Recherche fondamentale

Enfermées seules pendant 72 heures dans une enceinte close qui mesure le méthane qu'elles émettent, avec traite manuelle deux fois par jour, 160 chèvres en lactation vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit un séjour pouvant provoquer vocalisations, baisse d'ingestion, perte de poids transitoire et agitation, et reconnaît que l'hébergement individuel est un facteur stressant. Il écrit pourtant que la procédure "n'implique aucune mesure invasive sur les animaux". Les chèvres retournent ensuite à l'élevage, où leur efficience alimentaire et leur résilience continuent d'être mesurées, les données servant à nourrir des modèles mathématiques de réduction du méthane.

Objectifs

Chez les ruminants, La dégradation des aliments se produit principalement dans le rumen (estomac) grâce à l'action d'une communauté microbienne complexe. Ce microbiote est responsable de la fermentation des aliments dont les produits principaux sont les acides gras volatils, le gaz carbonique et le méthane. La réduction des émissions de méthane des ruminants est un défi majeur pour le secteur de l'élevage. La conception de stratégies optimales de réduction de méthane nécessite la prise en compte des éléments de productivité et de résilience animale. En effet, une stratégie de réduction des émissions ne doit peut pas défavoriser la santé et la production (e.g. production du lait des chèvres laitières dans notre cas). Dans ce contexte, ce projet associe la modélisation mathématique et l’expérimentation animale pour contribuer à une meilleure compréhension des interactions entre caractères clés. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer la dynamique de production de méthane de chèvres dont les caractéristiques et les capacités de résilience et d’efficience alimentaire sont connues. Les données résultantes seront utilisées pour le développement de modèles mathématiques. Par efficience alimentaire, on entend le rapport entre les produits animaux et les ressources mobilisées. Ce ratio résulte de la capacité des animaux à transformer les ressources alimentaires en produits (lait, viande). Par résilience, nous entendons la capacité à court terme de l'animal à faire face aux perturbations environnementales. Notre hypothèse est que des animaux présentant des différences en termes de leur efficacité ou robustesse pourraient présenter des différences dans leur dynamique de production de méthane. Nous espérons que ce travail produira des connaissances permettant la conception de stratégies de réduction de la production du méthane tout en conservant résilience animale et des productions optimales. Ce projet s’appuie sur des projets en cours et futurs de notre équipe autour de l’efficience alimentaire et la résilience.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à une meilleure compréhension des liens entre émissions de méthane par des ruminants et caractères d’intérêt clés, comme leur production de lait et leur santé ou bien-être Cette approche globale est centrale pour la conception des stratégies durables pour la réduction d’émission de méthane dans l’atmosphère. Le projet fournira, de plus, des données clés (cinétiques d’ingestion couplées aux cinétiques de production de méthane) pour les travaux de modélisation portés par notre équipe. Ces modèles prédictifs s’intègrent dans une démarche d’élevage de précision en produisant des outils d’aide à la décision pour le suivi de l’élevage et la formulation de stratégies alimentaires durables. En plus, les modèles mathématiques résultants sont des outils qui pourraient aider à réduire le besoin d'expérimentations animales pour prédire les réponses des animaux aux changements alimentaires, ce qui répond aux principes des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner).

Procédures

Pour toute la durée de la procédure, les animaux serons soumis à un hébergement individuel pendant 72 heures dans des enceintes fermées permettant la mesure de la production de méthane. Pendant le séjour dans les enceintes, les animaux serons soumis à une traite manuelle 2 fois par jour, pour un totale de 6 traites d’une durée d’environ 3 minutes chacune.

Impact sur les animaux

Les séjours (3 jours) dans les enceintes peuvent entraîner un stress en raison de l’hébergement individuel des animaux. Le séjour dans les enceintes peut conduire certains animaux à vocaliser et à diminuer leur ingestion, ceci conduisant à une perte de poids transitoire. Le séjour pourrait avoir un impact sur l’activité de l’animal (excrétions excessives, agitation ou immobilisation).

Devenir

La procédure de mesure de méthane n’implique aucune mesure invasive sur les animaux. Les chèvres retournent dans l’élevage à la fin.

Remplacement

Les modèles mathématiques résultants de ce projet seront des outils permettant d’étudier des alternatives durables pour la réduction de méthane. La construction des modèles doit impérativement reposer sur des données expérimentales obtenues in vivo, en prenant en compte la spécificité de l’animal (i.e. son comportement alimentaire et son niveau de production). Des systèmes in vitro existent pour étudier la production de méthane. Néanmoins, les conclusions basées sur ces études in vitro sont limitées car ce type de système ne tient pas compte des facteurs physiologiques importants de l’hôte, comme par exemple l’absorption des acides gras volatils à niveau du rumen. Pour ce projet, l’expérimentation animale est donc essentielle et irremplaçable. Le but est que, dans l’avenir, les modèles résultants du projet constituent une alternative à l’expérimentation animale dans certains cas spécifiques.

Réduction

La procédure impliquera l’utilisation de chèvres dont le comportement alimentaire, l’efficience alimentaire ou la résilience auront déjà été caractérisées dans des expérimentations précédentes ou à venir. L’objectif est de déterminer la production de méthane chez des animaux avec des profils d’efficience et résilience variés pour permettre d’évaluer notre hypothèse. Pour éviter des conditions environnementales d'inconfort (température, humidité), nous avons décidé de n'utiliser le dispositif qu'au printemps et à l'automne. Pour chaque saison, nous caractériserons la production de méthane d'animaux avec deux niveaux différents de résilience ou efficience alimentaire. L’expérimentation en 2 saisons nous permettra évaluer 2 stades de lactation. Nous utiliserons 4 animaux par traitement (16 animaux par saison, par an) afin de tenir compte de la possibilité que certains animaux ne réussiront pas la phase d'habituation et sortiront de l’expérimentation sans passer par la phase de mesure de production de méthane. Les animaux à utiliser seront sélectionnées en connexion avec des protocoles précédents permettant la caractérisation de leur résilience ou de leur efficience alimentaire. La procédure a une durée de 5 ans pour permettre élargir le phénotypage d’un nombre important des animaux dans notre installation expérimentale. Ces animaux auront une caractérisation en termes de leur résilience/efficience dans des expériences à venir dans le cadre de projets de recherche de l’équipe. La consolidation d’une base des données important intégrant des données de production de méthane, résilience et efficience alimentaire sera un atout pour le développement de modèles mathématiques de notre équipe.

Raffinement

L’hébergement individuel est un facteur stressant pour les animaux. Pour réduire les nuisances sur le bien-être animal, une phase d’habituation sera mise en place pour minimiser le stress dans les enceintes. Dans cette phase d’habituation, les animaux seront exposés à l’hébergement individuel de manière graduelle. Les enceintes sont équipées d’un matelas qui laisse passer l’urine pour améliorer le confort de l’animal. Des brosses et des petites chaines seront installées comme enrichissement. La présence de parois transparentes (qui permettent la visibilité avec leurs congénères et de la présence humaine) et la présence d’une veilleuse pour la nuit pendant les phases d’habituation et de mesures réduiront le stress. Les animaux seront observés régulièrement pendant toute la durée du protocole d’habituation et pendant les mesures. Des points limites ont été mis en place et seront appliqués. Une caméra vidéo enregistrera en continu les comportements des 4 chèvres durant la période de mesures pour surveiller et détecter un éventuel changement de comportement. Les vidéos seront sauvegardées et visionnées systématiquement le lendemain matin par les animaliers. Si un animal présente des comportements anormaux durant la nuit, il sera sorti du dispositif. Une étape en amont des essais sera effectuée pour sélectionner des animaux qui, potentiellement, auront moins de stress. Cette sélection sera faite sur l’observation des comportements. L’observation de la production de lait et de la mamelle sera aussi prise en compte pour choisir des animaux ave une bonne conformation des trayons pour faciliter la traite manuelle.

Choix des espèces

Ce projet s’intègre dans le programme de recherche de l’équipe. Il utilisera l’animal modèle de l’unité : la chèvre laitière. Nous allons utiliser des chèvres en lactation dans des conditions similaires à l’élevage conventionnel de chèvres laitières .pour avoir des résultats représentatifs du contexte de production des élevages commerciaux. Nos travaux de modélisation suivent une approche mécanistique générique qui peut être appliquée aux autres espèces de ruminants y compris les bovins.

Jusqu'à trois chirurgies crâniennes sous anesthésie générale par animal, plus vingt séances d'entraînement à associer une odeur à une récompense : 20 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs bulbes olfactifs. Une électrode leur est implantée dans le bulbe olfactif, la stimulation est ensuite testée sur animal vigile pendant trente minutes, puis une IRM fonctionnelle est réalisée sous anesthésie. Une muselière rotative portant la partie externe de l'implant leur est fixée. Le porteur affirme que le recours aux brebis est "irremplaçable" pour évaluer la tolérance du dispositif et justifie le choix des ovins par des dimensions de bulbe olfactif proches de celles de l'humain et par un crâne encore assez fin entre 12 et 18 mois, ce qui rend les chirurgies plus rapides.

Objectifs

L’anosmie est une perte totale et irréversible de l’odorat. Les données épidémiologiques estiment que 10 à 15% de la population mondiale souffre d’une altération de l’odorat, et que 5% de la population mondiale est totalement anosmique. C’est un symptôme fréquent de la Covid-19, mais qui survient aussi après d’autres infections virales, ou après un traumatisme, ou qui peut être lié à des maladies neurodégénératives (Parkinson, Alzheimer) ou à des tumeurs cérébrales. La plupart des anosmies sont liées à un déficit de détection des odeurs dans la cavité nasale au niveau de l’épithélium olfactif, qui a tendance à dégénérer pendant le vieillissement et dont la fonction peut être altérée dans le cas d’infections. A terme l’anosmie altère le plaisir de manger, entraîne une perte d’appétit et de poids et réduit également la capacité à détecter des dangers. Elle affecte l’humeur, la santé, le travail et le bien-être. Elle est fréquemment associée à une détérioration de la qualité de vie perturbant la relation des patients à eux-mêmes et aux autres, menant très souvent à la dépression. Et il n'existe à ce jour aucun traitement pour corriger l’anosmie. Dans la plupart des cas d’anosmie, la première structure cérébrale recevant les informations olfactives, localisée au niveau des bulbes olfactifs (BO), reste fonctionnelle. La solution thérapeutique que nous proposons, consiste en un implant olfactif combinant un nez électronique (capteur olfactif externe) et un réseau d’électrodes, placé au niveau des bulbes olfactifs pour une stimulation électrique directe mimant l’information olfactive qui arrive au niveau du système nerveux central lorsque le système olfactif est fonctionnel. L’implant olfactif est une solution prometteuse pour les patients anosmiques. Notre objectif est de développer un implant qui serait à l’olfaction ce que l’implant cochléaire est à l’audition. Une étude pré-clinique sur l’animal est un prérequis indispensable avant d’envisager une implantation olfactive chez des patients. Ce projet consiste donc à fournir une preuve de la faisabilité chez le mouton, choisi pour ses similitudes d’organisation et de taille du système olfactif par rapport à l’humain. Pour la première fois, des tests de stimulations et de comportements olfactifs générés via un implant seront réalisés sur un animal éveillé. Ce projet se déroulera dans 4 établissements utilisateurs qui y collaborent.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour ambition de développer un implant olfactif qui aidera les patients anosmiques à retrouver des sensations olfactives, et d’apporter la preuve que cette stratégie produirait effectivement des sensations reconnues comme des odeurs. Ce projet constitue une étape clé dans l'amélioration de la qualité de vie et de la sécurité de nombreux patients anosmiques qui ne récupèrent pas leurs sensations olfactives. L’impact médical attendu est la réduction des complications associés à l'anosmie (malnutrition, dépression, accidents domestiques). En outre, les modèles animaux d'anosmie montrent qu'en l'absence d'apport olfactif, les signaux nerveux liés à la respiration (et aux émotions) disparaissent. Nous souhaitons développer un nez électronique capable de rétablir à la fois la détection des odeurs la perception des saveurs et l’apport respiratoire dans le bulbe olfactif imitant la détection naturelle du flux respiratoire par les neurones olfactifs. Cette restauration aurait un impact thérapeutique sur les états dépressifs, apportant un réel bénéfice aux patients anosmiques. Le projet permettra d’évaluer une approche chirurgicale originale pour la stimulation électrique du cerveau qui pourrait en outre promouvoir la régénération des neurones olfactifs. Cela pourrait aider les patients souffrant d'un dysfonctionnement olfactif, comme lors de maladies neurodégénératives (Alzheimer, accidents vasculaires cérébraux). L’impact scientifique attendu est une meilleure compréhension de l’interprétation des odeurs par le cerveau.

Procédures

10 animaux seront soumis à : • 1 intervention chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie pour la pose de l’électrode de stimulation, d’une durée totale estimée à 2 heures (EU2). • 1 test de stimulation du bulbe olfactif, sur animal vigile, d’une durée de 30 minutes (EU1). • 1 IRM fonctionnelle par stimulation du bulbe olfactif, sous anesthésie générale, d’une durée de 1 heure (EU3). • 1 euthanasie (EU4) .10 animaux seront soumis à : • 20 sessions d’entraînement à l’association d’odeur à une récompense de quelques minutes en tout, reparties pendant 4 à 8 semaines (EU1). • 1 intervention chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie, d’une durée totale estimée à 2 heures (EU2). • 2 interventions chirurgicales, sous anesthésie générale et analgésie, d’une durée de 1H chacune (EU2). • 1 euthanasie (EU1)

Impact sur les animaux

Après les différentes interventions chirurgicales, les animaux sont susceptibles de ressentir des douleurs post-opératoires, d’avoir un léger saignement de nez, une fuite de liquide céphalo-rachidien ou une infection. Ces risques sont considérés comme très limités étant donné les précautions chirurgicales appliquées pour toutes les interventions. Les différentes injections (analgésie, anesthésie, antalgie, antibiotiques...) réalisées au cours du projet, peuvent provoquer un léger stress lié à la manipulation de l’animal et une légère douleur liée à la piqure. Un inconfort dû aux pansements peut être également ressenti pour certains animaux au début de la phase de récupération (2 ou 3 jours), ainsi que lors du changement de ces pansements (10 minutes au maximum). Lors du test de stimulation du bulbe olfactif, les animaux seront placés individuellement dans une case de dimensions réduites, à proximité des autres brebis, ce qui peut générer un léger stress. Les entrainements au test olfactif et la manipulation des animaux peuvent entrainer du stress ou de la frustration en cas d’échec au test pour certaines brebis au début de l’entrainement. La mise en place d’une muselière rotative permettant donc de s’alimenter normalement et sur laquelle sera fixée la partie externe de l’implant olfactif des brebis, va probablement demander un temps d’adaptation aux animaux, donc un léger stress de quelques jours.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour des prélèvements de tissus post-mortem : les deux bulbes olfactifs de chaque brebis, ainsi que des biopsies d’épithélium olfactif, seront réalisées sur tous les animaux afin d’évaluer, par analyses histologiques et biochimiques, la réaction inflammatoire et la perte neuronale au sein de ces tissus.

Remplacement

Le développement et le test de l’implant olfactif seront réalisés avant tout démarrage de l’expérimentation animale. Ainsi, plusieurs tests se feront en laboratoire par les ingénieurs, sans recourir à l’animal. Le nez électronique sera ainsi exposé à une simulation de flux inspiratoire amenant l’odeur test sur le capteur de gaz. La stimulation électrique découlant de la détection de l’odeur sera quant à elle effectuée dans un milieu conducteur (verre d’eau) afin d’enregistrer la réponse électrique à la stimulation olfactive. Le but ultime de ce projet étant de développer un implant olfactif, le recours aux animaux est irremplaçable afin d’évaluer la tolérance et l'efficacité du dispositif.

Réduction

Les techniques chirurgicales ont été raffinées en amont sur le modèle animal de ce projet lors de dissections post-mortem de 5 brebis destinées à la réforme, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires à la mise au point de la technique. Le nombre de brebis choisis (20) a été défini sur la base des résultats obtenus sur des protocoles similaires sur brebis, qui ont montré qu’un tel effectif était nécessaire et suffisant pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives lors des tests de comportement. Trois stratégies permettent de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet : i) La combinaison successive des différentes approches (chirurgie, électrophysiologie, imagerie par IRM fonctionnelle, comportement) sur les mêmes animaux ; ii) l’utilisation des animaux comme leur propre contrôle, avant et après induction de l’anosmie, avant et après entraînement comportemental olfactif ; iii) la comparaison entre les deux bulbes olfactifs d’un même animal (côté implanté, versus côté non-implanté).

Raffinement

Les brebis seront hébergées en groupe pour conserver les relations sociales, s’acclimater à leurs différents environnements, avec surveillance accrue du personnel, conditions d’élevage optimisées (boisson, nourriture ad libitum, litière), enrichissements de milieu (brosses, ballons, mobiles suspendus, pierres à sel) et manipulations régulières pour les habituer aux interactions humaines et aux tests comportementaux. Les brebis soumises à des tests de stimulation électrique du bulbe olfactif ou sélectionnées pour les tests comportementaux olfactifs ne seront jamais placées en situation d’isolement. En fonction des besoins (situation post-opératoire, soins, tests, …) les animaux seront placés temporairement dans des loges d’hébergement individuelles, simplement séparés des autres par une barrière à clairevoies qui limite la taille de la loge, mais les laissent au contact visuel, olfactif, et auditif de leurs congénères. Les animaux sont habitués à ce genre de cloisonnement nécessité par certains soins (parage, prélèvements, échographies, …). Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale avec une gestion adaptée de la douleur et du risque infectieux ; suivi de la température ; tapis chauffant, réveil en cage individuelle, sous lampes infrarouge pour limiter l’hypothermie ; enrichissement de milieu, contact visuel et olfactif avec leurs congénères. La surveillance post-opératoire implique un traitement analgésique systématique et antibiotique si nécessaire. Nous utiliserons une grille d’évaluation de la douleur basée sur les mimiques faciales. S’il y avait des complications sévères, sans alternative thérapeutique, les brebis concernées seraient euthanasiées. D’une manière générale, si une brebis montre des signes d’inconfort (prostration, manque d’appétit, arrêt des relations sociales animal/animal, soigneur/animal), un vétérinaire sera consulté et son avis sera suivi (traitements, sortie du protocole pour une situation extrême). Tous les transports/transferts des animaux entre les différents sites se feront en bétaillère agrée, paillée et toujours en groupe pour limiter le léger stress lié au transport. Des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis de la procédure.

Choix des espèces

Les ovins ont été choisis car c’est une espèce dont l’organisation de la cavité nasale et les dimensions du bulbe olfactif sont quasi-similaires à celles de l’humain. Des brebis de 12 à 18 mois, c’est-à-dire ayant achevé leur puberté, et avant l’apparition d’une épaisseur d’os crânien trop importante, de manière à permettre des chirurgies plus aisées et rapides, pour une meilleure récupération des animaux.

Tuées à la fin du protocole pour prélever leur tissu nerveux, 320 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent une chirurgie du genou d'environ trente minutes sous anesthésie générale pour y installer une arthrose, une partie recevant en plus une injection intra-articulaire de virus destinée à supprimer un gène ou à marquer des neurones. Un groupe passe cinq semaines de tests de sensibilité cutanée et de locomotion, par séances d'environ deux heures, alors que la douleur articulaire induite dure environ huit semaines. Le porteur écrit que ces souris devenues douloureuses chroniques seront tuées à la fin de la procédure "afin de leur éviter toute souffrance inutile".

Objectifs

L'arthrose, représente la forme la plus courante de rhumatisme touchant plus de 250 millions de personnes dans le monde. L'arthrose affecte principalement les articulations du genou, des hanches, des mains, des facettes vertébrales et des pieds. L'arthrose du genou est la forme la plus fréquente et se caractérise par la dégradation du cartilage et une inflammation de l’articulation. Ces symptômes évoluent souvent lentement et s'aggravent avec le temps. L'arthrose s'accompagne également d'une perte de mobilité due à une dégradation progressive des muscles. Néanmoins, la douleur demeure le symptôme prédominant chez les patients atteints d'arthrose. Aux stades avancés, l'arthrose se caractérise par des douleurs sévères, en faisant l'une des principales causes de douleur chronique dans le monde. Étant donné l'absence actuelle de traitements efficaces pour ralentir ou inverser la progression de la maladie, la prise en charge de l'arthrose repose principalement sur le soulagement des symptômes. A ce jour, les traitements pharmacologiques disponibles sont associés à une efficacité limitée et à de nombreux effets secondaires, soulignant l'urgence d'identifier les sources et les mécanismes de la douleur associée à l'arthrose dans le but d'améliorer la qualité de vie des patients. Les contraintes mécaniques jouent un rôle critique dans la genèse de la douleur associée à l'arthrose. L'identification récente de protéines capables de détecter les stimulations mécaniques du genou a fourni les premières indications des mécanismes physiologiques responsables de la détection des mouvements dans l'articulation du genou. Un nouveau canal ionique activé par des pressions intenses a récemment été identifié, appelé TACAN, et pourrait jouer un rôle dans la douleur associée à l'arthrose. Des études ont montré qu'une diminution de son expression dans un contexte inflammatoire était associée à une augmentation des seuils de douleurs mécaniques, soutenant l'idée que TACAN est serait impliqué dans la détection de la douleur mécanique. Ce projet vise à étudier le rôle de TACAN dans l'arthrose pour mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à la douleur articulaire, en vue d'améliorer les stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à élucider le mécanisme par lequel la sensibilisation de la protéine TACAN par les médiateurs inflammatoires contenus dans le liquide synovial peut induire une hypersensibilité à la douleur mécanique, contribuant ainsi aux développements des douleurs associées à l'arthrose.

Procédures

Tous les animaux subiront une procédure chirurgicale afin d'induire le modèle d'arthrose. L'induction du modèle de douleur se fera sous anesthésie générale

Impact sur les animaux

Le modèle d'arthrose MIA induit une douleur modérée pendant environ 8 semaines et une perte de locomotion légère liée à la douleur de l'articulation.

Devenir

Les souris douloureuses chroniques seront euthanasiées à la fin de la procédure afin de leur éviter toute souffrance inutile.

Remplacement

Pour ce projet, l'utilisation de souris transgéniques permettant de cibler spécifiquement notre protéine d'intérêt. Aucune méthode alternative n'existe pour prévenir l'utilisation d'animaux dans ce protocole : en effet, il est nécessaire de réaliser ces études chez l'animal car l’intégration de la douleur implique de nombreux neurones organisés en réseaux complexes et méconnus du système nerveux central et périphérique.

Réduction

Le nombre de souris par groupe est réduit au maximum tout en permettant de discriminer un effet significatif entre les traitements avec une différence de 50% entre les groupes, et calculé par des tests statistiques adaptés. Nous utiliserons un nombre équivalent d'animaux mâles et femelles, selon les recommandations actuelles.

Raffinement

Les animaux seront reproduits au sein de notre animalerie. Les animaux sont stabulés dans des cages individuelles contenant plusieurs mâles ou femelles et situés dans des portoirs ventilés, thermorégulés avec hygrométrie contrôlée ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum ; changement de litière régulier. Nous utiliserons une pièce réservée pour la stabulation de souris transgéniques avec un cycle de lumière inversé. Les animaux seront hébergés en milieu enrichi (social et environnemental) afin de respecter au mieux leur confort et leur niveau de stress. Les tests comportementaux à la douleur seront réduits au minimum (fréquence et intensité des tests) et réalisés selon des protocoles expérimentaux établis et acceptés par la communauté scientifique. Les expérimentations seront réalisées au sein du laboratoire ayant une expérience reconnu dans les approches décrites dans ce projet. Aucun des modèles de douleurs décrits dans ce projet n'induit de déficit locomoteur sévère pouvant influer sur les besoins physiologiques de l'animal. Les procédures expérimentales impliquant une anesthésie se feront à l'aide d'isoflurane. Les animaux seront suivis quotidiennement par les membres utilisateurs du projet, et seront euthanasiés en cas de points limites atteints, après consultation de la SBEA.

Choix des espèces

Les souris transgéniques utilisées dans ce projet sont les seuls animaux permettant de supprimer le gène codant pour TACAN dans les nerfs innervant le genou. Adultes (P45-200) pour comparaison avec les autres données de la littérature.

12812 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant subir huit prélèvements sanguins à la queue, des gavages quotidiens pendant 30 semaines et des injections intrapéritonéales deux fois par semaine sur la même durée. S'y ajoutent une chirurgie de pose d'implant d'œstrogène, une injection sous-cutanée de cellules tumorales humaines dans les deux flancs, une ligature vasculaire, une biopsie de la queue au sixième jour de vie et des transports entre cinq établissements. Le porteur signale un risque de perforation de l'œsophage et de passage de la solution dans les poumons lors des gavages, des douleurs dès que la tumeur atteint un certain volume, des démangeaisons et des difficultés à s'alimenter et à s'abreuver. Les souris des procédures expérimentales sont tuées pour exploration anatomique, celles de l'élevage restant en vie pour l'accouplement sauf les mâles immunodéficients, et le bénéfice annoncé tient en une phrase, une meilleure compréhension des syndromes d'hypercroissance et l'identification potentielle de nouveaux traitements.

Objectifs

Les syndromes d’hypercroissance sont causés par des mutations génétiques affectant uniquement certains tissus. Notre objectif est de développer des modèles précliniques porteurs de mutations de ces genes dans différents tissus afin de comprendre la physiopathologie des anomalies et d’identifier de nouveaux traitements permettant de prévenir l’apparition des symptômes ou de freiner la pathologie. Le projet se déroule sur 5 sites différents.

Bénéfices attendus

Ce projet nous conduira à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant aux syndromes hypertrophiques et à l'identification potentielle de nouveaux traitements

Procédures

Les interventions subies par les animaux seront : 1) Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour l’insertion des implants d’œstrogène (EU1 et EU2) 2) Une injection en sous cutané de cellules tumorales humaines sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2). 3) Des prélèvements sanguins (n= 8 par souris) à la queue sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2) 4) Des inductions par gavages au tamoxifène (moins d’une minute) sur 5 jours pour induire les phénotypes d’hypercroissance (EU1 et EU2) 5) Des observations des tumeurs et des imageries in vivo sous anesthésie gazeuse durant maximum 30 min (EU3, EU4, EU5) 6) Des traitements en injections bihebdomadaires intra péritonéal (moins d’une minute) de traitements (30 semaines) (EU1 et EU2) 7) Des gavages quotidiens de traitements (moins d’une minute) pour une durée maximale de 30 semaines (EU1 et EU2) 8)Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour ligature vasculaire (EU1 et EU2) 9) Biopsie de la queue à jour 6 de vie pour génotypage (3 secondes) (EU1 et EU2)

Impact sur les animaux

Les souris recevront par voie sous cutanée (flancs gauche et droit) deux injections mais toutes n’auront pas de développement de tumeurs. S’il y a prise de greffe, et formation de tumeurs sous cutanées, les effets de la tumeur peuvent être indésirables et générer certaines contraintes : douleurs à partir d’un certain volume, difficultés à s’alimenter et à s’abreuver, tension au niveau de la peau, démangeaisons et irritations. L’insertion de l’implant et la mise en place d’un point de suture peut également provoquer une gêne avec des démangeaisons et une légère tension au niveau de la plaie suite à la cicatrisation. Une hypothermie, une déshydratation et un asséchement des yeux peut également survenir suite à l’anesthésie. Les séances d’imageries et les prélèvements sanguins répétés sont un stress. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Les injections péritonéales répétées peuvent induire une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection. Les ligatures vasculaires peuvent engendrer des infections localisées, des saignements et des douleurs. Le transport d'un centre à un autre pour les imageries in vivo peut induire un stress pour les animaux. Au cours des biopsies à jour 6 pour génotypage, une douleur localisée de très courte durée peut survenir.

Devenir

Les animaux de la procédure d’élevage seront maintenus en vie pour accouplement et maintien des lignées sauf pour les males immunodéficients. Les animaux des procédures d’expérimentation seront mis à mort pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Il n'existe pas de modèle in vitro qui permette d'étudier les caractéristiques des syndromes de surcroissance. Au cours de ces syndromes, les cellules nécessitent un environnement complexe avec de multiples interactions et facteurs de croissances qu’il est actuellement impossible de récréer in vitro. La souris est le seul mammifère pour lequel la protéine impliquée ici a été mutée.

Réduction

Nous utiliserons un nombre d'animaux nécessaire pour avoir la puissance statistique. Celle-ci été défini en utilisant un logiciel de statistique. Le nombre de souris par groupe a ensuite été calculé afin de pouvoir mettre en évidence un effet statistique significatif. Tout au long du projet pour minimiser le nombre d'animaux utilisés et conformément aux objectifs scientifiques, nous réutiliserons les différents tissus.

Raffinement

Nous éviterons toute souffrance inutile des animaux en les surveillant régulièrement. Le gavage sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et analgésie adaptées, avec une surveillance accrue post-opératoire. L’ensemble des prélèvements et des imageries sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Enfin, des points- limites précis ont été établis (poids, comportement, aspect du poil), entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.Le transport entre sites est assuré par un prestataire agréé. Les animaux ont accès à l’eau et l’alimentation pendant toute la durée du trajet. Les cages sont ventilées et enrichies avec du coton.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction. Elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. Par ailleurs, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). Souris âgées de 6 semaines pour l'induction au tamoxifène car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée. Ces souris seront ensuite suivies à l'âge adulte.

Pêchés dans la Saône, 1680 poissons de quatre espèces, chevesnes, spirlins, gobies à tache noire et chabots communs, vont être utilisés sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun est anesthésié pour recevoir une marque d'élastomère, puis de nouveau à chaque transfert entre aquariums, avant un préconditionnement thermique de une à six semaines et deux séries de tests comportementaux d'une heure, certains subissant en plus un test de performance de nage. Le porteur attend un stress accru par la pêche et le changement de milieu, avec un risque d'infection plus élevé du fait de l'origine sauvage des animaux, dont il dit ignorer l'histoire. 1280 poissons sont tués pour des mesures de bioénergétique cellulaire, 400 sont remis à l'eau, et les gobies à tache noire, classés invasifs, ne peuvent en aucun cas être relâchés.

Objectifs

Le changement climatique est souvent caractérisé par une augmentation de la température moyenne, mais rarement par les variations de températures non prédictibles de plus en plus fréquentes qui l’accompagne. Cette variabilité thermique imprévisible, ou « stochasticité thermique » reste à ce jour encore peu étudiée mais peut entrainer des effets délétères sur les organismes vivants, et plus particulièrement sur les ectothermes, comme les poissons, dont la température interne dépend fortement de la température environnementale. Pour faire face à ces variations thermiques aléatoires, seuls les organismes possédant une large gamme de réponses comportementales et/ou physiologiques (= plasticité phénotypique) pourront se maintenir à moindre coût. En reproduisant cette stochasticité thermique en conditions contrôlées de laboratoire, ce projet a donc pour but de caractériser les réponses physiologiques et comportementales des poissons mises en place lors de ce stress thermique aigu. On s’attend donc à une augmentation de la dépense énergétique des poissons soumis à un régime thermique stochastique (aléatoire), en comparaison avec un régime thermique variable prévisible (saisonnier ou journalier) ou un régime thermique stable. On s’attend également à des répercussions au niveau comportemental, notamment à travers une diminution de l’activité physique et une augmentation de la quête alimentaire en fonction du potentiel adaptatif des espèces étudiées. Pour décrire les différentes composantes physiologiques et comportementales de la plasticité phénotypique, 4 espèces de poissons couramment rencontrées en Saône seront utilisées : le chevesne et le spirlin (2 espèces pélagiques eurythermes), le gobie à tache noire (espèce benthique invasive) et le chabot commun (espèce benthique native). Ces quatre espèces communes et représentatives des différentes niches écologiques permettront de généraliser au maximum les informations obtenues au cours de cette étude. Au total, 1680 poissons seront utilisés au cours des 5 prochaines années, dont une partie pourra être replacée dans le milieu naturel. En concertation avec les gestionnaires de biodiversité, nous nous assurerons de l’effet négligeable de ces prélèvements sur les populations naturelles.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de documenter et de mieux prédire l’impact du changement climatique sur les populations de poissons d’eau douce, en se focalisant plus particulièrement sur des variations rapides et stochastiques de la température encore très mal prises en compte dans la littérature scientifique. A l’aide d’une approche interdisciplinaire, entre écologie comportementale et physiologie, cette étude va permettre à court terme i) d’apporter des connaissances fondamentales pour définir les limites thermiques de certaines espèces en Saône et ii) de caractériser les effets d’une stochasticité thermique accrue sur le comportement et la physiologie des poissons. Ces données participeront par exemple à la compréhension des conséquences des changements environnementaux rapides souvent liées à l’activité humaine. A plus long terme, ces données pourront servir concrètement pour réfléchir à des directives de conservations des écosystèmes basées sur des données physiologiques et comportementales individuelles, en support aux données populationnelles. Les conclusions de ce projet d’envergure réalisé sur plusieurs espèces de poissons seront susceptibles d’être généralisables aux écosystèmes similaires à la Saône, dans un but de conservation des écosystèmes aquatiques, qui reste au centre des préoccupations du grand public, des instances gouvernementales et des chercheurs.

Procédures

À la suite de leur prélèvement en milieu naturel, tous les poissons seront acclimatés à l’animalerie et stabulés dans des conditions adaptées à leur espèce. Les poissons seront soumis à une anesthésie / analgésie afin de les implanter avec des marques pour les individualiser. Cette intervention dure au maximum 15 minutes par poisson. Les poissons seront ensuite soumis à une période de pré-conditionnement thermique (entre 1 et 6 semaines selon la procédure). A chaque manipulation (lors des transferts entre les aquariums de stabulation et les enceintes expérimentales), les poissons seront légèrement anesthésiés afin de limiter le stress du déplacement. Cette anesthésie ne fera pas effet pendant plus d’une minute sur le poisson. Tous les poissons en pré-conditionnement subiront deux séries de tests comportementaux (2 fois 1h) espacés de 2 jours de repos en conditions expérimentales. Certains d’entre eux subiront par la suite un test de performance de nage (

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables de ces protocoles pourrait être un niveau de stress accru faisant suite à la pêche, à la stabulation dans un nouveau milieu, et/ou aux expérimentations. Cette augmentation du stress peut s’exprimer via l’apparition d’infections chez les poissons. En effet, les risques d’infections sont plus hauts que la normale car comme les poissons viennent de milieux naturels, on ne connaît pas leur histoire et ce qu’ils auraient pu rencontrer dans leur habitat. Un autre point de surveillance sera lié à la période d’isolement des poissons (entre 2h et

Devenir

80 poissons (chevesnes) seront euthanasiés à la suite du protocole permettant de construire une courbe de performances thermiques pour réaliser une étude de performance thermique au niveau cellulaire. Sur les 1600 poissons prévus pour caractériser les conséquences physiologiques et comportementales des périodes de pré-conditionnements aux différents régimes thermiques, 1200 individus seront euthanasiés pour réaliser des mesures de bioénergétique cellulaire, et 400 poissons (100 de chaque espèce) seront replacés dans leur milieu naturel. De plus, les gobies à tache noire, étant considérés comme invasifs, ne peuvent pas être relâchés dans le milieu naturel.

Remplacement

A ce jour, seule l’expérimentation sur animaux permet de réaliser une étude intégrative qui prend en compte l’ensemble des réponses physiologiques et comportementales des organismes soumis à des contraintes environnementales. Dans le contexte de l’intensification du changement climatique, ce projet cherche à décrire les conséquences des variations de température sur des poissons issus du milieu sauvage (la Saône), afin d’apporter un éclairage pertinent et des prédictions des effets de ce stress thermique sur les écosystèmes aquatiques. De plus, l’utilisation d’espèces variées s’avère indispensable pour apporter des conclusions pertinentes, robustes et généralisables sur les conséquences d’une augmentation de la stochasticité thermique sur la biodiversité des rivières.

Réduction

Compte tenu de l’étendue de la variabilité interindividuelle des processus étudiés dans ce projet, le nombre de poissons a été réduit au minimum et défini au seuil de la pertinence scientifique et statistique, notamment grâce au marquage individuel permettant l’utilisation de tests à mesure répétées, prenant l’individu comme facteur aléatoire. Outre les 80 chevesnes nécessaires pour l’étude des courbes de performances thermiques, c’est surtout le protocole de comportement alimentaire (réponse fonctionnelle), qui selon la littérature implique pour établir une courbe robuste 5 individus au minimum par densité de proies (au nombre de 7), qui conditionne l’effectif choisi. Ainsi, 5 poissons x 7 densités de proies x 2 durées d’acclimatation x 5 profils thermiques x 4 espèces = 1400 poissons seront expérimentés au maximum. Afin de palier une mortalité possible liée à l’origine « sauvage » des poissons, 50 poissons supplémentaires par espèces seront pris en compte dans les calculs, soit au total 1680 poissons pêchés au cours des 5 ans du projet. Tout aménagement de protocole permettant de réduire encore le nombre de poissons utilisés au cours des expériences sera favorisé et certains poissons pourront également être relâchés après expérimentation.

Raffinement

Lors des protocoles in vivo (mesure de la consommation d’oxygène associée aux performances de nage et tests comportementaux), un des principaux objectifs est de limiter au maximum le stress et la douleur des animaux. Chaque geste contraignant (mesures et changement de milieu – tunnel, chambre ou nouvel aquarium) sera réalisé sous anesthésie légère, suivi par un temps d’acclimatation de 12h dans le tunnel de nage ou la chambre métabolique, avant les protocoles de respirométrie ou de 15 à 30 min avant les protocoles de comportement. Après chaque expérience, les poissons seront replacés dans leur aquarium de stabulation et toutes les précautions seront prises pour leur éviter toutes nuisances visuelles et sonores. Les poissons sont maintenus dans des aquariums de 60L ou 90L en densité adaptée à leur espèce. Les spirlins et les chevesnes juvéniles sont des poissons vivant en banc. Ils seront donc maintenus à plusieurs dans les aquariums (environ 15 par bac) afin d’optimiser les conditions de stabulation. Des cachettes adaptées (tubes de gros diamètres leur permettant de se cacher en banc), des plantes artificielles et du gravier sont disposés dans chaque aquarium. Un système de pompe filtrante assurera également une circulation d’eau bullée continue dans les aquariums. Les poissons seront nourris une fois par jour, avec des cubes de moules hachées avec du mix (différentes larves de moustiques, daphnies et de la verdure (épinards, spiruline)) et lors du nourrissage, leur comportement sera particulièrement observé. En effet, si un poisson ne se nourrit pas, des mesures seront prises à son égard. Une observation biquotidienne sera réalisée par le personnel animalier et les expérimentateurs afin de veiller au bien-être des animaux depuis leur arrivée à l’animalerie jusqu’à l’euthanasie. Les états de santé et de bien-être des animaux seront ainsi évalués en prenant en compte les signes cliniques et comportementaux selon des grilles d’évaluation afin de définir des points limites adaptés. Dès l’apparition de signes cliniques de mal-être, les animaux seront sortis du protocole et remis en conditions standard d’élevage. Dans le cas où des signes de douleur ou de mal-être devaient persister au-delà de 24 heures après la mise en stabulation, les animaux seront euthanasiés selon la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

Les 4 espèces de poissons sont couramment rencontrées dans la Saône et représentent plusieurs stratégies de vie au sein des poissons d’eau douce. Elles ont été identifiées en concertation avec les partenaires à l’origine de ce projet et le nombre d’individus prélevés n’aura aucun impact sur les populations naturelles. Le chevesne est une espèce très répandue dans la Saône, avec une tolérance thermique très large. Le spirlin est également une espèce ubiquiste, plutôt thermophile, de plus petite taille, permettant une stabulation optimale en condition expérimentale. Ce sont toutes les deux des espèces pélagiques. Le gobie à tache noire est une espèce benthique extrêmement invasive, qui se trouve actuellement en Haute-Saône, suspectée d’être plus tolérante face aux variations thermiques que l’espèce native qui occupe la même niche écologique que lui, le chabot commun. Du fait de leur diversité, ces 4 espèces permettront d’obtenir des résultats généralisables à la biodiversité des rivières. Les poissons utilisés seront soit des juvéniles, soit de jeunes adultes, soit des adultes, dont la taille sera adaptée à l’utilisation des tunnels de nage à disposition au laboratoire (entre 8 et 15 cm). Les spirlins, les gobies à tache noire et les chabots communs utilisés seront des adultes. Leur taille (entre 8 et 15 cm) permet des mesures en tunnel de nage. La taille des chevesnes adultes (>30 cm) étant incompatible pour une telle étude, seuls des chevesnes juvéniles seront employés.

279 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ischémie-reperfusion rénale d'environ 45 minutes sous anesthésie, six injections intraveineuses d'anticorps sur trois semaines, une biopsie de 2 mm pour génotypage, des échocardiographies hebdomadaires pendant quatre semaines, des prélèvements sanguins et urinaires à cinq dates, des passages en cage métabolique et un transport de douze heures entre deux établissements. Le porteur affirme qu'aucune alternative à l'animal n'existe dans la littérature pour étudier ce syndrome qui touche à la fois le cœur et le rein, et que la protéine visée deviendrait une cible thérapeutique si son hypothèse se vérifie. L'effectif se déduit d'un calcul de puissance fixant dix souris par groupe, auquel s'ajoutent 3 % de mortalité chirurgicale attendue, et une perte de poids d'environ 10 % est prévue dans les deux jours suivant l'ischémie.

Objectifs

Nous étudions la survenue et l’évolution d'une atteinte cardiaque aiguë en conséquence d'une atteinte rénale aiguë initiale. Nos récents travaux ont permis d’identifier le rôle important d’une première protéine nommée P1 dans cette atteinte cardiaque aigüe ; en effet, lorsque P1 est augmentée dans l’organisme, il y a augmentation de l’inflammation et de la fibrose dans le myocarde. Néanmoins, lorsque P1 est génétiquement ou pharmacologiquement diminué, l’inflammation et la fibrose sont également moindres. Nos travaux ont également montré que cette protéine P1 interagissait avec une deuxième protéine (P2) et que cette interaction favorisait la sécrétion de cytokines (protéines inflammatoires). Il semblerait donc que cette protéine P2 ait également un rôle important dans l’atteinte cardiaque aigüe suite à une atteinte rénale aigüe. Notre projet a donc pour but d’étudier l’inhibition de cette protéine P2 afin de voir si nous réduisons l’inflammation et la fibrose cardiaque suite à une atteinte rénale aigüe. Cette protéine P2 est retrouvée dans la membrane des cellules des vaisseaux sanguins mais elle peut également se détacher de la membrane et se présenter sous forme soluble pour se retrouver dans la circulation sanguine. Nous essaierons donc, dans une première procédure, de bloquer génétiquement l’expression de P2 grâce à une molécule T qui se fixe directement dans les cellules des vaisseaux sanguins, et dans une seconde procédure de bloquer la forme soluble de P2 grâce à un anticorps. Ensuite nous procéderons à une atteinte rénale aigue sur les souris et nous observerons l’apparition et l’évolution de la dysfonction cardiaque. Si notre hypothèse s’avère exacte, la protéine P2 deviendrait alors une potentielle cible thérapeutique dans cette pathologie cardio rénale. Ces travaux de recherche se dérouleront dans 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de déterminer l'intérêt de la protéine P2 dans l’atteinte cardiaque aigüe suite à une atteinte rénale aigüe. Si nos hypothèses s'avèrent exactes, nous pourrions considérer cette molécule comme une cible thérapeutique potentielle pour cette pathologie.

Procédures

Les animaux subiront différents types d'injections : - Injections intraveineuses pour l'anticorps (2 fois par semaine pendant 3 semaines, soit 6 injections au total ; une injection dure 1min), elles seront effectuées dans l'EU1 - Injections intrapéritonéales pour l'anesthésie chimique avant les chirurgies d'ischémie-reperfusion rénale ou contrôles (durée de la chirurgie : environ 45min pour les ischémies et 15 min pour les contrôles), avant chaque échocardiographie prévues toutes les semaines durant 4 semaines (une échocardiographie dure environ 15min par souris) ainsi qu'avant chaque prélèvement sanguin (un prélèvement dure 1min), ces interventions seront menées dans l'EU1 - Injections intrapéritonéales de la molécule de délétion génétique durant 3 jours à raison d'une injection par jour, elles seront effectuées au sein de l'EU2. Les animaux subiront également des prélèvements : -biopsies d'environ 2mm afin d'identifier les animaux d'intérêt pour la procédure 1, une biopsie dure 30 secondes. Ces prélèvements seront réalisés dans l'EU2. - sanguins à J-14 avant la chirurgie ainsi qu'à 24h, 72h et 28j post-chirurgie pour la procédure 1. A J14 avant chirurgie, puis à J10, J17, J24, J28 post chirurgie pour la procédure 2. - urinaires à J-14 avant la chirurgie ainsi qu'à 24h, 48h, 72h et 28j post-chirurgie pour la procédure 1. A J14 avant chirurgie, puis à J10, J17, J24, J28 post chirurgie pour la procédure 2. Pour les prélèvements urinaires, les souris ne resteront pas plus de 2h dans les cages métaboliques. Après chacun des prélèvements sanguins, du sérum physiologique sera injectée à chacune des souris pour les aider à récuperer. Tous ces prélèvements se dérouleront dans l'EU1.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront des biopsies de 2mm afin d'identifier les animaux d'intérêt pour la procédure 1. La douleur sera légère mais de courte durée. Les animaux subiront une ischémie reperfusion rénale qui pourrait engendrer une douleur. Une perte de poids d’environ 10% est attendue dans les 2 jours suite à cette intervention. De plus, ils subiront différents types d'injections : injections intraveineuses pour l'anticorps, intrapéritonéales pour l'anesthésie chimique. Bien que ces injections ne soient pas douloureuses, elles pourraient tout de même causer une gêne à l'animal ou un stress du fait de leur répétition. Le transport de l’établissement 1 vers l’établissement 2 pourrait également être une source de stress. Les souris subiront également des prélèvements sanguins et urinaires à différents temps, ce qui pourrait engendrer un stress.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour pouvoir évaluer les conséquences physiopathologiques par de l'histologie, l’étude de l'expression protéique et génétique des marqueurs de dommages tissulaires et inflammation à partir des organes et des tissus d'intérêt.

Remplacement

Nous étudions un syndrome qui implique 2 organes différents, à savoir le cœur et le rein, ainsi que les interactions biochimiques et biologiques qu'il existe entre eux. Malheureusement, il est impossible de reproduire un système aussi complexe dans un modèle cellulaire, le recours à l'animal est donc nécessaire. A ce jour, dans la littérature, il n’existe aucune alternative à l’animal pour étudier ce syndrome.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire est calculé au vu des différences obtenues lors de nos précédents travaux afin d'obtenir une différence de 20% entre les groupes contrôle et ischémie, soit 10 souris par groupe sachant que la mortalité imputable à la chirurgie est estimée à 3%. Le calcul a été obtenu en utilisant un logiciel de puissance statistique, prenant en compte les différences observées, la puissance de comparaison et la mortalité imputable au modèle.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 10 jours sera observée après l’arrivée des animaux en provenance de l’établissement secondaire. Le transfert sera effectué par un transporteur agréé et durera 12h. Un relevé de température de l’environnement sera fourni pour vérifier les bonnes conditions de transport. Les animaux déjà blessés, stressés ou malades au sein de l’établissement secondaire ne seront pas transférés. Une administration d’analgésique en sous-cutanée, en prémédication (45min avant l'opération) puis une anesthésie en intra-péritonéale seront effectuées pour toutes les opérations chirurgicales. Du gel ophtalmique sera appliqué sur les yeux des animaux avant la chirurgie pour éviter l'asséchement de leurs yeux. La prise en charge de la douleur post-opératoire durera tout l'après-midi (les opérations étant effectuées le matin) et une injection d'analgésie en sous-cutanée sera effectuée 6h après la fin de l’intervention. Une surveillance accrue (6h post chirurgie) sera réalisée après la chirurgie pour vérifier la bonne cicatrisation des animaux. Si toutefois des douleurs apparaissaient, une deuxième dose d’analgésique serait administrée avec ajout de nourriture gélifiée dans la cage. Nous utiliserons une anesthésie locale pour les prélèvements sanguins rétro-orbitaires et les injections intraveineuses. En cas de complications impossibles à traiter, l’animal serait retiré de l’étude et euthanasié.

Choix des espèces

Le modèle de souris présente de nombreux avantages pour notre protocole expérimental. Outre sa petite taille et son coût avantageux, la souris permet de générer un grand nombre de descendants très rapidement. Par ailleurs, son potentiel génétique permet d'analyser l'effet d'une absence/surexpression d'un gène cible. Nous disposons de tous les outils permettant une exploration physiopathologique complète. Par ailleurs, les souris utilisées pour nos procédures expérimentales auront un fond génétique très utilisé dans la littérature pour étudier la pathologie qui nous intéresse. Les souris utilisées auront entre 2 et 4 mois pour caractériser au mieux le syndrome cardio-rénal tel qu'il existe chez l'Homme adulte. De plus, ce stade permet aux animaux une récupération optimale après les chirurgies d'ischémie reperfusion rénale.

216 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever le cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une mini-pompe osmotique diffusant des anticorps de patients leur est implantée sous la peau du dos au cours d'une chirurgie d'une heure trente, sans anti-inflammatoire possible puisque les maladies étudiées sont neuroinflammatoires. Suivent trois tests comportementaux étalés sur 37 jours, dont sept jours d'apprentissage à retrouver une plateforme cachée dans une piscine remplie d'un liquide opaque et un conditionnement contextuel en chambre, les mâles étant hébergés seuls, ce qui supprime selon le porteur le blottissement et le toilettage entre congénères. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ni in silico ne permet d'étudier l'effet de ces anticorps sur la mémoire et que seuls des animaux vivants le permettent.

Objectifs

Les maladies de la neuromyélite optique (NMOSD) et de la MOGAD sont des maladies neurologiques auto-immunes très invalidantes qui détruisent certaines cellules du cerveau. Ce n’est que récemment que des études cliniques ont mis en évidence des atteintes en dehors du nerf optique et de la moelle épinière, notamment des atteintes de l’hippocampe dans le cerveau qui est une région responsable de la mémoire, et des troubles de la mémoire. Ces troubles sont encore peu étudiés dans ces deux maladies alors que cela représente un réel handicap chez les patients. Une étude préliminaire utilisant des anticorps de patients ayant la NMOSD (appelés NMO-IgG) a démontré que les NMO-IgG impactaient l‘activité des neurones de l’hippocampe suggérant un mécanisme concernant l’origine des troubles de mémoire chez ces patients. Les effets de substances pharmacologiques suggèrent qu’il est possible de combattre les effets délétères des anticorps de ces maladies sur la mémoire. L’objectif est de tester l’impact sur la mémoire spatiale des auto-anticorps NMO-IgG et MOG-IgG (anticorps de patients ayant la MOGAD) chez la souris. Il s’agira dans un premier temps d’évaluer si les souris développent des troubles de la mémoire liés à la présence de ces anticorps par la réalisation d’expériences testant la mémoire spatiale, une mémoire dépendante de l’hippocampe. Si tel est le cas, des substances pharmacologiques seront utilisées dans un second temps afin de déterminer si elles bloquent les troubles de la mémoire. Ce projet permettra d’une part de déterminer si les anticorps de ces maladies induisent des troubles de la mémoire, et d’autre part d’offrir de nouvelles solutions thérapeutiques ciblées de ces atteintes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra pour la 1ère fois d’identifier l’impact des anticorps NMO-IgG et MOG-IgG sur la mémoire. Cette étude permettra de caractériser les troubles de la mémoire, si ce sont des troubles de l’apprentissage ou des troubles de la consolidation de la mémoire, dans la NMOSD et la MOGAD. Ce projet permettra également d’analyser l’impact des anticorps sur différents types cellulaires dans l’hippocampe. Il permettra ainsi d’établir un lien entre auto-immunité, astrocyte et myéline étant des types de cellules présentes dans l’hippocampe et impliquées dans la mémoire. Enfin grâce à l’utilisation de produits pharmacologiques visant à rétablir les troubles de la mémoire, ce projet est une approche pré-clinique qui permettra d’offrir des pistes thérapeutiques dans le traitement de ces troubles chez les patients ayant la NMOSD et la MOGAD.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule procédure chirurgicale avec implantation d'une mini-pompe osmotique, l'intervention durant 1h30 au maximum. L'intervention chirurgicale est suivie par une phase de récupération d'environ 5 jours. Par la suite, ils passeront 3 tests comportementaux étalés sur une durée de 37 jours. Le premier test qui durera 30 minutes permet d’évaluer l’état de stress de la souris. Pour le second test, la souris qui est posée dans une piscine avec un liquide opaque et thermostaté doit pendant 7 jours apprendre à se rappeler de l’emplacement d’une plateforme cachée. Un jour et un mois après apprentissage, les capacités de rappel de l’emplacement de la plateforme seront testées. Le dernier test consiste à placer la souris pendant 6 minutes dans une chambre de conditionnement où elle pourra associer un évènement au contexte dans lequel elle est (la chambre). Un jour et un mois après, la souris est replacée dans le même contexte (la chambre) pour tester les performances de sa mémoire associative. Ces deux derniers tests permettent d’évaluer l’apprentissage et la consolidation de la mémoire spatiale.

Impact sur les animaux

La chirurgie peut induire des effets secondaires indésirables : perte de poids, douleur, stress pendant quelques jours. Les souris seront implantées avec une mini-pompe pouvant représenter une gêne et de l’inconfort pour les souris. La réalisation d‘injections peut engendrer du stress. Cela peut mener à des infections chez la souris tout comme la présence de points de suture. Les tests comportementaux peuvent également induire de l’inconfort (nouvel environnement), un certain degré de stress et de la fatigue (tests répétés). L’hébergement spécifique des mâles induit chez les souris des interactions sociales minimisées et une absence de contact physique positif qui empêche le blottissement, le toilettage et le réchauffement des souris entre elles.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer le cerveau et d'analyser les altérations morphologiques et cellulaires.

Remplacement

Actuellement, aucun modèle cellulaire ou in silico ne peut permettre d’étudier les conséquences cognitives des anticorps NMO-IgG et MOG-IgG. L’étude préliminaire ex vivo, bien qu’elle permette l’étude de mécanismes relatifs aux processus de mémoire, n’est pas suffisante pour démontrer un potentiel effet des anticorps sur des troubles de mémoire. L’étude physiopathologique de ces deux maladies, et donc l’effet d’anticorps sur la mémoire via des tests comportementaux, ne peut être effectuée que grâce à l’utilisation d’animaux vivants.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été établi à 15. Les prédictions statistiques se basent sur les résultats de plusieurs études comportementales menées chez la souris où le nombre d’individu requis pour observer des différences dans des tâches de mémoire où le comportement est subtil est de 15 avec une puissance statistique fiable, mais aussi sur l’évaluation d’un article. Dans cet article utilisant la même méthodologie que ce projet (diffusion d’anticorps humain de patients via une mini-pompe osmotique chez des souris de même souche), les résultats montrent qu’il faut au moins 15 souris par groupe pour atteindre une bonne puissance statistique. Deux études pilotes seront réalisées en amont des deux études comportementales pour permettre de valider la méthodologie. Il est important de noter que la deuxième étude pilote et l’étude comportementale sur la consolidation ne seront réalisées que si des différences statistiquement significatives sont obtenues lors de l'étude comportementale sur l’apprentissage. Pour réduire au maximum le nombre d’animaux, les souris ayant subi les tâches comportementales serviront également aux analyses du cerveau afin de corréler sur un même animal les performances de mémoire et les atteintes morphologiques.

Raffinement

Les animaux seront habitués à leur utilisateur et seront hébergés par petit groupe dans les cages ce qui permettra de réduire leur niveau de stress. Les cages seront enrichies par l’introduction de morceaux de carton, batônnets en bois à ronger, de la litière ainsi qu’une roue et un igloo. Les souris auront un accès permanent à l’eau et à la nourriture. Lors de la chirurgie, du gel ophtalmique sera appliqué sur les yeux. Une infiltration d’anesthésique sera faite en amont sur la zone d’incision. La cicatrisation sera facilitée en appliquant une crème cicatrisante sur la cicatrice. Un antiseptique sera appliqué sur la peau au niveau du champ opératoire et en post-opératoire sur la cicatrice pour éviter les infections. La mini-pompe osmotique sera placée sous la peau au niveau du dos et sur le côté pour ne pas gêner l’animal dans ses déplacements. L’emploi d’une mini-pompe osmotique a été privilégiée pour éviter des injections intracérébrales répétées aux souris. Le ciment dentaire utilisé pour fixer la canule sur le crâne sera limé si nécessaire pour éviter toute aspérité qui pourrait blesser la face interne de la peau de l’animal. Les maladies étudiées étant neuroinflammatoires, l’emploi de traitements anti-inflammatoires n’est pas envisageable. 8h après la chirurgie le temps que la première dose d’anti-douleur ait fait effet, les souris recevront une seconde injection en sous-cutané. Les souris feront l’objet d’un suivi journalier post chirurgie jusqu’à la fin de la procédure à l’aide d’une grille d’évaluation basée sur un système de scorage permettant l’évaluation de la douleur, du comportement, de la cicatrisation, du poids et leur prise alimentaire et de leur agressivité à la manipulation. Un score trop élevé sur l’ensemble des catégories ou l’atteinte d’un point limite dans une des catégories conduira à la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris car elle possède une organisation anatomique et un réseau limbique similaire à l’homme avec un hippocampe très développé. Depuis 50 ans, la souris est considéré comme un des meilleurs modèles expérimentaux pour l’étude de la mémoire. Depuis 15 ans la plupart des études dans ce domaine sont effectuées sur ce modèle. Une étude pilote a montré que les anticorps des patients NMOSD et MOGAD reconnaissent leur cible chez la souris. Enfin, les souris présentent l’intérêt de permettre l’utilisation facile de souris de modèles transgéniques. Les souris seront utilisées à un stade jeune adulte, soit à 8 semaines. A cet âge les souris ont atteint leur taille définitive facilitant l’implantation des mini-pompes osmotiques. De plus, l’étude sur laquelle les hypothèses statistiques se basent utilise des souris âgées de 8 semaines.