’interprétation des odeurs par le cerveau.

Procédures

10 animaux seront soumis à : • 1 intervention chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie pour la pose de l’électrode de stimulation, d’une durée totale estimée à 2 heures (EU2). • 1 test de stimulation du bulbe olfactif, sur animal vigile, d’une durée de 30 minutes (EU1). • 1 IRM fonctionnelle par stimulation du bulbe olfactif, sous anesthésie générale, d’une durée de 1 heure (EU3). • 1 euthanasie (EU4) .10 animaux seront soumis à : • 20 sessions d’entraînement à l’association d’odeur à une récompense de quelques minutes en tout, reparties pendant 4 à 8 semaines (EU1). • 1 intervention chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie, d’une durée totale estimée à 2 heures (EU2). • 2 interventions chirurgicales, sous anesthésie générale et analgésie, d’une durée de 1H chacune (EU2). • 1 euthanasie (EU1)

Impact sur les animaux

Après les différentes interventions chirurgicales, les animaux sont susceptibles de ressentir des douleurs post-opératoires, d’avoir un léger saignement de nez, une fuite de liquide céphalo-rachidien ou une infection. Ces risques sont considérés comme très limités étant donné les précautions chirurgicales appliquées pour toutes les interventions. Les différentes injections (analgésie, anesthésie, antalgie, antibiotiques...) réalisées au cours du projet, peuvent provoquer un léger stress lié à la manipulation de l’animal et une légère douleur liée à la piqure. Un inconfort dû aux pansements peut être également ressenti pour certains animaux au début de la phase de récupération (2 ou 3 jours), ainsi que lors du changement de ces pansements (10 minutes au maximum). Lors du test de stimulation du bulbe olfactif, les animaux seront placés individuellement dans une case de dimensions réduites, à proximité des autres brebis, ce qui peut générer un léger stress. Les entrainements au test olfactif et la manipulation des animaux peuvent entrainer du stress ou de la frustration en cas d’échec au test pour certaines brebis au début de l’entrainement. La mise en place d’une muselière rotative permettant donc de s’alimenter normalement et sur laquelle sera fixée la partie externe de l’implant olfactif des brebis, va probablement demander un temps d’adaptation aux animaux, donc un léger stress de quelques jours.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour des prélèvements de tissus post-mortem : les deux bulbes olfactifs de chaque brebis, ainsi que des biopsies d’épithélium olfactif, seront réalisées sur tous les animaux afin d’évaluer, par analyses histologiques et biochimiques, la réaction inflammatoire et la perte neuronale au sein de ces tissus.

Remplacement

Le développement et le test de l’implant olfactif seront réalisés avant tout démarrage de l’expérimentation animale. Ainsi, plusieurs tests se feront en laboratoire par les ingénieurs, sans recourir à l’animal. Le nez électronique sera ainsi exposé à une simulation de flux inspiratoire amenant l’odeur test sur le capteur de gaz. La stimulation électrique découlant de la détection de l’odeur sera quant à elle effectuée dans un milieu conducteur (verre d’eau) afin d’enregistrer la réponse électrique à la stimulation olfactive. Le but ultime de ce projet étant de développer un implant olfactif, le recours aux animaux est irremplaçable afin d’évaluer la tolérance et l'efficacité du dispositif.

Réduction

Les techniques chirurgicales ont été raffinées en amont sur le modèle animal de ce projet lors de dissections post-mortem de 5 brebis destinées à la réforme, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires à la mise au point de la technique. Le nombre de brebis choisis (20) a été défini sur la base des résultats obtenus sur des protocoles similaires sur brebis, qui ont montré qu’un tel effectif était nécessaire et suffisant pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives lors des tests de comportement. Trois stratégies permettent de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet : i) La combinaison successive des différentes approches (chirurgie, électrophysiologie, imagerie par IRM fonctionnelle, comportement) sur les mêmes animaux ; ii) l’utilisation des animaux comme leur propre contrôle, avant et après induction de l’anosmie, avant et après entraînement comportemental olfactif ; iii) la comparaison entre les deux bulbes olfactifs d’un même animal (côté implanté, versus côté non-implanté).

Raffinement

Les brebis seront hébergées en groupe pour conserver les relations sociales, s’acclimater à leurs différents environnements, avec surveillance accrue du personnel, conditions d’élevage optimisées (boisson, nourriture ad libitum, litière), enrichissements de milieu (brosses, ballons, mobiles suspendus, pierres à sel) et manipulations régulières pour les habituer aux interactions humaines et aux tests comportementaux. Les brebis soumises à des tests de stimulation électrique du bulbe olfactif ou sélectionnées pour les tests comportementaux olfactifs ne seront jamais placées en situation d’isolement. En fonction des besoins (situation post-opératoire, soins, tests, …) les animaux seront placés temporairement dans des loges d’hébergement individuelles, simplement séparés des autres par une barrière à clairevoies qui limite la taille de la loge, mais les laissent au contact visuel, olfactif, et auditif de leurs congénères. Les animaux sont habitués à ce genre de cloisonnement nécessité par certains soins (parage, prélèvements, échographies, …). Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale avec une gestion adaptée de la douleur et du risque infectieux ; suivi de la température ; tapis chauffant, réveil en cage individuelle, sous lampes infrarouge pour limiter l’hypothermie ; enrichissement de milieu, contact visuel et olfactif avec leurs congénères. La surveillance post-opératoire implique un traitement analgésique systématique et antibiotique si nécessaire. Nous utiliserons une grille d’évaluation de la douleur basée sur les mimiques faciales. S’il y avait des complications sévères, sans alternative thérapeutique, les brebis concernées seraient euthanasiées. D’une manière générale, si une brebis montre des signes d’inconfort (prostration, manque d’appétit, arrêt des relations sociales animal/animal, soigneur/animal), un vétérinaire sera consulté et son avis sera suivi (traitements, sortie du protocole pour une situation extrême). Tous les transports/transferts des animaux entre les différents sites se feront en bétaillère agrée, paillée et toujours en groupe pour limiter le léger stress lié au transport. Des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis de la procédure.

Choix des espèces

Les ovins ont été choisis car c’est une espèce dont l’organisation de la cavité nasale et les dimensions du bulbe olfactif sont quasi-similaires à celles de l’humain. Des brebis de 12 à 18 mois, c’est-à-dire ayant achevé leur puberté, et avant l’apparition d’une épaisseur d’os crânien trop importante, de manière à permettre des chirurgies plus aisées et rapides, pour une meilleure récupération des animaux.

Capturées, anesthésiées, ouvertes pour recevoir un capteur et un émetteur en moins de cinq minutes, 50 truites de mer adultes subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont gardées en observation dans un vivier placé dans la rivière, puis relâchées quand elles ont retrouvé une nage normale. Le projet suit leurs trajets en mer pour estimer leur exposition aux parcs éoliens en mer et aux captures accidentelles. Le porteur indique que l'extraction de l'enregistreur ne permet pas la survie de l'animal, les truites recapturées à leur retour de mer seront donc tuées, et il table sur la récupération d'environ un quart des appareils.

Objectifs

Les poissons migrateurs sont pour la plupart en déclin en raison notamment de l’impact des activités anthropiques qui interviennent sur l’ensemble des habitats du continuum terre/mer. Dans les eaux côtières, les captures accidentelles et la présence des parcs éoliens offshores sont autant de pressions qui sont susceptibles de fragiliser un peu plus ces espèces en causant des mortalités et/ou modifications de leurs parcours migratoires. La connaissance de l’utilisation des eaux marines côtières par ces espèces est cruciale pour déterminer les zones et périodes où elles sont susceptibles d’être en interaction avec ces pressions, mais elle reste à ce jour très incomplète. Un programme de recherche précédent a toutefois permis des avancées notables dans la compréhension des trajets migratoires des salmonidés. Entre 2018 et 2020, 124 truites de mer post-reproductrices ont été équipées de marques archives DST (Data Storage Tag). Les données environnementales (température et pression) enregistrées ont permis de reconstruire, avec parfois des incertitudes importantes, les trajectoires individuelles des individus équipés. Les résultats montrent qu’une majorité d’individus pouvaient parcourir plusieurs centaines de kilomètres en mer tandis que d’autres restaient dans la bande côtière où plusieurs parcs éoliens offshores ont été installés depuis. Les hydrophones acoustiques déployés au sein des parcs éoliens offshores et plus largement ceux disponibles dans le cadre d'un réseau européen offrent l’opportunité de mettre en place un suivi par télémétrie acoustique combiné à une approche par DST pour notamment confirmer ou affiner les trajectoires de migration des truites de mer et d’évaluer le niveau d’exposition de l’espèce aux parcs éoliens offshores .

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont les suivants : Les phase marines des populations de poissons migrateurs amphihalins, populations globalement menacées par différentes pressions d’origine anthropique, restent très mal connues. Cette méconnaissance complique leur gestion. Ce projet vise à produire des connaissances sur les trajectoires de migration marine des truites de mer à large échelle. Par ailleurs, dans le contexte de développement des énergies marines renouvelables (parcs éoliens offshore), les données permettront une première évaluation du recouvrement des trajectoires des truites de mer et des parcs éoliens. Compte-tenu de sa dépendance au milieu côtier, la truite de mer pourrait être fortement exposée aux nombreuses pressions (bruit, modification des champs électro-magnétiques, etc.) exercées des parcs éoliens offshore. Les impacts de ces pressions récentes, qui s’additionnent aux autres, doivent être évaluées dans le cadre des politiques publiques.

Procédures

Procédure chirurgicale: Insertion par chirurgie du capteur et de l'émetteur (réalisée sous anesthésie). Durée

Impact sur les animaux

Insertion par chirurgie du capteur et de l'émetteur (réalisée sous anesthésie) : les nuisances potentielles (douleurs, saignements, infection) sont limitées par l'utilisation de mesures prophylactiques et des traitements adaptés et définis avec la collaboration d'un vétérinaire spécialisé. Cette intervention est considérée comme « modérée ». Les individus sélectionnés auront une gamme de poids (min-max) qui leur permettra de supporter l'insertion du matériel scientifique. Ce dernier ne dépassera pas 2% du poids de l'animal comme recommandé dans la littérature.

Devenir

Après la procédure chirurgicale, les individus sont relâchés dans leur milieu naturel pour être suivi. La récupération des biologgers lors de leur recapture quelques mois plus tard est indispensable pour acquérir les données enregistrées pendant le suivi. Cependant comme les individus développent un tissu conjonctif autour du matériel lors du processus de cicatrisation, leur extraction ne permet pas la survie de l’animal. C’est pourquoi, les truites de mer adultes recapturées lors de leur retour de mer seront mises à mort. Une partie des individus ne pourra pas être recapturée et finira sa vie dans le milieu naturel.

Remplacement

L'objectif de l'étude est de produire des connaissances sur l’écologie de la truite de mer (comportement dans le milieu naturel). Le modèle biologique ne peut être substitué par des alternatives non animales.

Réduction

L’effectif de truites de mer adultes à marquer (50) est établi en fonctoin du taux de retour des DST. D’après l’expérience acquise pendant au cours d'un progamme précédent, nous tablons sur la récupération d’environ 25% des DST. Une bonne partie sera issus d’individus recapturés au piège lors de leur retour, et des DST supplémentaires pourraient être découverts soit par des promeneurs sur la côte (suite à mort des individus en mer) ou bien via des pêcheurs. Les données de géolocalisation des poissons par les hydrophones permettront de retracer les trajectoires et l’histoire de l’ensemble des poissons marqués qui pourront être analysées seules ou en combinaison avec les données issues des DST. Les données attendues sont jugées suffisantes pour produire des connaissances nouvelles. La taille d’échantillon résultant d’un équilibre entre minimisation de l’impact sur la population de truite de mer et qualité et quantité de données acquises. L’échantillon recueilli au final sera de taille modeste, mais les données haute-fréquence acquises seront très informatives.

Raffinement

Les principales mesures de raffinement concernent la limitation des nuisances (angoisse et douleur) lors de la manipulation des animaux avant, pendant et après la chirurgie et la limitation des risques d'infection postopératoire. La combinaison d'utilisation de produits anesthésiques de concentration adaptée (1- concentration pour l'anesthésie pré-opératoire et 2- pour le maintien de l'anesthésie pendant l'opération) et d'antalgiques limitent directement l'angoisse et la douleur pendant et après l'opération et l'administration d'antibiotiques limite les risques d'infections liés à l'opération. Les mesures prophylactiques classiques (désinfection du matériel) limitent également les sources d'infection pouvant induire des nuisances post-opératoires. Les opérations de chirurgie seront effectuées par du personnel habilité et spécifiquement formé par un vétérinaire. Le protocole opératoire est co-construit avec un vétérinaire. Les conditions environnementales d'importance première pour les poissons (température et oxygénation de l'eau) seront contrôlées avant, pendant et après la capture et l'opération. Pendant l’opération, un tube alimenté en eau sera introduit dans la bouche des poissons pour maintenir un bon niveau d’oxygénation des branchies. Après l’opération, les individus seront gardés en observation dans un vivier placé dans la rivière afin de contrôler la façon dont ils récupèrent de l'anesthésie et seront relâchés lorsqu'ils auront retrouvé un comportement actif normal (équilibre dans la colonne d'eau, nage).

Choix des espèces

La truite de mer et plus précisément son comportement dans le milieu naturel, est l’objet même de l’étude, il ne s’agit pas d’un modèle biologique utilisé pour tester une hypothèse. Compte-tenu de sa dépendance au milieu côtier, la truite de mer pourrait être fortement exposée aux nombreuses pressions (bruit, modification des champs électro-magnétiques, etc.) exercées des parcs éoliens offshore. Les impacts de ces pressions récentes, qui s’accumulent aux autres, doivent être évaluées dans le cadre des politiques publiques. Les adultes post-reproduction sont ciblés. Ils sont pour la plupart d’entre eux d’une taille suffisante pour accueillir le matériel de télémétrie. Les adultes trop petits pour lesquels le matériel représenterait plus de 2% du poids seraient écartés, comme recommandé dans la littérature.

Dépourvues de système immunitaire pour que les greffons humains ne soient pas rejetés, 600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un carré de peau de 20 mm de côté leur est retiré sur toute l'épaisseur au milieu du dos, un substitut cutané est suturé dans la plaie, et les pansements sont changés deux fois par semaine sous anesthésie générale. Le porteur attribue un stress à l'isolement en cage individuelle pendant trois à quatre semaines, isolement qu'il impose pour éviter que les souris ne s'arrachent entre elles les greffons. Elles sont tuées par groupes de six, quinze, trente, soixante, quatre-vingt-dix et cent vingt jours après la greffe, pour prélever la peau autour de la zone greffée.

Objectifs

L’objectif de notre projet est d’évaluer la fonctionnalité de différents substituts cutanés afin de sélectionner les formulations qui permettront de favoriser la régénération du tissu cutané, la revascularisation et la repigmentation au cours du temps après réalisation d’une greffe cutanée. Ce projet est la suite de projets précédemment autorisés au cours desquels nous avons évalué les premiers substituts cutanés sur 3 modèles de plaie cutanée différents. Les substituts cutanés sont obtenus à l’aide de la première machine automatisée au monde à produire des greffes de tissu cutané personnalisées pour les adultes et les enfants présentant des lésions cutanées graves, telles que des brûlures profondes. Ce processus innovant implique la croissance d’une nouvelle peau en utilisant les propres tissus de l’organisme comme modèle. Ces substituts cutanés, produits à partir de prélèvements de peau de différents donneurs (enfant, adulte, homme, femme, peau claire, peau sombre), et sélectionnés sur la base de résultats d’analyses préalables, seront greffés sur des souris immunodéficientes afin d’éviter le rejet des greffes, après induction d’une plaie cutanée sur toute l’épaisseur de la peau. Les nouveaux substituts cutanés seront préparés à partir de cellules de peau jeunes, moyennement âgées et très âgées, avec une seule ou plusieurs couches de cellules, et comprenant ou non des cellules pigmentées. Des prélèvements seront effectués à différents temps après réalisation des greffes de substituts cutanés afin d’étudier la fonctionnalité des différents substituts cutanés greffés, les interactions se mettant progressivement en place entre les substituts cutanés et l’environnement de l’hôte, le développement d’un réseau vasculaire, la régénération du tissu cutané à partir du greffon lors de la cicatrisation, et la repigmentation du tissu cutané régénéré. Un ensemble d’analyses seront effectués sur les prélèvements cutanés collectés et permettront de caractériser au cours du temps la fonctionnalité des substituts cutanés, d’appréhender les interactions se mettant progressivement en place au cours du temps entre les substituts cutanés et l’hôte, et de suivre l’évolution des substituts cutanés au cours du temps. Les résultats obtenus permettront de déterminer les paramètres optimaux pour obtenir le substitut cutané idéal en fonction de chaque donneur.

Bénéfices attendus

Les substituts cutanés sont des biomatériaux capables de remplacer une partie de la peau et constituent une alternative précieuse pour la gestion des plaies lorsque les thérapies standards sont un échec. Cependant, sélectionner le bon substitut n’est pas une décision thérapeutique aisée. Aujourd'hui, si les auto-transplantations (donneur et receveur sont la même personne) sont les greffes de première intention pour la couverture des plaies, elles se heurtent à l’écueil d’une disponibilité limité de peau, en particulier dans la prise en charge des grandes brûlures et les procédures restent invasives et douloureuses. Des greffes de tissu "étranger" peuvent pourvoir au remplacement temporaire de la peau, avant de laisser la place à une auto-transplantation. Subsiste évidemment les risques de rejet, douleurs et infection, et la formation de cicatrices. La technologie utilisée pour produire les substituts cutanés que nous allons évaluer va permettre de révolutionner les traitements actuellement disponibles pour les lésions cutanées les plus sévères et plus particulièrement les grandes brûlures. Il s’agit d’un processus innovant impliquant la croissance d’une nouvelle peau en utilisant les propres tissus de l’organisme comme modèle, évitant ainsi toute forme de rejet de cette auto-transplantation, et permettant de produire une surface de nouvelle peau très importante. Il est donc important de tester ces nouveaux substituts cutanés sur des modèles de plaies simples et chroniques représentatifs chez l’animal qui pourront être utilisés par la suite chez l’Homme et ainsi permettre d’améliorer la cicatrisation de grandes brûlures et de larges plaies cutanées.

Procédures

Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour l’induction de la plaie cutanée et la réalisation d’une greffe de substitut cutané. Sous anesthésie générale, un prélèvement de peau carré de 20 mm de côté sur toute l’épaisseur de la peau sera effectué au milieu du dos et en arrière des omoplates sur l’ensemble des souris. Un substitut cutané sera placé dans le lit de la plaie cutanée et suturé en plusieurs points indépendants. Un traitement analgésique des souris sera administré avant la chirurgie puis après la fin de celle-ci. La chirurgie sera réalisée en 25 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Les greffes de substitut cutané seront protégées par des compresse et pansement changés 2 fois par semaine, sous anesthésie générale pendant 10 minutes environ, permettant d’effectuer des observations et de scorer différents paramètres au niveau des greffes cutanés. Un suivi quotidien de l’ensemble des souris sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations, week-ends et jours fériés inclus. Un maintien des souris greffées en cage individuelle sera nécessaire pendant 3 à 4 semaines maximum après réalisation des greffes cutanées pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles les compresse et pansement et surtout le greffon cutané. Après régénération tissulaire et cicatrisation complètes, 3 à 4 semaines maximum après réalisation des greffes cutanées, les souris seront replacées à 2 par cage jusqu’à la fin des expérimentations.

Impact sur les animaux

L’induction d’une plaie cutanée pour la réalisation de la greffe cutanée va engendrer une douleur modérée transitoire pendant quelques heures. L’hébergement en cage individuelle des souris greffées, nécessaire tout au long du processus cicatriciel et de régénération tissulaire, soit pendant 3 à 4 semaines maximum, pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le greffon cutané, et l’ensemble compresse, pansement et bandes de sparadrap, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes.

Devenir

Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 600 souris seront euthanasiées à différents temps après réalisation de la greffe cutanée, 15, 30, 60, 90 et 120 jours après, avec 6 souris, 3 souris mâles et 3 souris femelles, par temps de prélèvement. Un prélèvement cutané sera réalisé au large de la région greffée pour réaliser un ensemble d’analyses permettant de caractériser sur des temps précoces et prolongés la fonctionnalité et l’évolution de substituts cutanés greffés, processus dépendants de mécanismes complexes (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, mise en place de la vascularisation…).

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de caractériser sur un temps prolongé la fonctionnalité et l’évolution de substituts cutanés greffés, processus dépendants de mécanismes complexes (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, mise en place de la vascularisation …). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous ne grefferons que des substituts cutanés sélectionnés sur la base de résultats d’analyses préalables. Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ainsi, 6 souris par temps de prélèvements, 3 souris mâles et 3 souris femelles, seront suffisants. Ce nombre a été déterminé sur la base des résultats des études précédentes obtenus sur différents modèles de greffe cutanée et suivant les mêmes conditions expérimentales. La réalisation de l’ensemble des analyses envisagées sur un même prélèvement cutané permettra également de limiter le nombre d’échantillons et donc d’animaux nécessaires.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de la réalisation de la greffe cutanée (traitement pour supprimer la douleur avant la chirurgie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celle-ci (traitement pour supprimer la douleur après la chirurgie et observations régulières). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré deux fois par semaine à chaque renouvellement de pansement, et si une perte de poids trop importante par rapport au poids maximal est observée ou si des signes d’infection de la plaie greffée ou des modifications du comportement des animaux sont observés, ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les animaux seront placés dans des conditions permettant d’observer leur comportement pendant leur phase d’activité et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie). Des bâtonnets de coton seront placés dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant d’induire une plaie représentative des plaies à traiter chez l’Homme, et la souche de souris utilisée est dépourvue de système immunitaire, permettant d’éviter les risques de rejet suite à une greffe de peau d’un organisme étranger. Son utilisation est largement décrite dans la littérature scientifique pour les études sur les greffes cutanées et pour le développement de substituts cutanés. Les animaux seront des souris âgées de 6-7 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7-8 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur des greffes cutanées (généralement 6 à 8 semaines).

Pour comparer la durée de la gestation entre deux lignées génétiquement modifiées, 128 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Les femelles gestantes passent deux échographies sous anesthésie gazeuse, restent isolées quatorze jours sous surveillance vidéo, puis reçoivent une injection intrapéritonéale d'anesthésique avant une ponction sanguine sous la mâchoire et l'ouverture de l'abdomen pour prélever les embryons et le liquide amniotique, juste avant leur mise à mort. Le porteur range parmi les effets attendus le stress lié à la manipulation et à l'isolement, ainsi qu'une douleur légère due aux anesthésies. Il affirme qu'aucun modèle alternatif ne permet d'étudier la durée de la gestation et ses déterminants génétiques.

Objectifs

Les anomalies de la durée de la gestation compliquent plus d’un quart des grossesses dans l’espèce humaine. La prématurité est la première cause d'évènements indésirables et de mortalité périnatales dans les premières années de vie, et de handicaps dans la petite enfance. Le dépassement du terme est associé à une incidence accrue de morts-nés et de fragilité fœtale, ainsi qu’à un taux accru d’accouchements par césarienne qui sont associés à un risque plus élevé de complications médicales chez la mère. Chez la souris, les lignées de laboratoires présentent des différences de durée de gestation qui sont génétiquement fixées. Nous utiliserons deux lignées de souris génétiquement modifiées pour étudier les différences de durée de gestation entre plusieurs lignées de souris. Ces études permettront de mieux comprendre le rôle de certains gènes dans la durée de la gestation, dans la prématurité et le dépassement de terme.

Bénéfices attendus

L’étude d’un contrôle génétique de la durée de la gestation chez la souris nous permettra de mieux connaitre les mécanismes de l'accouchement. Une meilleure connaissance de ces mécanismes pourrait permettre d’identifier des déterminants du déclenchement du travail dans l’espèce humaine, de mieux comprendre la physiologie de l’accouchement à terme et la physiologie de l’accouchement prématuré. , et éventuellement d'ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour ces pathologies de la grossesse humaine.

Procédures

Echographie sous anesthésie générale gazeuse, d'une durée de 5 mn (2 échographies pendant la gestation/ animal) Anesthésie générale par injection intrapéritonéale d'anesthésique (15 sec/souris), puis prélèvement sanguin par ponction sous-mandibulaire (

Impact sur les animaux

Stress du à la manipulation et à l’isolement. Douleur légère et stress dus à l'anesthésie gazeuse lors des échographies et aux injections intrapéritonéales d'anesthésiques.

Devenir

Mise à mort des animaux pour prélèvement d'organes et de sang

Remplacement

Il n’existe pas de modèle alternatif pour étudier la durée de la gestation et ses déterminants génétiques.

Réduction

L'utilisation de lignées modifiées génétiquement permet de beaucoup réduire le nombre d'animaux utilisés, par rapport à une approche par croisements entre lignées. De plus, tous les animaux des lignées seront utilisables. L'échographie permet de détecter précocément la gestation et de réduire le nombre d'animaux à utiliser. Les données de la littérature permettent de réduire le nombre d’animaux pour la comparaison des durées de gestation. Des tests statistiques seront réalisés pour analyser les données. L'étude sera réalisée en deux phases afin de valider dans un premier temps notre hypothèse sur le rôle d’une séquence d’ADN sur la durée de la gestation. La 2ème phase, qui nous permettra d’explorer en profondeur les mécanismes impliqués dans la mise-bas, ne sera nécessaire que si l'hypothèse est validée dans la première phase de l'étude.

Raffinement

Les animaux disposeront d'enrichissement. Les durées d'isolement des animaux seront réduites au maximum. L'échographie et les procédures sous anesthésie générale permettront de limiter la souffrance et le stress des animaux. La vidéo infrarouge en continu permettra également un suivi sans perturber les animaux. Des points limites ont été définis entrainant une mise à mort anticipée si nécessaire.

Choix des espèces

La souris est déjà utilisée comme modèle de la gestation humaine dans plusieurs articles, notamment au moment de la parturition et pour les questions relative à l'immunologie de la gestation . Les modèles murins sont très activement utilisés par la communauté scientifique internationale pour l'étude de la prématurité ainsi qu'attesté par de nombreuses revues récentes dans la littérature. Les souris âgées de 8 semaines seront utilisées pour les croisements : souris jeunes, sexuellement matures, n'ayant encore jamais développé de gestation.