Recherche fondamentale

Entraînées quatre à huit semaines à associer une odeur à une récompense, rendues anosmiques, puis opérées deux heures sous anesthésie générale pour implanter une électrode dans le bulbe olfactif, 20 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié subit un test de stimulation du bulbe sur animal vigile et une IRM fonctionnelle sous anesthésie, l'autre moitié deux chirurgies supplémentaires d'une heure, chaque animal servant de témoin à lui-même avant et après induction de l'anosmie et portant une muselière rotative qui supporte la partie externe de l'implant. Le porteur attend des saignements de nez, des fuites de liquide céphalo-rachidien, des infections, et de la frustration en cas d'échec au test, les brebis circulant en bétaillère entre quatre établissements utilisateurs. Toutes sont tuées pour prélever leurs deux bulbes olfactifs et des biopsies d'épithélium olfactif.

Objectifs

L’anosmie est une perte totale et irréversible de l’odorat. Les données épidémiologiques estiment que 10 à 15% de la population mondiale souffre d’une altération de l’odorat, et que 5% de la population mondiale est totalement anosmique. C’est un symptôme fréquent de la Covid-19, mais qui survient aussi après d’autres infections virales, ou après un traumatisme, ou qui peut être lié à des maladies neurodégénératives (Parkinson, Alzheimer) ou à des tumeurs cérébrales. La plupart des anosmies sont liées à un déficit de détection des odeurs dans la cavité nasale au niveau de l’épithélium olfactif, qui a tendance à dégénérer pendant le vieillissement et dont la fonction peut être altérée dans le cas d’infections. A terme l’anosmie altère le plaisir de manger, entraîne une perte d’appétit et de poids et réduit également la capacité à détecter des dangers. Elle affecte l’humeur, la santé, le travail et le bien-être. Elle est fréquemment associée à une détérioration de la qualité de vie perturbant la relation des patients à eux-mêmes et aux autres, menant très souvent à la dépression. Et il n'existe à ce jour aucun traitement pour corriger l’anosmie. Dans la plupart des cas d’anosmie, la première structure cérébrale recevant les informations olfactives, localisée au niveau des bulbes olfactifs (BO), reste fonctionnelle. La solution thérapeutique que nous proposons, consiste en un implant olfactif combinant un nez électronique (capteur olfactif externe) et un réseau d’électrodes, placé au niveau des bulbes olfactifs pour une stimulation électrique directe mimant l’information olfactive qui arrive au niveau du système nerveux central lorsque le système olfactif est fonctionnel. L’implant olfactif est une solution prometteuse pour les patients anosmiques. Notre objectif est de développer un implant qui serait à l’olfaction ce que l’implant cochléaire est à l’audition. Une étude pré-clinique sur l’animal est un prérequis indispensable avant d’envisager une implantation olfactive chez des patients. Ce projet consiste donc à fournir une preuve de la faisabilité chez le mouton, choisi pour ses similitudes d’organisation et de taille du système olfactif par rapport à l’humain. Pour la première fois, des tests de stimulations et de comportements olfactifs générés via un implant seront réalisés sur un animal éveillé. Ce projet se déroulera dans 4 établissements utilisateurs qui y collaborent.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour ambition de développer un implant olfactif qui aidera les patients anosmiques à retrouver des sensations olfactives, et d’apporter la preuve que cette stratégie produirait effectivement des sensations reconnues comme des odeurs. Ce projet constitue une étape clé dans l'amélioration de la qualité de vie et de la sécurité de nombreux patients anosmiques qui ne récupèrent pas leurs sensations olfactives. L’impact médical attendu est la réduction des complications associés à l'anosmie (malnutrition, dépression, accidents domestiques). En outre, les modèles animaux d'anosmie montrent qu'en l'absence d'apport olfactif, les signaux nerveux liés à la respiration (et aux émotions) disparaissent. Nous souhaitons développer un nez électronique capable de rétablir à la fois la détection des odeurs la perception des saveurs et l’apport respiratoire dans le bulbe olfactif imitant la détection naturelle du flux respiratoire par les neurones olfactifs. Cette restauration aurait un impact thérapeutique sur les états dépressifs, apportant un réel bénéfice aux patients anosmiques. Le projet permettra d’évaluer une approche chirurgicale originale pour la stimulation électrique du cerveau qui pourrait en outre promouvoir la régénération des neurones olfactifs. Cela pourrait aider les patients souffrant d'un dysfonctionnement olfactif, comme lors de maladies neurodégénératives (Alzheimer, accidents vasculaires cérébraux). L’impact scientifique attendu est une meilleure compréhension de l’interprétation des odeurs par le cerveau.

Procédures

10 animaux seront soumis à : • 1 intervention chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie pour la pose de l’électrode de stimulation, d’une durée totale estimée à 2 heures (EU2). • 1 test de stimulation du bulbe olfactif, sur animal vigile, d’une durée de 30 minutes (EU1). • 1 IRM fonctionnelle par stimulation du bulbe olfactif, sous anesthésie générale, d’une durée de 1 heure (EU3). • 1 euthanasie (EU4) .10 animaux seront soumis à : • 20 sessions d’entraînement à l’association d’odeur à une récompense de quelques minutes en tout, reparties pendant 4 à 8 semaines (EU1). • 1 intervention chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie, d’une durée totale estimée à 2 heures (EU2). • 2 interventions chirurgicales, sous anesthésie générale et analgésie, d’une durée de 1H chacune (EU2). • 1 euthanasie (EU1)

Impact sur les animaux

Après les différentes interventions chirurgicales, les animaux sont susceptibles de ressentir des douleurs post-opératoires, d’avoir un léger saignement de nez, une fuite de liquide céphalo-rachidien ou une infection. Ces risques sont considérés comme très limités étant donné les précautions chirurgicales appliquées pour toutes les interventions. Les différentes injections (analgésie, anesthésie, antalgie, antibiotiques...) réalisées au cours du projet, peuvent provoquer un léger stress lié à la manipulation de l’animal et une légère douleur liée à la piqure. Un inconfort dû aux pansements peut être également ressenti pour certains animaux au début de la phase de récupération (2 ou 3 jours), ainsi que lors du changement de ces pansements (10 minutes au maximum). Lors du test de stimulation du bulbe olfactif, les animaux seront placés individuellement dans une case de dimensions réduites, à proximité des autres brebis, ce qui peut générer un léger stress. Les entrainements au test olfactif et la manipulation des animaux peuvent entrainer du stress ou de la frustration en cas d’échec au test pour certaines brebis au début de l’entrainement. La mise en place d’une muselière rotative permettant donc de s’alimenter normalement et sur laquelle sera fixée la partie externe de l’implant olfactif des brebis, va probablement demander un temps d’adaptation aux animaux, donc un léger stress de quelques jours.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour des prélèvements de tissus post-mortem : les deux bulbes olfactifs de chaque brebis, ainsi que des biopsies d’épithélium olfactif, seront réalisées sur tous les animaux afin d’évaluer, par analyses histologiques et biochimiques, la réaction inflammatoire et la perte neuronale au sein de ces tissus.

Remplacement

Le développement et le test de l’implant olfactif seront réalisés avant tout démarrage de l’expérimentation animale. Ainsi, plusieurs tests se feront en laboratoire par les ingénieurs, sans recourir à l’animal. Le nez électronique sera ainsi exposé à une simulation de flux inspiratoire amenant l’odeur test sur le capteur de gaz. La stimulation électrique découlant de la détection de l’odeur sera quant à elle effectuée dans un milieu conducteur (verre d’eau) afin d’enregistrer la réponse électrique à la stimulation olfactive. Le but ultime de ce projet étant de développer un implant olfactif, le recours aux animaux est irremplaçable afin d’évaluer la tolérance et l'efficacité du dispositif.

Réduction

Les techniques chirurgicales ont été raffinées en amont sur le modèle animal de ce projet lors de dissections post-mortem de 5 brebis destinées à la réforme, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires à la mise au point de la technique. Le nombre de brebis choisis (20) a été défini sur la base des résultats obtenus sur des protocoles similaires sur brebis, qui ont montré qu’un tel effectif était nécessaire et suffisant pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives lors des tests de comportement. Trois stratégies permettent de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet : i) La combinaison successive des différentes approches (chirurgie, électrophysiologie, imagerie par IRM fonctionnelle, comportement) sur les mêmes animaux ; ii) l’utilisation des animaux comme leur propre contrôle, avant et après induction de l’anosmie, avant et après entraînement comportemental olfactif ; iii) la comparaison entre les deux bulbes olfactifs d’un même animal (côté implanté, versus côté non-implanté).

Raffinement

Les brebis seront hébergées en groupe pour conserver les relations sociales, s’acclimater à leurs différents environnements, avec surveillance accrue du personnel, conditions d’élevage optimisées (boisson, nourriture ad libitum, litière), enrichissements de milieu (brosses, ballons, mobiles suspendus, pierres à sel) et manipulations régulières pour les habituer aux interactions humaines et aux tests comportementaux. Les brebis soumises à des tests de stimulation électrique du bulbe olfactif ou sélectionnées pour les tests comportementaux olfactifs ne seront jamais placées en situation d’isolement. En fonction des besoins (situation post-opératoire, soins, tests, …) les animaux seront placés temporairement dans des loges d’hébergement individuelles, simplement séparés des autres par une barrière à clairevoies qui limite la taille de la loge, mais les laissent au contact visuel, olfactif, et auditif de leurs congénères. Les animaux sont habitués à ce genre de cloisonnement nécessité par certains soins (parage, prélèvements, échographies, …). Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale avec une gestion adaptée de la douleur et du risque infectieux ; suivi de la température ; tapis chauffant, réveil en cage individuelle, sous lampes infrarouge pour limiter l’hypothermie ; enrichissement de milieu, contact visuel et olfactif avec leurs congénères. La surveillance post-opératoire implique un traitement analgésique systématique et antibiotique si nécessaire. Nous utiliserons une grille d’évaluation de la douleur basée sur les mimiques faciales. S’il y avait des complications sévères, sans alternative thérapeutique, les brebis concernées seraient euthanasiées. D’une manière générale, si une brebis montre des signes d’inconfort (prostration, manque d’appétit, arrêt des relations sociales animal/animal, soigneur/animal), un vétérinaire sera consulté et son avis sera suivi (traitements, sortie du protocole pour une situation extrême). Tous les transports/transferts des animaux entre les différents sites se feront en bétaillère agrée, paillée et toujours en groupe pour limiter le léger stress lié au transport. Des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis de la procédure.

Choix des espèces

Les ovins ont été choisis car c’est une espèce dont l’organisation de la cavité nasale et les dimensions du bulbe olfactif sont quasi-similaires à celles de l’humain. Des brebis de 12 à 18 mois, c’est-à-dire ayant achevé leur puberté, et avant l’apparition d’une épaisseur d’os crânien trop importante, de manière à permettre des chirurgies plus aisées et rapides, pour une meilleure récupération des animaux.

Trois injections quotidiennes pour déclencher la modification génétique, puis deux séances d'imagerie sous anesthésie avec injection d'un agent de contraste dans la veine de la queue: 40 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin de chaque procédure pour prélever les organes. Chaque séance dure environ une heure et intervient au premier puis au sixième jour après la première injection. Le projet porte sur les malformations vasculaires cérébrales d'une maladie génétique héréditaire dont ces souris reproduisent les mutations, avec l'espoir déclaré d'améliorer le diagnostic des atteintes cérébrales chez les patients. Ni la maladie étudiée ni la substance injectée ne sont nommées, et le porteur affirme que les souris ne présentent aucun signe visible de stress ou de souffrance, sans perte de poids ni modification de comportement.

Objectifs

Nous étudions une maladie génétique héréditaire qui fragilise les vaisseaux sanguins et qui se manifeste, entre-autre, par des hémorragies, par l’élargissement des vaisseaux sanguins ainsi que des malformations entre les artères et les veines. Cette maladie peut conduire à des complications sévères touchant différents organes : atteinte du foie pouvant nécessiter une greffe, des poumons mais aussi du cerveau. Il s’agit d’une maladie génétique dont la prise en charge et le contrôle des symptômes est difficile. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la maladie pour développer de nouvelles approches thérapeutiques. Très peu d’études sont réalisées sur le cerveau et pourtant dans cet organe, des mauvaises connexions entre les artères et les veines peuvent apparaître chez les patients mais les problèmes du système vasculaire du cerveau, et les répercussions que cela peut avoir sur les cellules nerveuses ne sont pas bien décrits. Différents acteurs sont impliqués dans le développement de cette maladie qui contrôlent, ensemble, à différents niveaux, la bonne organisation du réseau vasculaire sanguin. Pour comprendre le rôle de chacun de ces acteurs, on utilise des modèles de souris ne produisant plus certains de ces acteurs et on étudie les conséquences de cette perte sur les vaisseaux sanguins. Nous allons dans ce projet étudier les effets de la perte de ces acteurs sur les vaisseaux sanguins cérébraux par imagerie médicale. Cette technique nous permet de connaître de nombreux paramètres vasculaires et de voir les désorganisations des vaisseaux sanguins dans les souris malades. Cette étude pourra apporter un bénéfice certain dans le diagnostic des problèmes cérébraux des patients atteints de cette maladie.

Bénéfices attendus

Notre étude vise à identifier les conséquences de la perte de facteurs connus pour contrôler l’organisation des vaisseaux sanguins dans un organe encore très peu étudié, le cerveau avec une technique d’imagerie qui n’a encore jamais été utilisée sur ce type de souris. Ces facteurs sont à l’origine d’une maladie vasculaire génétique et les patients atteints de cette maladie ont parfois des problèmes de malformations vasculaires cérébrales. L’imagerie médicale apportera de nouvelles données d’imagerie qui auront un intérêt direct dans le diagnostic des atteintes cérébrales des patients.

Procédures

Des injections sont prévues pour induire la modification génétique mimant celle des patients (1 injection par jour pendant 3 jours). Deux imageries médicales maximum sont ensuite réalisées sur chaque animal au premier et au 6ème jour après cette première injection. Pour procéder à l’imagerie médicale, les animaux sont anesthésiés et un agent de contraste est injecté dans la veine de la queue. Chaque imagerie dure environ 1h.

Impact sur les animaux

Les injections induisent une douleur de quelques secondes lors de la piqûre. L'imagerie medicale nécessite une anesthésie générale le temps de l’examen. Les souris ne présentent pas de signes visibles de stress ou de souffrance, notamment aucune perte de poids ou modification de comportement n’ont été observées à l'âge où les expériences sont réalisées.

Devenir

Les protocoles nécessitent qu’à la fin de chaque procédure, tous les animaux soient euthanasiés, afin de récupérer les organes.

Remplacement

Le développement de cette pathologie fait intervenir plusieurs types cellulaires. Il n’est actuellement pas possible de recréer les interactions cellulaires entre tous ces acteurs in vitro. De plus, les cellules composant les vaisseaux sanguins ont un phénotype différent d’un tissu à l’autre. Cette différence est fondamentale mais non maintenue en culture. Afin de comprendre les mécanismes moléculaires qui conduisent aux malformations vasculaires cérébrales, nous devons avoir recours à l’expérimentation animale, les modèles in vitro n’étant pas adéquats.

Réduction

Nous avons utilisé un logiciel statistique, ainsi que les données de la littérature pour déterminer la taille des groupes nécessaires permettant de faire les tests statistiques nécessaires à la validation des données par la communauté scientifique. Dix souris par groupe seront nécessaires.

Raffinement

Les changements de litière, de biberon et l’apport d’alimentation sont pris en charge par les zootechniciens de façon quotidienne, y compris les week-end. Les cages contiennent des petites maisons et du matériel de nidification changé régulièrement comme dispositif d’enrichissement. Chez les souris adultes, une mise en place de point limite permettra de s’assurer du bien-être des animaux. L’imagerie médicale est réalisée sous anesthésie générale, avec un enregistrement des paramètres vitaux des souris (respiration rythme cardiaque). Pendant toute l’expérience, une échelle de cotation de douleur basées sur des signes indicatifs de gêne sera utilisée afin d’évaluer l’état général de chaque animal et de définir des points limites, permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l’animal. En cas de signe de douleur, des analgésiques seront administrés.

Choix des espèces

Les souris utilisées dans ce projet portent des modifications génétiques semblables aux mutations portées par les patients atteints de cette maladie. Elles constituent donc le meilleur modèle de la pathologie pour mieux comprendre les mécanismes de développement de cette pathologie et mieux développer des traitements. Les symptômes de cette maladie apparaissent à l’adolescence, nous allons étudier les phénotypes vasculaires à l’âge jeune adulte uniquement.

Issues du croisement de deux lignées transgéniques présentes dans le laboratoire et porteuses d'une fluorescence rouge dans les neurones de l'habénula, 80 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie stéréotaxique de trente à quarante minutes sous anesthésie générale, le temps d'injecter lentement un traceur dans le cerveau. L'inconfort attendu se limite selon le porteur aux sutures et disparaît avec la cicatrisation en 24 heures, les coordonnées d'injection ayant d'abord été calées sur des animaux morts. Deux à trois semaines plus tard, les 80 souris sont tuées pour prélever leur cerveau, mise à mort que le porteur qualifie d'"indispensable" et qui doit préparer des travaux ultérieurs sur d'autres souris transgéniques.

Objectifs

Ces dix dernières années, un nombre important de travaux précliniques ont adressé le rôle d’une structure particulière du cerveau, l’habénula, dans diverses pathologies psychiatriques, en particulier la dépression, ainsi que dans des processus de récompense/motivation, notamment associés à l’addiction. Les connexions de cette structure sont relativement bien connues car étudiées depuis plus de 50 ans par diverses approches anatomiques et dernièrement par des techniques de traçages génétiques. Cette structure de petite taille est cependant hétérogène, étant constituée de plusieurs types de neurones qui semblent impliqués de manière différentielle dans les diverses réponses émotionnelles et motivationnelles et qui définissent des compartiments dans l’habénula. Ainsi les objectifs des recherches actuelles par de nombreux laboratoires sont de précisément étudier ces divisions. Cependant, ces neurones ne forment pas une population homogène et, jusqu’à aujourd’hui, il n’y avait aucun marqueur afin de caractériser des populations spécifiques. Nous avons identifié un marqueur potentiel sous la forme d’une protéine : TBR1. En effet, nous avons identifié de nombreux neurones exprimant cette protéine dans le télencéphale basal et nous avons de bons arguments (développement) qui suggèrent qu’ils sont à l’origine de projections dans l’habénula. L’objet du projet est de confirmer la nature de ces neurones, les projections dans l’habénula et identifier certaines de leurs connexions. Ce travail est préliminaire à des études fonctionnelles plus poussées avec des modèles de souris transgéniques permettant de manipuler spécifiquement ces neurones, et donc qui permettront l'étude fonctionnelle de ces neurones dans le cadre de pathologies psychiatriques.

Bénéfices attendus

Nous serons à ma connaissance les premiers à identifier un phénotype chimique spécifique d’au moins une population de neurones spécifiquesprojetant dans l’habénula depuis le télencéphale basal. Ce travail ouvre la voie à des études ultérieures avec des modèles de souris TBR1 pour des études à la fois de traçage et fonctionnelles plus exhaustives. Ceci pourra donc déboucher sur des avancées significatives concernant le rôle de l’habénula dans diverses pathologies psychiatriques et notamment des formes résistantes de dépression.

Procédures

Les animaux recevront des injections ciblées de molécules nous permettant de déterminer l'endroit où les neurones ciblés envoient leurs axones. Cette technique nécessite une intervention chirurgicale de courte durée sous anesthésie générale et avec injection d'analgésiques. La durée de l’intervention est de 30 à 40 mn, essentiellement due au temps de l’injection sur plusieurs minutes.

Impact sur les animaux

Les expériences d’injection de traceurs neuronaux sont susceptibles d’entrainer un inconfort temporaire modéré, particulièrement au niveau des sutures. Cet inconfort disparait avec la cicatrisation en 24h. La douleur est prise en charge par des analgésiques.

Devenir

La mise à mort des animaux est indispensable pour le prélèvement du cerveau 2 à 3 semaines après la chirurgie

Remplacement

La nature anatomo-fonctionnelle de ce projet impose de travailler sur l’animal entier et ne peut s’envisager sur modèles in vitro. Le choix de la souris s'impose comme étant le modèle mammifère le plus adapté.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisé, les coordonnées stéréotaxiques seront déterminées initialement sur animaux morts. Le nombre d’animaux utilisés est déterminé par les données passées sur ce genre d’expérience par rapport à la taille de la région ciblée pour l’injection.

Raffinement

Le poids des animaux sera surveillé dans les trois jours suivant la chirurgie. Tout signe de douleur ou le développement d’un hématome sous cutané sera aussi recherché pendant cette période de trois jours. Si des signes de douleur sont apparents, celle-ci sera prise en charge par un analgésique. Si l’état de l’animal ne s’améliore pas à la troisième journée, une intervention du vétérinaire sera demandée. Afin de faciliter la récupération des animaux, les cages seront enrichies avec des dômes en carton et des nestlets pour permettre la confection d'un nid.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce est dicté par les données actuellement disponibles (Atlas pour les coordonnées d’injection et structures déjà décrites) et la présence de deux lignées transgéniques dans nos locaux. Nous utiliserons les souris issues du croisement de reproducteurs permettant une fluorescence rouge dans les neurones qui sont abondants dans l’habénula. Toutes les chirurgies s’effectueront sur animaux adultes.

Quatre chirurgies par animal pour implanter puis retirer un dispositif d'enregistrement cérébral et un plot de fixation de la tête, de trois à six heures chacune, et un contrôle alimentaire puis hydrique pour obtenir leur coopération: 4 macaques rhésus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les séances de tâche comportementale durent de une à trois heures, cinq jours par semaine, pendant une période pouvant atteindre un an et demi pour l'entraînement, autant ensuite pour les enregistrements électrophysiologiques. Le porteur ramène ce contrôle de la motivation à un "certain inconfort" et affirme que les animaux comprennent vite que leur coopération leur garantit leur ration journalière complète, avant de conclure qu'il est "impossible de répondre à la question du remplacement dans ce projet". Les implants seront retirés en fin de procédure et les quatre macaques doivent rejoindre un autre projet ou un lieu de retraite, ce que le porteur présente comme un raffinement majeur puisqu'il évite les analyses histologiques post-mortem.

Objectifs

Ce projet, se déroulant dans deux EU, vise à mieux comprendre le fonctionnement neurophysiologique d’un ensemble de structures cérébrales sous-corticales, les ganglions de la base, chez le primate non-humain lors de la prise de décision entre actions, comportement typique de la vie quotidienne aussi bien pour ces animaux que pour les humains. Au-delà de l’apport en connaissances fondamentales sur le fonctionnement cérébral, cette problématique représente un enjeu de santé publique car un dysfonctionnement des ganglions de la base est associé à de nombreux déficits neuropsychiatriques et neurologiques liés à la prise de décision et l’exécution de l’action, dont les troubles obsessionnels compulsifs, l’impulsivité et la maladie de Parkinson.

Bénéfices attendus

Dans notre vie quotidienne, nous devons continuellement faire des choix entre actions potentielles, que ces choix soient guidés par des stimuli sensoriels externes (feu rouge = appui sur la pédale de frein ; feu vert ; appui sur l’accélérateur), ou par des indices de valeurs acquis par l’expérience (mouvement du bras vers la droite pour prendre une tasse de café, ou à gauche pour prendre la bouteille de jus d’orange). Les mécanismes neuronaux sous-tendant ces sélections et exécutions d’actions sont donc sollicités en permanence mais malgré des décennies de recherche, leur compréhension reste incomplète et controversée. Les données de la littérature les plus récentes indiquent que les décisions entre actions seraient déterminées dans les mêmes structures que celles impliquées dans la préparation et l’exécution de l’action, le cortex sensorimoteur, selon un mécanisme computationnel comprenant un signal d’urgence qui pousse les sujets à agir en situation d’incertitude. Elles suggèrent également que les ganglions de la base (BG) fourniraient ce signal d'urgence, permettant l’ajustement du compromis vitesse-précision en fonction du contexte dans lequel la tâche est effectuée. De façon importante, les BG sont interconnectés avec de nombreuses aires corticales et il est aujourd’hui admis que la compréhension du fonctionnement de ces noyaux nécessite l’étude du réseau cortico-ganglion de la base dans son ensemble. Ce projet vise donc à tester l’hypothèse novatrice selon laquelle les ganglions de la base régulent la prise de décision et l’exécution de l’action en fournissant aux structures cérébrales, notamment corticales, responsables du choix de l’action un signal « énergisant » appelé urgence, permettant de choisir et d’agir au moment opportun et à la bonne vitesse. En soutient de cette hypothèse, une incapacité à décider au bon moment ou à agir avec la vitesse appropriée est caractéristique de nombreux troubles neuropsychiatriques et neurologiques basés sur un dysfonctionnement des ganglions de la base, tels que l’impulsivité, les troubles obsessionnels compulsifs ou la maladie de Parkinson.

Procédures

Les animaux recevront un entrainement sur une tâche comportementale avec renforcement positif (pastilles sucrées ou recompenses liquides) dans une salle de test (EU 1/2). Lors de cet entrainement, les animaux pourront être amenés à suivre un protocole de controle de la motivation pour les encourager à réaliser les séances comportementales. Nombre : les quatre animaux. Durée des sessions 1–3 heures. 5 jours par semaine. La durée de l'entrainement et du controle de la motivation associé dépendront de la capacité des animaux à apprendre à réaliser la tâche comportementale, mais n'excède généralement pas un an et demi. Les singes passeront également des IRM (EU 1/2) et des examen de tomodensitométrie (CT-scan) (EU 2/2) sous anesthésie générale. Nombre : 1 IRM & 3 CT par animal. Durée : IRM 1 heure, CT 30 min. Les singes passeront quatre chirurgies - pour l'implantation de dispositifs d'enregistrement neurophysiologique et le retrait de ces dispositifs (EU 1/2). Nombre : Tous les animaux. Durée : de 3 à 6 heures. En cas d'infection suspectée, des prélèvements sanguins seront effectués chez l'animal sous anesthésie afin d'évaluer son état immunologique. En outre, des prélèvements locaux pourraient être réalisés sur un animal vigile maintenu avec la tête fixe, si nécessaire, dans le but de caractériser les souches bactériennes responsables de l'infection et de déterminer le traitement antibiotique approprié. Les singes fourniront des enregistrements intracérébàraux lors des sessions d'enregistrements électrophysiologiques avec renforcement positif (jus de fruit) dans une salle de test (EU 1/2). Nombre : les quatre animaux. Durée des sessions 1–3 heures. 5 jours par semaine. Pour la réalisation de ces enregistrements électrophysiologiques, les animaux seront habitués à un protocole de contrôle hydrique. La durée des enregistrements électrophysiologiques et du controle hydrique associé dépendront de la capacité des animaux à réaliser la tâche comportementale, et à notre capactité à collecter les données neurophysiologiques nécessaires pour répondre aux questions du projet. Nous anticipons une durée n'excédant pas une année et demi.

Impact sur les animaux

Durant la phase d'entraînement à la tâche comportementale, l'application d'un contrôle de la motivation (controle alimentaire ou hydrique) pour motiver les animaux à travailler peut occasionner un certain inconfort. Toutefois, les animaux comprennent rapidement que leur coopération et la réalisation de la tâche leur garantissent l'accès à leur ration journalière complète et des friandises en bonus. Concernant les acquisitions de données IRM ou CT-scan, réalisées sous anesthésie générale, un inconfort lié à l’anesthésie (fatigue, nausées, vomissements) peut survenir au réveil de l'animal mais il s'estompe rapidement. Pour ce qui est des interventions chirurgicales (i.e. l'implantation du plot de fixation de la tête et du dispositif d'enregistrements électrophysiologiques), des douleurs post-opératoires peuvent être présentes. Cependant, une médication appropriée, incluant des analgésiques, des anti-inflammatoires et des antibiotiques si nécessaires, est mise en place en collaboration avec le vétérinaire pour les minimiser.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux pourront participer à un autre projet ou gagner un lieu de vie approprié pour leur retraite.

Remplacement

Il est de nos jours impossible de recueillir les données nécessaires à la réalisation de ce projet à partir d'expériences qui n'impliqueraient pas les animaux, et les primates non humains en particulier. En comparaisons à d’autres espèces animales, les expériences menées chez le singe macaque présentent plus de pertinence pour la compréhension des fonctionnements et disfonctionnement de la cognition et de l’action humaine en raison des capacités cognitives et motrices de cet animal très proches de celles de l’humain, et des similarités structurelles du cerveau entre les deux espèces. Il est donc impossible de répondre à la question du remplacement dans ce projet.

Réduction

Pour des questions de robustesse et de reproductibilité des résultats, chaque question posée doit être abordée en fournissant des données complètes sur plusieurs animaux, selon la pratique habituelle en électrophysiologie sur primate non humain. Ce projet a été planifié afin de maximiser la quantité de données que l’on peut obtenir avec chaque animal et donc minimiser le nombre d'animaux nécessaires à cette étude. Plusieurs types de données seront collectées sur chaque animal : comportementales, psychophysiques, électrophysiologie musculaire et neuronale. De plus, la technique d’enregistrement neurophysiologique employée pour ce projet, technique largement utilisée par de nombreux laboratoires et ayant demontré son efficacité pour caractériser l'activité cérébrale, permettra de collecter de nombreuses données en un minimum de temps, réduisant ainsi le risque de recours à des animaux supplémentaires afin de guarantir la puissance statistique des résultats.

Raffinement

L’animalerie dans laquelle les animaux seront hébergés est spécialement étudiée pour favoriser le bienêtre animal. L'animalerie dispose de lumière naturelle, de distractions grâce aux vues sur l'activité humaine, de contacts sociaux, d'activités quotidiennes et un espace plus vaste dans lequel les animaux peuvent non seulement bouger mais aussi s'échapper comme ils le feraient dans la nature en cas de tension entre eux. Le contrôle de la motivation des animaux est choisi afin d’avoir le moins d’impact possible sur leur bien-être (mise en place progressive et individualisée du contrôle de la motivation, par contrôle alimentaire en priorité et hydrique en dernier recours). Dans tous les cas, les singes seront incités à coopérer et participer aux manipulations par le biais du renforcement positif. Les enregistrements électrophysiologiques sont conçus pour supprimer les gênes quotidiennes associées à ce type de procédure et les implants chirurgicaux seront fabriqués « sur mesure » pour diminuer les risques de complications post-chirurgicales. La pose de ces implants sera faite sous anesthésie générale et contrôle antidouleur permanent, en condition aseptique stricte. La chaise dans laquelle les singes effectueront la tâche est large et de type « ouverte », conçue pour que la contention soit minimale. Le matériel permettant de mesurer et enregistrer le mouvement des yeux et la taille de la pupille est basé sur l’analyse d’images vidéo et ne constitue donc aucune gêne pour l’animal. Des CT scan seront réalisés une fois que le singe sera implanté avec le dispositif d'enregistrements électrophysiologiques, dans le but de vérifier la position des électrodes en superposant ces images aux clichés d'IRM anatomique de l'animal. Lors des examens d’imageries, l'animal ainsi que ses paramètres physiologiques sont surveillés pendant toute la durée de l’examen. Cette procédure constitue un raffinement majeur, puisqu'elle permet d'éviter des analyses histologiques post-mortem et évite donc la mise à mort des animaux à la fin des procédures. Enfin, les implants chirurgicaux seront retirés à la fin de la procédure et les animaux pourront participer à un autre projet ou gagner un lieu de vie approprié pour leur retraite.

Choix des espèces

Les expériences proposées dans ce projet reposent sur des questions qui peuvent seulement être résolues par des études chez le singe, et ce pour les raisons suivantes : La prise de décision entre actions et un comportement dit « interactif », qui nécessite souvent l’utilisation des bras et des mains guidés la vision pour atteindre et manipuler les objets qui nous entourent. Cette caractéristique exclue de fait le modèle rongeur (animaux se basant principalement sur l’olfaction pour l’exploration, comportement de transport des membres supérieurs et préhension pauvre) ainsi que les animaux plus anciens phylogénétiquement comme modèles préférentiels pour l’étude des bases neuronales de la prise de décision entre mouvements du bras dirigés vers un but. Les animaux sont utilisés à l'âge adulte ou jeune adulte (le developpement du cerveau doit être complet).

Tués à l'issue d'une sixième intervention menée sans réveil, pour prélever la trachée greffée et de la muqueuse nasale, 20 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit six chirurgies sous anesthésie générale sur 56 jours, dont une de quatre à cinq heures, avec un prélèvement de 50 mL de sang à chaque anesthésie. Le porteur attend des douleurs cervicales de cinq à six jours, des troubles de la déglutition, un risque d'infection du site opératoire et, pour les animaux porteurs d'un stent, des difficultés respiratoires si le dispositif se déplace. Il décrit le remplacement trachéal chez l'humain comme une impasse thérapeutique et conclut que le recours à l'expérimentation animale est "indispensable" avant tout essai clinique.

Objectifs

En chirurgie des voies aériennes pédiatriques, les maladies nécessitant d’enlever une grande partie de la trachée sont des impasses thérapeutiques. En effet, une résection étendue nécessite un remplacement trachéal dont la technique chirurgicale n’est pas maitrisée à ce jour. De nombreuses techniques de remplacement ont été publiées chez l’adulte et l’enfant, avec des suites opératoires compliquées. Le remplacement trachéal reste exceptionnel. Néanmoins, la problématique clinique demeure. Notre équipe a fait le choix d’un projet de recherche de remplacement trachéal avec un procédé de décellularisation. L’objectif du projet est l’évaluation in vivo de ce remplacement de trachée par une étude comparative de la survie sans événement respiratoire et de l’aspect endoscopique après remplacement trachéal avec et sans stent trachéal.

Bénéfices attendus

A ce jour, il n’y a pas d’étude comparative de l’évolution clinique et endoscopique d’un modèle vivant de gros animal après un remplacement trachéal. Cette étude comparative permettra d’analyser d’une part les événements cliniques et endoscopiques survenant dans les suites à court et moyen termes, avec ou sans stent trachéal, et d’autre part les processus cellulaires, tissulaires et systémiques sous-jacents. Les différences attendues, dans le groupe avec stent par rapport au groupe sans stent, sont une diminution des événements respiratoires obstructifs par fragilisation de la trachée et diminution du calibre de la trachée. Les bénéfices à long terme seront la preuve de concept de la fiabilité du remplacement trachéal par décellularisation et la possibilité d’une étude du remplacement trachéal chez l’homme. De plus, des résultats positifs permettront également d’envisager la technique pour des indications différentes

Procédures

20 porcs auront six interventions chirurgicales sous anesthésie générale. La première intervention dure 60 minutes. La deuxième dure 240 à 300 minutes. Les troisième, quatrième, cinquième interventions durent 30 minutes. La sixième intervention dure 90 minutes et est sans réveil. Un prélèvement sanguin de 50 mL sera réalisé lors de chaque anesthésie générale. Les interventions auront lieu sur une période de 56 jours.

Impact sur les animaux

La première intervention peut être génératrice de stress et de douleur modérée dont la durée prévisible est de 3 à 4 jours. L’infection du site opératoire est une complication potentielle. Le prélèvement du muscle peut entrainer des douleurs modérées à la mobilisation de la tête. Il n’y pas de trouble de déglutition attendu. La perte de poids, sauf cause infectieuse, n’est pas attendue. La deuxième intervention peut être source de difficulté à respirer soit aiguë, soit progressive dans le temps. Il n’y a pas de risque hémorragique attendu. Des douleurs modérées sont attendues au site opératoire cervico-trachéal, d’une durée prévisible de 5-6 jours. Le prélèvement musculaire peut entraîner des douleurs modérées à la mobilisation de la tête. Le geste trachéal peut générer des troubles modérés de la déglutition. Les difficultés majeures d’alimentation ne sont pas attendues. Des douleurs cervicales légères à modérées sont attendues après les interventions 3, 4, et 5, d’une durée prévisible d’un à deux jours. Pour les animaux qui seront porteurs de stent trachéal, une mobilisation du stent peut également être cause de difficulté à respirer.

Devenir

Les 20 animaux seront mis à mort à l’issue de la sixième intervention pour prélèvement du complexe trachée native-matrice trachéale implantée, et pour prélèvement de muqueuse nasale.

Remplacement

Le remplacement n’est pas possible car l’étude porte sur le remplacement trachéal circonférentiel au sein d’un organisme vivant complexe (avec une anatomie proche de celle de l’homme). Il n’y a ni modèle in vitro ni modèle in silico. Par ailleurs, cette étude n’a pas été rapportée par une autre équipe à ce jour. Le recours à l'expérimentation animale est indispensable pour ce projet avant la réalisation d’essais cliniques chez l’homme.

Réduction

Nous avons déjà débuté les études chirurgicales d’implantation sterno-céphalique sur des porcs vivants. Ces chirurgies nous ont permis d’affiner et de perfectionner les techniques chirurgicales au préalable, et d’étudier la sécurité de cette intervention. Le nombre total d’animaux a été calculé́ en respectant les critères pour une analyse statistique non paramétrique par échantillons appariés. Les extrémités du remplacement seront conservées pour études histologiques, immunologiques et biomécaniques. Les prélèvements non utilisés seront cryopréservés ou fixés pour une possibilité d’étude rétrospective sans recourir à de nouvelles expérimentations animales. Enfin lors de la mise à mort, sur le principe de la mutualisation des prélèvements, d’autres tissus du porc pourront également être mis à disposition de nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés, de manière globale, en expérimentation animale.

Raffinement

La méthodologie utilisée nous permettra d’assurer l’absence de souffrance inutile et le bien-être des animaux. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi). Le vétérinaire référent du Laboratoire passera une fois par semaine et à la demande des zootechniciens si besoin. Durant les périodes post-opératoires immédiates, le suivi des animaux est quotidien à l’aide d’une grille de suivi des points limites définis a priori (dyspnée, alimentation, perte de poids, douleur). Les animaux auront un traitement antalgique adapté. Afin d’éviter une surinfection de la zone de greffe, une antibioprophylaxie systématique sera administrée. En cas de signes externes de souffrance (perte de poids, prostration, fièvre) ou de difficulté aiguë à respiratoire sans traitement possible, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Parmi les différents modèles animaux envisageables (rongeurs, lapins, chèvre, mouton, porc), le porc a une trachée dont les caractéristiques anatomiques et biomécaniques se rapprochent le plus de celle de l’homme. De plus, des modèles de porcs sont déjà utilisés dans d’autres études de remplacement trachéal. Enfin, l’immunologie du cochon est bien connue. Cette connaissance établie facilitera notre analyse de la réaction inflammatoire potentielle sur le site de greffe. Animaux matures sexuellement pour limiter la croissance des tissus, plus intense chez les animaux en croissance (juvéniles). L'âge est relativement secondaire en revanche nous visons des animaux dont le poids est stabilisé entre 45 et 60 kg. Cette stabilité (relative) du poids est habituellement atteinte entre 12 et 18 mois.

Pour savoir si des infections répétées altèrent la mémoire des cellules souches du sang, 1288 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyse. Elles reçoivent jusqu'à dix injections intrapéritonéales espacées de quatre semaines, un gavage, une injection intratrachéale sous anesthésie gazeuse, une irradiation myéloablative suivie d'une greffe de moelle osseuse dans le sinus rétro-orbitaire, puis jusqu'à cinq prélèvements sanguins au même endroit entre 4 et 20 mois. Le porteur indique une fatigue, une hypothermie légère, un inconfort respiratoire et une perte de poids pendant deux à quinze jours, ainsi qu'une douleur des poumons, de l'œsophage ou de l'œil. Une seule phrase justifie l'effectif de 1288 animaux, celle d'une évaluation destinée à obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Objectifs

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont responsables de la production et du renouvellement continu de toutes les cellules sanguines. Les CSH peuvent reconnaître les signaux produits en réponse à des infections et produire plus de globules blancs, responsables de la lutte contre l'infection. Cette reconnaissance induit également une mémoire qui leur permet d'avoir une réponse plus efficace lors d'une seconde infection. Nous étudions comment des stimuli mimant des infections répétées peuvent affecter cette mémoire et si cela peut avoir un impact sur la capacité des CSH à produire les cellules du sang.

Bénéfices attendus

La mémoire immunitaire innée a un intérêt thérapeutique car elle permet une protection large et non spécifique contre différentes infections et pourrait être utilisée comme vaccin. Cette mémoire ayant été récemment mise en évidence dans les cellules souches hématopoïétiques, cellules générant les cellules sanguines, il est important d’en connaître toutes les conséquences sur leur fonction afin d’éviter une déficience de l’hématopoïèse. Ce projet a donc un bénéfice important d'un point de vue fondamental.

Procédures

Les procédures utilisées sont les suivantes : multiples injections de molécules en intrapéritonéale (toutes les 4 semaines, jusqu'à 10 injections maximum) sur souris vigiles, injection permettant l'expression d'une molécule fluorescente par une unique ingestion par gavage sur souris vigiles, injection en intratrachéale (unique) sous anesthésie gazeuse, transplantation de moelle osseuse par une unique injection intraveineuse dans le sinus rétro-orbital après traitements myéloablatifs (une unique dose d'irradiation), injection de molécule (unique) ou prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse dans le sinus rétro-orbital (répété tous les mois, de 4 à 20 mois avec un maximum de 5 prélèvements).

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent présenter des signes de stress liés à leur contention. Les procédures sont classées modérées en raison de la répétition des gestes expérimentaux et de l’inconfort que peut ressentir l’animal après des injections mimant une infection ou après une myéloablation. Elles peuvent entraîner, selon les procédures, une fatigue, une légère hypothermie, un inconfort respiratoire et une perte de poids pendant 2 à 15 jours. Les souris peuvent présenter une douleur légère à modérée au niveau des poumons, de l’œsophage ou de l’œil pendant une durée de 5 minutes, minimisée par des antalgiques et des anesthésiques.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure en vue d'analyses.

Remplacement

Dans ce projet, nous souhaitons déterminer si la mémoire immunitaire des CSH est modifiée par le nombre de stimulations auxquelles elles peuvent répondre et si cela impacte sa fonction. L’inflammation que nous induisons est une réponse immunitaire intégrant des systèmes de communication cellulaires complexes (endothélium, système lymphatique et vasculaire, système neuronal) que l’on ne peut actuellement pas reproduire in silico, ni in vitro, ni ex vivo. De plus, il est impossible à ce jour de maintenir des CSH en culture sans induire leur activation et leur différenciation. Pour une étude longitudinale comme c’est le cas ici, nous n’avons pas d’autre choix que d’utiliser le modèle in vivo. Dans ce sens, le modèle murin est particulièrement bien adapté à ces différentes problématiques. Il n’y a donc pas d’alternative actuellement à l’utilisation des souris pour atteindre l’objectif de ce projet. Cependant, des tests de stimulation et des étapes finales d’analyse de différenciation ont/pourront être effectués afin de limiter son utilisation.

Réduction

Le nombre maximum de souris nécessaires (n=1288) a été évalué afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les expérimentations seront réalisées en veillant à réduire, supprimer ou soulager tout inconfort, douleur ou angoisse subis par les souris afin d'améliorer leur bien-être. Pour cela, les procédures seront effectuées sous anesthésie, dans des conditions stériles, et si nécessaire et si possible, un analgésique et un antibiotique sera administré. L'état de santé des souris sera surveillé quotidiennement à l'aide d'une grille d'évaluation de la douleur, permettant de déterminer les niveaux de douleur afin de prendre les mesures nécessaires pour la limiter. Tout au long de l'étude, les souris seront hébergées dans des conditions conformes à la réglementation européenne en vigueur. Cela inclut un environnement contrôlé avec une température et une ventilation régulée, une lumière suivant un cycle de 12 heures, et une hygrométrie adaptée. Les souris auront un accès constant à la nourriture et à l'eau. Elles seront maintenues en groupes de 3 à 5 animaux par cage. Leur environnement sera enrichi avec des dômes en carton ou du coton.

Choix des espèces

Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme. Animal de petite taille et à reproduction rapide. Bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. De nombreuses souches d'animaux génétiquement modifiés permettant de poser les questions biologiques qui nous intéressent existent déjà. Nous utiliserons dans ce projet des souris adultes jeunes (entre 6 semaines et 20 semaines au moment du début de la procédure) et âgées (entre 18 et 27 mois).

1 204 souris vont être utilisées dans ce second volet, chacune passant deux mois de sessions quotidiennes de quarante minutes, la tête immobilisée dans un dispositif de contention, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux opérations du crâne précèdent l'entraînement, la seconde durant jusqu'à deux heures. La tâche apprise repose sur une récompense en eau, obtenue en rationnant les souris à la moitié de leur consommation habituelle, avec une pesée quotidienne destinée à ce que la perte de poids ne dépasse pas 10 %. Toutes sont tuées et leur cerveau prélevé, l'objet déclaré étant de comprendre les altérations sensorielles de l'autisme et de tester une molécule déjà passée en essai clinique chez l'humain.

Objectifs

L’autisme est un trouble neurodéveloppemental caractérisé par des déficits sociaux, des comportements répétitifs et les altérations sensorielles. Il est estimé qu'à l'échelle mondiale, environ un enfant sur 34 est atteint d'autisme. Malgré la prévalence de l’autisme, les mécanismes neurobiologiques responsables des changements du comportement ne sont pas bien compris. Une meilleure compréhension de la neurobiologie de l’autisme est cruciale pour la gestion des symptômes des personnes autistes, le développement d'approches thérapeutiques innovantes, ainsi que pour l’amélioration du diagnostic. L'objectif de ce projet est d’utiliser des souris génétiquement modifiées, possédant les traits de l’autisme, pour étudier de manière plus approfondie les altérations neuronales dans l’autisme. Dans cette étude, qui se déroule dans 2 établissements utilisateurs, nous avons donc choisi de nous concentrer sur deux régions du cerveau qui sont similaires entre la souris et l'homme. Nous proposons de développer et d'utiliser une nouvelle expérience comportementale visant à identifier à la fois les altérations comportementales et les modifications physiologiques cérébrales dans ces souris modèles de l’autisme. Ces mesures nous permettront de tester quels mécanismes cellulaires peuvent être responsables des altérations comportementales liées à l'autisme. Finalement, nous pourrons tester grâce à cette tâche comportementale, si une intervention pharmacologique ciblant ces mécanismes peut corriger les altérations comportementales présentes au niveau sensoriel dans l’autisme. Nous utiliserons pour cela, une molécule expérimentale qui a déjà été testée dans des essais cliniques chez l'homme et dont le profil de sécurité et la pharmacocinétique sont bien définis.

Bénéfices attendus

Des études de dépistage à grande échelle menées aux États-Unis suggèrent que la prévalence de l'autisme est de 1 enfant sur 34. Bien qu'il n'existe pas d'études de cette ampleur en Europe, la prévalence de l'autisme est probablement similaire. Les symptômes sensoriels affectent la grande majorité des personnes atteintes d'autisme et ont des conséquences fortement négatives sur leur vie quotidienne. Par exemple, ils pourront avoir des difficultés pour s’intégrer dans une classe bruyante, des difficultés pour manger certains aliments ou pour porter certains vêtements. Ces symptômes sont une source majeure de stress pour les familles concernées. La compréhension des processus neurophysiologiques qui sont à l’origine de ces difficultés sensorielles peut apporter des informations importantes sur la façon dont le fonctionnement du cerveau est altéré dans l'autisme. De telles études peuvent conduire à l'identification des mécanismes moléculaires, cellulaires et cérébrales qui sont responsables des perturbations sensorielles, révélant ainsi de nouvelles cibles pour le développement de traitements pharmacologiques visant à améliorer des symptômes tels que la surcharge sensorielle ou l'hyper/hypo-réactivité sensorielle. De telles études nécessitent des approches invasives et des manipulations qui ne sont pas possibles dans un cadre clinique. Nous pensons que notre étude permettra de mieux comprendre les types de cellules et les circuits impliqués dans l'altération de la perception multisensorielle. Elle fournira des biomarqueurs précliniques pour l'évaluation de nouveaux médicaments expérimentaux. Elle nous permettra d'évaluer l'efficacité d'un médicament expérimental existant qui a été proposé comme traitement de l'autisme. Notre étude a le fort potentiel de fournir des informations qui, à terme, amélioreront la vie des personnes diagnostiquées autistes. Ces connaissances peuvent également renforcer l'autonomie et le bien être des personnes autistes en leur permettant de comprendre pourquoi elles se sentent comme elles le font dans certaines situations.

Procédures

Tous les animaux inclus dans les expériences comportementales seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie : la première durera environ 45 à 90 minutes, et la deuxième durera de 90 à 120 minutes (EU « A »). Pour comprendre les mécanismes neurobiologiques sous-jacent de l'autisme, les animaux apprendront à effectuer une tâche comportementale non aversive et non douloureuse, basé sur les récompenses, pendant 45 minutes par jour (EU « B »). En même temps, nous effectuons des mesures de l'activité des neurones du cerveau (EU « B »). Afin de permettre ces enregistrements, les animaux sont entraînés à accepter une contention partielle (immobilisation de la tête). Pour s'assurer que les animaux ne ressentent ni stress ni anxiété, ils seront progressivement habitués à l'installation et à l’immobilisation de leur tête d’une minute à 35 minutes, pendant 5 jours (EU « B »). Cela permet aux animaux d’apprendre que cette immobilisation est réversible et non douloureuse. Lorsqu'ils seront à l'aise avec le dispositif (pas de signes de détresse, capables de manger et boire), l'entraînement à la tâche comportementale commencera. Chaque session de travail comportemental dureras 40 minutes, et les sessions seront répétées quotidiennement pendant 2 mois (EU « B »). Tous les animaux inclus dans les expériences visant à définir l'activité du cerveau hors cadre comportemental seront soumis à une intervention chirurgicale sous anesthésie et analgésie, qui durera 90 minutes (EU « A »). Pour s'assurer que les animaux ne ressentent ni stress ni anxiété, ils seront progressivement habitués à l'installation et à l’immobilisation de la tête d’une minute à 35 minutes, pendant 5 jours (EU « B »). Cela permet aux animaux apprendre que cette immobilisation est réversible et pas douloureuse. Lorsqu'ils seront à l'aise dans le dispositif (pas de signes de détresse, capables de manger et boire), l’enregistrement de l’activité du cerveau commencera (EU « B »).

Impact sur les animaux

1) Chirurgies: Les animaux seront soumis à des interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie. Le risque d'inconfort, de douleur, d'infection et/ou de perte de poids est inhérent à ces procédures. 2) Immobilisation partielle : L’enregistrement de l’activité neuronale des différents groupes des neurones nécessite de maintenir la tête de l'animal dans une position fixe. Cette méthode n'est pas douloureuse et est bien établie dans la littérature, mais elle provoque un malaise pendant les premiers séances. 3) Restriction hydrique : Notre tâche comportementale nécessite la mise en place d’une récompense. Après notre étude précédente, nous avons choisi une récompense hydrique (nécessitant la restriction de l’eau). La perte de poids (10 % du poids initial de l'animal) ne peut être évitée car les souris reçoivent une ration d'eau correspondant à 50 % de leur consommation d'eau ad libitum.

Devenir

Toutes les souris seront euthanisiées et leurs cerveaux seront prélevés pour des analyses post-hoc.

Remplacement

Les expériences proposées dans cette étude nécessitent des circuits neuronaux intacts et des mesures à la fois physiologiques et comportementaux. Un modèle animal est absolument nécessaire pour reproduire la complexité de ces interactions neuronales et ne peut pas être remplacé par les études in vitro ou in silico. Les études cliniques ne sont pas adaptées à notre objectif expérimental des approches invasives sont nécessaires pour répondre à notre question scientifique. Les circuits neuronaux sont bien conservés chez les différentes espèces mammifères et sont donc susceptibles d'être fonctionnellement similaires chez les rongeurs et les humains. L’utilisation des modèles de plus faible sensibilité neuronale (tels que la mouche à vinaigre) n’est pas adaptée non plus à notre projet, car cet organisme ne possède pas la structure cérébrale ciblée par notre étude.

Réduction

Une conception expérimentale minutieuse garantira la reproductibilité des résultats et, avec des techniques d'analyse statistique appropriées, l'utilisation d'animaux sera réduite au minimum. Les protocoles comportementaux, physiologiques, et pharmacologiques ont déjà été mis en place pour une étude précédente sur la perception tactile. Une première étude pilote a été réalisée pour modifier les protocoles comportementaux pour étudier la perception multisensorielle. Cette première étude nous a permis de déterminer le nombre d'animaux nécessaires pour réaliser ces expériences et avoir des résultats statistiquement valides. Cela nous a permis d'assurer la crédibilité de nos résultats avant de procéder à l'étude principale. Les données comportementales, physiologiques, et pharmacologiques seront recueillies auprès des mêmes animaux. Les injections du traitement seront précédées par les injections contrôles dans les mêmes animaux. Toutes les expériences seront réalisées par groupe de 6 à 8 souris, et notre stratégie sur le nombre des souris nécessaire sera adaptée aux résultats. Ces mesures nous permettront de réduire le nombre d'animaux utilisés dans l'étude et de mesurer simultanément plusieurs paramètres.

Raffinement

Tous les résultats scientifiques sur les facteurs influençant le bien-être des animaux ainsi que la capacité des animaux à ressentir et à exprimer la douleur, la souffrance, l'angoisse et les dommages durables seront pris en compte. Les expériences seront conçues et réalisées de la manière la plus éthique possible. Des souris transgéniques seront utilisées pour explorer les déficits multisensorielles dans les modèles de souris d’autisme, et aucune souffrance inhérente n'y est associée. Le bien-être des animaux est impératif pour cette étude. Afin de garantir le moins de gêne et de souffrance pour les animaux, le matériel adéquat sera mis à disposition des personnes autorisées, compétentes et dûment qualifiées, qui respecteront rigoureusement les procédures mises en place. Pour les chirurgies: Utilisation d'anesthésiques, d'analgésiques, d'un anti-inflammatoire, d'une crème pour les yeux et d'un tapis chauffant pour maintenir la température de l'animal. Tous les animaux seront manipulés en utilisant les techniques les moins stressantes possibles, conformément à la littérature : l'utilisation d'un tunnel ou des mains en forme de coupe. Les animaux seront transférés entre les deux sites dans leurs cages d'origine, pendant leur phase active, et placés dans l'obscurité à l'intérieur d'un chariot. . Pendant la restriction en eau, les animaux seront pesés chaque jour, et leur alimentation en eau sera ajustée afin de s'assurer qu'ils ne dépassent jamais une perte de poids de 10 %. Un tube et du matériel de nidification seront placés dans chaque cage afin de garantir la poursuite de tous les comportements normaux de l'animal. Les animaux seront placés dans des cages collectives afin de garantir des interactions sociales. L'hydrogel qui sera fourni comme source d'eau est considéré comme un enrichissement car les animaux le manipulent abondamment avec leurs pattes avant. Les animaux seront habitués à la pièce d’expérimentation. Les animaux seront progressivement habitués à la fixation de la tête pour garantir un stress minimal. Tous les animaux exploreront librement l'installation avant et après chaque session, en marchant et en grimpant sur ses différentes parties. Les stimulations tactiles et auditives utilisées pendant la tâche comportementale ne sont pas douloureuses et ne provoquent pas des crises d’épilepsie. Des points limites spécifiques et des mesures conservatrices pour chaque phase de la procédure sont définis.

Choix des espèces

L’utilisation des souris transgéniques a été privilégiée pour rester cohérent avec les études antérieures effectuées au sein de notre équipe. Les rongeurs ont des systèmes somatosensoriel et auditif très développés et sont considérés comme une espèce modèle pour les études concernant le traitement de certains types d'informations sensorielles. De plus, à ce jour la souris est la seule espèce de mammifère pour laquelle il est possible, facilement, de modifier le génome afin de créer des modèles de maladies humaines. L'étiologie de l'autisme a une forte base génétique. Les modèles transgéniques impliquant la manipulation (suppression ou modification des gènes à haut risque pour l'autisme) sont considérés comme les modèles ayant une forte « valeur de construction ». Conformément aux études précédentes, pour explorer le comportement en même temps que l'activité cérébrale, les souris auront 4-5 semaines au début des chirurgies, 8-9 semaines au début de la tâche comportementale. Pour l'exploration de l'activation du cervelet, les souris auront 10 -12 semaines au début de la procédure.

L'extrémité de la queue coupée et le saignement observé jusqu'à trente minutes, puis la carotide mise à nu et ponctionnée, le saignement observé vingt minutes encore : 32 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les mêmes animaux subissent les deux épreuves, ce que le porteur présente comme une mesure de réduction. Le projet cherche à mesurer le rôle d'une enzyme, la PKC theta, dans l'arrêt du saignement, avec l'espoir lointain de traitements antiplaquettaires plus sûrs pour les patients. Toutes les souris sont tuées, la ponction de la carotide et la perte de sang qu'elle entraîne étant, selon le porteur, incompatibles avec un réveil.

Objectifs

L’hémostase est le processus biologique assurant l’arrêt des saignements. Elle implique notamment les plaquettes sanguines, qui, suite à une lésion vasculaire, adhèrent, s’activent et agrègent pour former un caillot qui bouche la lésion vasculaire. Ce processus implique différents récepteurs des plaquettes. Des études récentes suggèrent un rôle de la protéine kinase C (PKC) theta dans les voies de signalisation des certains de ces récepteurs. Le but de ce projet est d’évaluer le rôle de la PKC theta dans l’hémostase en évaluant l’impact de son absence ou de la présence d’une PKC theta humaine dans des modèles d’hémostase chez la souris.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont de mieux comprendre le rôle de la PKC theta dans l’arrêt du saignement. Les récepteurs comprenant la PKC theta dans leur voie de signalisation sont impliqués dans l’arrêt du saignement mais également en thrombose artérielle. Un bénéfice à long terme de ce projet pourrait être le développement de nouveaux traitements antiplaquettaires impactant peu l’arrêt du saignement, et donc plus sûr pour le patient que les traitements actuellement disponibles.

Procédures

Les animaux anesthésiés sont soumis à un temps de saignement à la queue (coupure de l’extrémité de la queue et observation du saignement jusqu’à son arrêt, maximum 30 min) et à une exposition de la carotide avec un temps de saignement à la carotide (ponction de la carotide et observation du saignement pendant 20 min).

Impact sur les animaux

Pour toutes les procédures, une des nuisances attendues est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée) ainsi que le risque de saignement au site d’incision.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure car une ponction de la carotide, et la perte de sang importante qui en découle, n’est pas compatible avec un réveil de l’animal.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’étudier le rôle de la PKC theta dans l’arrêt du saignement. Ce processus étant particulièrement complexe et faisant intervenir plusieurs types cellulaires (plaquettes, globules rouges, globules blancs) ainsi que les conditions d’écoulement du sang (vaisseau, pression artérielle, flux sanguin), les modèles in vitro ne sont pas assez sophistiqués pour en reproduire toute la complexité. De plus, il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle d’arrêt du saignement in vitro.

Réduction

Le projet se fera par étapes. Les mêmes animaux seront utilisés pour les 2 modèles de temps de saignement afin de réduire le nombre d’animaux nécessaire. Ce nombre est fixé à 8 souris/groupe pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Les effectifs sont calculés selon notre expérience sur les modèles d’hémostase, le critère recherché étant la comparaison de moyennes (temps d’arrêt du saignement, volume de sang perdu).

Raffinement

Une période d’acclimatation de 2 semaines entre l’arrivée des souris à l’animalerie et leur utilisation sera respectée. Les animaux seront habitués à la contention pour faciliter l’injection IP d’anesthésiant. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum: • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 3 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. • Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de l’expérimentation • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée à 38°C afin lutter contre l’hypothermie pendant l’expérimentation ainsi que son réveil en boite à 37°C • Par l’injection d’analgésique avant chaque procédure. • Par application de gel sur les yeux lors de l’anesthésie afin de les protéger. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.

Choix des espèces

La souris est un animal pour lequel les modèles d’études in vivo sont largement maitrisés et caractérisés, notamment les modèles d’arrêt du saignement. De plus, les techniques de mutation génétique ont permis de générer des souris déficientes pour le la PKC theta ou exprimant la PKC theta humaine, nous permettant ainsi d’évaluer leur rôle respectif dans l’arrêt du saignement. Les souris seront utilisées au stade adule entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris adultes et ne présentant pas encore de vieillissement.

Gavage quotidien, trois injections dans l'abdomen par semaine ou implantation d'une pompe sous la peau, radiographies sous anesthésie, deux heures en cage métabolique et prélèvement de sang par ponction du cœur : 284 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet teste trois inhibiteurs déjà développés pour d'autres maladies sur un modèle murin d'ostéopathie striée avec sclérose crânienne, maladie osseuse rare sans traitement. Le porteur écrit n'envisager "aucun autre dommage" que la manipulation et l'isolement, puis conclut avec la structure chargée du bien-être des animaux non-humains que l'accumulation de ces nuisances légères occasionne une souffrance modérée. Toutes les souris sont tuées pour prélever leurs os et leur cæcum, et le porteur affirme qu'aucune alternative ne remplace le traitement d'un "organisme entier".

Objectifs

L’ostéopathie striée avec sclérose crânienne (OSSC) est une maladie osseuse génétique caractérisée par une augmentation de la formation osseuse par suractivation des ostéoblastes, cellules fabriquant le tissu osseux. Cette activation incontrôlée des ostéoblastes est due à une mutation d'un gène particulier. Les patients présentent du fait de la formation osseuse exagérée, des compressions de structures vasculaires et nerveuses, notamment au niveau du crâne, de la mâchoire ou encore du rachis. Il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement à proposer aux patients, qui subissent des interventions chirurgicales à répétition pour lever ces compressions. Un modèle murin de la pathologie a été généré. L’objectif de ce projet est de tester dans le traitement de l’OSSC 3 molécules qui ont déjà été développées et utilisées dans le traitement d’autres pathologies. Grâce à nos précédents travaux, nous avons défini la fenêtre thérapeutique à laquelle nous allons tester 3 inhibiteurs pour traiter les conséquences de la mutation dans le modèle murin de l'OSSC. Entre 8 et 11 semaines, les animaux mutés seront traités avec l'un des trois molécules. A l’issue de ces trois semaines de traitement, les conséquences de l'utilisation de ces 3 molécules seront évaluées par l’analyse du phénotype osseux (analyse par radiographie et microtomographie de l'architecture osseuse).

Bénéfices attendus

L’OSSC est une maladie rare caractérisée par une augmentation de la densité osseuse s’accompagnant de compressions vasculaires et nerveuses. Cette pathologie, causée par des mutations dans un gène identifié et impliqué dans une voie de signalisation impliquée dans le développement osseux, ne bénéficie pour le moment d’aucun traitement efficace. L’objectif de ce projet est de tester dans le traitement de l’OSSC 3 inhibiteurs de cette voie de signalisation déjà développés et utilisés dans le traitement d’autres pathologies. Si l’un ou plusieurs de ces inhibiteurs se révèlent efficaces, ces travaux permettront d’entamer les démarches pour le repositionnement de ces inhibiteurs dans le traitement de l’OSSC.

Procédures

L’identification d’un potentiel traitement pour l’OSSC nécessite soit 3 injections intrapéritonéales par semaine, soit l’implantation de pompes osmotiques soit le gavage quotidien des animaux. A l’initiation du traitement, à mi-chemin et à la fin du traitement, le phénotype osseux des souris est exploré par un examen radiographique qui nécessite une anesthésie et qui dure 5 minutes, 2 h maximum d'isolement en cage métabolique pour le recueil d'urines pour l’analyse des marqueurs osseux urinaires, l’injection de 2 molécules pour analyser la formation dynamique de l’os (2 minutes par injection) et enfin, le prélèvement sanguin intracardiaque pour l’analyse des marqueurs osseux sanguins.

Impact sur les animaux

Aucun autre dommage que d’être manipulé pour l’injection (anesthésies et injections de fluorochromes) et isolé pendant 2h maximum n’est envisagé dans le cadre de la caractérisation du phénotype osseux. Les injections, peuvent éventuellement provoquer une gêne très passagère mais qui ne nécessite pas de médication particulière. Cependant, en concertation avec la SBEA locale, nous estimons que l'accumulation de nuisances légères occasionne une souffrance modérée.

Devenir

Les animaux concernés par cette procédure sont mis à mort pour réaliser des prélèvements post-mortem des os et des caecum qui permettront de caractériser le phénotype osseux et de définir une fenêtre de traitement.

Remplacement

L’OSSC est une maladie rare caractérisée par une augmentation de la densité osseuse s’accompagnant de compressions vasculaires et nerveuses. Cette pathologie, causée par des mutations dans un gène identifié et impliqué dans une voie de signalisation impliquée dans le développement osseux. La culture de cellules mutées in vitro a déjà fourni des informations sur les voies de signalisation impliquées dans le développement de cette pathologie mais toutes ces études préalables in vitro sont menées sur des cellules de patients. Or, ces derniers ne peuvent être diagnostiqués que quand l’ostéosclérose est déjà installée, celle-ci n’apparaissant que lorsque le gène est muté. C’est pourquoi un modèle de souris où le gène est invalidé a été généré. Ce modèle nous a permis de définir la fenêtre thérapeutique (entre 8 et 11 semaines) où les animaux vont être traités. Aucune alternative ne peut remplacer le traitement systémique d’un organisme entier, ici le modèle murin de la maladie, par des inhibiteurs de cette voie de signalisation.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques. Leur nombre (284) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires à l’éventuel repositionnement d’inhibiteurs déjà existants pour d'autres applications dans le traitement de l’OSSC. L’analyse initiale du modèle à 6 semaines ainsi que nos travaux précédents permet d’estimer la puissance statistique de nos analyses et l’échantillonnage nécessaire pour caractériser les effets biologiques souhaités.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans les conditions standards de l’animalerie. L’utilisation de pompes osmotiques remplace les injections intra-péritonéales ou sous cutanées quotidiennes et réduit donc le stress que représentent la contention et les injections nécessaires sur des périodes prolongées. Le volume libéré par les pompes est beaucoup plus faible que lors d’une injection, puisqu’il diffuse au cours de la journée, et la pompe contient un volume nécessaire pour un traitement chronique sur 4 semaines. Ainsi cela nous permettra de nous affranchir de la clairance et de la demi-vie de la molécule testée. Ce mode d'administration est un mode que nous souhaiterions développer au sein du laboratoire pour limiter le stress des animaux. Sous anesthésie gazeuse, les pompes seront placées sur le côté de l’animal, sous la peau, après avoir effectué une légère incision, puis suturé à l’aide d’agrafes chirurgicales. Ce mode de suture est préféré aux points de sutures avec un fil chirurgical en raison de sa solidité dans le temps et de sa rapidité à mettre en place de manière à diminuer le temps d'anesthésie de l'animal. Les animaux se verront administrer un analgésique au moyen d’une injection sous cutanée ou en intra-péritonéale toutes les 12h pendant 2 jours. Les mesures de densité minérale osseuse, seront effectuées tous les 15 jours sous anesthésie avec analgésie. Le temps de radiographie sera d’environ 5 minutes par animal et il sera surveillé jusqu’à son réveil. Le personnel de l’animalerie et les expérimentateurs assureront une surveillance quotidienne. Nous ne prévoyons pas de complications pour les animaux aux différents temps de la procédure qui se résument à 6 injections intrapéritonéales (anesthésies et injections de fluorochromes dilués dans du sérum physiologique qui sont nécessaires au suivi de la formation dynamique de l’os), 2h maximum d’isolement en cage métabolique pour un recueil d'urines. Cependant, dans l’éventualité d’apparitions de signes de souffrance, les mesures préalablement définies dans le projet - surveillance plus fréquente, traitement analgésique et apport de nourriture gélifiée - seront appliquées. En cas d'impossibilité à réduire ou stopper la douleur, l'animal sera euthanasié.

Choix des espèces

L’identification de potentiels traitement de l'OSSC, maladie rare osseuse, nécessite l’administration systémique dans un organisme entier, ici le modèle murin de la pathologie. Avant l’initiation du traitement, à 8 semaines, à mi-chemin de la durée du traitement et à la fin du traitement à 11 semaines, le phénotype osseux de toutes les souris traitées sera analysé afin de pouvoir analyser l’effet du traitement sur les animaux.

Gavées quatre jours avec des antibiotiques puis vingt-huit jours avec des probiotiques, 384 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour l'analyse de leur tube digestif. L'objet du projet est de dérégler leur microbiote intestinal avec une dose légère d'antibiotique, puis de tester quels régimes, prébiotiques ou probiotiques le rétablissent. Le porteur reconnaît que la contention et le gavage constituent des nuisances, avec un risque de fausse route entraînant la mise à mort immédiate de l'animal, et propose comme raffinement des "caresses avant le gavage". Il affirme qu'aucun effet indésirable n'est attendu "selon plusieurs études" qu'il ne cite pas, et indique administrer les antibiotiques dans l'eau de boisson au détriment de la précision des quantités ingérées.

Objectifs

L’objectif de ce projet consiste à perturber l’équilibre du microbiote intestinal en utilisant un traitement antibiotique léger. Plusieurs régimes sont ensuite testés pour évaluer leur capacité à rétablir ou non l'équilibre intestinal. Ces régimes sont constitués de macronutriments (protéines, lipides, glucides), de probiotiques (microorganismes bénéfiques pour l’organisme) ou prébiotiques (substances non digestives favorables au développement de la flore intestinale).

Bénéfices attendus

Expertiser l'impact d'une dose légère d'antibiotique sur l'homéostasie intestinale. Voir l'impact de certains produits (macronutriments, prébiotiques et probiotiques) sur le microbiote intestinal. Trouver des méthodes alternatives pour améliorer l'homéostasie intestinale par des régimes riches en macronutriments,, prébiotiques ou probiotiques.

Procédures

1)Gavage qui dure 4 jours pour les antibiotiques. (20 secondes par souris) 2) Gavage de probiotiques 28 jours. (20 seconde par gavage par souris) 3)Prelevement de féces une fois par semaine. (Maximum 15 minutes par prelevement) 4) Prise du poids une fois par semaine. (15 seconde paar souris) 5) Prise d'urine une seule fois à la fin du porotocole. (Maximum 15 minutes par prelevement)

Impact sur les animaux

Le modèle avec une dose légère d'antibiotique ne génère pas de diarrhée. Aucun effet indésirable n'est attendu selon plusieurs études. Par ailleurs, bien que réalisée par du personnel compétent, la préhension et la contention ainsi que le geste de gavage constituent des nuisances pour les animaux. Le stress, l'introduction accidentelle de liquide ainsi que la perte de poids sont des complications physiologiques et psychologiques que les manipulateurs vont essayer d'éviter.

Devenir

384 souris seront mises à mort pour analyser l'impact des modifications de la flore intestinale sur le tube dijestif.

Remplacement

Une grande étude in vivo est réalisée en amont de ce modèle. L'impact de 240 souches probiotiques, prébiotiques et macronutriment (lipides) a été réalisé in vitro sur des cellules de l'intestin. Seuls les produits avec un fort impact sont retenus pour la phase in vivo. Présélectionner les produits in vitro est une étape très importante vu le nombre de produits qui ne vont pas être sélectionnés pour la phase in vivo. Cependant, l'impact des antibiotiques passe essentiellement par le microbiote intestinal et seul le modèle animal peut offrir la possibilité de perturber le microbiote intestinal ainsi que les effets de cette perturbation sur l'homéostasie intestinale..

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre de souris utilisables pendant la partie in vivo, un grand travail in vitro estréalisé en amont. Les macronutriments, prébiotiques et probiotiques ne présentent que 10 % des produits testés in vitro 90 % des produit testé ne passeront pas à l'étape in vivo. Concernant la partie biostatistique et pour avoir des résultats statiquement interprétables au niveau de l’étude de la flore intestinale, les groupes seront composés de 8 animaux.

Raffinement

Le choix du modèle animal implique automatiquement la prise en compte des mesures de raffinement liées au nombre de souris par cage qui respectera le confort animal. Dans ce modèle le nombre de souris programmé est de 8 souris par cage en portoir ventilé. L’enrichissement des cages et l’entretien des animaux en présence de professionnels et scientifiques expérimentés est la première préoccupation des meneurs de ce projet. Le suivi quotidien des animaux 7 jours sur 7 permettra d’améliorer leurs conditions de vie en captivité en diminuant les sources de stress. Mettre en place une surveillance constante des animaux pendant les procédures expérimentales, pour détecter rapidement tout signe de détresse ou de malaise. Pré-entraîner les animaux à des procédures non douloureuses pour réduire le stress lors des manipulations ultérieures. Utiliser des méthodes de renforcement positif telque les caresses avant le gavage pour faciliter la coopération des animaux. Afin d’éviter de faire subir 2 gavages par jour aux animaux, l’administration des antibiotiques se fera par l’intermédiaire de l’eau de boisson. Cette option prend en compte le bien-être des animaux au détriment de la précision des quantités ingérées. Établir des critères clairs définissant les points limites à ne pas dépasser en termes de détresse, de douleur ou desouffrance animale. Mettre en place des protocoles pour arrêter immédiatement toute procédure en cas de dépassement des points limites, les critéres d'arret par rapport à la souffrance seront les suivants: •score supérieur ou égal à 10 selon critères de jugement •comportement de l’animal : animal isolé par rapport au milieu extérieur, posture inhabituelle, piloérection. •fèces ; décoloration et/ou présence de sang. Au cas ou le gavage abime la trachée ou fait fausse route l'animal est immediatement mis à mort. En cas de souffrance l'utilisation d'analgésique est envisagable.

Choix des espèces

Le protocole sera réalisé avec des souris, car c'est le modèle expérimental le plus utilisé pour l'étude de la santé intestinale et du microbiote. Les modèles murins ont été particulièrement utiles pour mieux comprendre certaines fonctions du microbiote des mammifères, et nous considérons donc qu'ils sont adaptés à nos recherches. Le debut des traitement à 6 semaines coincide avec le debut de maturation de la flore intestinale. Avant la prise des antibiotiques la flore intestinale presentera un indice de diversité trés élevé, l'impact des antibiotiques sur la flore intestinale sera plus important.

1 204 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées et leur cerveau prélevé, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit deux opérations du crâne sous anesthésie, de 45 à 120 minutes, puis apprend une tâche récompensée par de l'eau, tête immobilisée, quarante minutes par jour pendant deux mois. La récompense repose sur une restriction hydrique, les souris recevant la moitié de leur consommation d'eau habituelle et perdant 10 % de leur poids, perte que le porteur décrit comme impossible à éviter. Il écrit par ailleurs qu'aucune souffrance inhérente n'est associée à l'usage de ces souris transgéniques et que l'habituation garantit qu'elles ne ressentent "ni stress ni anxiété".

Objectifs

L’autisme est un trouble neurodéveloppemental caractérisé par des déficits sociaux, des comportements répétitifs et les altérations sensorielles. Il est estimé qu'à l'échelle mondiale, environ un enfant sur 34 est atteint d'autisme. Malgré la prévalence de l’autisme, les mécanismes neurobiologiques responsables des changements du comportement ne sont pas bien compris. Une meilleure compréhension de la neurobiologie de l’autisme est cruciale pour la gestion des symptômes des personnes autistes, le développement d'approches thérapeutiques innovantes, ainsi que pour l’amélioration du diagnostic. L'objectif de ce projet est d’utiliser des souris génétiquement modifiées, possédant les traits de l’autisme, pour étudier de manière plus approfondie les altérations neuronales dans l’autisme. Dans cette étude, qui se déroule dans 2 établissements utilisateurs, nous avons donc choisi de nous concentrer sur deux régions du cerveau qui sont similaires entre la souris et l'homme. Nous proposons de développer et d'utiliser une nouvelle expérience comportementale visant à identifier à la fois les altérations comportementales et les modifications physiologiques cérébrales dans ces souris modèles de l’autisme. Ces mesures nous permettront de tester quels mécanismes cellulaires peuvent être responsables des altérations comportementales liées à l'autisme. Finalement, nous pourrons tester grâce à cette tâche comportementale, si une intervention pharmacologique ciblant ces mécanismes peut corriger les altérations comportementales présentes au niveau sensoriel dans l’autisme. Nous utiliserons pour cela, une molécule expérimentale qui a déjà été testée dans des essais cliniques chez l'homme et dont le profil de sécurité et la pharmacocinétique sont bien définis.

Bénéfices attendus

Des études de dépistage à grande échelle menées aux États-Unis suggèrent que la prévalence de l'autisme est de 1 enfant sur 34. Bien qu'il n'existe pas d'études de cette ampleur en Europe, la prévalence de l'autisme est probablement similaire. Les symptômes sensoriels affectent la grande majorité des personnes atteintes d'autisme et ont des conséquences fortement négatives sur leur vie quotidienne. Par exemple, ils pourront avoir des difficultés pour s’intégrer dans une classe bruyante, des difficultés pour manger certains aliments ou pour porter certains vêtements. Ces symptômes sont une source majeure de stress pour les familles concernées. La compréhension des processus neurophysiologiques qui sont à l’origine de ces difficultés sensorielles peut apporter des informations importantes sur la façon dont le fonctionnement du cerveau est altéré dans l'autisme. De telles études peuvent conduire à l'identification des mécanismes moléculaires, cellulaires et cérébrales qui sont responsables des perturbations sensorielles, révélant ainsi de nouvelles cibles pour le développement de traitements pharmacologiques visant à améliorer des symptômes tels que la surcharge sensorielle ou l'hyper/hypo-réactivité sensorielle. De telles études nécessitent des approches invasives et des manipulations qui ne sont pas possibles dans un cadre clinique. Nous pensons que notre étude permettra de mieux comprendre les types de cellules et les circuits impliqués dans l'altération de la perception multisensorielle. Elle fournira des biomarqueurs précliniques pour l'évaluation de nouveaux médicaments expérimentaux. Elle nous permettra d'évaluer l'efficacité d'un médicament expérimental existant qui a été proposé comme traitement de l'autisme. Notre étude a le fort potentiel de fournir des informations qui, à terme, amélioreront la vie des personnes diagnostiquées autistes. Ces connaissances peuvent également renforcer l'autonomie et le bien être des personnes autistes en leur permettant de comprendre pourquoi elles se sentent comme elles le font dans certaines situations.

Procédures

Tous les animaux inclus dans les expériences comportementales seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie : la première durera environ 45 à 90 minutes, et la deuxième durera de 90 à 120 minutes (EU « A »). Pour comprendre les mécanismes neurobiologiques sous-jacent de l'autisme, les animaux apprendront à effectuer une tâche comportementale non aversive et non douloureuse, basé sur les récompenses, pendant 45 minutes par jour (EU « B »). En même temps, nous effectuons des mesures de l'activité des neurones du cerveau (EU « B »). Afin de permettre ces enregistrements, les animaux sont entraînés à accepter une contention partielle (immobilisation de la tête). Pour s'assurer que les animaux ne ressentent ni stress ni anxiété, ils seront progressivement habitués à l'installation et à l’immobilisation de leur tête d’une minute à 35 minutes, pendant 5 jours (EU « B »). Cela permet aux animaux d’apprendre que cette immobilisation est réversible et non douloureuse. Lorsqu'ils seront à l'aise avec le dispositif (pas de signes de détresse, capables de manger et boire), l'entraînement à la tâche comportementale commencera. Chaque session de travail comportemental dureras 40 minutes, et les sessions seront répétées quotidiennement pendant 2 mois (EU « B »). Tous les animaux inclus dans les expériences visant à définir l'activité du cerveau hors cadre comportemental seront soumis à une intervention chirurgicale sous anesthésie et analgésie, qui durera 90 minutes (EU « A »). Pour s'assurer que les animaux ne ressentent ni stress ni anxiété, ils seront progressivement habitués à l'installation et à l’immobilisation de la tête d’une minute à 35 minutes, pendant 5 jours (EU « B »). Cela permet aux animaux apprendre que cette immobilisation est réversible et pas douloureuse. Lorsqu'ils seront à l'aise dans le dispositif (pas de signes de détresse, capables de manger et boire), l’enregistrement de l’activité du cerveau commencera (EU « B »).

Impact sur les animaux

1) Chirurgies: Les animaux seront soumis à des interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie. Le risque d'inconfort, de douleur, d'infection et/ou de perte de poids est inhérent à ces procédures. 2) Immobilisation partielle : L’enregistrement de l’activité neuronale des différents groupes des neurones nécessite de maintenir la tête de l'animal dans une position fixe. Cette méthode n'est pas douloureuse et est bien établie dans la littérature, mais elle provoque un malaise pendant les premiers séances. 3) Restriction hydrique : Notre tâche comportementale nécessite la mise en place d’une récompense. Après notre étude précédente, nous avons choisi une récompense hydrique (nécessitant la restriction de l’eau). La perte de poids (10 % du poids initial de l'animal) ne peut être évitée car les souris reçoivent une ration d'eau correspondant à 50 % de leur consommation d'eau ad libitum.

Devenir

Toutes les souris seront euthanisiées et leurs cerveaux seront prélevés pour des analyses post-hoc.

Remplacement

Les expériences proposées dans cette étude nécessitent des circuits neuronaux intacts et des mesures à la fois physiologiques et comportementaux. Un modèle animal est absolument nécessaire pour reproduire la complexité de ces interactions neuronales et ne peut pas être remplacé par les études in vitro ou in silico. Les études cliniques ne sont pas adaptées à notre objectif expérimental des approches invasives sont nécessaires pour répondre à notre question scientifique. Les circuits neuronaux sont bien conservés chez les différentes espèces mammifères et sont donc susceptibles d'être fonctionnellement similaires chez les rongeurs et les humains. L’utilisation des modèles de plus faible sensibilité neuronale (tels que la mouche à vinaigre) n’est pas adaptée non plus à notre projet, car cet organisme ne possède pas la structure cérébrale ciblée par notre étude.

Réduction

Une conception expérimentale minutieuse garantira la reproductibilité des résultats et, avec des techniques d'analyse statistique appropriées, l'utilisation d'animaux sera réduite au minimum. Les protocoles comportementaux, physiologiques, et pharmacologiques ont déjà été mis en place pour une étude précédente sur la perception tactile. Une première étude pilote a été réalisée pour modifier les protocoles comportementaux pour étudier la perception multisensorielle. Cette première étude nous a permis de déterminer le nombre d'animaux nécessaires pour réaliser ces expériences et avoir des résultats statistiquement valides. Cela nous a permis d'assurer la crédibilité de nos résultats avant de procéder à l'étude principale. Les données comportementales, physiologiques, et pharmacologiques seront recueillies auprès des mêmes animaux. Les injections du traitement seront précédées par les injections contrôles dans les mêmes animaux. Toutes les expériences seront réalisées par groupe de 6 à 8 souris, et notre stratégie sur le nombre des souris nécessaire sera adaptée aux résultats. Ces mesures nous permettront de réduire le nombre d'animaux utilisés dans l'étude et de mesurer simultanément plusieurs paramètres.

Raffinement

Tous les résultats scientifiques sur les facteurs influençant le bien-être des animaux ainsi que la capacité des animaux à ressentir et à exprimer la douleur, la souffrance, l'angoisse et les dommages durables seront pris en compte. Les expériences seront conçues et réalisées de la manière la plus éthique possible. Des souris transgéniques seront utilisées pour explorer les déficits multisensorielles dans les modèles de souris d’autisme, et aucune souffrance inhérente n'y est associée. Le bien-être des animaux est impératif pour cette étude. Afin de garantir le moins de gêne et de souffrance pour les animaux, le matériel adéquat sera mis à disposition des personnes autorisées, compétentes et dûment qualifiées, qui respecteront rigoureusement les procédures mises en place. Pour les chirurgies: Utilisation d'anesthésiques, d'analgésiques, d'un anti-inflammatoire, d'une crème pour les yeux et d'un tapis chauffant pour maintenir la température de l'animal. Tous les animaux seront manipulés en utilisant les techniques les moins stressantes possibles, conformément à la littérature : l'utilisation d'un tunnel ou des mains en forme de coupe. Les animaux seront transférés entre les deux sites dans leurs cages d'origine, pendant leur phase active, et placés dans l'obscurité à l'intérieur d'un chariot. . Pendant la restriction en eau, les animaux seront pesés chaque jour, et leur alimentation en eau sera ajustée afin de s'assurer qu'ils ne dépassent jamais une perte de poids de 10 %. Un tube et du matériel de nidification seront placés dans chaque cage afin de garantir la poursuite de tous les comportements normaux de l'animal. Les animaux seront placés dans des cages collectives afin de garantir des interactions sociales. L'hydrogel qui sera fourni comme source d'eau est considéré comme un enrichissement car les animaux le manipulent abondamment avec leurs pattes avant. Les animaux seront habitués à la pièce d’expérimentation. Les animaux seront progressivement habitués à la fixation de la tête pour garantir un stress minimal. Tous les animaux exploreront librement l'installation avant et après chaque session, en marchant et en grimpant sur ses différentes parties. Les stimulations tactiles et auditives utilisées pendant la tâche comportementale ne sont pas douloureuses et ne provoquent pas des crises d’épilepsie. Des points limites spécifiques et des mesures conservatrices pour chaque phase de la procédure sont définis.

Choix des espèces

L’utilisation des souris transgéniques a été privilégiée pour rester cohérent avec les études antérieures effectuées au sein de notre équipe. Les rongeurs ont des systèmes somatosensoriel et auditif très développés et sont considérés comme une espèce modèle pour les études concernant le traitement de certains types d'informations sensorielles. De plus, à ce jour la souris est la seule espèce de mammifère pour laquelle il est possible, facilement, de modifier le génome afin de créer des modèles de maladies humaines. L'étiologie de l'autisme a une forte base génétique. Les modèles transgéniques impliquant la manipulation (suppression ou modification des gènes à haut risque pour l'autisme) sont considérés comme les modèles ayant une forte « valeur de construction ». Conformément aux études précédentes, pour explorer le comportement en même temps que l'activité cérébrale, les souris auront 4-5 semaines au début des chirurgies, 8-9 semaines au début de la tâche comportementale. Pour l'exploration de l'activation du cervelet, les souris auront 10 -12 semaines au début de la procédure.