Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Effet de drogues sénolytiques sur un nouveau modèle de glioblastome murin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
812 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyser la tumeur de leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie de 30 à 40 minutes pour recevoir dans le cerveau un lentivirus qui déclenche un glioblastome, puis des injections cinq jours de suite, deux séances d'imagerie par semaine sous anesthésie, jusqu'à cinq cycles de traitement et des anticorps bloquants toutes les deux semaines. Le projet doit tester sur ces tumeurs des drogues dites sénolytiques, qui visent à éliminer les cellules sénescentes, et la mise à mort intervient notamment à une variation de poids de 10 à 15 % en 48 heures ou quand la tumeur gêne la mobilité. Le porteur annonce 18 souris par type d'expérience, un nombre "qui peut paraître élevé" et qu'il dit "nécessaire" à des résultats reproductibles.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer l'effet de drogues dites sénolytiques (drogues qui éliminent les cellules sénescentes) seules ou en combinaison avec d'autres traitements, dans un nouveau modèle immunocompétent de tumeur cérébrale de type glial appelée glioblastome. Le modèle de glioblastome de type mésenchymateux proposé dans le projet récapitule au mieux les altérations moléculaires identifées chez les patients en utilisant une nouvelle technologie d'invalidation de l'expression de gènes.
Bénéfices attendus
Le glioblastome est la tumeur cérébrale adulte primaire la plus fréquente et agressive dont les patients ne survivent pas plus de 15 mois en moyenne à ce jour. Ce projet devrait générer un modèle préclinique immunocompétent de glioblastome de type mesenchymateux qui récapitule au plus près les altérations moléculaires des glioblastomes de patients. En effet, afin de traduire de façon efficace nos résultats de recherches fondamentales à la clinique il est indispensable de se rapprocher au plus près de la pathologie humaine. Nos résultats devraient permettre de proposer des nouvelles aprroches thérapeutiques pour la prise en charge des patients avec un glioblastome.
Procédures
La procédure expérimentale sera réalisée sur des souris adultes agées de 6-8 semaines et comprend 6 actes techniques incluant une injection intra-crâniale de lentivirus nécessitant un acte chirurgical, une série d'injections, un suivi de la croissance tumorale par utilisation d’imagerie par bioluminescence, des traitements, des prélèvements sanguins puis finalement une euthanasie. La chirurgie prendra environ 30-40min sur animal anesthésié et analgésié en pré et post-opératoire. Les injections d'une durée de 10-20 secondes, seront réalisées 1 fois par jour pendant 5 jours consécutifs sur animal vigil. La quantification de bioluminescence sera réalisée deux fois par semaine, toutes les semaines sur animal anesthésié. Cette mesure est indolore et dure selon l'intensité de la bioluminescence entre 1 et 4 min. Les traitements d'une durée de 10-20 secondes, seront administrés sur souris vigiles pendant 5 jours consécutifs et ce cycle sera renouvelé toutes les deux semaines. Les animaux recevront au maximum 5 cycles de traitement. L'administration d'anticorps bloquants se fera en 4 injections espacées de deux jours et ce cycle sera renouvelé toutes les deux semaines sur souris vigile. Des prélèvements de sang seront réalisés sur animal vigil (durée de quelques secondes, 4 fois par animal).
Impact sur les animaux
Plusieurs effets indésirables sont attendus lors de cette procédure. L'acte chirurgicale est invasive, il s'agit d'une injection de lentivirus dans le cerveau effectué sous anesthésie/analgésie mais qui entraîne des nuisances (risques anesthésiques, douleur post-opératoire, risque infectieux). Concernant la charge tumorale, les nuisances sont une variation du poids corporel notamment une perte de masse musculaire, le développement d'une masse tumorale gênant la mobilité ou les fonctions normales de l'animal, une dégradation de l'état général de l'animal (signes cliniques généraux parmi lesquels posture et état de vigilance, prostration ou décubitus, déshydratation, lésions cutanées). Lors des injections des traitements, une inflammation locale déterminée par palpation délicate de la zone d’injection peut avoir lieu. Nos mesures de croissances tumorale par imagerie de bioluminescence, sont sujet à de risques anesthésiques. De la douleur légère de courte durée peut être ressentie lors des prélèvements sanguins. Dans de très rares cas un hématome ou une perte de sang hémorragique peut être observée. De la douleur légère de courte durée peut être ressentie lors des injections.
Devenir
Toutes les souris de ce projet seront euthanasiées en fin de procédure. En effet, l'euthanasie des animaux est nécessaire afin de prélever le cerveau des souris et d'analyser la tumeur cérébrale induite pendant la procédure, au niveau moléculaire et histologique.
Remplacement
En parallèle de ce projet in vivo, nous caractériserons des prélèvements chirurgicaux de glioblastomes de patient collectés avant et après traitement. Ce matériel est rare car la survie des patients après diagnostic est inférieure à 15 mois. Cette étude fondamentale demeurera néanmoins descriptive ; pour avancer dans le développement de nouveaux traitements nous devons réaliser des études fonctionnelles dans un modèle animal. Dans un souci de remplacement et réduction, nous projetons de générer des organoides à partir de glioblastomes de patient afin de tester de nouveaux traitements in vitro. Cependant, l'environnement tumoral, et notamment le système immunitaire, est essentiel à la réponse aux traitements et à ce jour, il n'existe pas encore de modèle d'organoides conservant le microenvironnement global (notamment, la microglie, les monocytes et les cellules T infiltrants, les cellules endothéliales et les péricytes). Un projet collaboratif visant à générer des organoides de glioblastomes incluant de la microglie et des monocytes infiltrants est en cours. Selon les résultats obtenus sur ce projet, nous pourrons remplacer une partie de nos expériences in vivo par des expériences réalisées sur ces organoides.
Réduction
Nous veillerons à utiliser le moins d’animaux possible pour l’ensemble de nos expériences, leur nombre est de 812 pour cette prodédure. Nous utiliserons pour chaque type d’expérience 18 animaux. Ce nombre, qui peut paraître élevé, est nécessaire pour l’obtention de résultats reproductibles et statistiquement significatifs car les gliomes sont par nature très hétérogènes. Afin d'éviter l'euthanasie séquentielle d’animaux au cours du temps pour évaluer l’apparition de la tumeur, son volume et sa croissance, nous utiliserons la méthode de suivi in vivo par bioluminescence grâce à l'expression de la luciférase dans les cellules tumorales. A chaque euthanasie des animaux afin d'éviter tout double emploi des animaux, nous collecterons divers tissus sur un même animal (cerveau, ganglions, rate, sang). De plus, la tumeur fluorescence sera localisée dans le cerveau disséqué à la loupe binoculaire. Immédiatement après son prélèvement, la tumeur sera séparée en deux parties, une pour les analyses histologiques et immunologiques et une autre pour les analyses moléculaires et biochimiques.
Raffinement
Afin de réduire le stress post-opératoire, les animaux, des femelles, seront logées par groupes déterminés pendant une période d'acclimatation de 7 jours minimum avant la procédure chirurgicale. L'enrichissement initial de la cage est composé bandes de papier kraft pliées en accordéon. Les animaux seront analgésiés et anesthésiés avant et pendant toute la procédure chirurgicale. Pendant la chirurgie, les animaux seront placés sur un tapis chauffant afin de prévenir l'hypothermie et nous appliquerons un gel ophtalmique sur les yeux pour éviter leur déshydratation. Post-chirurgie, les animaux seront placés dans une salle de réveil chauffée, la qualité du réveil sera observée pour détecter toute anomalie potentielle de la procédure anesthésique. Pendant 48 heures post-chirurgie, nous administrerons un analgésique. Les animaux seront surveillés quotidiennement et euthanasiés dès que les points limites seront atteints. Ceux-ci comprennent une variation relative du poids corporel comprise entre 10 et 15 pourcents en 48h, une masse tumorale gênant la mobilité ou les fonctions normales de l’animal et une dégradation de l’état général de l’animal comprenant des signes cliniques généraux parmi lesquels posture et état de vigilance, prostration ou décubitus, déshydratation, lésions cutanées. Nous avons établi dans l’équipe une grille de suivi post-opératoire pour les animaux pouvant développer des tumeurs cérébrales. Cette grille est consultée et une fiche de suivie est remplie à chaque examen. Nous analyserons la croissance tumorale par bioluminescence et le poids des animaux deux fois par semaine. En fin de processus d’expérimentation, si une souris est isolée nous regrouperons cet animal avec des animaux sujets au même traitement et lorsque cela ne sera pas possible nous apporterons de l’enrichissement supplémentaire dans la cage sous forme de maisonnette. Lors des prélèvements sanguins, il est possible que le saignement ne se stoppe pas rapidement. Une compression plus longue avec un papier essuie tout propre sera directement effectuée sur le point de prélèvement afin de stopper l'écoulement de sang. En cas d'apparition de prostration et de difficulté à récupérer (anomalie cardiorespiratoire), l'animal sera pris en main pour effectuer des frictions afin de le stimuler. De la nourriture hydratée sera déposé à côté de lui dans la cage. Si cet état perdure plus que quelques minutes, alors l'animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Les nombreux outils génétiques développés et caractérisés chez la souris font de cette espèce un modèle de choix pour l’étude in vivo des tumeurs. De plus, les modèles les plus représentatifs de la biologie et de la génétique des tumeurs humaines sont établis chez la souris. Nous utiliserons des souris adultes de 6-8 semaines pour induire de novo des glioblastomes. En effet ce type de tumeur est diagnostiqué chez des sujets adultes d'âge médian de 59 ans, cette tumeur se développe donc à l'âge adulte. Notre projet, qui vise à évaluer l'effet de drogues sénolytiques dans un nouveau modèle immunocompétent de glioblastome, utilisera uniquement des souris femelles. En effet, les modèles de glioblastomes murins se développent de façon similaire chez les mâles et les femelles. De façon plus importante dans une étude récente, nous avons montré que l’enrichissement de la signature murine de sénescence chez les patients avec un glioblastome est un facteur de mauvais pronostique quel que soit le sexe. Ces résultats montrent donc que l’étude de la sénescence dans le contexte des glioblastomes peut être réalisée sur un seul sexe. Nous avons choisi pour ce projet de travailler sur des femelles.
Caractérisation d’un modèle cardiaque déficient en Frataxine
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
Après quinze jours d'habituation à la manipulation, les rats passent à partir de neuf semaines une échocardiographie de 45 minutes sous anesthésie gazeuse, une mesure de la fonction musculaire sous anesthésie injectable levée par un réversant, une pesée hebdomadaire et une prise de sang. 60 rats porteurs d'une mutation du gène de la frataxine vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour vérifier si cette lignée reproduit l'atteinte cardiaque de l'ataxie de Friedreich. Le porteur indique que chez la souris, la même déficience provoque dès neuf semaines "une réduction rapide de l'état", et prévoit, si les mêmes symptômes apparaissent chez le rat, de tuer les individus dès les premiers signes ou de les surveiller de près. Tous les rats seront tués à l'issue des expériences pour une analyse histologique de leur cœur.
Objectifs
L'ataxie de Friedreich est une maladie évolutive, due à l’atteinte de certaines cellules du système nerveux (maladie neuro-dégénérative). Elle se traduit avant tout par des troubles de l’équilibre et de la coordination des mouvements volontaires (ataxie). Une atteinte cardiaque, des troubles ostéo-articulaires (scoliose, pieds creux) et un diabète sont parfois associés. Dans cette étude nous allons utiliser un modèle de rat déficient pour une petite protéine, induisant le developpement d'une ataxie de Friedreich. Ce modèle est bien défini chez la souris, notamment dans le décours de la pathologie, qui dès l’âge de 9 semaines présente une réduction rapide de l'état, du fait d'une pathologie cardiaque de ces souris. Si les mêmes symptômes se présentent chez le rat, ils seront euthanasiés dès l'apparition des premiers symptômes ou seront surveillés de manière rapprochée et à l'aide des points limites décrits dans la section appropriée. Pour ce projet, nous effectuerons une caractérisation détaillée de la fonction cardiaque de rats mâle et femelle par échocardiographie, de la fonction musculaire par une électromyographie (EMG), ainsi qu'une analyse histologique du cœur de ces animaux. Globalement, ce projet nous permettra d'évaluer dans quelle mesure ce modèle de rat correspond au spectre clinique de l'ataxie de Friedreich.
Bénéfices attendus
À court terme, ce projet nous permettra de valider un nouveau modèle de rat de l'ataxie de Friedreich, qui recapitule le tableau clinique de la pathologie humaine. Ce modèle nous servira dans un deuxième temps à obtenir des preuves de concept in vivo que de nouvelles approches thérapeutiques sont efficaces sur plusieurs signes cliniques prédictifs de la pathologie humaine, avec pour but, poursuivre par un développement thérapeutique clinique. L'objectif final étant de proposer un traitement efficace pour les patients atteints d'ataxie de Friedreich.
Procédures
Nous allons réaliser une mesure de la fonction cardiaque sous anesthésie gazeuse (45 minutes) et une mesure de la fonction musculaire (10 minutes) sous anesthésie (une injection d'anesthésique et une autre de son réversant). Il y aura également un e suivi du poids des animaux (1X/semaine) et un prélèvement sanguin (30 secondes).
Impact sur les animaux
La mutation induit un phenotype dommageable induisant une dysfonction cardiaque. Les animaux subiront une anesthésie gazeuse pouvant induire de légères difficultés repiratoire. Les animaux subiront une injections intrapéritonéale pouvant conduire à une diminution de la mobilité. Une prise de sang sera effectuée sous anesthésie sur l'ensemble des animaux pouvant induire de légères difficultés respiratoire et une hypovolémie.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des expériences afin de prélever les organes et réaliser des analyses complémentaires post-mortem (analyses histologiques).
Remplacement
L'objectif de cette étude est de caractériser des modèles de rats portant une mutation dans le gène de la frataxine dans les cardiomyocytes, représentatif de la clinique humaine. Il s'agit en particulier de caractériser de façon détaillée la fonction cardiaque de ces animaux. Des modèles in vitro vont permettre de mieux comprendre les mécanismes d'action, mais seul un modèle animal nous permettra de caractériser les symptomes de la pathologie de l'ataxie de Friedreich. Des modèles cellulaires ou le gène de la frataxine est inhibé ont été étudiés et ont permis de cibler différentes molécules étant capables de diminuer les effets cellulaires indésirable de l'inhibition de ce gène. Cependant cette étape in vivo, qui nous permettra de comprendre la physiologie cardiaque d'un animal où la frataxine est inhibée, est indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez l’homme. Nous avons dans cette étude choisi un modèle de rat. Un avantage majeur des modèles de rats par rapport aux souris est leur grande similitude physiologique avec les humains. Leur système cardiovasculaire et leur système nerveux sont plus proches de ceux des humains que ceux des souris, tout comme le nombre et le type d'enzymes hépatiques. Il semblerait qu’un modèle de rat pour l'ataxie de Friedreich reflété mieux la plupart des aspects de la maladie humaine.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été déterminé au fur et à mesure de notre expérience. Nous préconisons habituellement 9 animaux par groupe et par sexe. Cependant dans cette étude nous travaillerons sur des groupes de 12 animaux pour la partie phénotypage car il s’agit de rats Long Evans, issus de croisements non consanguins et présentent donc une plus grande variabilité. Pour la partie analyse moléculaire 3 animaux par groupe sera suffisant pour obtenir des résultats comparables. De plus, les données de modèles similaires chez la souris montrent des différences dans l'évolution de la maladie cardiaque entre les mâles et les femelles. Pour cette raison, nous devons les garder séparés.
Raffinement
Afin d’améliorer leurs conditions de vie, les rats seront ainsi stabulés dans des conditions optimales pour l’espèce : en petit groupe, avec des paramètres environnementaux maitrisés, un milieu enrichi à l’aide de nids, de bâtons à ronger, de balles à ronger et de croquettes d'alimentation dans le fond de la cage pour favoriser l'enfouissement. Pour les cages de mâles, à chaque change, nous leur remettons un peu de litière sale de leur précédente cage afin de limiter l'agressivité pour la prise de territoire / hiérarchie. Nous enrichissons fortement le milieu de vie des animaux, surtout des mâles afin d'éviter au maximum l'agressivité. Tous les animaux seront observés de manière quotidienne et suivis selon un tableau de scoring pour l'évaluation de la douleur et pour l'établissement de points limites, prenant en compte le poids, l'apparence physique, les signes cliniques et le comportement de l'animal. Tout au long des procédures, si l’état de santé de l’animal est dégradé, le personnel formé et compétent décide de ne pas réaliser le test et d'euthanasier l’animal le cas échéant. A réception, les animaux vont passer une période d'habituation de 15 jours qui vise à les habituer à la manipulation et donc réduire le stress ressenti lors du transport. Lors de l'anesthésie de l'EMG, du gel oculaire est placé sur la cornée afin de prévenir tout déssèchement de l'oeil, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant à 37°C durant toute la durée de l'anesthésie pour prévenir la déperdition de chaleur.
Choix des espèces
Le modèle rat portant une mutation inductible sur le gène de la frataxine dans les cellules musculaires permet de reproduire tout ou une partie des symptômes de l'ataxie de Friedreich observés en clinique humaine (données préliminaires). Nous utiliserons des animaux adultes jeunes, mâle et femelle. Nous avons besoin que les animaux soient matures physiologiquement, cérébralement et physiquement pour effectuer cette batterie de tests. Le planning de phénotypage démarrera à l'âge de 9 semaines.
Caractérisation d’un modèle murin de trouble bipolaire par injection chronique de roténone à faible dose
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une souris placée sous surveillance dont l'état ne s'améliore pas en 48 heures est mise à mort. 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour récupérer leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, modéré ou sévère, pour reproduire chez elles des comportements proches des phases du trouble bipolaire. Elles reçoivent une injection sous la peau chaque jour pendant huit semaines, de roténone pour les souris traitées, un inhibiteur de la chaîne mitochondriale, et passent trois fois chaque test comportemental, à quatre semaines d'intervalle, sans que le porteur nomme ces tests. Il décrit une "légère douleur" au point d'injection, un "stress modéré" lié aux manipulations, à la contention et parfois à l'isolement, et des effets de la roténone sur l'anxiété, alors que le projet déclare aussi un niveau de souffrance sévère.
Objectifs
Le trouble bipolaire est une cause d’invalidité majeure dans le monde avec plus de 45 millions de personnes atteintes. Il est caractérisé par une alternance entre des phases dépressives similaires à la dépression majeure et des phases maniaques présentant une élévation anormale de l’humeur ainsi que des altérations cognitives allant de la distractibilité à des comportements à risque. L’espérance de vie des patients est réduite en moyenne de 10 ans à cause du risque élevé de mort par suicide (1 patient sur 10) et de comorbidités (par exemple les troubles de l’addiction et de l’anxiété, mais aussi des troubles somatiques telles que les maladies cardiovasculaires). Cependant, les mécanismes neurobiologiques ainsi que les éléments précipitant les différentes phases restent largement méconnus, à tel point qu’il n’existe pour l’instant pas de modèle expérimental récapitulant les principaux aspects de la maladie. L’objectif de ce projet est à d’établir des méthodes d’étude des phases maniaques et dépressives du trouble bipolaire au niveau comportemental, puis de se focaliser sur les transitions entre phase, un aspect méconnu de la maladie qui pourrait amener à une meilleure compréhension de sa biologie et à de nouvelles pistes thérapeutiques. Pour cela, nous avons besoin d’un modèle de la maladie récapitulant les deux phases à l’échelle individuelle. Notre laboratoire dispose déjà de l’expertise nécessaire pour étudier les phénotypes anxiodépressifs, et nous sommes en train de mettre au point des tests pour évaluer les phénotypes maniaques inhérents au trouble bipolaire. Nous proposons donc ici d’établir et de caractériser un modèle récent de trouble bipolaire basé sur une des hypothèses majeures du domaine, à savoir l’hypothèse mitochondriale. Celle-ci se base sur un ensemble de données suggérant qu’une dysfonction mitochondriale légère serait au centre de cette pathologie. La première phase de caractérisation est de reproduire et d’étendre les résultats comportementaux suite à un traitement chronique de roténone, un inhibiteur de la chaîne mitochondriale.
Bénéfices attendus
Les études précliniques sont peu nombreuses sur le trouble bipolaire et sont critiques pour mieux comprendre sa neurobiologie et de nouvelles thérapies. Cette étude permettra d’évaluer la reproductibilité d’un modèle murin prometteur de la pathologie, et de développer de nouvelles pistes de compréhension de la maladie avec un suivi longitudinal et individuel des animaux.
Procédures
Une injection sous-cutanée est réalisée quotidiennement pendant 8 semaines. Les tests comportementaux ont pour objectif d'évaluer les comportements se rapprochant de la phase maniaque ou dépressive du trouble bipolaire. Chaque test comportemental a lieu 3 fois (une fois pendant la phase sans symptômes, une fois en phase maniaque et une fois en phase dépressive) à 4 semaines d'intervalle. Ils ne durent que 5 à 10 minutes par souris.
Impact sur les animaux
Les injections sous-cutanée (7 fois par semaine sur 8 semaines), sont espacées de 24h. Les doses de roténone sont modérées par rapport à celles utilisées dans la littérature. Elles peuvent provoquer une légère douleur au niveau du site d’injection. Les tests comportementaux sont couramment utilisés et peuvent provoquer un stress modéré en lien avec la manipulation, les contensions et l’isolement dans certains cas. La roténone en elle-même ne semble pas induire de phénotypes comportementaux à court terme (au moins jusqu’à deux semaines) d’après la littérature. A un mois, la roténone semble induire une hypoanxiété, puis de l’anxiété à 2 mois.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés et les cerveaux seront récupérés pour des études ultérieures
Remplacement
Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale nécessite également l’utilisation d’animaux.
Réduction
Les effectifs sont optimisés, les analyses comportementales nécessitent une taille d’effectifs suffisante compte tenu de la variabilité inter-individuelle (n = 20 sujets en tenant compte de cette variabilité). La stratégie des 8 groupes avec deux groupes (contrôles et traités) se base sur un effet attendu relativement important. Nous faisons le choix de travailler chez les animaux des deux sexes en accord avec les directives d'intégrer le sexe comme variable biologique dans les recherches : en effet, les troubles psychiatriques dont le trouble bipolaire sont un facteur majeur d'invalidité dans le monde et peuvent s'exprimer différemment chez les hommes et les femmes. Il est donc essentiel de s'intéresser aux deux sexes pour une meilleure compréhension du trouble et développer des approches thérapeutiques adaptées.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (cabanes plexiglass et cartons, tubes). Les animaux sont hébergés une semaine avant l’initiation des expériences. Des habituations à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure sont réalisées avant les tests comportementaux pour diminuer le stress des animaux. En complément, une friandise (sous la forme d'un morceau de gâteau) sera distribuée après chaque injection et après les tests comportementaux afin de diminuer le stress en faisant associer les manipulations à un événement positif. En cas de blessure, les animaux recevront un traitement analgésique jusqu’à la disparition des signes de douleur . En cas d’hypothermie, chaque animal est placé sur une couverture thermorégulée pour éviter toute hypothermie. Les éxpérimentateurs sont experts dans la préhension et la contention des souris, et sont soucieux d’éviter tout stress inutile lors de la réalisation des procédures. Des points limites gradés sont appliqués : les animaux surveillés sont pesés et oscultés quotidiennement (hydratation, température, état de la blessure si blessure). La décision d’euthanasie est prise s’il n’y a pas d’amélioration au bout de 48h. Dans ce cas, une euthanasie sera réalisée afin d'éviter toute souffrance supplémentaire.
Choix des espèces
Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, l’implémentation de modèles de troubles de l’humeur, ainsi que la possibilité d’utiliser des vecteurs viraux permettant l’utilisation de l’optogénétique font de la souris le modèle le plus pertinent. Les techniques précédemment mentionnées seront mises en œuvre ultérieurement une fois les modèles mieux caractérisés. Les souris seront adultes, âgées de 7 semaines ou plus. Le modèle roténone ayant été développé chez des animaux adultes et les patients étant typiquement diagnostiqués à l’âge adulte, nous nous focalisons sur le stade adulte dans un premier temps.
Traitement de l’inflammation par Plasma enrichi en plaquettes (PRP) en cas de discopathie dégénérative mécanique sur modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Une injection de collagénase dans un disque de la queue, sous anesthésie, en vingt minutes, provoque chez chaque rat une discopathie mécanique. Sept jours plus tard un millilitre de sang est prélevé, le plasma enrichi en plaquettes en est extrait puis réinjecté le même jour dans le disque abîmé, et une pompe est implantée sous la peau pour délivrer un analgésique en continu. Suivent douze semaines d'examens IRM de deux heures, à raison d'un par semaine, sur 12 rats utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. D'après le porteur, la discopathie provoque une douleur intense et longue si elle n'est pas soignée, avec enflure de la queue, prostration et pilo-érection, les rats étant tués dès l'atteinte d'un point limite ou au terme des douze semaines, pour prélever leurs queues.
Objectifs
Chez l’homme, les discopathies entrainant des lombalgies sont très fréquentes, estimées entre 15 et 50% dans la population générale. Caractérisée par une atteinte multifocale du complexe disque-vertèbre au niveau du squelette, la maladie se manifeste habituellement après 50 ans. Le retard diagnostique s’explique donc essentiellement par des plaintes cliniques aspécifiques évoluant par crise chez des patients. La prise en charge est généralement symptomatique par repos, kinésithérapie voire infiltration rachidienne de dérivés cortisonés. Dans une précédente étude, nous avons développé une méthode IRM permettant la détection des différentes zones de la vertèbre chez le rat sain et pathologique. Désormais, nous souhaitons traiter l’inflammation discale, évènement précoce de la maladie, chez le rat par du plasma enrichi en plaquettes (PRP). L’IRM permettra d’évaluer l’efficacité de l’injection de PRP sur la régénération discale.
Bénéfices attendus
Les bénéfices seront de deux ordres : 1) si l’injection de PRP permet une régénération discale chez le rat, ceci pourra être facilement transféré en clinique pour aider au traitement des discopathies humaines. 2) l’IRM est une méthode d’imagerie non-invasive qui devrait permettre d’évaluer l’efficacité thérapeutique du PRP sans biopsie et à des temps précoces.
Procédures
Toutes les procédures décrites dans ce document seront réalisées sous anesthésie générale. Chaque rat de ce projet subira une discopathie mécanique dans 1 disque de la queue grâce à une injection de collagénase. Cette chirurgie dure en moyenne 20min. Sept jours plus tard, 1mL sang sera prélevé en quelques secondes pour extraire le plasma contenant les plaquettes sanguines, qui sera injecté dans le disque pathologique la même journée (étape durant environ 10 minutes). Puis, une pompe sera implantée en sous-cutané pour libérer un analgésique en continu (procédure de 10 minutes environ). Finalement, des examens IRM de 2 heures seront réalisés 1 fois par semaine pendant 12 semaines.
Impact sur les animaux
La discopathie mécanique entraine une douleur intense et longue si elle n’est pas soignée, comme c’est le cas chez l’humain. Ainsi les nuisances peuvent inclure une enflure de la queue, une perte de poids temporaire, une prostration, une pilo-érection.
Devenir
Les animaux seront mis-à-mort lorsque les points limites seront atteints ou lorsqu'ils auront subi les 12 semaines de suivi IRM. Cette euthanasie est nécessaire pour prélever les queues et réaliser des coupes histologiques pour détecter la présence de sites inflammatoires, valider la régénération du complexe disco-vertébral et ainsi corréler avec le signal IRM obtenu.
Remplacement
Il est indispensable d’utiliser les animaux vivants, car nous souhaitons traiter une inflammation discale. Ces pathologies ne sont pas reproductibles in vitro car elles nécessitent un système immunitaire complet.
Réduction
Notre étude précédente a permis de suivre par IRM l’inflammation discale sans traitement par plaquettes sanguines. Nous souhaitons donc désormais utiliser principalement des rats traités avec des plaquettes sanguines, comme ceci est déjé réalisé chez l'humain. Nous analyserons la différence de vitesse de réparation du disque entre les 2 groupes. Le nombre d'animaux nécessaire à ce projet a été déterminé par une approche statistique.
Raffinement
Les 12 rats seront répartis dans 6 cages avec des tubes en carton, de la litière, de la paille, du coton, un bois à ronger, de la nourriture et de l’eau à volonté. Des observations quotidiennes et des scorages d’évaluation de la douleur hebdomadaires seront pratiqués dès le début de l’expérimentation pour évaluer l’évolution de la maladie. De ce fait, des points limites ont pu être établis. La cellule bien-être du laboratoire sera impliquée quotidiennement dans l’évolution du protocole. L’analgésie sera appliquée dès le début de l’expérimentation sur l’animal, et sera administrée tout au long des 12 semaines d’observations IRM.
Choix des espèces
Les rats seront utilisés du fait de leur utilisation courante dans la littérature pour ce modèle pathologique. De plus, nous avons réalisé une première étude sur cette espèce, qui nous servira dans les analyses en fin de projet. Comme nous souhaitons transférer les séquences IRM 3D nouvellement développées à l’homme, les animaux seront utilisés à l’âge adulte (250g pour les rats) car la croissance est terminée et le prélèvement veineux de 1 mL possible.
Modèles rongeurs de fragilisation de la barrière intestinale et de translocation bactérienne appliqués à l’évaluation d’efficacité de composés innovants dans des modèles de défaillance hépatique chroniques (ACLF)
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Rats : 3850
Barrière intestinale fragilisée par des agents chimiques, absorptions chroniques ou massives d'alcool, fonction du foie altérée: 4 150 souris et 3 850 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, 5 900 d'entre eux en gravité sévère. Les animaux peuvent présenter des diarrhées parfois hémorragiques, une perte de poids, un état de choc et une détresse cardio-respiratoire avec des troubles de la régulation de leur température. Le porteur décrit des gestes "peu invasifs ou traumatisants" et affirme écarter tout individu susceptible de subir un inconfort trop important, tout en indiquant que dans les études de survie la mort constitue le point final expérimental et qu'aucun point limite anticipé ne pourra alors s'appliquer. Il ajoute que les moyens de lutte contre la douleur peuvent introduire un biais expérimental, et vise une gravité "sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique".
Objectifs
Notre laboratoire est engagé dans la compréhension des mécanismes impliqués dans la décompensation aigue de la cirrhose hépatique et dans le développement de solutions thérapeutiques visant à protéger les patients qui la subissent. La cirrhose du foie est le stade terminal courant des maladies chroniques du foie provenant de différentes étiologies. L’aggravation de la maladie hépatique déclenche une cascade d’événements avec une prolifération bactérienne intestinale et une dysbiose comme événements centraux. Les toxines bactériennes peuvent directement provoquer la mort des hépatocytes, tandis que la dysbiose affecte également la fonction de barrière intestinale et augmente la translocation bactérienne, ce qui entraîne des épisodes inflammatoires, des infections systémiques, une vasodilatation et contribue à une décompensation aiguë accompagnée de défaillances de plusieurs organes. Les patients qui montrent des signes similairesou qui sont atteints de ces symptômes présentent une inflammation systémique élevée, qui est principalement précipitée par une infection bactérienne avérée et/ou une hépatite alcoolique sévère. Au cours de l’évolution de la cirrhose, les modifications du microbiote (dysbiose) sont aggravées par des modifications de la motilité intestinale, de la perméabilité, de la fonction de barrière envers le compartiment lymphatique et sanguin, de l'hypertension portale et du système immunitaire. Le rôle du microbiote semble crucial chez les patients atteints de cirrhose décompensée, car de nombreux événements déclencheurs sont liés aux microbes ou à leur interaction avec l’hôte. Ce projet de recherche sur cette maladie hépatique met l’accent sur les mécanismes associés au microbiote qui sont impliqués, de manière à pouvoir les cibler ou pour identifier des paramètres permettant d’évaluer les propriétés de composés en développement. Nous mettrons en place des modèles expérimentaux conçus pour fragiliser la barrière intestinale et induire une translocation bactérienne, ces modèles induits par des actions directes d’agents chimiques ou par des absorptions chroniques ou massives d’alcool pourront également être combinés à des modèles pathologiques où la fonction hépatique est altérée de manière à reproduire les caractéristiques de la pathologie.
Bénéfices attendus
Lors d’épisodes de défaillance hépatique et par voie de conséquence d'autres organes, il est nécessaire de prendre en charge les patients pour les défaillances multiples le plus précocement possible pour préserver le capital hépatocytaire qui subsiste, et qui peut se révéler être vital lors de la survenue d’un second évènement aigu. Aujourd’hui les traitements employés agissent sur les symptômes tels que la pression portale, l’infection, l’hémorragie digestive ou le syndrome hépato-rénal à l’aide de corticoïdes par exemple de manière à préserver les chances d’éligibilité à la transplantation. Les solutions thérapeutiques que nous espérons proposer visent aussi à agir sur les mécanismes à l’origine des effets fulminants observés. (Infection, inflammation, et immunité). L’action régulatrice de composés sur la translocation bactérienne par une action directe sur la barrière ou indirecte sur le microbiote pourrait avoir un impact important sur la réduction des effets déclencheurs de la défaillance aigue du fonctionnement du foie.
Procédures
Au cours des procédures expérimentales qui constituent ce projet conduit sur des rats ou des souris, nous serons amenés à effectuer des gestes peu invasifs ou traumatisants, il s’agit d’administrer aux animaux par des moyens classiques d’injection des agents qui vont conduire à l’apparition de la pathologie souhaitée ou à contrario des produits destinés à en limiter ou réduire les symptômes. Ces administrations seront dans certains cas répétées de manière quotidienne sur des périodes courtes (une semaine) , ou de manière bi-hebdomadaire au cours de période plus longues ( 10 semaines max) Dans les cas ou une immobilisation est plus confortable, pour l’opérateur et pour l’animal, et de manière systématique pour les prélèvements, une légère anesthésie de quelques minutes (3min) sera pratiquée par exposition des voies respiratoires à un agent anesthésiant.
Impact sur les animaux
Au cours de ce projet dont la finalité est le développement de modèles permettant de mener des évaluations de propriétés thérapeutiques de composés dans le traitement des patients dans un état ACLF dont la survie est engagée. La relation entre le foie et l’intestin joue un rôle primordial lors des phases qui précèdent le déclenchement de l’ACLF, l’altération de la fonction barrière et la translocation bactérienne sont des éléments que nous avons considérés et que nous devons reproduire dans nos modèles. Les modèles développés chez les rongeurs pourront présenter des troubles de la fonction digestive, associés à des diarrhées parfois hémorragiques et une perte de poids. Au cours de l’épisode ACLF, nous pourrons observer des animaux en état de choc et de détresse cardio-respiratoire, avec des épisodes de troubles de la régulation de la température corporelle. Les effets cités sont observés de manière plus ou moins prononcée, ces signes constituent les critères d’atteinte des points limites. Certains animaux atteindront des stades qui nécessiteront un point d’arrêt anticipé lorsqu’il sera possible de les appliquer par exemple lors de la mise à mort à un temps fixe précoce prédéterminé. En revanche, dans les situations d’études de survie où la mort est le point final expérimental, il ne pourra pas y avoir recours à des points limites anticipés. Pour évaluer les effets de nos composés, nous nous fixons comme objectif de reproduire une gravité qui sera jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique et conservant toute pertinence scientifique.
Devenir
L'évaluation histologique des organes majeurs (foie, reins et cerveau) et une investigation approfondie des biomarqueurs plasmatiques circulants imposent la mise à mort des animaux
Remplacement
La possibilité de disposer d’un modèle animal qui permet d’évaluer les effets des nouveaux composés sur tous les aspects d'une pathologie présente chez l’homme constitue une étape clé dans la lutte contre ces maladies et font de nos modèles des outils translationnels très pertinents. Bien qu'une première phase de sélection des meilleurs composés soit effectuée sur des modèles acellulaires ou cellulaires, contribuant ainsi à l’utilisation de méthodes alternatives visant à remplacer partiellement l’utilisation des animaux comme nous le rappelle la règle des 3R’s, l’évaluation finale du potentiel thérapeutique des produits dans des modèles animaux reste cependant nécessaire. Le recours à l'emploi d’un animal vivant permet d’évaluer la réelle efficacité des composés dans un système biologique complexe et «global », capable de métaboliser les principes actifs donc de déceler les effets secondaires, capable d'activer toutes les voies de signalisation qui participent à la caractérisation de ce modèle. Son remplacement à ce stade du projet scientifique (phase pré clinique) n'est pas envisageable dans une système biologique isolé ou cellulaire qui quel que soit sa nature ne pourra apporter tous les enseignements issus de l'expérimentation in vivo.
Réduction
La stratégie de réduction consiste à ne réaliser que les essais avec les composés les plus prometteurs ayant satisfait aux étapes de sélection préliminaires in vitro. La réduction du nombre d'animaux est motivée par la longueur/lourdeur des procédures expérimentales, cela nous a conduit lors d'essais pilotes ou préliminaires de cibler le juste nombre d'individus nécessaires à l'obtention de résultats pertinents. Les paramètres que nous étudions in vivo (bio marqueurs, induction/répression de gènes, effets histologiques etc) doivent être relevants. Nous écartons les paramètres dont la pertinence serait trop faible pour être statistiquement décelable qu'avec des effectifs trop importants. Nous disposons de données expérimentales ou publiées dans la littérature sur les paramètres biologiques ou biomarqueurs les plus pertinents et "robustes". La connaissance de la variance de ces biomarqueurs permet de définir un effectif théorique à l'aide du test statistique de Welsh qui associe variance et probabilité d'atteinte d'un seuil de significativité. Cette approche statistique permet d'affiner les effectifs et de réduire donc les nombres d'animaux qui seraient surévalués et non nécessaires à l'obtention d'un résultat biologique relevant. Les administrations par voie veineuse de manière répétées peuvent présenter des difficultés techniques qui obligent parfois à augmenter les effectifs des groupes (échec des injections à combler), la possibilité des injections multiples ou continues sur es des animaux cathétérisées est de ce point un avantage car cela permet de réduire le nombre d'animaux au strict nécessaire.
Raffinement
Les rats sont hébergés par paire , les souris par trio , l’enrichissement du milieu est systématisé par l’apport de dispositifs permettant aux animaux de rongeur (blocs ou billes des bois), un apport de coton compressé permet de maintenir l’instinct de création du nid, des tunnels en polycarbonate transparent teinté en rouge sont placés dans les cages pour apporter un espace simulant la dissimulation et favorisant le maintien de l’instinct grégaire des rats. Nous avons opté pour la pose de cathéters qui offrent un accès à l’aide d’un bouton métallique bouché par un obturateur aimanté qui présente l’avantage de pouvoir faire cohabiter les animaux dans une même cage sans crainte d’arrachage du cathéter par les congénères, cela constitue une amélioration significative du bien-être des animaux. L'établissement de points limites dans ce modèle expérimental de défaillance hépatique nous permet d'écarter tout individu susceptible de subir un inconfort trop important ou de la douleur. Bien conscient que nous développons dans ce projet des modèles sévères, nous nous efforçons d'avoir recours à des moyens analgésiques adaptés et non confondants. La pathologie et les mécanismes qui la déclenchent sont en partie connus, l'emballement inflammatoire en est une composante, le recours à des moyens de lutte contre la douleur peut introduire un biais expérimental ; une étape de validation s’impose pour chaque situation.
Choix des espèces
La littérature scientifique, est riche sur la cirrhose du foie, les rongeurs sont de bons répondeurs aux stimuli métaboliques, (condition importante dans ce projet.), mais il faut noter que la réponse du rat à l’induction de la fibrose (composant nécessaire à l’apparition de la cirrhose) est meilleure que celle de la souris. Dans le cas où il n’y a pas de différences majeures entre les espèces, le choix de l’espèce peut être strictement économique. L’hébergement des souris de petite taille est plus aisé. La souris nécessite 10 fois moins de réactifs ou médicaments parfois rare et précieux ou onéreux que le rat. La contrainte de la souris de petite taille est que les volumes d’échantillons biologiques obtenus sont limités, et on obtient moins d’informations scientifique à partir d’un seuil animal. Le recours dans ce cas au rat peut présenter des avantages.
Rôle des circuits thalamo-corticaux dans les déficits d’attention dans l’autisme
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Maintenues à 90 ou 95 % de leur poids initial par un rationnement alimentaire pouvant durer deux mois, les souris doivent rester assez affamées pour travailler contre une récompense. 560 souris porteuses d'une mutation modélisant l'autisme vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie d'entre elles subit une chirurgie cérébrale d'environ une heure pour l'injection d'un virus et l'implantation de fibres, avec inconfort, fatigue et parfois douleur dans les jours qui suivent. Ce rationnement, dont le porteur juge l'impact très faible, accompagne une "claire perspective translationnelle" annoncée pour le trouble du spectre autistique, quand l'expérience consiste à faire exécuter une tâche d'attention une heure par jour pendant deux mois.
Objectifs
Les déficits attentionnels affectent une large proportion des autistes (jusqu’à 80%). De récentes études suggèrent que les difficultés sensorielles et attentionnelles des autistes seraient étroitement liées. Ainsi, les autistes auraient des difficultés à sélectionner les stimuli sensoriels appropriés, ce qui entrainerait une surcharge cognitive. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle que joue l’attention dans le trouble du spectre de l’autisme. Plus précisément, ce projet examinera l’implication de différentes régions du cerveau et leur interaction lors d’une tâche comportementale permettant d’évaluer la capacité de transition attentionnelle dans un modèle transgénique d’autisme chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure connaissance des structures et circuits impliqués dans l’attention ainsi qu’une meilleure compréhension de l’implication des déficits attentionnels dans un modèle animal d’autisme. Ce projet fondamental a donc une claire perspective translationnelle, en particulier pour le trouble du spectre autistique.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une tâche comportementale d'environ 1h/jour pendant 2 mois maximum ainsi qu'à un rationnement alimentaire léger qui n'exédera pas deux mois. Les animaux de la procdure 2 subiront une chirurgie cérébrale qui dure en moyenne 1h.
Impact sur les animaux
Les chirurgies d’injection intra cérébrale de virus et d’implantation de fibres présentent un risque de diminution du bien-être animal dans les moments/jours qui suivent la chirurgie (inconfort, fatigue et parfois douleur). Afin de garantir la motivation des animaux pour la tâche comportementale ils seront mis en rationnement alimentaire léger (pour les maintenir à 90-95% de leur poids corporel initial) ce qui impacte très peu leur bien-être (légère sensation de faim garantissant la motivation des animaux à obtenir une récompense alimentaire). Cette restriction temporaire est en partie compensée par la nourriture obtenue au cours de la tâche comportementale.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour l’analyse des marqueurs biologiques et les vérifications anatomiques.
Remplacement
Elucider les bases neuronales de fonctions cognitives ne peut, par définition, s’étudier que chez des organismes entiers. L’approche cognitive chez l’humain n’autorise pas la manipulation fine des circuits neuronaux qui est nécessaire à la compréhension de leur fonctionnement. De plus, les espèces d'invertébrés n'ont pas la capacité pour les comportements décisionnels étudiés dans ce projet et, à l'heure actuelle, ces comportements n'ont été démontrés que chez les mammifères et les corvidés. De même, l’approche neurocomputationelle faisant appel à la modélisation est utile, mais complémentaire des approches invasives in vivo permettant de vérifier la véracité des modèles prédictifs. Dans ce contexte il demeure nécessaire d’avoir recours à l’expérimentation animale.
Réduction
Nous cherchons à utiliser le nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs et exploitables. Le nombre d’animaux par groupe est le minimum requis pour que nos tests conservent assez de puissance en tenant compte des pertes inévitables. Le recours à des méthodes réversibles (inactivation transitoire de certaines voies anatomiques par la technique d’optogénétique) permet de diminuer le nombre d’animaux nécessaire.
Raffinement
Le bien-être animal étant essentiel pour garantir des données comportementales exploitables dans notre recherche, toute souffrance sera évitée. Les animaux bénéficieront d’un enrichissement adapté (matériel de nidification, maisonnette) et seront hébergés en cage collective. Les protocoles de chirurgie ont été optimisés afin de garantir des conditions optimales (analgésie centrale, locale, gel oculaire, tapis chauffant, scoring post-opératoire). Le suivi post-opératoire sera effectué quotidiennement pendant 7 jours pour s’assurer de la récupération complète des souris. Des points limites généraux et spécifiques ont été identifiés afin de permettre une prise en charge optimale de la douleur et de l’inconfort. Tous les expérimentateurs et soigneurs sont formés et compétents dans les procédures requises pour ce projet et ont suivi les formations obligatoires.
Choix des espèces
D’une façon générale les rongeurs sont un bon modèle d’étude du système nerveux. De plus, de nombreuses épreuves comportementales spécifiques permettent de modéliser chez la souris des aptitudes cognitives complexes que l’on retrouve chez l’humain. Enfin, la souris permet l’utilisation de modèles transgéniques, dans notre cas un modèle induisant un phénotype autistique. Les animaux utilisés pour ce projet seront des jeunes âgés de 6-8 semaines au début des expérimentations. Ils atteindront 10-12 semaines avant le début des chirurgies et des protocoles comportementaux afin de limiter la variabilité de taille. Cet âge a également été choisi pour être cohérent avec les données de la littérature.
Rôle des changements épigénétiques liés à l’âge sur les fonctions remyélinisantes et cognitives des cellules oligodendrogliales
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour décrire comment le vieillissement de certaines cellules du cerveau limite la mémorisation et la réparation, 450 souris d'une lignée transgénique conçue pour modéliser ce vieillissement vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent un punch d'oreille qui les marque à vie, cinq semaines d'alimentation supplémentée par une substance qui altère la myélinisation du cerveau, puis une injection avant leur mise à mort. Les essais comportementaux dont le porteur tire son effectif de dix souris par groupe, par âge et par génotype, n'apparaissent pas dans la description des procédures. La pesée hebdomadaire tient lieu de seuil: si l'état général se dégrade ou si la perte de poids est jugée importante, les souris sont tuées.
Objectifs
Nos capacités de mémorisation et réparation du cerveau diminuent avec l’âge. Si les neurones sont à la base de l'organisation du cerveau, des études récentes ont aussi mis en évidence le rôle des cellules non-neuronales. Tout particulièrement, les cellules oligodendrogliales (qui myélinisent les neurones) semblent jouer un rôle essentiel dans le cerveau. Notre équipe a récemment développé une lignée de souris transgénique, qui modélise le vieillissement des cellules oligodendrogliales du cerveau. Dans ce projet, nous allons 1/ Décrire comment le vieillissement de cellules du cerveau limitent les capacités de réparation ; 2/ Décrire comment le vieillissement de cellules du cerveau limitent les capacités de mémorisation. Notre projet pourrait ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques intéressantes pour la maladie d’Alzheimer et les démences associées au vieillissement.
Bénéfices attendus
Nous espérons que ce projet répondra aux besoins scientifiques suivants. À court terme : une meilleure compréhension du rôle des cellules oligodendrogliales dans le vieillissement, en particulier dans les capacités de mémorisation et réparation. À long terme : développer des stratégies pour rajeunir les cellules oligodendrogliales, pour favoriser les fonctions cognitives dans le vieillissement et les maladies liées à l'âge, comme dans la maladie d’Alzheimer. Le déclin de la cognition cérébrale représente un problème majeur de santé publique, car les déficits d'apprentissage développemental et la démence liée à l'âge peuvent fortement affecter la qualité de vie des personnes et les dépenses de santé globales.
Procédures
Les souris seront soumises à un bref (5 secondes, une fois) punch d'oreille. Les souris seront nourries avec de l’alimentation supplémentée (en continu, à volonté, pendant 5 semaines). Les souris seront injectées avec un analgésique et anesthétique, avant mises à mort (1 minute, une fois).
Impact sur les animaux
Le punch à l’oreille entrainera une douleur légère de courte durée et marquage permanent. L’administration de l’analgésique et de l’anesthésie entraînera une douleur légère de courte durée.
Devenir
Toutes les cohortes expérimentales seront euthanasiées à la fin de l'étude, afin de corréler l'analyse comportementale par une analyse au niveau moléculaire et/ou cellulaire.
Remplacement
Si des progrès ont été réalisés pour modéliser les pathologies et la connectivité neuronale dans les cultures (organoïdes par exemple), ces modèles ne suffisent pas à appréhender pleinement les fonctions et dysfonctionnements cognitifs au niveau de l'organisme. À l'heure actuelle, il est nécessaire d'utiliser des modèles de souris pour mieux aborder le rôle de cellules spécifiques dans la mémoire et l'apprentissage. En parallèle, quand possible, nous exploitons des modèles cultures cellulaires, dont des lignées ou des cellules souches pluripotentes.
Réduction
Afin de calculer au plus juste le nombre d'animaux nécessaires dans chaque procédure expérimentale afin de détecter un effet statistiquement pertinent, nous avons effectué une analyse de puissance grâce à plusieurs tests statistiques. En raison de la variabilité interindividuelle, nous avons prévu d'inclure 10 souris par groupe, pour chacun des essais comportementaux, chaque âge et génotype. Nous n'avons remarqué aucune différence de comportement entre les sexes lors de nos études précédentes, nos cohortes seront donc composées de souris des deux sexes, à parité.
Raffinement
Sous le traitement alimentaire supplémenté, les animaux seront nourris avec des croquettes alimentaires complémentées avec une substance qui affecte la myélinisation du cerveau. L’alimentation, à volonté, sera changée tous les 2 jours. Les animaux seront pesés une fois par semaine. Nous avons défini des points limites et nous appliquerons une grille de score. Si l'état général de l’animal se dégrade ou si la perte de poids est importante, les souris seront mises à mort.
Choix des espèces
Les modèles de souris sont pertinents car ils nous permettent de faire des études comportementales, et d’adresser les changements de mémorisation et d’apprentissage. Les souris adultes seront utilisées à l'âge de 2 mois, 9 mois et 12 mois. Les différents âges nous permettent de comparer les souris jeunes, adultes, et âgées.
Etude du rôle de d’une protéine d’intérêt dans un modèle de souris de la maladie d’Alzheimer (1/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Soumises à quatre tests comportementaux d'une semaine chacun, entrecoupés d'une semaine de repos, 804 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent aussi une biopsie pour le génotypage et développent, à partir de quatre mois, les troubles cognitifs de leur lignée. Les tests censés mesurer leurs capacités mémorielles ne sont pas nommés, et l'objet du projet se limite à une "protéine d'intérêt" qui n'est pas davantage identifiée, dans un modèle de la maladie d'Alzheimer réparti sur deux établissements. Les souris qui ne portent pas le génotype recherché sont tuées faute d'usage, les autres avant huit mois, pour éviter les souffrances liées à un phénotype dommageable qui apparaît à douze mois et que la lignée a été construite pour porter.
Objectifs
L'objectif principal de ce projet est d'étudier le rôle d'une protéine d'intérêt dans le développement et la progression de la maladie d'alzheimer. Le projet se deroulera dans deux établissements utilisateurs notés EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait conduire au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ou préventives pour ralentir et/ou limiter le développement de la maladie d'Alzheimer.
Procédures
Les animaux adultes seront soumis à quatres tests comportementaux qui durent chacun environ 1 semaines. Les animaux seront mis au repos pendant une semaine entre chaque test. Ces tests permettent de mesurer les capacités mémorielles des animaux et seront réalisés dans l'EU2. Les élevages se dérouleront dans l'EU1.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront développer une légère douleur lors des biopsies pour le génotypage et des effets indésirables au cours des contraintes liées aux test comportementaux. Ces effets indésirables seront de l'ordre de l'angoisse et du stress de courte durée lorsque les animaux seront placés dans des environnements différents et multiples pour les tests comportementaux. Des effets indésirables liés aux troubles cognitifs se développant à partir de 4 mois peuvent aussi apparaitre.
Devenir
Les animaux sans génotypes d’intérêt pour le projet sont mis à mort. Les animaux ayant les bons génotypes seront mis à mort après les tests comportementaux, à l'age de 8 mois au plus tard, pour éviter les souffrances liées à leur phénotype dommageable exprimé à partir de 12 mois.
Remplacement
L'objectif de ce projet est de mettre en évidence le rôle d'une protéine inhibitrice de protéase dans un modèle expérimental de la maladie d'Alzheimer. Le projet met en jeu des explorations comportementales sur animal vigile qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro.
Réduction
Pour respecter le principe de réduction, le nombre de souris utilisées sera réduit à son minimum (analyses de paramètre multiples pour chaque souris et utilisation de tests statistiques adaptés). L’étude sera arrêtée si les expérimentations initiales invalident l’hypothèse de travail. Des prélèvements auront lieu pour des analyses histologiques afin d’extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Un nombre minimal et homogène d’animaux par étude est utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique. Des tests statistiques précis permettront de s'assurer de la significativité des résultats et un calcul de puissance a permis de dimensionner les groupes expérimentaux.
Raffinement
Pour assurer le bien-être des souris, elles seront placées en cage groupées dans un milieu enrichi. Les souris seront sous surveillance journalière et des points limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Durant le transfert des animaux entre les deux EU, les animaux seront transportés dans des boites de transports du type safebox contenant litière et enrichissement, elles-mêmes placées dans des sacs opaques à la lumière pour limiter le stress des animaux.
Choix des espèces
Les tests de comportement étant la méthode de choix pour tester l'efficacité d'une voie thérapeutique dans la maladie d'Alzheimer, nous avons besoin d'utiliser un organisme vertébré pour nos expériences in vivo. Le modèle souris est un bon modèle pour les raisons suivantes : - Plusieurs lignées transgéniques murines modélisant la maladie d'Alzheimer existent et sont disponibles commercialement. - Nous disposons de nombreux outils spécifiques de la souris (sondes pour hybridation in situ, immunohistologie, tests comportementaux). - La durée de vie des souris et leur capacité reproductive sont particulièrement adaptées à ce projet. Les souris adultes agées de 6 mois seront utilisées. A cet âge, les souris ont des défauts cognitifs détectables par des tests comportementaux et qui seront eventuellement modulés par l'absence ou la surexpression de notre protéine d'intérêt.
Études thérapeutiques contre l’infection par Aspergillus
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
9 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent deux injections intrapéritonéales et deux instillations intranasales sous anesthésie, par lesquelles Aspergillus fumigatus leur est inoculé après un traitement qui affaiblit leurs défenses immunitaires, l'infection provoquant poil hérissé, mobilité réduite et perte de poids. Dans la majorité des expériences, les souris sont tuées avant l'apparition des signes d'infection, et celles qui atteignent le score limite sont mises à mort. Le porteur justifie ce recours par le fait que l'effet des molécules à l'étude reste inconnu "à l'intérieur, dans la vie réelle", et qualifie l'expérimentation animale d'"indispensable".
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont d'identifier les molécules (endogènes ou exogènes) qui peuvent améliorer l'issue de l'infection à Aspergillus. Il a été démontré que les facteurs humoraux de l'immunité innée sont importants dans l’élimination d'Aspergillus dans les poumons, et certains de ces facteurs disparaissent des poumons chez les patients infectés. L’un de ces facteurs, la protéine surfactante SP-D, a montré un potentiel thérapeutique dans le modèle pré-clinique d’aspergillose invasive pulmonaire (IPA) chez la souris, améliorant l’issue fatale sans toutefois offrir une protection totale. Dans ce projet nous allons combiner différentes approches incluant des molécules ayant un effet antifongique direct et des molécules importantes pour la réponse immunitaire mais qui sont absentes chez les patients immunodéprimés infectés, afin d’obtenir un maximum de protection. Le premier objectif de ce projet est de déterminer si les traitements à effet immunodépresseur pris par les personnes à risque d’Aspergillose affectent les molécules de l'hôte essentielles au contrôle des premiers stades de l'infection. En l’absence d’infection, nous comparerons donc les facteurs présents dans les poumons de souris recevant le traitement à effet immunodépresseurs à ceux de souris recevant la solution véhicule. Le deuxième objectif est d'évaluer de nouvelles molécules thérapeutiques dans un modèle d'infection d'aspergillose invasive. La résistance à l’infection sera surveillée, et les marqueurs de résistance à l’infection (charge fongique, dommage des tissus, marqueurs immunologiques) seront mesurés dans les poumons. Toutes ces études ne peuvent être remplacées par des techniques in vitro et sont essentielles pour le développement de toute nouvelle thérapie ou application médicale.
Bénéfices attendus
Le projet identifiera les facteurs humoraux de l'immunité de l'hôte susceptibles d'être régulés différemment sous traitement à effet immunodépresseur, ce qui pourrait fournir des informations cruciales sur la reconstitution possible de ces facteurs humoraux en tant que stratégies thérapeutiques pour l'aspergillose pulmonaire. Le projet fournira également des résultats pré-cliniques de molécules antifongiques dans l'aspergillose pulmonaire.
Procédures
Certains animaux auront, selon les procédures : 2 injections intrapéritonéales par animal (moins de 10 secondes) 2 instillations intranasales par animal sous anesthésie (de 20 à 30 secondes)
Impact sur les animaux
Une nuisance légère de courte durée sans incidence significative sur le bien-être ou l’état général des animaux sera associée aux injections intrapéritonéales. Les dommages escomptés dans ces expériences sont liés à l’objectif visant à identifier les molécules (endogènes ou exogènes) qui peuvent améliorer l'issue de l'infection à Aspergillus. Aspergillus fumigatus sera inoculé aux souris et induira des signes cliniques d’infections (poil hérissé, mobilité réduite, perte de poids). Dans la majorité des expériences, les animaux seront mis à mort avant que les signes d’infections apparaissent.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car nous devrons prélever en fin de procédures certains organes vitaux pour analyse.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale est indispensable, car bien que nous ayons étudié in vitro l’effet des molécules à potentiel thérapeutique chez l’homme, nous ne connaissons toujours pas comment elles fonctionnent « à l’intérieur », dans la vie réelle, ce qui est essentiel pour envisager des traitements thérapeutiques contre l’infection d’aspergillose invasive du poumon (IPA). De plus, comprendre les mécanismes « in vivo » nécessite l’utilisation de mammifères possédant un système immunitaire, une anatomie et une pathogenèse similaire à l’homme, excluant l’utilisation des invertébrés. En effet, ces derniers peuvent être utilisés dans certaines études d’infections systémiques, mais notre étude nécessite la présence de poumons et d’un système respiratoire, couplé au système vasculaire circulatoire, ainsi qu’un système immunitaire complexe. Enfin, le modèle mammifère pré-clinique d’IPA développé par la communauté scientifique mime l’IPA humaine, n’affectant les souris qu’après traitement à effet immunodépresseur . D’importance, les défenses immunitaires de la souris lors de l’Aspergillose sont proches de celles de l’homme et la maladie est très similaire à l’aspergillose invasive humaine. Ce modèle a d’ailleurs été utilisé pour les études de traitement contre l’IPA et nos résultats seront donc conformes et comparables aux autres études.
Réduction
Le nombre de souris nécessaires à ce projet est évalué à 9680 sur 5 ans. Ce nombre a été déterminé après analyses statistiques préalables permettant de déterminer à partir de combien de sujets une mesure est exploitable scientifiquement, et ce dans le souci de n’utiliser que le strict nécessaire d’individus tout en récupérant le maximum d’information par animal. Lorsque la technique d’analyse des tissus le permet, nous combinons un même animal pour plusieurs analyses inflammatoires et infectieuses (l’analyse protéomique des réponses inflammatoires et de la charge fongique peuvent être effectue sur les mêmes poumons).
Raffinement
Le suivi des animaux, selon une liste de signes cliniques, permettra d’attribuer un score quantitatif du bien-être des animaux tel que décrit par la structure du bien-être animal. Des aides alimentaires (type gel hydrique) et une réhydratation sous-cutanée avec de la solution saline seront mises en place au besoin. Si un animal atteint le score limite, il sera mis à mort.
Choix des espèces
L’aspergillose expérimentale chez la souris reproduit la pathologie observée chez l’homme, avec un développement pulmonaire qui se produit exclusivement lorsque l’animal est immunodéprimé, comme c’est le cas après un traitement par un immunodépresseur transitoire. Ce modèle développé par la communauté scientifique et clinique étudiant A. fumigatus permets l’étude de traitement thérapeutique en phase pré-clinique. Les souris utilisées seront adultes, âgées de 7 à 11 semaines. Le choix de ce stade de développement permet d'avoir des souris dont le système immunitaire est complètement développé et dont les poumons ont atteint leur taille définitive.
Etude de l’effet de l’hypoxie intermittente sur un modèle de rétinopathie induite par l’oxygène dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
3 360 souris vont être utilisées, chacune passant cinq jours en hyperoxie puis quatre à dix jours en hypoxie intermittente, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Certains souriceaux reçoivent dès huit jours de vie une injection dans l'œil sous anesthésie, et subissent jusqu'à cinq examens d'imagerie rétinienne également sous anesthésie, un régime alimentaire particulier pouvant durer quatre mois. Les bénéfices annoncés se limitent à mettre en évidence de "potentielles" cibles thérapeutiques contre la rétinopathie du prématuré, quand le porteur reconnaît que le retour à l'air ambiant est mal supporté et peut provoquer une détresse respiratoire. Les mères sont tuées dès la sortie du caisson pour cette raison, les souriceaux étant confiés à des femelles Swiss présentées comme de bonnes mères adoptantes avant d'être tués à leur tour pour les prélèvements.
Objectifs
La rétinopathie du prématuré (ROP) est un trouble oculaire potentiellement cécitant qui affecte les prématurés. Elle survient lorsque les vaisseaux sanguins de la rétine se développent anormalement. Chez les prématurés, les vaisseaux sanguins de la rétine ne sont pas complètement formés à la naissance et, par conséquent, ils peuvent être perturbés par des facteurs tels que l'oxygénothérapie et d'autres traitements médicaux L'hyperoxie fait référence à un état d'augmentation des niveaux d'oxygène ou à une concentration d'oxygène supérieure à la normale. L'hypoxie se caractérise par des niveaux d'oxygène réduits ou une concentration d'oxygène inférieure à la normale. La concentration normale d’oxygène dans l’air ambiant (normoxie) est de 20.9 pourcent. La rétinopathie désigne toute lésion de la rétine des yeux pouvant entraîner une déficience visuelle. La rétinopathie fait souvent référence à une maladie vasculaire rétinienne ou à des lésions de la rétine causées par un flux sanguin anormal. L'angiogenèse est le processus physiologique de formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux sanguins préexistants. La néovascularisation fait référence à la formation de nouveaux vaisseaux sanguins, en particulier à une croissance anormale ou excessive des vaisseaux.
Bénéfices attendus
La rétinopathie du premature (ROP) est un trouble de la rétine qui peut entraîner une perte de vision importante chez les prématurés. La rétinopathie du prématuré est le résultat de perturbations du développement déclenchées par plusieurs facteurs, dont le niveau d'oxygénation. En France et en Europe, environ 30 pourcent des prématurés de moins de 31 semaines d'âge gestationnel développent une ROP. Le projet permettra de mieux comprendre pourquoi le risque de maladies rétiniennes sévères chez les individus prématurés est augmenté lorsqu’ils souffrent d'apnée du sommeil. Elle permettra de définir les mécanismes et les expressions géniques qui entrent en jeu. Cela permettra de mettre en évidence de potentielles cibles thérapeutiques chez l’Homme.
Procédures
Les animaux seront soumis à des variations de concentrations d’oxygène (hyperoxie pendant 5 jours et hypoxie intermittente pendant 4 ou 10 jours). Certains recevront des injections intraoculaires (qui durent entre 2 et 3 minutes), une fois, sous anesthésie. Des tests d'imagerie rétinienne et fonctionnelle (5-10 min par test) seront réalisés sous anesthésie (2 ou 5 fois par animal, selon le groupe, avec un intervalle minimum d’une semaine). Certains animaux recevront un régime particulier pendant maximum 4 mois.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à une stabulation dans un environnement modifié (hyperoxie ou hypoxie). Le modèle d’hyperoxie peut induire chez les adultes une difficulté de réadaptation en conditions standard, ce qui peut provoquer une détresse respiratoire. Certains souriceaux subiront une injection intraoculaire. Dans de rare cas, cela peut induire une inflammation localisée de l’œil. L'anesthésie générale peut entrainer chez la souris une hypothermie avec un possible arrêt cardio-respiratoire. La contention légère de l'animal pour les injections intra péritonéales et les examens de l'œil peuvent entrainer un léger stress des animaux. Les injections intrapéritonéales entrainent également une douleur légère de courte durée liée à la piqure de l’aiguille. Le changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme, changement de régime alimentaire) peut aussi générer un léger stress chez ces derniers.
Devenir
L’ensemble des animaux seront euthanasiés à l’issu de chaque procédure. Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem sur les souriceaux, cela implique donc leur euthanasie. Les mères, ne pouvant être replacées, seront également euthanasiées.
Remplacement
Les études in vitro ne permettent pas l’étude des signes cliniques de la pathologie de l’oeil en particulier ; la souris est une des espèces les plus appropriées pour ce type d’étude. Ces modèles permettent d’étudier la maladie dans un organisme entier, qui ne peut pas être reproduit en utilisant des cultures de cellules isolées provenant de différents tissus.
Réduction
Pour cette étude nous utiliserons un total de 3360 souris. Nous devons répéter les expériences (5 expériences/groupe expérimental) en raison de la grande variabilité dans le développement de la pathologie entre les souris d'un même lot. Nous avons limité au maximum le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement interprétables selon nos précédentes expériences (variabilité inter- animal/ inter - expériences). Le nombre de 6 animaux défini par groupe est le minimum requis pour obtenir des résultats interprétables et atteindre l’objectif scientifique défini dans ce projet, selon nos expériences antérieures.
Raffinement
Les animaux sont hébergés par portée dans des cages ventilées ou caissons d’expérimentation. Les cages comportent plusieurs cotons et une petite maisonnette pour pouvoir faire leur nid. Les animaux sont hébergés avec alimentation et abreuvement à volonté. Lors des expériences de d’hyperoxie et d’hypoxie, les animaux sont stabulés dans des cages ayant les mêmes dimensions qu’en stabulation normale, avec les mêmes enrichissements. Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la règlementation. Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. Suite à l’hyperoxie, le retour en condition de normoxie est mal supporté par les mères et peut induire une détresse respiratoire, afin d’éviter cela nous euthanasions les mères dès le retour en normoxie. Les souriceaux bénéficieront d’une mère adoptante swiss à la sortie du caisson. En effet, les souris Swiss sont connues pour être de bonnes mères adoptantes. Certains souriceaux subiront une injection intraoculaire sous anesthésie générale et anesthésie locale. L’animal est placé sur tapis chauffant durant l’anesthésie pour prévenir le risque d’hypothermie.
Choix des espèces
Les souris sont utilisées pour ces expériences car elles constituent un modèle bien établi pour étudier les pathologies de la rétine. La souris est un animal petit, facilement manipulable, qui se reproduit bien. En outre, l’étude des mécanismes physiopathologiques conduisant à la dégénérescence rétinienne sur la souris a été validée par de nombreuses publications, et ce modèle offre l’avantage de multiples options pour les analyses. De plus, notre projet nécessite l'utilisation de souris car c'est l'espèce dans laquelle a été développé le modèle de rétinopathie induite par l’oxygène et l’hypoxie intermittente. Pour le modèle de rétinopathie induite par l’oxygène, les animaux seront utilisés dès 8 jours de vie. En effet, chez la souris la vascularisation rétinienne se développe à la naissance jusqu’à 21 jours. Les variations d’oxygénation déclenchent une néovascularisation que pendant la vasculogenèse rétinienne qui a lieu les 3 premières semaines de vie de la souris. L’hyperoxygénation entre 8 et 13 jours de vie entraine une perte des vaisseaux. Au retour en normoxie à 13 jours l’hypoxie relative mène à une néovascularisation pathologique.
Etude des voies nerveuses impliquées dans le contrôle de la transmission sensorielle chez la souris : modèle de la maladie de Parkinson
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Choisies parce que seules leurs lignées transgéniques permettent de cibler les populations de neurones visées, 5 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 2 520 d'entre elles en gravité sévère. Chaque animal reçoit deux chirurgies sous anesthésie, une heure trente sur le cerveau et quarante-cinq minutes sur la moelle épinière, puis trois injections intrathécales et cinq heures d'électrophysiologie, 4 320 subissant en plus une perfusion intracardiaque. Les sept tests comportementaux annoncés, répétés trois fois par animal, ne sont pas nommés, et le porteur signale des saignements, une douleur postchirurgicale, des infections de suture et une hypersensibilité mécanique et thermique causée par l'application répétée des stimuli. La mise à mort sert à l'analyse histologique des cerveaux et des moelles épinières.
Objectifs
La maladie de parkinson (MP) est une maladie neurodégénérative caractérisée par la lésion des neurones à dopamine, neurotransmetteur jouant un rôle clé dans la communication entre les neurones et plus spécifiquement dans la MP. La région précise du cerveau concernée est appelée la substance noire compacte (SNc). Ceci provoque la dégénérescence des voies de communication entre des structures impliquées dans la motricité avec l’apparition des symptômes moteurs handicapants. En plus des symptômes moteurs, la MP est caractérisée par des symptômes non-moteurs qui affectent la qualité de vie des patients y compris les sensations douloureuses. Il est donc important d’identifier et de comprendre le fonctionnement les circuits neuronaux au sein du cerveau, mais aussi ceux impliqués dans les échanges entre le cerveau et la moelle épinière afin d’apporter un éclairage sur le dysfonctionnement du système nerveux dans la maladie. Ce projet vise donc à étudier dans le contexte de la MP le fonctionnement des neurones de la moelle épinière lombaire en lien avec des structures du cerveau produisant des neurotransmetteurs spécifiques (dopamine, sérotonine, noradrénaline et glutamate) et qui jouent un rôle clé dans cette maladie et les symptômes douloureux associés. Cette étude sera conduite sur un modèle expérimental de la MP chez la souris sauvage et transgénique. Nous pourrons ainsi apporter une avancée dans la connaissance de la physiopathologie de la maladie de parkinson.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compréhension de la connexion entre le cerveau et la moelle épinière et son implication dans un modèle expérimental de la maladie de Parkinson. Il apportera une avancée dans la connaissance de la physiopathologie de la pathologie.
Procédures
Chirurgie : 5040 animaux recevront 2 chirurgies sous anesthésie au niveau du cerveau et dans la moelle épinière : durée moyenne 1h30 pour le cerveau et 45min pour la moelle Tests comportementaux : 5040 animaux recevront 7 tests comportementaux sans anesthésies 3 fois d'une durée moyenne de 30min par test Injections intrathécales : 5040 animaux recevront 3 injections intrathécales sous anesthésies durée moyenne de 2 min Electrophysiologie : 5040 animaux seront soumis à cette approche sous anesthésie d'une durée moyenne de 5h Perfusions intracardiaques : 4320 animaux subieront une perfusion intracardiaque sous anesthésie
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux sont inhérents à l'induction de la maladie de Parkinson qui induit un déficit moteur (réduction d'activité locomotrice, perte de poids). Les effets sont liés aux différentes chirurgies d’injection de virus dans le cerveau et/ou la moelle épinière. Ils comprennent : le saignement, la douleur postchirurgicale, l’infection de la suture et la perte de l’implant. Le saignement peut aussi apparaître suite à l'injection intrathécale répétée. Certains effets indésirables pourraient également survenir à la suite du comportement sensoriel tels qu’une hypersensibilité mécanique et thermique causée par l’application répétée des différents stimuli.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort à la fin de l'expérimentation afin de procéder à l'analyse histologique des cerveaux et des moelles épinières.
Remplacement
En accord avec la Directive Européenne et le principe des 3Rs, le recours au modèle animal reste la seule alternative pour la réalisation de cette étude qui nécessite une évaluation comportementale et un ciblage de neurones spécifiques dans un organisme intégré. Le recours au modèle transgénique pour répondre aux questions scientifiques très spécifiques nous conforte dans cette décision. Aucun modèle in vitro ne peut reproduire de telles conditions.
Réduction
La réalisation de ce projet dans son ensemble concernera des souris mâles et femelles, ce qui permet d’inclure tous les animaux des portées. La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expériences, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. La réduction du nombre d’animaux est prise en compte tout en conservant une signification scientifique statistique qui tient compte de l’hétérogénéité inter-individuelle ainsi le nombre de souris utilisé dans chacun des groupes expérimentaux ne dépassera pas ainsi 15 animaux par groupe expérimentaux.
Raffinement
Tous les protocoles seront réalisés par des experts dans le domaine et sont ainsi optimisés pour soulager le stress et la douleur des animaux. Les animaux sont hébergés tout au long de l’expérimentation en cages collectives avec enrichissement du milieu (tunnel, maisonnette, cellulose pour le nid). Les animaux seront surveillés quotidiennement par l'expérimentateur avec une surveillance renforcée après les chirurgies jusqu’à la fin de l’expérimentation avec la mise en place d’une réhydratation, un réchauffement, des traitements vétérinaires si besoin. L’utilisation d’anesthésiques et d’analgésiques est prévue pour soulager les douleurs post-chirurgicales. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter toute souffrance et détecter d’éventuels signes cliniques (poids, apparence physique, comportements provoqués/non provoqués). En plus, des points limites spécifiques sont déterminés suite à la chirurgie (poids, mobilité, respiration, état de la suture).
Choix des espèces
La souris est un modèle animal très reproductible, permettant d'inclure le plus faible nombre d'animaux possible dans les protocoles. De plus, c’est un mammifère présentant une relation de parenté biologique avec l’espèce humaine. Enfin, les lignées transgéniques pour cibler des populations neuronales de cette n’existent que chez la souris, d’où le choix de travailler avec cette espèce. Les modèles utilisés doivent être réalisés à l’âge adulte lorsque les réseaux neuronaux sont mis en place et le système nerveux est mature. D’où le choix de souris adultes à partir de 8 semaines.
Déchiffrer le code de compatibilité entérofécal après transplantation de microbiote fécal pour contourner la resistance aux inhibiteurs des points de contrôle immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Une tumeur implantée, deux administrations orales de matières fécales murines, jusqu'à quatre injections d'immunothérapie et des prises de sang hebdomadaires: 1 508 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie d'entre elles subit en plus une intervention chirurgicale de cinq minutes sous anesthésie générale pour l'injection d'un traceur. Le porteur ramène les contraintes à une douleur et une gêne modérées liées à l'implantation de la tumeur, à un inconfort lors du gavage fécal et à une perte de poids possible. Il ne précise ni la nature du traceur, ni les immunothérapies employées, ni le calcul qui aboutit à cet effectif, dont il indique seulement qu'il découle d'un "nombre maximal théorique d'animaux par groupe".
Objectifs
Des précédentes études ont montré l'impact de la composition du microbiote intestinal (MI) sur la réponse immunitaire et la réponse aux traitements par immunothérapies contre le cancer. Il a d’abord été montré que la prise d’antibiotiques (ATB), en créant une dysbiose intestinale, est associée à une diminution de l’efficacité de ces immunothérapies dans de nombreux types de cancers. Puis, des compositions spécifiques du microbiote intestinale ont été mises en évidence comme étant associées à la réponse ou à la résistance aux immunothérapies. Ensuite, des travaux sur des modèles de souris ont permis de démontrer que la transplantation de microbiote fécal (TMF) à partir de selles de patients répondeurs ou résistants aux immunothérapies conduisait à la réponse ou à la résistance aux immunothérapies chez ces souris, respectivement. Finalement, la transplantation de microbiote fécal chez les patients parait être une approche efficace pour contourner la résistance aux immunothérapies induite par une dysbiose intestinale. Malgré des résultats prometteurs en clinique, il est nécessaire de comprendre les mécanismes qui expliquent la réussite ou l'échec de la transplantation de microbiote fécal à contourner la résistance aux immunothérapies. L'objectif principal de ce projet est de décrire les effets de la transplantation de microbiote fécal sur le système immunitaire et son implication dans la réponse antitumorale.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de comprendre les mécanismes expliquant la réussite ou l'échec de la transplantation de microbiote fécal à contourner la résistance aux immunothérapies. Cela permettra par la suite de mieux sélectionner les donneurs pour la transplantation, ainsi que de mieux sélectionner les patients pouvant recevoir la transplantation de microbiote fécal. De plus, ce projet apportera plus de compréhension sur les liens existants entre le microbiote intestinale, le cancer et la réponse aux immunothérapies. Enfin, par la compréhension des ces mécanismes, les patients ayant une dysbiose intestinale et résistants aux immunothérapies pourront bénéficier d'une tranplantation de microbiote fécal afin de contourner cette résistance.
Procédures
Les interventions prévues seront pour certaines procédures l'implantation d'une tumeur (une fois, d'une durée d'1 minute), l'administration orale de matières fécales murines (2 fois, durée 1 minute), l'administration de traitements d'immunothérapie (4 fois maximum, durée 1 minute), l'injection au niveau de la queue (une fois, durée 1 minute, anesthésie locale). De plus, il est prévu pour certaines procédures d'utiliser un traceur pour suivre la migration cellulaire, nécessitant une procédure chirurgicale, sous anesthésie générale, d'une durée de 5 minutes (une fois). Enfin, des prélèvements de sang seront réalisés, au maximum 1 fois par semaine (durée 5 minutes). Les injections seront réalisées sous anesthésie locale.
Impact sur les animaux
Les contraintes principales pour les animaux seront pour certaines procédures une douleur et une gêne modérée liée à l'implantation d'une tumeur, un inconfort lié à l'administration de matières fécales par voie orale au moment de l'administration, ainsi qu'une potentielle perte de poids liée à la tumeur, aux traitements et à l'administration des matières fécales.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure, afin de prélever les organes pour analyser les tissus, les cellules, doser des protéines ou de l'ADN.
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale, intestinale et périphérique et l’effet de la transplantation de microbiote fécal sur l'immunité et la réponse antitumorale, avec toutes les interactions nécessaires, impossibles à reproduire in vitro ou ex vivo.
Réduction
Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Par la suite, l’étude est divisée en plusieurs procédures séquentielles, dont certaines dites "GO-NO-GO", et sera arrêtée si une des procédures invalide l’hypothèse de travail ; le nombre de souris sera ainsi diminué. Le nombre d’animaux est scrupuleusement contrôlé afin de respecter la règle des 3R. Notre critère de jugement principal est le suivi de la croissance tumorale. D'après nos études antérieures avec des lignées tumorales, nous avons défini un nombre maximal théorique d'animaux par groupe. Cela a permis de définir le nombre d'animaux nécessaire et suffisant pour observer l'effet recherché. L'analyse des résultats sera faite en utilisant des méthodes statistiques.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être : stabulation conventionnelle, régime alimentaire normal et de l’eau ad libitum, ainsi qu’un enrichissement adapté. Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début de l’expérimentation. La surveillance régulière quotidienne permettra le suivi clinique de la souris ainsi que de son comportement, permettant l’éventuelle mise en place de mesures d'analgésie. Toutes les injections seront réalisées sous anesthésie locale. Les souris auront un examen clinique quotidien et des pesées régulières. Les points limites précoces seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques. La génétique et l'immunotlogie sont proches de celle de l’Homme et bien connues. La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques, la plus susceptible d’apporter les résultats satisfaisants pour nous au vu des objectifs du projet. Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et les effets des bactéries et de la transplantation de microbiote fécal sur l’immunité et la réponse antitumorale. Les animaux seront utilisés au stade adulte, à partir de 6-7 semaines de développement, les cancers cibles touchant l’adulte. De plus, à cette âge là, les animaux sont matures du point de vue immunologique.