Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
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- Système cardiaque
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- Système immunitaire
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- Système nerveux
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- Système urogénital
Identification du rôle d’une hormone dans la progression tumorale chez la souris 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Une injection intrapéritonéale d'une substance qui favorise les tumeurs, puis un irritant intestinal dans l'eau de boisson pendant trois cycles de cinq jours, et des mesures de tumeur au pied à coulisse trois fois par semaine. 2 016 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Le projet cherche à établir qu'en modulant le fer des globules blancs on renforce la réponse contre les tumeurs, preuve de concept présentée comme une piste thérapeutique. Le porteur annonce des points limites entraînant une mise à mort anticipée sans en préciser aucun, et dépose ce protocole en double, deux demandes de 2 016 souris publiées le même jour.
Objectifs
A ce jour, plusieurs moyens thérapeutiques existent pour lutter contre le cancer. Parmi eux, on retrouve des traitements dont le but est de stimuler notre système immunitaire afin de contrôler les cellules cancéreuses. Cette technique constitue un grand espoir pour l’amélioration de la survie des patients. Ces traitements sont essentiellement centrés sur les globules blancs, qui sont les principaux acteurs de la réponse anti-tumorale, capables d’éliminer les masses tumorales déjà formées. La fonction des les globules blancs est influencée par la composition de leur environnement, et nous proposons que le fer puisse être un de ses éléments. En effet, il est établi que le fer est un élément essentiel pour les cellules métaboliquement actives comme les globules blancs, car il est nécessaire pour un nombre important de réactions cellulaires. Notre hypothèse de travail est basée sur des données de la littérature selon lesquelles un milieu dépourvu de fer diminue la prolifération des globules blancs et la production de molécules anti-tumorales. La concentration sanguine du fer étant contrôlée par une hormone sécrétée majoritairement par le foie et qui favorise sa rétention dans les cellules, nous avons développé des modèles murins génétiquement modifiés afin d’induire une sur-expression ou une délétion de cette hormone spécifiquement dans les globules blancs. Grâce à ce projet, nous voulons apporter la preuve de concept qu’une modulation des niveaux de fer intracellulaire des globules blancs, médiée par l’hormone du fer, impacte leur prolifération et activation, et in fine leur réponse anti-tumorale. Ainsi, de nouveaux traitements centrés autour du fer pourraient voir le jour et garantir une meilleure qualité de vie aux patients, avec des traitements de faible toxicité.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle d’une hormone contrôlant les taux de fer de cellules immunitaires. Cela permettra de proposer des traitements modulateurs du fer qui pourront avoir un effet anti-tumoral ou d' améliorer l’efficacité des traitements déjà existants.
Procédures
Une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie générale (15 sec/souris) ou alternativement une injection intrapéritonéale d'une substance favorisant le développement de tumeurs (15 sec/souris) suivi de l'ingestion d'un irritant de l'intestin via l'eau de boisson pendant 3 cycles de 5 jours toutes les 2 semaines. Mesure de la croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse trois fois par semaine (30 sec/souris) jusqu'à fin de l'expérimentation ou mesure de la croissance tumorale par imagerie sous anesthésie générale toutes les deux semaines pendant 2 mois (5 minutes par souris).
Impact sur les animaux
L'injection intrapéritonéale et l'injection sous-cutanée de tumeurs peut entraîner un stress ou une douleur de courte durée chez les animaux. La croissance tumorale peut occasionner un stress, une gêne ou des douleurs aux animaux. L'irritant colique peut entraîner une perte de poids et être responsable de diarrhées et de risque de saignement et donc une souffrance des animaux. Enfin la manipulation des souris pour mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse ou les échographies peuvent également induire un stress chez les animaux. Le tatouage et biopsies de queue engendreront un stress et une douleur légère. Le transport entre les 2 animaleries peut également engendrer un stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes et analyse.
Remplacement
Les hypothèses testées chez l'animal ont préalablement été testées dans des systèmes in vitro et mises au point in vivo en se basant sur des données publiées de la littérature. Le recours aux modèles de tumeurs chez la souris nous permettra de caractériser les cellules immunitaires qui s'infiltrent et s'activent dans la tumeur . Ces paramètres ne peuvent pas être observés in vitro et le recours à l'animal est donc nécessaire dans le cadre de cette étude. Les souris sont âgées de 8 semaines au minimum car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature.
Réduction
Les effectifs ont été déterminés et les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés. L'utilisation de l'imagerie permet une surveillance non invasive de la croissance tumorale en évitant la mise à mort séquentielle d'animaux.
Raffinement
Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Les injections sous-cutanée et les imageries seront faites sous anesthésie générale. Des points-limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. L’état général des animaux sera suivi de manière quotidienne par le personnel qualifié de l'animalerie et très régulièrement par le responsable du projet. Lors du transfert, les souris seront mises dans des boites de transport avec de l'enrichissement et de la nourriture.
Choix des espèces
La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral. En effet, de nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. De plus, la disponibilité de modèles de souris transgéniques nous permet d'étudier le rôle de certains mécanismes dans le développement tumoral. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Nous utiliserons des souris adultes de 8 à 14 semaines car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier le développement tumoral.
Activité neuronale oscillatoire dans les circuits des ganglions de la base pendant le mouvement normal et pathologique: Au-delà des gammes de fréquences (2/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Deux chirurgies du cerveau de trois à cinq heures chacune, une IRM sous anesthésie de trois heures, puis des injections intramusculaires quotidiennes de MPTP cinq jours par semaine pendant jusqu'à six mois : 6 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Cette neurotoxine installe des symptômes parkinsoniens permanents, avec tremblements, rigidité musculaire, difficultés à s'alimenter, perte de poids et apparition d'escarres. Le porteur écrit qu'il n'est "pas nécessaire de réaliser davantage d'expériences sur les animaux si les données sont déjà disponibles quelque part dans le monde", et justifie pourtant ces six macaques par les "pratiques standards" du domaine. Tous sont tués et leur cerveau congelé pour localiser les électrodes, le choix entre macaque à longue queue et macaque rhésus dépendant selon lui des "possibilités d'approvisionnement" dans un contexte de pénurie de singes.
Objectifs
Dans la maladie de Parkinson, le ralentissement et l’absence de mouvements volontaires s’accompagnent d’activités oscillatoires anormales dans un réseau de structures localisées sous le cortex cérébral, aussi appelé les ganglions de la base. Néanmoins, le lien entre ces activités oscillatoires pathologiques et les troubles moteurs caractéristiques de la maladie de Parkinson reste flou malgré des décennies de recherche. D'une part, la concomitance entre la réduction/abolition de ces activités oscillatoires suite à des traitements pharmacologiques et/ou à des procédures chirurgicales et l'amélioration clinique des troubles moteurs suggère un lien de causalité entre ces oscillations neuronales et la planification, le contrôle et la coordination des mouvements. D'autre part, il a été démontré que le ralentissement et l’absence de mouvements volontaires peuvent apparaître avant l'émergence des activités oscillatoires dans les ganglions de la base. De plus, les caractéristiques de ces oscillations neuronales peuvent varier en fonction des différentes structures qui composent le réseau des ganglions de la base. Notre plan de recherche est structuré en trois objectifs complémentaires. Le projet vise à (i) caractériser comment ces activités oscillatoires se produisent et comment elles se propagent dans les différentes structures des ganglions de la base chez des singes parkinsoniens effectuant des mouvements de bras volontaires en direction d’une cible; (ii) identifier le lien entre les caractéristiques de ces oscillations neuronales dans différentes structures du réseau des ganglions de la base et les mouvements normaux/anormaux; (iii) développer de nouvelles approches thérapeutiques permettant une inversion rapide et robuste des changements neuronaux et comportementaux.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à développer des approches thérapeutiques innovantes pour la maladie de Parkinson qui diffèrent significativement des thérapies actuellement disponibles et qui ne peuvent être développées sans une profonde compréhension mécanistique et quantitative de la façon dont le cerveau remplit ses fonctions ainsi que des mécanismes qui sous-tendent ses dysfonctionnements. Ce projet permettra de comprendre les mécanismes de génération et de propagation des activités oscillatoires anormales observées dans les ganglions de la base chez des singes après induction d’un syndrome parkinsonien et révèlera le lien avec les symptômes moteurs parkinsoniens. Ce projet sera donc extrêmement intéressant pour les personnes souhaitant développer de protocoles thérapeutiques originaux visant à restaurer le fonctionnement normal du cerveau. A terme, ce projet aidera à soulager les troubles moteurs des patients souffrant de la maladie de Parkinson tout en minimisant l'apparition d'effets secondaires et donc participera à améliorer leur qualité de vie.
Procédures
Chaque animal subira une IRM pour obtenir une image morphologique 3D du cerveau (30min de transport jusqu'à l'IRM et 180min de procédure). Chacun des animaux sera également soumis à deux chirurgies d'une durée de 3à 5h chacune. La première chirurgie permettra l'injections de particules virales inactivées dans le cerveau visant à modifier les caractéristiques des neurones, et l'implantation d'électrodes d'enregistrements pour recueillir l'activité de ces neurones. La seconde chirurgie permettra l'implantation d'électrodes permettant de délivrer différentes intensités de courant électrique dans le cerveau pour restaurer son fonctionnement normal. Chaque animal subira également une injection intramusculaire quotidienne d'une substance chimique inerte et sans danger pour l'animal visant à manipuler l'activité des neurones dont les caractéristiques ont été modifiées préalablement (une injection par jour d'environ 20 à 30s, 5 jours par semaines durant 3 à 6 mois environ). L'induction du syndrome parkinsonien chez les animaux se fera grâce à des injections quotidiennes intramusculaires (une injection par jour d'environ 20 à 30s pendant n jours) d'une neurotoxine (appelé MPTP) qui provoque des symptômes permanents de la maladie de Parkinson. Le nombre de jours d'injection et le dosage de cette neurotoxine dépendra de la progression du syndrome (mais n'excédera pas plus de 6 mois). Enfin, chaque animal participera à une séance quotidienne d'enregistrements électrophysiologiques de l'activité neuronale (une séance d'environ 1h par jour, 5 jours par semaine durant 12 mois environ).
Impact sur les animaux
La phase précoce de conditionnement et de l'entrainement (c'est-à-dire la capture de l'animal dans la volière à l'aide d'un colier, l'entrainement de l'animal dans la tâche comportemental) peut stresser les animaux. Au cours de la procédure IRM, les nuisances sont essentiellement liées à l'anesthésie qui peut entrainer une baisse de la température corporelle, des troubles respiratoires et/ou cardiaques. Durant le transport à l'IRM, il faut également être très prudent afin que l'animal ne se blesse pas (par exemple plaies/coupures ) avec la cage de transport. De plus, des douleurs et infections peuvent survenir suite aux interventions chirurgicales . Enfin, l'induction du syndrome parkinsonien provoquera l'apparition de symptômes moteurs (c'est-à-dire des difficultés à effectuer des mouvements, une rigidité musculaire, une posture anormale et des tremblements au repos). Par ailleurs, selon la sévérité de ces symptômes parkinsoniens, les animaux pourront présenter des difficultés à s'alimenter et à bouger pouvant donc entrainer une perte de poids et l'apparition d'escarres.
Devenir
Une fois la procédure terminée, les animaux seront profondément anesthésiés et euthanasiés afin de pouvoir effectuer des analyses histochimiques post-mortem qui sont indispensables pour localiser les sites d'enregistrements de l'activité neuronale et l'aspect du cerveau après l’induction du syndrome parkinsonien. Après constatation de la mort de l’animal, le cerveau sera retiré du crâne, congelé pour procéder aux analyses histologiques.
Remplacement
Notre projet a pour but de caractériser les dysfonctionnements qui se produisent dans le cerveau après induction d'un syndrome parkinsonien et de déterminer les conséquences sur le comportement afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour les patients atteints de la maladie de Parkinson. Ce type de projet ne peut donc pas être effectué via des approches in silico, in vitro ou ex vivo et l'approche in vivo est indispensable. De plus, les singes ont un cerveau et des comportements semblables à l'homme ce qui permet de développer des tâches comportementales complexes et susceptibles de refléter les comportements humains. L'utilisation de rongeurs ou d’autres espèces de vertébrés n'est donc pas appropriée et nous sommes obligés d'utiliser des primates non-humains.
Réduction
Notre objectif est de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés pour la recherche. Nous y parvenons en planifiant soigneusement et en maximisant les données obtenues chez chaque animal. Ainsi, chaque animal sera son propre contrôle, ce qui diminuera par deux le nombre total d’animaux utilisé pour ce projet. Le nombre d'animaux a été choisi en fonction des pratiques standards qui combinent l'étude de l'activité neuronale et l'étude du comportement chez les primates non-humains. Enfin, notre stratégie de libre accès aux données sera essentielle non seulement pour les avancées scientifiques, mais aussi pour des raisons éthiques. En effet, il n'est pas nécessaire de réaliser davantage d'expériences sur les animaux si les données sont déjà disponibles quelque part dans le monde.
Raffinement
En début de protocole et durant 3 mois, l’expérimentateur habituera les animaux à sa présence (15-30min par jour, 5 jours par semaine). L’expérimentateur apprendra à l’animal à se laisser attraper par son collier à l’aide d’une canne et à rester calmement assis dans une chaise de travail (5 jours par semaine). Pendant la durée totale des expériences, les animaux seront maintenus en groupe et bénéficieront d'un environnement enrichi (jouets, musique). Le transport de l’animal vers la plateforme de bio imagerie située à 200m de l’animalerie se fera à l’aide d’une boîte de transport dédiée mise sur un chariot et protégée des regards extérieurs par une housse. L’animal anesthésié sera maintenu au chaud sous une couverture et bordé d’une bouillotte. Au total, la durée de l’examen sera de 30min de transport et 180min d’acquisition IRM. Les chirurgies seront réalisées de façon stérile et sous anesthésie profonde. Une couverture antalgique en pré- et post-opératoire sera utilisée pour limiter la douleur de l’animal après l’intervention chirurgicale. Enfin, pour limiter la douleur que peuvent engendrer les incisions cutanées, nous administrons un anesthésique local avant incision. Pour le contrôle de la température, avant l’induction de l’anesthésie, une sonde sera insérée dans le rectum des animaux. De plus, durant la totalité de la chirurgie, les animaux seront placés sous une couverture (électrique) chauffante qui est régulée en fonction de la température corporelle. Suite aux chirurgies, les animaux seront quotidiennement observés durant 5 à 7 jours post-chirurgie par le personnel de l'animalerie sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition etc. Une attention toute particulière sera porté aux risques d'infections, d'abcès, d'œdèmes et d'inflammation. Enfin, durant l'induction du syndrome parkinsonien, les animaux seront également quotidiennement observés pour évaluer la sévérité de la maladie et induire un syndrome parkinsonien stable et modéré. Si les symptômes s'accentuent (difficultés à s'alimenter et à bouger, pouvant entrainer une perte de poids et l'apparition d'escarres), l'animal sera immédiatement sorti du protocole et séparé des autres animaux, de façon à sécuriser son hébergement et éviter qu’il se blesse. De plus, des précautions particulières seront prises telles que l'utilisation de matelas moelleux/alèses et de fréquents changements de position pour éviter les chocs et le développement d'escarres.
Choix des espèces
Contrairement à d'autres espèces de vertébrés (e.g., rongeurs), le macaque possède une organisation du cerveau semblable à celle de l'homme. De plus, le macaque possède un répertoire de comportements plus large et plus proche de celui de l'homme ce qui nous permet de développer des tâches comportementales complexes et susceptibles de refléter les comportements humains. L'utilisation du primate non-humain permettra donc de plus facilement transposer nos résultats à l’homme et reste donc indispensable dans le cadre de cette étude. De plus, les animaux utilisés pour ce projet seront âgés d’au moins 36-48 mois. A cet âge, on peut considérer que le développement du système nerveux central à atteint sa maturité. Ce paramètre est important à respecter puisqu’il nous permettra de comparer plus aisément les résultats obtenus chez ces animaux avec les caractéristiques observés chez l’homme à l’âge adulte. Notons que dans le contexte (européen et mondial) actuel de pénurie de singes pour la recherche scientifique, le choix du singe cynomolgus ou du singe rhésus dans ce projet dépendra des possibilités d'approvisionnement. Quoiqu'il en soit, nous n'attendons pas de différences majeures entre ces deux espèces.
Impact de l’infection par les Entérovirus du groupe B sauvages ou mutés chez la souris
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
Sur 216 souris, 180 vont être utilisées dans des procédures classées en souffrance sévère, toutes tuées pour prélever les organes. L'infection passe par une injection intrapéritonéale unique de virus Coxsackie B3, et le porteur justifie la classe sévère par la perte de poids et la baisse d'activité qu'elle provoque. L'objet déclaré est de comprendre comment ce virus persiste dans le cœur et entretient une myocardite, aucun traitement n'étant testé ici. Le porteur retient la souris parce que l'inflammation n'est décrite que chez les mammifères et qu'il dispose de souches virales adaptées à cette espèce, et écrit avoir "le souci permanent de réduire le nombre de souris sacrifiées".
Objectifs
La myocardite virale est une maladie inflammatoire du cœur. L’incidence de cette maladie est d’environ 1,5 million de cas par an dans le monde. Elle résulte principalement d’une infection des tissus cardiaques par des virus communs comme les Entérovirus et elle est considérée comme une des causes majeures de mort subite cardiaque chez l’enfant et l’adulte jeune. Actuellement les mécanismes qui régulent le développement de la myocardite virale aiguë et sa progression en myocardite chronique et la cardiomyopathie dilatée restent inconnus et limitent le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. L'objectif principal de ce projet est d'étudier le mécanisme qui permet à ces virus de rester dans le cœur et de développer la maladie.
Bénéfices attendus
Bien que des progrès remarquables aient été réalisés au cours des dernières années au niveau des outils de diagnostic de la cardiomyopathie, la prise en charge clinique de cette pathologie reste difficile avec des traitements symptomatiques de l’insuffisance cardiaque et ou des troubles du rythme. Notre projet qui vise à court terme d’apporter une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires viraux impliqués dans sévérité de la myocardite virale. Ainsi, les résultats attendus auront un bénéfice pour la santé humaine par une meilleure prise en charge des patients souffrants de myocardite virale.
Procédures
L'administration du virus se fera une fois par voie intrapéritonéale. A un temps définit, les organes de souris seront prélevés pour les analyses virologiques, histologiques et immunologiques. Aucun prélèvement sur animaux vigiles ni de procédures chirurgicales seront appliqués sur les animaux des procédures. La durée de l'étape 1 est de 14 jours et celle de l'étape 2 est de 7 jours.
Impact sur les animaux
Les premiers signes d'infection par le virus Coxsackie B3 chez la souris sont la perte de poids ce qui justifié la classe sévère des procédures et une diminution d'activité. Le stress et l'inconfort lié à la contention et aux injections.
Devenir
A la fin de chaque étape de la procédure, tous les animaux seront mis à mort pour prélever les organes cibles afin effectuer les analyses virologiques, biochimiques et histologiques.
Remplacement
La myocardite est une maladie inflammatoire du muscle cardiaque. Le phénomène de l’inflammation est décrit uniquement chez les mammifères. Nous ne pouvons donc pas utiliser de modèle invertébré pour répondre à notre objectif. La complexité du système à étudier, en tenant compte de tous les phénomènes biologiques de l’organisme, fait qu’il n’y a aucune méthode alternative pour substituer à l’utilisation des animaux.
Réduction
Nous avons le souci permanent de réduire le nombre de souris sacrifiées dans nos projets, pour cela nous utiliserons des études statistiques afin de justifier la pertinence de nos résultats tout en utilisant le moins de souris possible. Tenant compte de nos résultats ultérieurs et l’expérience des membres du projet, nous utilisons des logiciels pour calculer/estimer le nombre minimal d’animaux à utiliser dans chaque groupe.
Raffinement
Afin de limiter la souffrance et l'angoisse des animaux, nous mettrons en œuvre des mesures enrichissement des cages notamment avec du coton, aucun hébergement individuel n’est prévu, et les expériences seront menées par le même expérimentateur du début jusqu’à la fin. Au cours de l'infection, les animaux seront pesés et observés pour leur comportement dans les cages tous les jours, y compris les week-ends et les jours fériés.
Choix des espèces
Conformément aux données de la littérature la souris est l’animal le plus utilisé dans les études de recherche sur les maladies cardiovasculaire. Plusieurs données sur les infections virales (existence des souches de virus adaptées à la souris) et inflammation ont été établie par nous-même et d’autres laboratoires en utilisant la souris comme modèle d’étude. L’existence sur le marché d’un grand nombre d’anticorps dirigés contre les marqueurs de l’inflammation spécifique murin, facilitera notre étude afin de progresser, plus rapidement, dans nos recherches. Nous travaillons avec des souris adultes (5-6 semaines, poids ~17- 20g) afin d’être en conformité avec nos résultats antérieurs (utilisation des mêmes doses de virus déjà connues pour induire l’infection) et aussi pour éviter d’éventuel problème de l’immaturation du système immunitaire.
Identification du rôle d’une hormone dans la progression tumorale chez la souris 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Toutes mises à mort pour prélèvement d'organes, 2 016 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles reçoivent une injection sous-cutanée de cellules tumorales ou une injection intrapéritonéale d'une substance qui favorise les tumeurs, suivie de trois cycles de cinq jours d'ingestion d'un irritant intestinal dans l'eau de boisson. Le porteur décrit une perte de poids, des diarrhées et des risques de saignement liés à cet irritant, et mesure les tumeurs au pied à coulisse trois fois par semaine. Il conclut que le recours à l'animal est "nécessaire" parce que l'infiltration des cellules immunitaires dans la tumeur ne s'observe pas in vitro, et attend de ce travail des "traitements modulateurs du fer".
Objectifs
A ce jour, plusieurs moyens thérapeutiques existent pour lutter contre le cancer. Parmi eux, on retrouve des traitements dont le but est de stimuler notre système immunitaire afin de contrôler les cellules cancéreuses. Cette technique constitue un grand espoir pour l’amélioration de la survie des patients. Ces traitements sont essentiellement centrés sur les globules blancs, qui sont les principaux acteurs de la réponse anti-tumorale, capables d’éliminer les masses tumorales déjà formées. La fonction des les globules blancs est influencée par la composition de leur environnement, et nous proposons que le fer puisse être un de ses éléments. En effet, il est établi que le fer est un élément essentiel pour les cellules métaboliquement actives comme les globules blancs, car il est nécessaire pour un nombre important de réactions cellulaires. Notre hypothèse de travail est basée sur des données de la littérature selon lesquelles un milieu dépourvu de fer diminue la prolifération des globules blancs et la production de molécules anti-tumorales. La concentration sanguine du fer étant contrôlée par une hormone sécrétée majoritairement par le foie et qui favorise sa rétention dans les cellules, nous avons développé des modèles murins génétiquement modifiés afin d’induire une sur-expression ou une délétion de cette hormone spécifiquement dans les globules blancs. Grâce à ce projet, nous voulons apporter la preuve de concept qu’une modulation des niveaux de fer intracellulaire des globules blancs, médiée par l’hormone du fer, impacte leur prolifération et activation, et in fine leur réponse anti-tumorale. Ainsi, de nouveaux traitements centrés autour du fer pourraient voir le jour et garantir une meilleure qualité de vie aux patients, avec des traitements de faible toxicité.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle d’une hormone contrôlant les taux de fer de cellules immunitaires. Cela permettra de proposer des traitements modulateurs du fer qui pourront avoir un effet anti-tumoral ou d' améliorer l’efficacité des traitements déjà existants.
Procédures
Une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie générale (15 sec/souris) ou alternativement une injection intrapéritonéale d'une substance favorisant le développement de tumeurs (15 sec/souris) suivi de l'ingestion d'un irritant de l'intestin via l'eau de boisson pendant 3 cycles de 5 jours toutes les 2 semaines. Mesure de la croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse trois fois par semaine (30 sec/souris) jusqu'à fin de l'expérimentation ou mesure de la croissance tumorale par imagerie sous anesthésie générale toutes les deux semaines pendant 2 mois (5 minutes par souris).
Impact sur les animaux
L'injection intrapéritonéale et l'injection sous-cutanée de tumeurs peut entraîner un stress ou une douleur de courte durée chez les animaux. La croissance tumorale peut occasionner un stress, une gêne ou des douleurs aux animaux. L'irritant colique peut entraîner une perte de poids et être responsable de diarrhées et de risque de saignement et donc une souffrance des animaux. Enfin la manipulation des souris pour mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse ou les échographies peuvent également induire un stress chez les animaux. Le tatouage et biopsies de queue engendreront un stress et une douleur légère. Le transport entre les 2 animaleries peut également engendrer un stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes et analyse.
Remplacement
Les hypothèses testées chez l'animal ont préalablement été testées dans des systèmes in vitro et mises au point in vivo en se basant sur des données publiées de la littérature. Le recours aux modèles de tumeurs chez la souris nous permettra de caractériser les cellules immunitaires qui s'infiltrent et s'activent dans la tumeur . Ces paramètres ne peuvent pas être observés in vitro et le recours à l'animal est donc nécessaire dans le cadre de cette étude. Les souris sont âgées de 8 semaines au minimum car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature.
Réduction
Les effectifs ont été déterminés et les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés. L'utilisation de l'imagerie permet une surveillance non invasive de la croissance tumorale en évitant la mise à mort séquentielle d'animaux.
Raffinement
Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Les injections sous-cutanée et les imageries seront faites sous anesthésie générale. Des points-limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. L’état général des animaux sera suivi de manière quotidienne par le personnel qualifié de l'animalerie et très régulièrement par le responsable du projet. Lors du transfert, les souris seront mises dans des boites de transport avec de l'enrichissement et de la nourriture.
Choix des espèces
La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral. En effet, de nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. De plus, la disponibilité de modèles de souris transgéniques nous permet d'étudier le rôle de certains mécanismes dans le développement tumoral. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Nous utiliserons des souris adultes de 8 à 14 semaines car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier le développement tumoral.
Etude de l’impact des dépolarisations corticales envahissantes sur les centres cardiorespiratoires du tronc cérébral chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour savoir si des vagues de dépolarisation à la surface du cerveau perturbent les centres qui règlent le cœur et la respiration, 20 rats sont opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. La préparation chirurgicale dure deux heures trente et donne accès aux vaisseaux fémoraux, au cortex et au tronc cérébral, suivie d'une heure trente de déclenchement et d'enregistrement des dépolarisations. Le porteur indique que les animaux ne pourront ni survivre ni servir à un autre protocole après cet abord du cerveau. Il détaille dix rats pour l'étude, huit pour la mise au point des enregistrements et deux de majoration en cas de problème, et précise qu'un point limite atteint pendant la procédure entraîne la mise à mort immédiate.
Objectifs
Nous chercherons à connaître si des phénomènes de dépolarisations des cellules cérébrales ont un impact sur les centres qui régulent le cœur et la respiration. Nous émettons l’hypothèse que les dépolarisations corticales qui se propagent à la surface du cerveau de proche en proche, se propageant aussi vers ces centres. Celles-ci peuvent ainsi modifier la respiration l’homéostasie corporelle, telle que l’élimination du CO2 et l’oxygénation régulée par la respiration, de même que la perfusion des organes par le système cardiovasculaire. Ce mécanisme pourrait participer à l’instabilité de la pression artérielle observée après une agression cérébrale aigue.
Bénéfices attendus
L’avenir de la réanimation neurologique va reposer sur la personnalisation des thérapeutiques mise en œuvre à partir de biomarqueur tel que les dépolarisations corticales (SD). Les résultats de ce projet permettront de mieux appréhender la physiopathologie menant à des lésions cérébrales secondaires et les modifications sur le système nerveux autonome après une lésion cérébrale aiguë. Une meilleure compréhension des données issues du monitorage multimodal permettra de préciser les origines des agressions cérébrales au lit du patient. Cela pourrait permettre d’ajuster précocement les thérapeutiques en cours et ainsi de réduire la quantité de lésions cérébrale à la fin du séjour en réanimation, avec pour objectif d’améliorer le devenir à long terme. Ces expérimentations pourront ainsi servir de base à une analyse plus détaillée des fonctions du tronc cérébral, et leurs changements après une agression cérébrale aiguë, sur des modèles animaux et en analysant les données de monitorage multimodal et d’imagerie des patients hospitalisés en réanimation.
Procédures
Les animaux sont soumis à une procédure unique sans réveil. Au cours de cette procédure, les animaux sont anesthésiés puis une préparation chirurgicale de 2h30 permet un abord des vaisseaux fémoraux et du cerveau (cortex et tronc cérébral). Le déclenchement et l’enregistrement des dépolarisations corticales se font sur une durée de 1h30 avant l’euthanasie.
Impact sur les animaux
Les deux procédures indépendantes de ce projet seront réalisées sous anesthésie générale sans réveil. Les animaux seront transférés depuis la cage de stabulation dans une cage similaire. Ils y seront isolés et transportés vers la pièce d’expérimentation jusqu’au début de la première étape de la procédure expérimentale (durée du transfert avant le début de l’anesthésie : 10min). Les animaux auront un accès ad libitum à l’eau et la nourriture. Aucune nuisance en termes d’environnement, de mobilité ou de douleur n’est prévue avant l’induction de l’anesthésie générale, sans réveil. Il n’y aura donc pas de nuisance pour les animaux : nuisance légère lors de l'induction de l'anesthésie.
Devenir
En fin de procédure, les animaux seront euthanasiés, car il ne pourront pas survivre ni être utilisé par un autre protocol après l'abord chirurgical du cerveau.
Remplacement
L’analyse des changements d’activité des structures corticales et sous-corticales ainsi que des modifications physiologiques qui en découlent (changement de fréquence cardiaque, pression artérielle ou fréquence respiratoire), nécessite d’étudier un organisme vivant dans son ensemble. Une procédure sur tranche de cerveau ne permet pas d’étudier l’impact sur la régulation de la respiration, de la fréquence cardiaque ou de la pression artérielle. Les connaissances actuelles et la controverse qui existent autour de la propagation des dépolarisations corticales envahissantes au niveau des structures sous corticale ne permettent pas d’utiliser des modèles non-animaux. Les connaissances actuelles sont limitées quant aux mécanismes de propagation des SD ne permettant pas la modélisation informatisée des impacts sur le tronc cérébral. Il n’existe pas de modèle ex-vivo permettant de reproduire les interactions multicellulaires dans les différentes structures corticales et sous-corticales.
Réduction
Notre plan d’expérience est prévu avec un nombre d’animaux minimal de 10 animaux permettant d’effectuer des analyses statistiques descriptives (moyenne ou médiane et distribution) fiables. Un nombre de 8 animaux est prévue pour une étape de mise au point des enregistrements electrophysiologiques au niveau du tronc cérébral et des tehniques de clarifications de cereau de rat. Une majoration de 20% soit 2 annimaux est prévue en cas de problème expérimentaux rencontrés au cours du projet. Soit un total de 20 animaux. En cas de bon fonctionnement de la phase de mise au point et d'abscence de problème expériementaux, ce nombre sera réduit à un minimum de 10 animaux. Les expérimentations seront réalisées sans réveil. La réutilisation de ces animaux dans d'autres protocoles ne sera pas possible. Si des animaux adultes déjà utilisés par d'autres protocoles comportementaux, ou la reproduction, sans altération de leurs physiologies sont mis à disposition par les utilisateurs de l'animalerie ils pourront être utilisés dans ce protocole. Les données répété des différent temps expériemntaux seront comparées par un test apparié.
Raffinement
Tout au long de leur période de stabulation, les rats seront hébergés en groupes de 3 à 5 animaux dans des cages présentant des éléments d’enrichissement (e.g., nesting cup, tunnel, brique Carfil) avec boisson et alimentation ad libitum ce qui minimisera l’angoisse de ces animaux. Concernant la douleur, une injection sous-cutanée de buprénorphine sera pratiquée avant tout acte chirurgical pour obtenir un effet analgésique et une injection sous-cutanée d’anesthésique local (lidocaïne pour une action rapide + ropivacaïne pour une action prolongée sur l’ensemble de la procédure) sera réalisée au niveau du scalp et en regard des vaisseaux fémoraux pour obtenir un effet analgésique supplémentaire. La profondeur de l’anesthésie sera ajustée au cours de la procédure en fonction d’une grille décrivant les réactions de l’animal au pincement de la patte ou de la queue. En cas de survenue de points limite pendant la procédure, les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
Nous avons choisi le rat, car c’est l’espèce la plus utilisée dans l’étude du métabolisme et de la vascularisation cérébrale. De plus, les changements vasculaires observés au cours des dépolarisations corticales envahissantes sont proches de ceux observés chez l’homme, contrairement à la souris. En effet, nous avons pu étudier préalablement les changements de concentrations cérébrales de glucose et de lactate engendrés par une dépolarisation corticale envahissante après un traumatisme crânien grave chez le rat. Le choix de ce modèle nous permettra de comparer nos résultats à ceux obtenus par d’autres équipes. Nous utiliserons des rats adultes de 12 à 14 semaines. Il s’agit d’une étude chez l’animal ayant atteint un stade mature d’un point de vue cérébral et non d’une étude concernant le développement ou le vieillissement.
Etude d’une voie de réparation de l’ADN dans un modèle de vieillissement prématuré de muscle
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Une biopsie d'oreille au sevrage est le seul geste décrit, alors que les souris de cette nouvelle lignée perdent progressivement leur masse musculaire jusqu'à un éventuel changement de démarche vers douze mois. 276 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour prélever les muscles et les observer en imagerie cellulaire. Le projet porte sur la réparation de l'ADN dans les cellules musculaires au cours du vieillissement, avec des analyses fixées à deux, six et douze mois. Le porteur annonce n'attendre aucun signe de stress ni de souffrance aux âges retenus, tout en prévoyant des pesées deux à trois fois par semaine et des prises de température rectale jusqu'à l'atteinte des points limites.
Objectifs
Au cours du vieillissement, les lésions dans l'ADN s'accumulent et vont être responsables de l'augmentation du risque de mutations génétiques, de dysfonctionnements cellulaires, ainsi que de diverses maladies liées à l'âge telles que le cancer, les maladies neurodégénératives et d'autres conditions de santé associées au vieillissement. Les mécanismes de réparation de l’ADN sont encore très peu connus et investigués dans les cellules du muscle squelettique. L’objectif de ce projet est d’avoir une meilleure compréhension de ces mécanismes de réparation de l'ADN dans les cellules musculaires au cours du vieillissement à travers un nouveau modèle murin. Pour l'ensemble de ce projet, un maximum de 276 souris seront nécessaires.
Bénéfices attendus
Ce nouveau modèle murin sera pour l’heure un modèle unique pour pouvoir étudier des aspects encore peu explorés de certaines voies de réparation de l'ADN dans le muscle squelettique, et permettre une meilleure compréhension de protéines structurantes de l'ADN dans des conditions normales et pathologiques, et de déterminer leur implication dans ces mécanismes de réparation à l’ADN pour à plus long terme envisager de nouvelles cibles et stratégies thérapeutiques.
Procédures
Une petite biopsie d’oreille (=1mm) sera réalisée au moment du sevrage pour pouvoir effectuer l’identification génétique de chacune des souris. Le temps du geste par animaux et < 1min.
Impact sur les animaux
La perte de la protéine d'interêt ne devrait pas générer d’effet indésirable avant plusieurs mois. D’après nos études précédentes, le modèle ne devrait pas présenter d’atteinte de points limites sur les points de cinétique définis. Notre étude sera placée à 2, 6 et 12 mois. Les effets attendus sont une perte lente et progressive de la masse musculaire qui entrainera petit à petit une perte de poids et qui pourra très progressivement emmener à un éventuel changement dans la démarche des souris vers l’age de 12 mois. D’après notre expérience au laboratoire sur le modèle de vieillissement prématurés nous ne nous attendons pas à avoir des signes de stress, de souffrance ou de comportement anormal aux ages définis. Cependant une surveillance sera mise en place et adaptée tout au long du protocole afin de détecter tout signe de souffrance qui entrerait alors dans un point limite.
Devenir
Mise à mort afin de collecter les muscles pour analyses approfondies d'imagerie cellulaire.
Remplacement
Des cellules seront isolées et immortalisées à partir des animaux homozygotes de la nouvelle lignée murine afin de réaliser des expériences sur cellule quand cela est possible. Cependant, les modèles in vitro ne permettent pas une étude au-delà de quelques jours ce qui n’est donc pas suffisant pour observer certains phénotypes, mécanismes ou encore l’effet de certains traitements. De plus la ½ vie des protéines d'intérêts dans des cellules musculaires est très longue, réduisant l’apparition et le niveau des phénotypes observables par rapport à la durée de vie de cellules en culture et augmentant l’hétérogénéité des résultats, voir l'absence de conclusion. D’autre part, le modèle murin reste l’unique moyen pour étudier fonctionnellement le muscle dans son entité au cours du vieillissement et pour évaluer les mécanismes impliquées dans de telles voies de signalisation.
Réduction
Nous utiliserons le nombre d’animaux minimal mais suffisant pour permettre d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le maximum de données pouvant être généré à partir d’un même groupe d’animaux sera recherché. Des conseils auprès de collaborateurs expérimentés et une collaboration avec un laboratoire spécialiste des mécanismes de réparation de l’ADN sur tissu permettent d'optimiser les expériences et réduire la variabilité et donc le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. Les effectifs d’animaux par groupe sont adaptés à chaque groupe. Des tests de comparaisons de moyennes ou de rang seront utilisés pour comparer deux groupes. Le personnel est formé à ces analyses. Les animaux seront traités par petite cohorte ce qui permettra si les résultats statistiques le permettent d’utiliser moins de souris. Dans la mesure du possible, les autres muscles seront collectés pour des études parallèles afin d’exploiter au maximum chacune des souris pour des études parallèles.
Raffinement
Une surveillance régulière et progressive des animaux sera réalisée par l’expérimentateur pour détecter les signes cliniques et/ou physiques précoces du phénotype. Les animaux seront pesés une fois par mois jusqu’à 11 mois, puis toutes les semaines jusqu’à la détection d’un phénotype. Enfin, ils seront pesés 2 à 3 fois par semaine jusqu’à l’atteinte des points limites. En même temps que les pesées, une prise de température rectale sera mesurée et permettra de détecter de manière précoce et concomitante à la pesée toute altération de l’état général de la souris. À l'aide de ces deux paramètres, les premiers signes d’un phénotype et d’un vieillissement pourront être détectés précocement et une observation et une vigilance plus accrues des cages concernées seront alors mises en place. Au cours de ces surveillances, nous porterons également nos observations sur le comportement social et la capacité de la souris à se déplacer correctement. Des points limites suffisamment prédictifs seront mis en place pour éviter toute souffrance des animaux et au-delà desquels la procédure sera arrêtée. Les animaux seront alors mis à mort immédiatement en cas de signes de souffrance et leurs tissus collectés. Les animaux seront toujours à plusieurs par cage afin de maintenir l’aspect social et chaque cage sera dotée d’un environnement enrichi. Si toutefois des souris devaient se retrouver seules dans la cage, il est prévu d’apporter un enrichissement renforcé et adapté, comme par exemple avec l’ajout de dômes en carton pour veiller au bien-être de la souris.
Choix des espèces
Malgré des différences entre la symptomatologie chez les souris et les hommes, le modèle murin est extrêmement utile pour les études mécanistiques, physiopathologiques et la mise au point de traitements thérapeutique. Plus spécifiquement, le muscle, que ce soit en termes de structure, de fonctionnement et de pathologie est extrêmement proche de celui de l’Homme. Le modèle murin se révèle donc être un système idéal et indispensable pour étudier le rôle de gènes sur le plan moléculaire, cellulaire, tissulaire et fonctionnel au sein d’une entité. Pour répondre à notre problématique, des souris agées de 2 à 9 mois seront utilisées pour la reproduction dans une première procédure. Passé cet âge les souris deviennent trop âgées. Elles seront euthanasiées à l’issue de cette procédure. A cet age le phénotype dommageable ne devrait pas être survenu. Toutefois les souris seront attentivement surveillées. Dans une 2ème procédure, des souris contrôles et mutantes seront utilisées à l’age de 2 mois, 6 mois et 12 mois afin de pouvoir évaluer l’importance de la signalisation de réparation de l’ADN dans le muscle, l’implication de notre protéine d’intérêt dans cette signalisation et le tout au cours du vieillissement.
Ciblage par molécule innovante d’une protéine sécrétée dans le cancer du rein (EU2/2).
- Recherche fondamentale
- Oncologie
52 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection intraveineuse de cellules tumorales, puis jusqu'à seize cycles d'imagerie sous anesthésie gazeuse, avant une injection d'anticorps couplé à un métal radioactif et quatre anesthésies de quarante-cinq minutes en quatre jours consécutifs. Le porteur affirme qu'aucune méthode sans animaux ne permet de générer des métastases et que seul un "organisme complexe" reproduit ce que l'on rencontre chez le patient. Les métastases pulmonaires provoquent une perte de poids et des troubles respiratoires bien réels, quand le bénéfice annoncé reste un espoir pour les malades d'un sous-type de cancer du rein qui représente 5 % des cas.
Objectifs
Le rein est un élément central dans la régulation de l'homéostasie. Ils filtrent le sang et produisent un certain nombre d’hormones capitales dans la régulation de la tension artérielle. Le cancer du rein est un problème majeur de santé publique avec ~400 000 nouveaux cas par an dans le monde. Ce projet vise à cibler une protéine, initialement décrite comme participant au développement du cerveau, dans un sous-type de cancer du rein, dit chromophobe. En effet, cette protéine est spécifiquement exprimée par les cellules de la tumeur primaire et des métastases de cancer du rein chromophobe. Nous prendrons l’avantage du développement au laboratoire d’un anticorps dirigé contre la protéine d’intérêt couplé à un métal radioactif, technique appelée radiothérapie interne vectorisée. Cette technique permet soit de détecter des métastases par imagerie nucléaire ou de cibler thérapeutiquement les cellules tumorales sous l’effet des rayonnements ionisants. Ces candidats médicaments seront testés sur un modèle tumoral murin. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les cancers du rein chromophobe sont une maladie rare. Elle ne touche que 5 % des cancers du rein. Actuellement, ce sous-type de cancer du rein fait l’objet de très peu de recherche et par conséquent les perspectives thérapeutiques de ces patients sont pauvres. Par ailleurs, les patients métastatiques n’ont quant à eux aucune perspective thérapeutique, puisqu’ils reçoivent le traitement de référence des autres sous types de cancer du rein. Ce dernier n’a jamais montré d’efficacité thérapeutique dans leur pathologie. Ainsi, notre projet pourrait permettre de développer la première stratégie thérapeutique spécialement dédiée au cancer du rein chromophobe et apporter un espoir à ces patients métastatiques pour qui l’issue est aujourd’hui fatale.
Procédures
Dans ce projet, les animaux recevront tous une injection intraveineuse des cellules tumorales (2 minutes), puis au cours du suivi longitudinal hebdomadaire, ils seront au maximum soumis à 16 cycles d’imagerie (Injection d’un traceur et une anesthésie gazeuse à l’isoflurane durant l’acquisition 10 minutes). Ces gestes seront réalisés dans l'établissement utilisateur 1. Ensuite dans l'établissement utilisateur 2, certains animaux recevront une injection intraveineuse du composé pour l’imagerie sous anesthésie gazeuse (détection des métastases). Ces derniers seront ensuite soumis à 4 anesthésies gazeuse de 45 minutes pour l’imagerie nucléaire (4 jours consécutifs). Une autre partie des animaux recevront une injection intraveineuse du composé thérapeutique sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane (5 minutes).
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les animaux développeront des métastases pulmonaires. L’apparition de ces métastases peut être associé à une perte de poids et à des problèmes respiratoires.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort pour réaliser une analyse histologique des tumeurs.
Remplacement
Dans le cadre de ce projet, nous cherchons à voir si notre molécule pourrait être utilisable pour la détection et le ciblage thérapeutique de métastases de cancer du rein chromophobe. Afin de tester l’effet de notre molécule sur des métastases, nous utilisons des modèles animaux, car il n’existe pas d’autre solution pour générer des modèles de métastases autrement que par des expériences in vivo. Seul un organisme complexe permet de récapituler les caractéristiques physiques et biologiques que l’on retrouve chez le patient (accessibilité du traitement au cellules tumorales, notamment).
Réduction
Afin de réduire considérablement nos effectifs, nous avons choisi d’utiliser une approche de suivi longitudinal par imagerie. De plus, le nombre d’animaux a été déterminé par des approches statistiques nous permettant de répondre à notre question biologique.
Raffinement
Méthodes utilisées pour réduire la douleur : La plupart des interventions sur les animaux seront réalisés sous anesthésie gazeuse (anesthésie générale). De plus, nous utiliserons le suivi longitudinal par imagerie pour suivre l’apparition des foyers métastatiques. De la sorte, nous serons dans la capacité d’arrêter la procédure avant l’apparition de signes cliniques. Nous avons également mis en place une grille de scoring. En fonction du score, les animaux recevront un analgésique ou ils sortiront de la procédure (mise à mort).
Choix des espèces
La souris est un organisme modèle qui partage 98% son patrimoine génétique avec l’homme. Ce modèle permet donc d’étudier les mécanismes biologiques que l’on retrouve chez l’homme. Procédure 1 à 3 : 3: La souris immunodéficiente est le modèle le plus approprié pour greffer des cellules cancéreuses humaines afin qu’il n’y ait pas de rejet des cellules. Au début du projet, Les animaux sont âgés de 6 à 8 semaines car la prise tumorale est meilleure à cet âge.
Prélèvement de tissus pour la caractérisation génétique (génotypage) des modèles murins génétiquement modifiés.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 800 souris vont être utilisées pour une biopsie d'oreille de cinq secondes chacune, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le geste est pratiqué sur animal vigile maintenu en contention, avec un second prélèvement sur la même oreille si l'analyse génétique échoue. La procédure elle-même ne tue aucune souris, et leur sort dépend ensuite du résultat du génotypage : entrée dans un projet de recherche, maintien dans les colonies d'élevage, ou mise à mort pour prélever des tissus ou faute de correspondre aux caractéristiques attendues. Le porteur affirme qu'aucune méthode n'est aussi performante que la biopsie d'oreille et présente le génotypage comme une "nécessité" pour valider et entretenir ces lignées.
Objectifs
La thématique générale de mon projet de recherche est la compréhension des mécanismes de régénération des cellules souches pulmonaires. Pour cela, j’étudie les mécanismes de dérégulation que sont la fibrose et le cancer. Ce projet nécessite le développement et l’utilisation de modèles murins génétiquement modifiés. Chaque animal, identifié par application d'une boucle d'oreille, sera caractérisé par génotypage sur une biopsie d’oreille. Cette demande d’autorisation de projet de génotypage se justifie par la nécessité de : - sélectionner les animaux d’intérêt pour mon projet de recherche (inclus dans d’autres demandes d’autorisation de projet) ; - sélectionner les animaux d'entretien des colonies ; -sélectionner les animaux pour les prélèvements d’organes ou de tissus post mortem pour des études ex vivo (hors champ de demande d’autorisation de projet).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de la procédure de génotypage sont de permettre une sélection des animaux d’intérêt.
Procédures
Une biopsie de l’oreille (durée : 5 secondes) est réalisée sur animal vigile puis déposé dans un microtube. Dans la très grande majorité des cas, un seul prélèvement sera réalisé par animal. En cas de problème lié à l’analyse génétique de la biopsie, un deuxième prélèvement sur la même oreille pourra être envisagé.
Impact sur les animaux
Les biopsies d’oreille sont des gestes qui provoquent une douleur légère et dans de très rares cas un léger saignement. L’animal est maintenu en contention pendant la biopsie ce qui représente une source de stress. S
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie à l'issue de cette unique procédure. Leur devenir diffère ensuite selon les résultats du génotypage : a/ ils sont sélectionnés pour un projet de recherche ; b/ ils sont conservés pour l’entretien des colonies ; c/ ils sont euthanasiés pour des prélèvements de tissus post mortem ; d/ ils sont euthanasiés si leurs caractéristiques ne répondent pas aux besoins du projet et si aucune autre utilisation n’est possible.
Remplacement
Il n’existe à ce jour pas de méthodes aussi performantes que la biopsie d’oreille pour réaliser le génotypage des souris, qui est nécessaire pour valider les études utilisant des lignées d’animaux génétiquement modifiés, et entretenir ces lignées.
Réduction
A ce jour, nous ne disposons pas d’autres moyens aussi efficaces permettant de caractériser et sélectionner les animaux génétiquement modifiés. les plans d’élevage en amont, sont définis afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux générés et donc d’animaux génotypés.
Raffinement
Les biopsies sont réalisées par un personnel expérimenté. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Elles sont réalisées avec du matériel adapté permettant un geste rapide et précis. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Les cages y sont amenées les unes après les autres afin de réduire autant que possible le stress des animaux Un suivi des animaux est réalisé suite à cette procédure et des points limites adaptés ont été mis en place.
Choix des espèces
Les modèles murins génétiquement modifiés sont très utilisés pour comprendre des pathologies humaines car les outils pour générer ces modèles sont bien connus et miment les pathologies humaines. Les biopsies sont réalisées sur des animaux âgés d’au moins 21 jours.
Étude fonctionnelle des gènes d’une famille de facteurs de transcription chez le poissons-zèbre pour l’étiopathogénie de la scoliose idiopathique-EU2/2
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Pour vérifier si la mutation d'un gène repérée dans deux familles de personnes scoliotiques déforme la colonne vertébrale, trois lignées de poissons-zèbres mutants sont créées. 780 poissons-zèbres vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger, répartis sur trois générations par lignée. Chacun subit sous anesthésie un prélèvement de quelques millimètres de nageoire caudale pour identifier sa mutation, et 180 d'entre eux passent trois séances de micro-scanner à huit, douze et seize semaines, avec un transport pouvant durer trente minutes avant chaque séance. Les 600 autres sont tués dès la lignée stabilisée, et les 180 restants après la dernière imagerie, le retour à l'aquarium principal étant exclu pour raison sanitaire.
Objectifs
La scoliose, dite idiopathique, qui touche près de 3% des sujets selon les régions géographiques, comporte une composante génétique. Cependant, les modalités exactes de transmission ne sont pas clairement établies. L’hypothèse sous-tenant le projet « scoliose et génétique » est que s’il existe des gènes de prédisposition à la scoliose « idiopathique », une analyse génétique poussée de familles scoliotiques présélectionnées par leur arbre généalogique permettra de détecter de nouvelles mutations spécifiquement associées à la pathologie par comparaison entre patients atteints et apparentés « sains ». Cette analyse a permis de découvrir une mutation d’un gène codant une protéine impliquée dans la transcription de l’ADN chez plusieurs personnes atteintes de scoliose idiopathique dans deux familles indépendantes. Chez le poisson-zèbre, il existe trois gènes qui pourraient être l’homologue de ce gène chez l’homme. Nous allons donc inactiver ces trois gènes indépendamment afin de générer trois lignées de mutants poissons-zèbres. Les mutants poissons-zèbres ainsi générés seront par la suite analysés cliniquement par l’imagerie afin de vérifier l’absence ou la présence de scoliose chez ces animaux. De ce fait, nous souhaitons utiliser le poisson-zèbre comme modèle animal pour étudier le rôle fonctionnel de cette protéine, et son implication dans la physiopathologie de la scoliose idiopathique. Ce projet sera réalisé dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2).
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu du projet est la validation du gène exploré dans la genèse de la scoliose idiopathique. Cette hypothèse serait renforcée par le développement de scolioses chez les mutants ainsi créés. La validation de ce variant permettrait d’avancer dans la compréhension de la genèse des scolioses idiopathiques (physiopathologie) et éventuellement à long terme d’avancer dans la prédiction de progression des courbures scoliotiques découvertes. En effet, la progression de l’identification des mécanismes génétiques causaux à la scoliose dite « idiopathique » permettrait de pouvoir proposer aux patients chez qui une scoliose est découverte un séquençage exomique précoce de manière à avoir une meilleure connaissance du risque et donc d’adapter le traitement des patients (agressivité du traitement orthopédique par corset, nécessité de chirurgie correctrice).
Procédures
EU1 : Afin d’identifier le type de mutation porté par les poissons, un prélèvement du tissu de la nageoire caudale sera réalisé sous anesthésie générale afin de minimiser la souffrance des animaux. Un seul prélèvement de quelques millimètre sera effectué par animal, la manipulation dure 1-2 minutes. Cette intervention n’entraîne pas de séquelles impactant la nage ou les capacités d’alimentation. EU2 : Les animaux seront transportés de l’animalerie (UE1) jusqu’au laboratoire d’imagerie (EU2) pour la réalisation d’une imagerie micro-scanner à 8,12 et 16 semaines de vie. La durée est de 30 minutes maximum par trajet. L’analyse par imagerie micro-scanner, anesthésie incluse aura une durée totale de 3 à 4 minutes. Les animaux seront mis à mort en fin de procédure expérimentale par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Concernant la création d’une lignée mutante, le phénotype (Ensemble des caractères apparents d'un individu) attendu causerait éventuellement une déformation de la colonne vertébrale, il ne devrait pas y avoir d’impact majeur sur la capacité des poissons à se mouvoir ou à s’alimenter (classe légère). L’inactivation d’un gène codant pour une protéine qui est impliquée dans la synthèse des neurotransmetteurs pourrait entrainer des modifications de la physiologie des animaux et potentiellement affecter leur croissance et leur capacité à se reproduire, sans pour autant les empêcher de se nourrir ou de se déplacer, bien qu’ils puissent être de taille plus petite ou avoir un axe corporel incurvé ou déformé. L’effet indésirable prévu chez les animaux suite aux prélèvements de tissu au niveau de la nageoire caudale pour identification génétique est une petite plaie de quelques millimètres suivie ensuite d’un processus cicatriciel, indolore et capable de se regénérer en quelques jours. Le transport jusqu’au lieu du scanner ainsi que la réalisation des imageries peuvent être source de stress ou d’angoisse pour les poissons. Le protocole d’imagerie sera réalisé sous anesthésie générale afin de maintenir les poissons immobiles, ce qui peut entrainer un risque anesthésique. Les animaux sont placés en quarantaine jusqu’à la fin du protocole d’imagerie puis euthanasiés afin d’éviter toute contamination par d’éventuels pathogènes de l’aquarium principal.
Devenir
Nous générons au total 780 animaux, 180 animaux porteurs d’une mutation des gènes cibles seront conservés à l’animalerie. Les autres animaux (soit 600 animaux) seront euthanasiés une fois la génération d’une lignée de mutation de troisième génération, stable sur le plan génétique soit établie. Ces 180 animaux seront euthanasiés après la procédure d’imagerie micro-scanner, un retour de quarantaine au système principal de l'animalerie étant impossible par sécurité sanitaire.
Remplacement
Les études sur lignées cellulaires ne permettent pas d’analyser la colonne vertébrale en entier et de suivre l’apparition de scolioses. Notre projet nécessite donc une approche in vivo sur l’animal. Les poissons-zèbres, du fait de leur forme longitudinale, permettant une torsion axiale de la colonne (contrairement aux quadrupèdes par exemple) sont un modèle de choix pour l’étude des scolioses.
Réduction
Nous n’avons pas de résultats préliminaires nécessaires pour effectuer des tests statistiques. Les expériences sont réalisées sur des poissons juvéniles puis adultes. Nous limitons le nombre minimal au maintien d’une lignée, dont 20 poissons/aquarium. Nous élèverons 20 poissons pour la première génération (F0), puis 120 poissons (homozygotes, hétérozygotes et les sauvages à identifier) pour la deuxième generation (F1), 120 poissons (homozygotes et hétérozygotes à identifier) pour la troisième génération (F2). Nous avons besoin de 3 générations, de ce fait nous aurons au total 260 individus (20 F0 + 120 F1 + 120 F2) pour chaque lignée. Nous aurons 780 (260 x 3) individus pour les trois lignées de mutants (3 gènes homologues à celui de l’Homme chez le poisson-zèbre). La population adulte de poissons utilisée pour produire les embryons est ainsi restreinte pour limiter le nombre d’animaux mais suffisamment développée pour assurer des conditions de reproduction efficaces pour les études envisagées. Concernant la réalisation des scanners : nous limiterons le nombre d’animaux utilisés aux besoins statistiques de nos analyses. Ce nombre permettra d’effectuer des analyses statistiques comparatives ainsi qu’une analyse de variabilité inter-observateurs avec une puissance suffisante (score kappa de Fleis attendu : >0.8 ; alpha
Raffinement
Pour assurer le bien-être des animaux une densité de 20 poissons/aquarium de 3.5L sera appliquée. Nous nous appliquerons à réduire la souffrance, la douleur et l’angoisse. L’alimentation sera composée d’aliments secs et de proies vivantes adaptés au stade développemental des poissons-zèbre afin de leur permettre d’exprimer leur comportement naturel de prédateur. Les animaux ne seront jamais hébergés seuls. Dans le cas de l’identification d’un poisson-zèbre exprimant notre mutation d’intérêt, alors nous mettrons en place un enrichissement social en introduisant dans l’aquarium d’autres congénères. Les poissons présentant des anomalies qui les empêcheraient d'appréhender leur milieu normalement seront euthanasiés. De même pour préserver l'ensemble des poissons hébergés et le maintien d'un certain statut sanitaire, une limite d'âge de 18 mois est appliqué pour éviter la propagation d’infections par des animaux vieillissants. Les manipulations nécessitant une immobilisation et les prélèvements de nageoire caudal, seront conduites sur animaux anesthésiés. Nous surveillerons les animaux après le prélèvement de la nageoire caudale pour vérifier qu’il n’y ait pas de saignement et que dans les jours qui suivent la régénération de la plaie se met en place. Dans chaque cas, nous suivrons les signes visibles d’un animal souffrant et procéderons si nécessaire à une interruption de l’expérience ou à une mise à mort.
Choix des espèces
Le modèle poisson-zèbre partage 71% de son génome avec celui de l’homme et celui-ci est facilement modifiable par des techniques de biologie moléculaire. De plus, son élevage et sa reproduction sont rapides et aisés. Dans le cas de notre étude sur la scoliose qui est une déformation en trois dimensions de la colonne vertébrale, les modèles animaux quadrupèdes sont de mauvais modèles d’étude car la présence d’appui sur les pattes avant leur permet de compenser et d’empêcher l’évolutivité d’une telle déformation. Les poissons-zèbres cependant constituent un bon modèle pour ces déformations vertébrales, leur colonne vertébrale comportant de grandes similarités avec l’espèce humaine : une structure vertébrale longitudinale, constituée d’éléments osseux mobiles et de disques intervertébraux, organisée en 4 segments. L’analyse de la morphologie de la colonne vertébrale par micro scanner chez le poisson-zèbre a déjà été validée par des études précédentes. Nous analyserons les images issues du scanner micro-CT avec un logiciel dédié. Grâce à ces images, nous mesurerons les courbures de la colonne vertébrale des mutants par comparaison avec celle de poissons sauvages. Les animaux seront étudiés du point de vue phénotypique (apparition de scoliose) à 3 points cinétiques à 8, 12 et 16 semaines, qui correspondent respectivement à une période de forte croissance, au stade juvénile (parallèle avec l’aggravation pubertaire des scolioses humaines) et une analyse finale au stade adulte. Ceci permettra de suivre l’évolution de la scoliose dans le temps lors de sa phase de constitution puis une analyse finale à l’âge adulte
Etude de l’efficacité radiosensibilisante de nanoparticules dans le glioblastome
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Deux chirurgies crâniennes de trente minutes par animal, l'une pour implanter des cellules de gliome dans le cerveau, l'autre pour y injecter le traitement : 90 des 100 souris de ce projet suivent ce protocole, les dix autres ne recevant que la tumeur. Toutes sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec perte de poids, de motricité et de sensibilité attendues à mesure que la tumeur cérébrale se développe. Le porteur détaille que la radiothérapie fractionnée et l'IRM n'induisent par elles-mêmes ni douleur ni comportement anormal et classe ces gestes en légers, la sévérité venant de la tumeur qu'il implante. Toutes seront tuées, le porteur jugeant probable que la tumeur leur fasse atteindre les points limites.
Objectifs
Ce projet a pour but de caractériser l’intérêt de nouvelles nanoparticules pour les tumeurs cérébrales hypoxiques, décrites dans la littérature comme résistantes aux traitements actuels et notamment à la radiothérapie. Devant le manque d’efficacité des thérapies standards, ce projet se justifie par le besoin d’améliorer, par des approches innovantes, l’efficacité des thérapies actuelles.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est une amélioration des stratégies thérapeutiques conventionnelles du glioblastome en utilisant des NPs qui ont montré, par des études précédentes, leur capacité à rester suffisamment longtemps dans la tumeur pour les fractions de radiothérapie.
Procédures
Les animaux sont soumis à: - Chirurgie (implantation cérébrale de cellules tumorales sous anesthésie générale et injection intracrânienne du traitement) : 30 minutes maximum par animal, réalisée deux seules fois sur chaque animal, 90animaux sont concernés. Un groupe Controle avec seulement la chirurgie (10 animaux) d'implantation des cellules tumorales sera aussi considéré. Une chirurgie terminale est également prévue une fois les points limites atteints, après perfusion transcardiaque pour prélever les cerveaux
Impact sur les animaux
Les séances fractionnées de Radiothérapie n’induisent pas en elles-mêmes de douleurs, de perte de poids ou de comportement anormal. Ces interventions sont donc légères. Les séances d’imagerie (IRM) n’induisent pas en elles-mêmes de douleurs, de perte de poids ou de comportement anormal. Ces interventions sont donc légères. La procédure chirurgicale pour l’établissement du modèle de tumeur cérébrale et l’injection du traitement en intracérébral peuvent induire des douleurs. Ces interventions sont donc modérées. Nous nous attendons à avoir une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux qui auront un développement de GBM. A ce titre la procédure dans son ensemble de suivi d'efficacité thérapeutique a été classée sévère.
Devenir
Tous les animaux (100 souris) seront mis à mort car il est probable que la présence de la tumeur entraine l'atteinte des points limites
Remplacement
Les tumeurs sont connues pour être multi-compartimentales, c'est-à-dire qu’au-delà du simple compartiment de la cellule tumorale existent la vascularisation, l’hypoxie et l’inflammation qui influent fortement sur la croissance tumorale. L’utilisation de modèles in vivo permet d’intégrer ces différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et aux réponses aux différents traitements. Ce projet intervient après plusieurs étapes de validation in vitro ayant permis de retenir les meilleures NPs (taille, aspect de toxicité,) mais ne peut pas s’effectuer intégralement sur des modèles de remplacement in vitro ou in silico.
Réduction
L’utilisation des méthodes d’imagerie non invasive se conforme à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux car elles permettent de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur chez le même animal sans nécessité d’euthanasie de plusieurs animaux à chacun des temps. Chaque animal est dans ce cas son propre contrôle et permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. Afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques, nous avons réalisé des simulations statistiques à l’aide des données précédemment acquises au sein de l’équipe sur le modèle mais aussi sur les données issues d’autres tumeurs par le partenaire fabriquant les NP. Ces simulations ont permis de mettre en évidence qu’il faudrait maximum 10 animaux par sous-groupe de traitement nécessaire afin d’obtenir une différence significative en espérant une valeur statistique de 5% pour une puissance de 80%. Ce nombre d’animaux est cependant un nombre maximum et pourra être revu à la baisse durant l’étude après analyse statistiques séquentielles.
Raffinement
A leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux (5 souris par cage) dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation avant toute expérimentation et bénéficierons également d’enrichissement (roue d’activité, cartons). Les animaux seront surveillés de leur arrivée à la fin du protocole par un personnel compétent afin de déterminer leur état (poids, apparence physique, respiration) et la mise en place, si nécessaire, de mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera réalisée 3 fois par semaine. Les animaux disposeront de croquettes humidifiées dans le fond de la cage ainsi que de complément alimentaire afin de limiter la perte de poids dû aux procédures expérimentales. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés et par le choix de points limites cohérents.
Choix des espèces
Les modèles tumoraux in vivo sont nécessaires afin d’évaluer l’effet du traitement sur les cellules tumorales tout en prenant en compte toutes les composantes du microenvironnement tumoral qui peuvent modifier l’effet thérapeutique du traitement. Nous utiliserons donc des souris immunocompétentes car ces souris présentent la composante inflammatoire et notamment macrophagique, cible de notre traitement. Le modèle de tumeur cérébrale utilisé repose sur l’implantation de cellules de gliomede la même soucge de souris qui permet alors d’éviter toute inflammation aberrante due au rejet de « greffe » par la souris souche utilisée. Ce projet consiste en une évaluation de l’effet d’un traitement sur un modèle animal de glioblastome. Le choix de la souris est alors idéal pour obtenir des résultats fiables et reproductibles, permettant de réduire à un minimum le nombre d’animaux utilisés. De plus, ces modèles sont déjà maîtrisés dans notre laboratoire. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes, âgés de 8 à 10 semaines en début de protocole. Cela permettra le développement de tumeurs plus reproductibles. De plus, à ce stade, le cerveau est mature et il est possible de suivre l’évolution des animaux sur des temps longs.
Développement de modèles de souris pour l’étude de maladies neurologiques et cardiaques 1/3
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
4 420 souris vont être utilisées, chacune pouvant subir jusqu'à six échocardiographies de vingt minutes sous anesthésie, six injections intrapéritonéales, six tests de force de préhension et six passages sur tapis roulant, plus une biopsie pour génotypage. Un quart des souriceaux d'une des lignées naît privé d'un gène nécessaire à la production d'énergie et meurt le premier jour de vie. Un quart de l'autre lignée développe une cardiomyopathie, avec perte de poids, mobilité réduite et posture anormale à partir de neuf semaines. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour analyse des tissus, le bénéfice annoncé se limitant à fournir des modèles et à comprendre des maladies qui restent incurables.
Objectifs
Les maladies dues à un défaut de production d’énergie, sont de maladies génétiques très rares et incurables. Ces maladies peuvent se manifester à tout âge et peuvent affecter plusieurs types d'organes en même temps. Les mutations du notre gènes d’intérêt n 1 et 2, codant des protéines essentielles pour la production d'énergie dans nos cellules, provoquent des maladies affectant le cerveau et le cœur. Comme ces maladies affectent les cellules qui ne se divisent pas, la culture cellulaire ne peut pas aider à comprendre comment le dysfonctionnement mitochondrial affecte le fonctionnement des organes affectés et le développement de la maladie. Ainsi, un modèle animal doit être utilisé pour comprendre les mécanismes physiopathologiques de ces maladies. Nous avons décidé d'utiliser les souris comme modèle parce que les souris sont plus proches de l’humain et la physiologie mitochondriale chez l’homme et la souris sont très similaires. Nos objectifs sont les suivants : - Création et étude d'un modèle de souris pour l'étude du développement des maladies associées au gène d’intérêt 1 et 2. La création de ces deux modèles animaux et la compréhension du développement de la maladie mitochondriale sont des étapes nécessaires à la mise au point d'un traitement efficace.
Bénéfices attendus
Ce projet fournira des modèles murins pour les maladies mitochondriales et permettra de découvrir leurs mécanismes pathologiques. Ces deux points sont des étapes essentielles pour le développement d'un traitement pour ces maladies encore incurables.
Procédures
-échocardiographie (20 min par souris; 6 fois maximum par souris) -anesthésie gazeuse (20 min par souris; 6 fois maximum par souris) -injection intra-péritonéale (1 min par souris ; 6 fois maximum par souris) -grip-test (5 min par souris ; 6 fois maximum par souris) -treadmill (5 min par souris ; 6 fois maximum par souris); biopsie pour génotypage: (1 min par souris; 1 fois par souris )
Impact sur les animaux
Les souris où l’expression du notre gène d’intérêt 1 est abolie (seuls 25% des souris de chaque portée), développeront une cardiomyopathie.. À partir de 9 semaines, ces souris peuvent commencer à perdre du poids et avoir une mobilité réduite avec une posture anormale. Les souris où l’expression du notre gène d’intérêt 2 est abolie (seuls 25% des souris de chaque portée), développeront maladie neurologique et meurent le premier jour de vie. Les autres nuisances que les souris subiront sont le stress pendant le test comportementaux, pendant l’échocardiographie, pendant l’injection intra péritonéal et le stress pendant le transport vers le centre expert de l’échocardiographie.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort pour l'analyse moléculaire, histologique et biochimique des tissus.
Remplacement
L’objectif de notre projet est d’étudier la pathophysiologie des maladies mitochondriales. Pour cette raison l’utilisation d’un modèle animal est nécessaire. La préparation des cultures cellulaires primaires, pour l'étude du rôle moléculaire des protéines codées par notre gènes d’intérêt, aide à réduire le nombre d'animaux utilisés mais ils ne peuvent malheureusement pas remplacer l'utilisation du modèle animal.
Réduction
Afin de réduire le nombre de souris utilisées pour les expériences, nous nous sommes basés sur nos précédents travaux sur l’étude d’autres modèles murins de maladies mitochondriales et sur de méthodes et analyses statistiques. De plus, lorsque cela est possible, les prélèvements d’une même souris seront utilisés pour plusieurs analyses. L’échocardiographie est elle-même une méthode de réduction car elle permet un suivi longitudinal des souris, par opposition à une mise à mort séquentielle.Nous utiliserons des méthodes statistiques comme des tests t de Student et Anova en fonction des groupes d’animaux comparés.
Raffinement
Dans un contexte de raffinement adapté, les animaux seront surveillés quotidiennement par les techniciens de l'animalerie (dans les weekends par les personnes d’astreinte), et une fois par semaine par les chercheurs travaillant sur ce projet, pour détecter un éventuel état de souffrance et/ou d’angoisse. Pour minimiser la détresse causée par les symptômes de la maladie, nous avons établi des critères de décision pour la mise à mort des souris lorsque cela est nécessaire. Concernant l'échocardiographie, les souris seront anesthésiées, pour être capable de mesurer correctement les différents paramètres du système cardiaque et éviter le stress. Concernant les injections le volume injecté sera réduit au minimum possible et la solution sera chauffée à la température ambiante. Pour assurer le bien-être des souris, elles seront placées en cage groupée dans un milieu enrichi avec des carrés de coton, des maisonnettes et des bâtonnets à ronger. L’enrichissement social des souris sera garanti en évitant tout isolement prolongé. Le transfert des souris vers le centre expert de l’échocardiographie se fera dans des cages de transport sécurisées dans des véhicules dédiées tout en réduisant les vibrations et le bruit.
Choix des espèces
Les souris sont génétiquement, physiologiquement et anatomiquement proches des humains. La physiologie mitochondriale et la tissu-spécificité des fonctions mitochondriales chez l’homme et la souris sont très similaires. Pour nos études, nous utiliserons des souris de différentes tranches d'âge (nouveau-nés, souris juvéniles et juvéniles adultes). Les tests comportementaux et les échocardiographies seront réalisés sur des souris âgées de 3 semaines et plus.
Exploration du métabolisme du fer dans les maladies neurodégénératives en statut conventionnel.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Porteuses d'une mutation qui reproduit une maladie neurodégénérative pédiatrique, les souris de ce projet servent à explorer l'accumulation de fer dans leur cerveau. 2 720 vont être utilisées, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger : 1 360 subissent un prélèvement de sang à la queue, 1 280 une injection intrapéritonéale de piégeurs de fer ou d'inhibiteur, 560 un gavage. Le porteur qualifie de léger chacun de ces gestes, y compris l'injection de fer, et fixe comme point limite une perte de poids supérieure à 20 % en une semaine. Toutes sont anesthésiées puis tuées à l'issue, pour les analyses d'immunologie et les cultures cellulaires.
Objectifs
Des mutations ou des défauts dans cette machinerie de recyclage des sucres provoquent généralement une accumulation progressive de fragments de cahines de sucres partiellement dégradés dans un compartiment de la cellule appelé lysosome. Cela conduit à une pathologie métabolique grave nommée maladie neurodégénérative pédiatrique est caractérisée par l’accumulation de sucres défectueux ayant un effet délétaire dans le cerveau. Les conséquences cliniques de celle-ci sont la perte des facultés d’élocution, de compréhension et de motricité des jeunes enfants atteints ainsi que des décès prématurés. A l’heure actuelle, établir un diagnostic précoce de la pathologie est complexe et aucun traitement ne permet de ralentir la détérioration mentale. Des essais de thérapie génique sont en cours d'étude (notre équipe et collaborateurs). Un premier essai à base de vecteurs a été réalisé chez 4 patients, le suivi de 5 ans montre des résultats encourageants. Ainsi, d’autres alternatives thérapeutiques restent à être recherchées pour les patients qui seront exclus de cette approche et pour les patients chez qui la thérapie génique aurait échoué. Parmi elles, l’exploration de l’accumulation du fer observée dans le cerveau de patients et dans notre modèle de souris mutante. Le fer est extrêmement toxique et est capable de produire du stress oxydant, de l’inflammation, voire une mort cellulaire dépendante du fer ou ferroptose. De ce fait, nous souhaitons explorer la ferroptose en vue de diagnostic et/ou traitement associant la thérapie génique en cours. Les objectifs de ce projet sont de mettre en évidence de la ferroptose et identifier les populations cellulaires touchées dans ce contexte.
Bénéfices attendus
Ce travail va nous permettre de mieux comprendre la maladie étudiée. A travers l'étude approfondie des cultures cellulaires issues des animaux, nous allons pouvoir decrypter les mécanismes associés. La modélisation de la surcharge en fer va aussi nous permettre d'étudier avec précisions aussi bien sur l’inflammation que le stress oxydant. L’étape suivante sera la perspective de se projeter vers une solution thérapeutique majeure à cette pathologie pédiatrique grave qui n’est actuellement toujours pas soignée.
Procédures
1360 animaux vont subir un prélevement sanguin à la veine caudale. Pour les 1360 souris cela se fera en quelques secondes avec une couverture analgésique et un anesthésique approprié. 1280 souris vont avoir une injection non douloureuse de piégeurs de fer ou d’inhibiteur d’une molécule régulant le fer ou de serum physiologique en intrapéritonéale en une seule fois avec un volume réglementaire. C’est un geste qui sera réalisé avec un minimum de contention par des personnes habitués et qui dure moins de 10 secondes. 560 souris seront gavées avec un volume adapté avec un geste précis et professionnel durant 5 secondes. Toutes les 2720 souris (males et femelles) suivront une anesthésie et analgésie terminale en vue d'une mise à mort réglementaire necessaire à la bonne réalisation des expériences associées (immunologie et culture).
Impact sur les animaux
Les modèles de souris à générer ne présentent aucun phénotype dommageable et sera surveillé et notifié si cas contraire observé. Les interventions sur l’animal sont traduites dans les 3 procédures par des actes induisant une douleur ou une gêne classée comme « légère ». L’injection du fer est une injection uniquegénérant chez la souris une douleur classée « légère ». Les traitements de chélation de fer ou d’inhibition d’hepcidine se font par gavage ou injection intrapéritonéale induisent chez la souris une douleur ou une gène classée « légère ». En fin d’expérimentation, les souris seront anesthésiées avec un mélange de kétamine 400mg/kg) et de Xylazine (10 mg/kg) -intrapéritonéal avec un matériel approprié est un acte induisant une douleur ou une gêne classée légère.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l’issue des procédures afin de pouvoir etre exploiter et permettre la démonstration de nos hypothèses expérimentales.
Remplacement
Quand cela est possible, le modèle animal est remplacé par des cultures cellulaires mais qui restent issues de l’animal. Nous avons une étape « in vitro » indispensable à la compréhension et au décryptage des interactions cellulaires et des voies de signalisation de la ferroptose dans notre modèle Afin de valider ces interactions cellulaires au sein du cerveau, actuellement seul le modèle in vivo peut modéliser les interactions entre plusieurs cellules du cerveau pour une démarche thérapeutique. Nous sommes également vigilantes sur les avancées des modèles organoïdes afin de mettre en perspective le remplacement de notre modèle animal. Pour l’instant, la complexité physiologique et les réponses systémiques de ce projet ne peuvent pas être reproduites in vitro.
Réduction
Un nombre restreint de souris est utilisé dans chaque groupe (n=10) afin de perfectionner la procédure et de maximiser les chances de réussite et de réduire le nombre de pertes potentielles. Notre étude utilise des méthodes expérimentales validées, publiées et utilisées extensivement par les laboratoires de recherche. Les analyses statistiques seront effectuées à l'aide d'un logiciel de statistique performant.
Raffinement
Afin de réduire au maximum les douleurs et l’inconfort des animaux, cette étude sera conduite par un expérimentateur formé à l’expérimentation animale et avec le diplôme de chirurgie. Les injections intrapéritonéales seront réalisées par un personnel compétent et habitué. Le gavage des animaux est un geste difficile qui est réalisé par un personnel formé et entrainé. Le comportement des souris sera évalué quotidiennement par un personnel compétent. De toute façon, nos procédures nécessitent une manipulation fréquente des animaux qui permettra à l’expérimentateur d’observer et d’évaluer l’état de santé de l’animal ainsi que son évolution dans le temps. En particulier, nous observerons : Les altérations physiques : • Les variations du poids de l’animal (et variations de l’ingestion de nourriture et d’eau), flan creusé/dos vouté, yeux enfoncés/vitreux • Les signes cliniques observables (fréquence respiratoire et cardiaque) •Les changements du comportement •Les réponses comportementales aux stimuli externes Tout écart de la normalité sera répertorié et des solutions seront considérées pour pallier à cette situation. L’ensemble de ces 4 critères sera utilisé pour déterminer l’état de santé de l’animal. Dans le cas où une souris montrerait un état de santé détérioré qui ne pourra être amélioré par les traitements (antidouleur, antibiotiques, administrations de solutions glucosées), la souris sera euthanasiée. En tous cas, une perte de poids supérieure à 20 % dans l’espace d’une semaine est considérée en soi comme un point limite et engendra la mise à mort de l’animal. Ces cas sont très rares, dans le cadre de nos expériences mais le nombre d’animaux utilisés prend en considération ces éventuelles pertes pour les tests statistiques. Nous réaliserons les expériences anatomiques, cellulaires et moléculaires sur les mêmes animaux utilisés. La technique de préhension de l’animal sera réalisée sans lui tenir la queue suivant les recommandations du service du bien-être animal.
Choix des espèces
Le métabolisme du fer a été très étudié chez la souris qui s'est révélé être un modèle pertinent. Les hypothèses scientifiques sur lesquelles reposent le projet ont été élaborées sur la base de travaux déjà publiés chez la souris. Cette souche muté d’intéret est adaptée pour étudier la pathologie et développer des thérapies pour les maladies lysosomales. Notre projet de recherche est basé sur l’utilisation de modèles animaux génétiquement modifiés qui nécessitent d’utiliser des animaux contrôles sauvages. Aucune autre espèce n’est disponible avec autant d’outils précieux qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Les stades de développements sont adaptés aux caractéristiques physiopathologiques de la maladie que nous voulons étudier. Les animaux seront utilisés à 2 et 5 mois. Ce sont des âges assez précoces qui vont nous permettre de pourvoir étudier le développement de la pathologie avec ou sans apport en fer. A 2 mois ces animaux ont les 1ers influx de fer et à 5 mois on peut voir les consequences de cette accumulation sur les fonctions du cerveau et des differents types cellulaires qui y coexistent.