Recherche fondamentale
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Innovation thérapeutique dans le cancer du pancréas EU 1/2
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié reçoit une greffe de cellules tumorales pancréatiques par chirurgie, l'autre sans chirurgie, puis toutes passent une échographie sous anesthésie chaque semaine, certaines une IRM d'une heure et des prélèvements de sang hebdomadaires pratiqués sur animal éveillé. Le porteur range parmi les effets attendus une perte de poids supérieure à 20 %, des mutilations, de l'agressivité et les douleurs dues à l'implantation des tumeurs. Il écrit que "seule l'utilisation de modèles animaux" permet d'atteindre ses objectifs, et que la mise à mort en fin de procédure est "indispensable".
Objectifs
Le cancer du pancréas (adénocarcinome pancréatique canalaire) est la troisième cause de décès par cancer dans les pays occidentaux. Son très mauvais pronostic s’explique par l'absence de biomarqueurs pour la détection précoce de la maladie et d’approches thérapeutiques efficaces lorsque la chirurgie n’est plus possible. Les chimiothérapies actuelles améliorent peu la survie des patients, et les thérapies ciblées et immunothérapies n’ont pas encore eu l’effet clinique escompté. Dans ce contexte, notre équipe de recherche conduit depuis plusieurs années, des projets de recherche fondamentaux et translationnels jusqu’à la clinique pour comprendre comment ce cancer se met en place, pour identifier les patients à risque et ceux porteurs de lésions précoces, pour vaincre la résistance aux traitements et proposer une thérapie sur mesure. Seule l'utilisation de modèles animaux peut nous permettre d'atteindre ces objectifs. Ce projet se déroule dans deux établissements utilisateurs agréés.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est la validation de stratégies thérapeutiques efficaces pour la prise en charge du cancer du pancréas
Procédures
Tous les animaux inclus dans les différents protocoles expérimentaux seront soumis au suivi de la progression tumorale par échographie, une fois par semaine au niveau de l'unité expérimentale EU 1/2. Cette procédure non invasive ne requiert que l'anesthésie des animaux. Sur la période, 480 souris seront soumises à une greffe de cellules tumorales pancréatiques ne nécessitant pas de chirurgie. Sur la période, 480 souris seront soumises à une greffe de cellules tumorales pancréatiques nécessitant une chirurgie. La transplantation cellulaire sera effectuée en une seule intervention d'une durée de 15 à 20 minutes. Dans certains cas, les souris vigiles pourront être soumises à des prélèvements sanguins au cours du développement tumoral (recherche de biomarqueurs sanguins précoces, de réponse au traitement, marqueurs métaboliques, immunophénotypage). Un prélèvement sera effectué avant l'apparition de la tumeur puis une fois par semaine pendant la durée de l'expérimentation. En IRM des images anatomiques (pondérée T2) de l’abdomen (avec synchronisation au mouvements respiratoires) seront réalisé une fois, en contrôle, avant administration de la thérapie et une fois, 1 à 2 semaines après la première. Soit 2 acquisitions pas animal, afin de déterminer le volume et la localisation de la (des) tumeur(s). La durée d'analyse par souris est d'environ 1 heure. Le suivi de la progression tumorale par imagerie optique (durée de l'analyse 5 minutes par souris) et par échographie (durée de l'analyse 10 mn par souris) sera réalisé une fois en contrôle, avant administration de la thérapie puis une fois par semaine pendant la durée du protocole expérimental.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux sont une dégradation de l'état général ; comportement anormal (modification de l'activité générale, léchages, mutilation, agitation, agressivité), modifications d'aspect (perte de poids supérieure à 20%), modifications motrices, modifications végétatives (pilo-érection, variation de la température cutanée), des douleurs dues à l'implantation des tumeurs.
Devenir
La mise à mort des animaux en fin de procédure est indispensable à la réalisation d'études comparatives afin de mettre en évidence les mécanismes antitumoraux mis en jeux.
Remplacement
Notre projet de recherche fondamentale et translationnelle pour la découverte de biomarqueurs et pour la thérapie du cancer du pancréas nécessite l'utilisation de modèles murins de référence reproduisant fidèlement la complexité et l'hétérogénéité intra- et inter-tumorale de la pathologie humaine. Ces critères ne peuvent être apportés par les modèles cellulaires. L'utilité de ces modèles dans nos domaines de recherche est reconnue et validée internationalement. Les publications scientifiques, notre retour d'expériences et la mise en commun des informations et données expérimentales provenant de ces modèles permettent d'appliquer les principes de remplacement, de réduction et de raffinement dans nos protocoles.
Réduction
Nous avons réalisé une étude statistique qui nous a amené à réduire le nombre d'animaux par groupe à 6, afin d'obtenir des résultats exploitables
Raffinement
Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel compétent de la zootechnie qui vérifie leur état. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront suivis quotidiennement et seront placés sous structure du Bien être animal (SBEA) pour les procédures classées modérées (chirurgie, prélèvement et injections). Par ailleurs, nous utiliserons deux méthodes d'imagerie non invasive pour le suivi de la croissance tumorale. Pour toutes les procédures décrites dans ce projet, les animaux hébergés en zone d'expérimentation EU 1/2 seront transférés vers les salles d'expérimentation selon une procédure adaptée qui garantit leur maintien en bonne santé, leur bien-être et respecte les exigences scientifiques. Les animaux seront transportés dans leur cage sur un chariot adapté, avec accès à la nourriture pendant le transfert. Les biberons seront retirés pour éviter l'humidification de la litière et remis en place dès l'arrivée des cages dans les laboratoires appropriés. Le retour vers la zone d'hébergement se déroulera selon les mêmes modalités. Nous utiliserons des analgésiques pour diminuer la douleur dès que nécessaire, et des croquettes seront placées dans la cage pour faciliter la récupération post-procédure. La douleur sera évaluée par observation du comportement général de l’animal (recherche de toute modification du comportement : isolement, absence de réaction lorsque l’animal est attrapé,ne s’agrippe plus aux barreaux de sa cage), de l’état du pelage (poils hérissés, mal entretenus, pelage terne). Des points limites ont été définis pour chaque procédure expérimentale. Dès que l'un d'entre eux sera atteint l'animal sera immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
La souris est le modèle d'étude de base le plus pertinent pour notre projet. Les allo- et xénogreffes chez la souris immuno-déficiente sont utilisées pour les tests précliniques. Les méthodologies d'investigation sont bien décrites, les protocoles expérimentaux sont disponibles et partagés. Ceci permet de réduire le nombre de souris nécessaires. Les animaux pourront être livrés à partir de 5 semaines d'âge, pour acclimatation d'une semaine avant la mise en expérimentation.
Maintien et production pour l’expérimentation de la lignée de souris kF-DH à phénotype dommageable
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Expédiées à deux ou trois mois vers un autre établissement pour y servir dans un projet distinct, les souris kF-DH sont élevées pour reproduire une maladie rénale liée au dépôt d'anticorps produits par une cellule cancéreuse. 640 souris porteuses de ce phénotype dommageable vont être utilisées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le génotypage se fait par poinçonnage du pavillon de l'oreille après dix-sept jours, une bague d'identification étant posée sur l'autre oreille. Celles qui restent pour la reproduction sont tuées avant six mois, soit avant que l'insuffisance rénale ne se déclare, et le porteur indique qu'à la fin du projet l'élevage sera arrêté et la lignée conservée sous forme cryoarchivée.
Objectifs
Dans certaines maladies rénales, un anticorps fabriqué par une cellule cancéreuse ou pré- cancéreuse va se déposer au niveau du rein et provoquer des lésions rénales. Ces lésions rénales vont aboutir à une insuffisance rénale terminale en l’absence de traitement, et potentiellement au décès du patient. L’objectif de cet élevage est de produire des animaux reproduisant la maladie rénale observée chez l’homme. Ces animaux seront par la suite utilisés dans un projet déposé visant à étudier les mécanismes de développement des lésions rénales en aval des dépôts d’immunoglobulines, afin de développer de nouveaux marqueurs diagnostiques, pronostiques et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
L’élevage de ces animaux permettra d'obtenir des animaux reproduisant de manière très fidèle la pathologie humaine. Ces animaux seront intégrés dans un projet scientifique plus large, déposé, pour lequel nous espérons plusieurs bénéfices : - Mieux comprendre les conséquences rénales des dépôts d’anticorps - Identifier des cibles thérapeutiques spécifiques au rein permettant d’envisager une thérapie plus ciblée que les actuelles chimiothérapie - Etendre les découvertes de ce projet à d’autres pathologies rénales (en particulier le diabète qui présente beaucoup de similarités avec cette maladie). Cela permettra in fine d’envisager des alternatives thérapeutiques aux actuelles toxiques chimiothérapies recommandées dans cette pathologie.
Procédures
Afin de réaliser le génotypage, un poinçonnage de l’oreille sera effectué après l’âge de 17 jours. Cette méthode consiste à prélever un petit échantillon de tissu sur la périphérie du pavillon de l’oreille où le tissu est le plus mince, à l’aide d’un poinçon. Cette intervention n’est réalisée qu’une fois par animal et dure moins de 30 secondes. Seulement les animaux utilisés pour les croisements seront génotypés.
Impact sur les animaux
Les souris doubles mutées présentent à partir de 8 mois une perte progressive de fonction rénale. Les symptômes de l'insuffisance rénale terminale sont, chez l'homme et la souris, très peu spécifiques. Les principaux symptômes, ou nuisances, seront donc une asthénie, un amaigrissement et une altération de l'état général et du comportement traduite par un poil hérissé, une baisse de la réactivité, ou une prostration. Cependant, les animaux ne devraient pas souffrir de ces nuisances pendant la période d’élevage. Les souris pourraient ressentir une légère nuisance due au prélèvement effectué pour le génotypage mais également lors de la pose de la bague d’identification sur l’autre oreille (douleur légère de courte durée).
Devenir
Une partie des animaux portant le génotype d’intérêt kF-DH sera expédiée avant l’expression du phénotype dommageable avec leurs contrôles DH (sans phénotype dommageable) et utilisée dans un projet de recherche déposé dans un autre établissement utilisateur. Une autre partie des animaux kF-DH sera utilisée pour l’élevage dans notre établissement. Les animaux utilisés pour l’élevage seront mis à mort avant 6 mois, soit avant que le phénotype dommageable ne s’exprime, ou plus tôt si non nécessaires pour maintenir l’élevage (e.g.si surplus). Les animaux ayant atteint les points limites selon la grille d’évaluation du bien-être animal seront mis à mort.
Remplacement
Les modèles cellulaires ne permettent pas de reproduire la complexité de la maladie des dépôts d’immunoglobulines monoclonales. D’autre part, il est probable que le développement des lésions rénales soit la conséquence de multiples types de cellules présent dans le rein. Il est donc impossible de reproduire cette pathologie sur des modèles qui ne soient pas des animaux.
Réduction
Afin de respecter la règle des 3R, une réduction du nombre d'animaux utilisés est appliquée pour répondre aux différentes questions du projet scientifique. Un nombre total de 640 animaux au phénotype dommageable est nécessaire et comprend les animaux pour accouplements et les animaux issus des accouplements et nécessaires pour l’expérimentation pour le projet scientifique associé. La production des animaux sera planifiée et suivie par l’expérimentateur et les zootechniciens de l’établissement utilisateur afin de limiter le nombre d’animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l’élevage. Le nombre de reproducteurs, le schéma de croisement et la durée d’accouplements seront définies en amont de la mise en place des croisements. Ces paramètres seront définis en fonction des objectifs et des différentes caractéristiques connues des lignées (taille de portées, viabilité, phénotype, etc.). L'élevage sera suivi via le fichier de l'élevage. En fin de projet expérimental, l’élevage sera arrêté et le modèle restera accessible sous forme cryoarchivé pour utilisation ultérieure.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des cages de taille réglementaire (6 maximum par cage) comportant des enrichissements (nids). Tous les animaux kF-DH mutés de manière homozygote pour les deux modifications génétiques et susceptibles de développer le phénotype dommageable à partir de 8 mois seront suivis tous les jours à partir de deux mois et ce jusqu'à leur envoi à 2-3 mois vers l’établissement où sera réalisée l’expérimentation. Dans le cas où les animaux homozygotes ne sont pas transférés vers l’EU pour l’expérimentation, ces derniers seront utilisés pour les croisements et mis à mort avant 6 mois, soit avant que le phénotype dommageable ne s’exprime. Les animaux seront suivis avec la grille d’évaluation du bien-être animal contenant des mesures de raffinement (croquettes humides et/ou aliment gélifié déposés dans la cage) et des points limites précoces. La production des animaux sera planifiée et suivie par l'expérimentateur et les zootechniciens de l'établissement utilisateur afin de limiter le nombre d’animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l'élevage.
Choix des espèces
La souris et le rat sont les seules espèces permettant à ce jour de reproduire la maladie observée chez l’homme. Les souris doubles homozygotes kF-DH seront utilisées pour les croisement dès l’âge de deux mois et ce jusqu’à 6 mois, soit avant le développement du phénotype dommageable. Dans l'article initial, les souris commencent à développer des lésions rénales à l’âge de 6 mois, et la présence de dépôts sans retentissement rénal est retrouvée dès l’âge de 2 mois. Les animaux doubles homozygotes kF-DH envoyés pour expérimentation auront ainsi un âge de 2-3 mois.
Etude du Syndrome Nephrotique Idiopathique (SNI) sur la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Trois injections intrapéritonéales espacées de deux jours, puis la mise à mort pour prélever les lymphocytes T : les souris donneuses fournissent les cellules injectées par voie intraveineuse aux souris receveuses, qui reçoivent à leur tour quatre injections avant d'être tuées. 400 souris vont être utilisées, 300 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 100 un niveau léger, pour comprendre le rôle d'une protéine dans le syndrome néphrotique idiopathique, première maladie rénale de l'enfant. Le porteur écrit que les animaux ne subissent que des injections et que celles-ci n'induisent aucune souffrance au-delà de la douleur de la piqûre. Il affirme que la seule stratégie pour comprendre le rôle de cette protéine consiste à éteindre son expression in vivo.
Objectifs
Le syndrome néphrotique idiopathique (SNI) est la forme la plus fréquente des maladies rénales de l’enfant et de l’adulte jeune. Ce syndrome est caractérisé par la survenue brutale d’oedèmes généralisés liés à une fuite urinaire massive de protéines (protéinurie) entraînant une perte importante de protéines du sang, en particulier de l’albumine. Les oedèmes sont souvent associés à une hyperlipidémie et une hypercoagulabilité sanguine. Bien que la majorité des patients réponde favorablement au traitement de première intention par les corticoïdes, le taux de rechute avoisine les 80%, et un traitement à long-terme, qui associe les corticoïdes à d’autres immunosuppresseurs, est souvent nécessaire pour maintenir la rémission, ce qui est délétère pour les patients compte-tenu des effets secondaires néfastes de ces traitements. La cause exacte du SNI reste inconnue. Les études génétiques récentes n’ont pas permis d’identifier des anomalies structurales de gènes. Actuellement, l’hypothèse la plus étayée par les différentes études clinico-biologiques concernant ce syndrome, notamment la réponse aux traitements immunomodulateurs et/ou immunosuppresseurs, est celle d’une pathologie du système immunitaire dont certaines cellules, encore non identifiées, pourraient sécréter un facteur soluble plasmatique contribuant à l’induction du défaut de perméabilité des glomérules rénaux à l’origine de la protéinurie. Dans de précédentes études, il a pu être démontrer in vivo, sur des modèles murins, que la surexpression de Cmip précèdait l'apparition de la protéinurie selon des mécanismes qui restent à élucider. Il a été identifié, chez les patients atteints de SNI, cette même protéine CMIP, dont l’expression est particulièrement augmentée au cours des poussées de la maladie, dans les lymphocytes T et les podocytes du glomérule rénal. Actuellement, la fonction de cette protéine reste inconnue, d'où l'objet de ce projet. Comprendre la fonction de CMIP dans le système immunitaire permettra d' identifier les mécanismes par lesquels, la surexpression de CMIP dans les lymphocytes T, induirait le développement d'un SNI. Les résultats attendus constitueraient une avancée majeure dans la compréhension de cette pathologie et pourrait permettre d’identifier une nouvelle cible thérapeutique potentielle. (A noter que la nomenclature internationale désigne C-Maf inducing Protein humaine par CMIP et celle de souris par Cmip)
Bénéfices attendus
Lors de la phase de poussée du SNI, l'expression de CMIP est détectée dans le système immunitaire (lymphocytes) et dans le rein (podocytes). Il a pu être démontré, par l'utilisation de souris transgéniques, que l'expression de Cmip dans les lymphocytes engendrait des perturbations du système immunitaire. Ces phénomènes précèdent l'apparition de la protéinurie. Les mécanismes impliqués dans ces perturbations ne sont pas connus et leur élucidation pourrait permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans cette maladie. L'élucidation de la fonction de CMIP permettrait une grande avancée dans la compréhension des dysfonctions immunitaires induites par la surexpression de cette protéine.
Procédures
Au cours de l’expérimentation, Les souris donneuses recevront une injection intrapéritonéale (qui dure 10 secondes par souris) tous les deux jours pour un total de 3 injections, puis elles sont sacrifiées et les lymphocytes T prélevés pour être injectés en IV (qui dure 30 secondes par souris) sous AG dans les souris receveuses qui recevront une injection IP tous les deux jours pour un total de quatre avant le sacrifice
Impact sur les animaux
Pour l'ensemble des procédures, les animaux ne subissent que des injections. Ces injections, hormis la douleur de la piqure n'induiront aucune autre souffrance et n'auront pas d'autre incidence sur leur condition de vie.
Devenir
Les animaux sont systématiquement euthanasiés en fin de procédure afin de prélever les organes dans le but de préparer des cellules d'intérêts.
Remplacement
Le gène CMIP est de découverte récente et son implication dans les maladies humaines reste inconnue. Il est peu exprimé voire indétectable chez le sujet sain. En revanche, il est fortement exprimé dans certaines pathologies dysimmunitaires humaines en particulier le syndrome néphrotique idiopathique (SNI) où il est surexprimé dans les lymphocyte T CD4 qui sont impliqués dans la maladie. Pour l’instant, sa fonction est inconnue. La seule stratégie pour comprendre comment il agit pour entraîner des désordres immunitaire à l'origine du SNI, est de l’invalider in vivo (éteindre l’expression du gène) et analyser les conséquences sur la fonction du lymphocyte T par rapport aux souris contrôles (qui expriment normalement le gène). La compréhension de la fonction de CMIP dans le lymphocyte T est primordiale si on veut élucider les mécanismes immunopathologiques du SNI
Réduction
Le nombre de souris par lot a été déterminé dans une étude pilote sur des souris contrôle non traitées. Ces souris ont été euthanasiées, les organes prélevés et les lymphocyte T préparés. Le phénotypage des lymphocytes T a été effectué par cytométrie. Nous avons utilisé le test de Mann-Whitney pour comparer les différentes sous-populations de lymphocytes T avec leur phénotype spécifique, ainsi que le taux de cellules nécessaires pour une analyse transcriptomique. Nous avons ainsi estimé le nombre de souris à traiter pour pouvoir finaliser toutes les études, qui doivent être réalisées (immunoselection, immunofluorescence, préparation de protéines et d’ARN) à partir des cellules extraites de ces souris. Le nombre d'animaux pour chaque procédure a été réduit au maximum tout en garantissant la qualité et la significativité des résultats.
Raffinement
Les animaux sont hébergés par lot de même sexe sans dépasser le nombre de 5 animaux par cage ni d’animaux seul dans une cage. Ils ont à disposition de l’eau et des aliments à volonté et l’enrichissement est constitué par l’apport de papier compressé, d’un refuge en cellulose et de Sizzel-dri (enrichissement foisonnant à base de papier Kraft). Les souris sont surveillées visuellement 2 à 3 fois par jour au cours des procédures. Les points limites à l’expérimentation sont décidés en cas de souffrance ou de détresse, insensibilité aux stimuli, prostration, troubles respiratoires, hypothermie. Dans ces conditions, et en accord avec le code de l’expérimentation, les souris seront euthanasiées.
Choix des espèces
CMIP est une protéine clé dans l'apparition de la protéinurie aussi bien chez l'homme que chez la souris. Nous avons choisi la souris car elle est reconnue comme modèle dans l’étude du SNI. Au cours d'études précédentes, nous avons généré des lignées de souris transgéniques qui sur-expriment Cmip dans les lymphocytes et les podocytes mais également des lignéesinvalidées pour le gène CMIP que nous utilisons dans ce projet Nous utiliserons des souris adultes entre 8 et 10 semaines car le système immunitaire est mature chez la souris à ces âges.
Optimisation de produits de thérapie génique pour des indications de dystrophies musculaires
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Une injection unique dans le muscle, puis jusqu'à dix prises de sang sous anesthésie gazeuse en quinze à soixante jours : 600 souris porteuses d'une anomalie génétique de dystrophie musculaire vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs muscles, leur foie et leur rate. Le projet compare des vecteurs de thérapie génique pour retenir celui qui reste efficace aux doses les plus faibles, le porteur rappelant que des essais cliniques récents dans la myopathie de Duchenne ont provoqué des effets indésirables allant jusqu'au décès. Il décrit pourtant toutes les atteintes comme légères et affirme qu'aucune nuisance n'est attendue des traitements, tous "de nature bénéfique". Sur les 600 animaux, il écrit seulement que le nombre par groupe est optimisé, sans donner ni effectif de groupe ni calcul.
Objectifs
Les dystrophies musculaires sont un ensemble de pathologies invalidantes sans traitement présentant des atteintes fonctionnelles (réduction de la force musculaire, avec parfois atteinte cardiaque ou respiratoire). Les modèles animaux de ces maladies sont des souris. Une option thérapeutique possible est la thérapie génique, qui consiste à apporter une copie normale correspondant au gène mutant à l’aide d’un véhicule appelé vecteur. Celui utilisé est dérivé d’un virus appelé virus non-pathogène associé à l’Adenovirus (AAV) dans lequel on introduit le gène médicament en lieu et place du génome viral. La thérapie génique clinique a connu un succès significatif ces dernières années avec, en particulier, l’autorisation du Zolgensma pour l’amyotrophie spinale de type I. Malgré ces récents succès, la délivrance sûre et efficace de matériel génétique continue d'être un défi majeur dans le cas des maladies neuromusculaires. En effet, le muscle squelettique représentant environ 40% de la masse corporelle est un véritable défi en termes de délivrance et de production de vecteurs, car jusqu'à présent les doses thérapeutiques prédites par les études sur de grands modèles animaux sont extrêmement élevées. Des effets adverses allant jusqu’au décès ont pu être observés dans de récents essais cliniques, en particulier dans la myopathie de Duchenne, sans compter que la perfusion de doses élevées de vecteurs est susceptible de déclencher des toxicités immunitaires indésirables. Par conséquent, il y a un grand intérêt à définir des stratégies permettant une efficacité aux doses les plus faibles possibles. L’objectif de ce projet est de comparer l’efficacité de produits portant un gène thérapeutique afin de sélectionner la forme la plus intéressantes en termes d’expression.
Bénéfices attendus
Dans ce projet, nous proposons de définir les meilleurs produits de thérapie génique, Les résultats pourraient permettre l’établissement de traitements de thérapie génique ayant une meilleure efficacité et une plus grande tolérance pour de futures applications chez l'Homme afin de traiter ces dystrophies musculaires qui n’ont pas de traitement à l’heure actuelle et qui sont très invalidantes voire léthales.
Procédures
Le traitement par transfert de gène se fait par injection intramusculaire une seule fois en moins de 5 minutes, Les prélèvements de sang se font au maximum une fois par semaine sur animaux sous anesthésie gazeuse de courte durée moins de 5 minutes. Une étude peut durer entre 15 et 60 jours maximum de ce fait un animal pourra être prélevé au maximum 10 fois. Cependant pour certains transferts de gène les animaux ne seront prélevés que toutes les 2 ou 3 semaines en fonction de la nécessité de suivre la réponse immunitaire. Selon nos expériences certains gènes provoquent peu de réponse immunitaire. Les prélèvements de sang ne se font pas le même jour que les injections afin de ne pas induire de douleur supplémentaire.
Impact sur les animaux
Les nuisances (douleur ou stress) attendues sur les animaux sont classées légères et sont liées en particulier à la nature des différents actes réalisés : douleur de piqûres pour administration d’anesthésique, d’intramusculaire pour injection du traitement par transfert de gène. Certains actes qui seraient susceptibles d’entrainer des douleurs sont réalisés sous anesthésie, la nuisance sera donc liée à l’acte d’anesthésie. Il y a une possibilité de sécheresse oculaire au cours des anesthésies. En ce qui concerne les modèles utilisés, même s’ils portent une anomalie génétique correspondant à une dystrophie musculaire progressive chez l’homme, ils présentent un phénotype moins important que les patients. Ils ne présentent donc pas de phénotype délétère à l’exception des modèles les plus sévères au stade avancé de la pathologie où l’on peut observer une scoliose ou une atrophie musculaire. Cependant, dans ce projet, nous utiliserons des animaux à des âges où aucune conséquence sur le comportement n’est observée. L’ensemble des animaux n’exprime donc pas de phénotype dommageable. Il n’y a pas de nuisances attendues dans ce projet par rapport à l’effet des traitements, qui sont tous de nature bénéfique et sont utilisés à des doses correspondant à la fenêtre thérapeutique.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de réaliser le prélèvement des muscles et des organes. Les muscles permettront de mesurer l’efficacité d’expression alors que, les organes tels que le foie ou la rate permettent de vérifier l’absence de toxicité.
Remplacement
Des étapes de validation de vecteurs antérieures à cette procédure ont été faites in vitro. . Théoriquement, les méthodes alternatives à l’expérimentation animale peuvent être de différentes natures : méthodes in silico ou in vitro. Les approches in silico utilisées en alternative à l’expérimentation animale à ce jour permettent uniquement des modélisations physico-chimiques comme la relation entre structure et activité biologique d’une molécule ou des modélisations toxico-cinétiques d’élimination de molécules. Des modèles in silico qui pourraient permettre de modéliser numériquement les expériences proposées dans ce projet à partir d’un ensemble de données n’existent donc pas à ce jour. Les méthodes in vitro les plus utilisées aujourd’hui comme alternative en expérimentation animale sont basées sur l’utilisation de cultures cellulaires. Elles présentent l’avantage d’offrir la possibilité d’utiliser des cellules humaines avec les considérations éthiques correspondantes bien sûr. Il est possible de réaliser des cultures cellulaires ou des organoïdes pour les organes considérés avec, même une certaine complexité, comme en co-culture avec certaines cellules additionnelles. Cependant, ces modèles ne permettent pas d’aborder les questions posées dans ce projet qui doivent prendre en compte des paramètres tels que les interactions avec le système immunitaire.
Réduction
Nous utiliserons les mêmes animaux contrôles pour des expériences différentes chaque fois que possible. Un maximum d’analyses sera réalisé sur organes prélevés après la mort des animaux pour éviter des doublons de procédures expérimentales. Le nombre d’animaux utilisés par groupe est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans un environnement enrichi. Les animaux sont anesthésiés lorsque les procédures expérimentales sont jugées potentiellement douloureuses ou stressantes. Dans ce cas, les animaux reçoivent au préalable un traitement analgésique si nécessaire. Les prélèvements de sang sont effectués sous anesthésie de courte durée. Nous appliquons les points limites établis préalablement et utilisons les procédures d’euthanasies appropriées. Des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées telles que l’utilisation d’une plaque thermostatée pour maintenir la température corporelle stable lors de la phase de réveil, ou l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus lors des anesthésies. L’euthanasie des animaux est programmée avant l’âge d’apparition de signes cliniques pour éviter les risques d’apparition de phénotype dommageable pour les lignées les plus sévères.
Choix des espèces
Pour ce projet, nous utiliserons les espèces souris car les modèles existants des pathologies étudiées sont sur ces espèces. Les animaux seront utilisés au stade adulte. A ce stade les animaux présentent une taille de muscle suffisamment importante pour injecter une quantité suffisante de vecteurs. Chez une souris plus jeune nous ne pourrions pas injecter une quantité de vecteur suffisante pour mesurer l’efficacité d’expression du gène médicament.
Élevage de lignées murines permettant l’exploration du développement du cerveau.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Tuées si leur génotype n'est pas celui attendu, ou une fois qu'elles ont servi à la reproduction, les souris de cet élevage qui portent le bon génotype partent vers d'autres projets. 30 600 souris vont être utilisées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque nouveau-né est maintenu une minute pendant qu'on lui tatoue un ou deux coussinets et qu'on lui prélève un bout de queue, et des mâles peuvent être hébergés seuls jusqu'à trois semaines. Le porteur justifie l'effectif en une phrase, indiquant que les accouplements ont été calculés d'après ses expériences antérieures pour produire un nombre suffisant d'animaux, sans autre élément sur ces 30 600 individus.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de mieux comprendre les mécanismes qui permettent la formation du cortex cérébral dans le contexte normal mais aussi pathologique. L’utilisation de modèles souris génétiquement modifiées nous aident à mieux caractériser notamment les mécanismes de génération, de migration et de mise en place de l’identité cellulaire des différents types neuronaux.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu du projet est d’augmenter la connaissance scientifique sur la formation du cerveau en condition normale ou pathologique.
Procédures
Les nouveau-nés subiront une contention d'une minute pendant laquelle un ou deux coussinet des pattes seront tatoués et une biopsie de queue sera prélevée. Des mâles pourront être hébergés individuellement pendant un maximum de 3 semaines.
Impact sur les animaux
La contention et la biopsie peuvent provoquer un stress et une légère souffrance chez l’animal. L’hébergement individuel des mâles peut entrainer un stress.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure si leur génotype n'est pas celui attendu ou après accouplement, les autres seront utilisés dans des projets scientifiques.
Remplacement
Il s’agit ici d’études sur le développement du cortex cérébral, qui ne peuvent pas être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère en développement. Aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de son développement dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part.
Réduction
Les stratégies d’accouplements ont été calculés selon nos expériences antérieurs pour générer un nombre suffisant d’animaux pour mener à bien à nos expériences.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi (coton, bâton, tunnel) avec eau et nourriture ad libitum et en groupe social tout au long de leur vie. Les nouveau-nés sont séparés de leur mère pendant 5 minutes maximum et sont surveillés après l’intervention pour vérifier qu’ils sont bien ré-acceptés par leur mère.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le developpement du système nerveux, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cortex cérébral entre les rongeurs et l’Homme.
Elevage de souris modèles de la maladie de Charcot
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Porteuses de mutations qui provoquent la maladie de Charcot, deux lignées de souris sont élevées pour fournir des lots à deux autres projets déjà autorisés. 375 souris à phénotype dommageable vont être utilisées sur trois ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, réduites pour l'essentiel à une biopsie de queue pour génotypage. Le porteur décrit la maladie comme paralysante, incurable et fatale, et indique que les animaux partent vers le site utilisateur à 70 ou 90 jours, avant les premiers signes moteurs, le stade terminal survenant à 170 jours pour la première lignée. Les souris qui n'ont pas le génotype attendu seront tuées, tout en pouvant servir d'animaux de compagnie aux autres pour éviter les cages solitaires.
Objectifs
La maladie de Charcot est une maladie neurodégénérative incurable, mortelle, causée par la perte des neurones moteurs localisés dans le cerveau et la moelle épinière, responsables de la contraction des muscles striés. Environ 7000 patients en France sont touchés par la maladie de Charcot. La maladie commence généralement entre 50 et 70 ans avec une faiblesse musculaire qui évolue rapidement vers une paralysie généralisée des membres et une insuffisance respiratoire entrainant le décès dans les 2 à 3 ans suivant l'apparition des symptômes. Les modèles de souris de la maladie de Charcot permettent d’explorer des pistes thérapeutiques. Notre objectif est d’élever deux lignées de souris génétiquement modifiées présentant une diminution de leur capacités motrices. Les animaux sont produits dans le but de répondre à des objectifs scientifiques centrés sur deux modèles d’étude complémentaires de la maladie de Charcot. La production des animaux a pour objectif de constituer des lots expérimentaux pour deux projets déjà validés par le ministère de l’enseignement, de la recherche et de l’innovation. Cette présente demande d’autorisation de projet élevage permet de faire suite à la précédente et nous permettra d’assurer une continuité d’élevage. Les lots expérimentaux sont produits pour répondre à deux études thérapeutiques des deux projets connexes. La règle des 3R est appliquée à ce projet dans son ensemble. Nous avons fixé une durée du projet de 3 années pour correspondre aux projets connexes. Ces souris porteuses de mutation causant la maladie de Charcot, issues de cet élevage, sont transférées à l’établissement utilisateur avant l’apparition des symptômes, puis sont incluses dans le cadre des projets expérimentaux.
Bénéfices attendus
L’élevage de deux modèles génétiques différents de la maladie permettra à terme d'évaluer deux approches thérapeutiques ciblant deux mécanismes distincts lorsque les souris seront utilisées en étude dans le cadre d'un autre projet. Le bénéfice de notre approche est clairement identifiable de par la robustesse et la reproductibilité de nos résultats et potentielles applications dans deux contextes génétiques différents. La valorisation de ce projet se traduira par des publications dans des journaux internationaux à comité de lecture et potentiellement un/des dépôts de brevet. L’élevage sur un site de deux lignées de souris porteuses d'une mutation causant la maladie de Charcot pour générer des lots expérimentaux qui sont étudiés sur un autre site utilisateur permet d’optimiser les espaces des sites utilisateurs. Le maintien de ces deux lignées sur deux sites permet également de réduire tout risque de perte d’une lignée et donc éviter de devoir générer des animaux en plus pour reconstituer une colonie. Les souris porteuses de la mutation (environ 50% de chaque descendance) sont transférées à un âge où aucun symptôme ne se déclare. La gestion du phénotype dommageable sur le second site se fait donc avec un personnel et un cadre spécifique au suivi de ce phénotype.
Procédures
Les animaux des deux lignées décrites seront transférés sur le deuxième site d’expérimentation avant l’apparition du phénotype dommageable. Cependant un suivi quotidien par équipe de zootechnie permet de rendre compte de tout signe lié à la pathologie qui pourrait se manifester de manière inhabituelle : tels que la boiterie d’un membre postérieur chez un premier modèle de la maladie de Charcot ou les tremblements d’un membre postérieur chez le deuxième modèle de la maladie. En examinant rétrospectivement les autorisations précédentes aucun problème lié à la pathologie n’a été signalé dans le délai de transfert que nous proposons. La biopsie pour le génotypage ne prend que quelques secondes.
Impact sur les animaux
La maladie de Charcot est une maladie paralysante incurable et fatale. Les modèles souris que nous utilisons ont été très bien phénotypés dans de nombreuses publications, ce qui nous assure une optimisation des 3Rs. Le transfert des animaux du site d’élevage se fait à un stade qui exclut toute déclaration de premiers signes moteurs chez les deux lignées. Le trait commun de la pathologie chez ces deux lignées est la diminution sélective des capacités motrices. Ces modèles présentent donc une atteinte motrice variable. Le génotypage des animaux requiert un prélèvement qui peut occasionner une gêne de très courte durée.
Devenir
Les individus sont produits uniquement à des fins d’élevage afin de générer des cohortes qui seront transférées dans d’une utilisation continue sur un autre site. Les animaux qui ne sont pas du bon génotype ou encore des animaux qui ont atteint un point limite seront euthanasiés.
Remplacement
L’utilisation de souris mimant la pathologie humaine est le seul système intégrant la complexité des interactions entre les neurones moteurs touchés dans la maladie et d’autres types cellulaires qui peuvent être très distants. Une telle interaction se met en place durant des mois et implique de nombreux autres types cellulaires autres que ceux ciblés ici. Notre premier objectif est de développer une approche thérapeutique utilisant des anticorps (immunothérapie) ciblant cette population de globules blancs. L’utilisation des modèles animaux de la maladie de Charcot est indispensable. La validation d’une approche thérapeutique qui intervient dans la complexité de cette communication entre le système immunitaire et le système nerveux requiert un modèle intégratif physiologique complet que seul l’animal offre. La barrière hémato-encéphalique et les méninges, qui sont les lieux où s’effectuent des échanges entre les cellules du système immunitaire et le système nerveux, illustrent la complexité de cette physiologie que l’on ne peut récapituler pleinement in vitro. Le modèle vivant demeure donc une étape requise pour tout transfert thérapeutique vers la clinique. Notre second objectif est d’explorer une approche thérapeutique ciblant certaines populations de cellules du cervelet. Ces réseaux neuronaux très distants entre la moelle épinière et le cervelet ne peuvent pas être mimés in vitro. Seuls les modèles expérimentaux mammifères présentent la diversité des interactions dynamiques et plastiques entre ces différentes populations de cellules. Les modèles souris de la maladie de Charcot sont donc les seuls modèles qui permettent d’explorer le potentiel thérapeutique des interactions aussi distantes qui peuvent exister dans cette pathologie. La validation d’une approche thérapeutique ciblant des interactions aussi distantes nécessite des modèles animaux. Cependant, afin d’explorer la pertinence des cibles thérapeutiques, nous développons des systèmes de co-cultures in vitro entre les cellules immunitaires et les neurones moteurs purifiés ainsi que des cultures organotypiques du cervelet.
Réduction
Nous avons donc déterminé pour une durée du projet de 3 années, un nombre total de 375 souris avec phénotype dommageable. Le nombre de souris est déterminé en suivant scrupuleusement les recommandations internationales et les études qui définissent les tailles optimales des cohortes de souris modèles de la maladie. Nous suivons donc un traitement statistique qui permet de réduire le nombre d’animaux et limiter les faux-positifs. Nous nous référons aux études réalisées sur les effets de taille de groupe sur la puissance et la fiabilité des tests statistiques. Pour un premier modèle de la maladie de Charcot chaque cohorte est composée de 24 souris pour le comportement. Pour le second modèle, chaque cohorte est composée de 14 souris pour le comportement. Afin de minimiser le nombre d’animaux, les animaux qui ont servi à la reproduction sont inclus dans les cohortes expérimentales. La stratégie d’élevage que nous avons permet de produire le juste nombre d’animaux qui répond aux besoins de réduction précédemment validées dans les saisines connexes à cette demande. Nous avons suffisamment de recul sur la gestion des animaux pour assurer une production de lots expérimentaux définis sur le site d’élevage. Nous utilisons également pour nos lots expérimentaux des cohortes mixtes mâle et femelle, réduisant ainsi le nombre d’animaux euthanasiés au sevrage.
Raffinement
Une connaissance extensive de ces deux modèles de la maladie de Charcot permet de connaître et donc anticiper les différents jalons de la maladie et donc d’optimiser l’élevage est éviter que le phénotype dommageable survienne lors de l’élevage. Les animaux sont transférés bien avant la possible apparition de premiers signes moteurs. De façon rétrospectives avec nos précédents élevages aucun phénotype dommageable n’a pu être signalé en suivant l’âge limite pour lequel les animaux sont systématiquement transférés sur le second site utilisateur. Les conditions d’élevage qui incluent des copeaux dans les litières, igloo, PVC et du coton vierge pour faire un nid végétal contribue à améliorer le bien-être des animaux en créant un microenvironnement propice au repos. Une surveillance visuelle quotidienne est effectuée par les zootechniciens. Toute anomalie indépendante de la pathologie comme des signes d’angoisse, de détresse, de douleur, d’infection et de déambulation anormale compte tenu de l’âge est signalée afin d’apporter une réponse rapide et adaptée. L’utilisation de mâles pour la reproduction permet d’avoir des portées plus robustes, plus nombreuses et de réduire de potentielles faiblesses car les femelles transgéniques sont connues commle étant de mauvaises reproductrices. Les animaux qui n'ont pas le génotype attendu pourront toujours servir d'animaux compagnons pour éviter tout animal isolé.
Choix des espèces
Les lignées transgéniques modèles de la maladie de Charcot récapitulent l’hétérogénéité clinique de la pathologie et renforce la validité et valorisation des résultats : début précoce ou tardif, progression lente ou rapide, traits cliniques, électrophysiologiques et histopathologiques spécifiques de la maladie. Nous évaluons deux protocoles thérapeutiques ciblant deux cibles cellulaires distinctes. Le protocole d’immunothérapie et de thérapie génique que nous proposons requiert une expérimentation sur les modèles murins de la pathologie. Notre étude a en effet pour objectif d’amener au plus proche de la clinique une stratégie thérapeutique. La complexité des interactions entre le système nerveux, le système immunitaire et des réseaux neuronaux distants et requiert un modèle mammifère à la physiologie complexe qui se rapproche de celle de l’homme. Les modèles de souris de la maladie de Charcot ont été particulièrement bien décrits dans la littérature. Les souris sont élevées sur le premier site puis transférées avant l’apparition des symptômes sur un deuxième site où elles seront prises en charge pour l’expérimentation. Pour le premier modèle le début de la maladie se situe à 110 j et le stade terminal à 170 j. Les souris sont transférées à l’âge de 70 j. Pour le deuxième modèle, un défaut de réponse à une sollicitation motrice est détectable à 60 j, mais à cet âge les souris ne présentent pas de défauts moteurs spontanés et prennent plus de poids que les souris contrôles (+15%). A partir de 290 j, stade où des tremblements des pattes postérieures sont présents, c’est le stade symptomatique. La survie des souris n’est pas altérée. Ces souris sont transférées du site d’élevage à l’âge de 90 j vers le site d’expérimentation dans le cadre de l’utilisation continue.
Etude des réseaux neuronaux impliqués dans la fonction sexuelle chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système urogénital
357 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit une injection de virus destinée à tracer les réseaux de neurones, puis est tué quatre jours plus tard. Juste avant, 150 mâles et 72 femelles passent un test de trente minutes : réflexe de dorsiflexion du pénis, stimulation électrique du pénis, stimulation vibratoire, stimulation mécanique des parties génitales ou injection d'une molécule provoquant une érection. Le porteur décrit la stimulation électrique du pénis comme sans douleur, retient l'irritation parmi les atteintes possibles, et affirme que l'étude de la fonction sexuelle exige un "organisme entier" faute de toute modélisation existante.
Objectifs
Les lésions de la moelle épinière sont un problème de santé important, avec une incidence annuelle de 15 à 52.5 cas par million, touchant des individus jeunes et en bonne santé. Ces lésions causent une paralysie et une perte de sensations bien connues, mais également une dysfonction du système autonome, qui est la partie du système nerveux qui régule les fonctions autonomes telles que la respiration, les battements du coeur ou encore la digestion. Ces dysfonctions autonomes sont, entre autres, des dysfonctions cardio-vasculaires, génito-urinaires, gastro-intestinales… et altèrent considérablement la qualité de vie ainsi que l’espérance de vie du patient. Des études de qualité de vie ont montré que pour la majorité des paraplégiques, la récupération de la fonction sexuelle augmenterait drastiquement leur qualité de vie. Les réseaux neuronaux impliqués dans la fonction sexuelle ne sont pas encore bien compris, il est donc important d'étudier ces réseaux dans la physiologie et dans la pathophysiologie de manière à déterminer avec plus de précision de nouvelles cibles thérapeutiques, afin de restaurer la fonction sexuelle chez les paraplégiques.
Bénéfices attendus
Les lésions de la moelle épinière présentent une incidence dramatique sur tous les aspects de la vie quotidienne individuelle. Les études de qualité de vie montrent que la restauration de la fonction sexuelle chez les paraplégiques et les tétraplégiques améliorerait considérablement leur qualité de vie. Par ce projet, nous espérons en savoir plus sur les mécanismes neuronaux de la fonction sexuelle, de manière à trouver un traitement compatible avec leurs déficits.
Procédures
Tous les animaux recevront une injection de virus et seront perfusés 4 jours suivant l'injection (temps de chirurgie : 30 minutes max). 90 mâles seront testés pour l'érection juste avant perfusion : 30 seront testés pour le réflexe de dorsiflexion du pénis (réflexe qui évalue la fonction sexuelle, 30 min max), 30 seront testés pour la stimulation électrique du pénis (30 min max), et 30 seront testés pour les injections d’un composé qui induit une érection (30 min max). 60 mâles seront testés pour l'éjaculation juste avant perfusion : 30 seront testés pour l'injection d’une molécule connue pour induire une érection (30 min), et 30 seront testés pour la stimulation vibratoire (30 min max). 24 femelles seront testées pour l'érection (engorgement du clitoris) par injection d'une molécule qui provoque une érection (30 min) et 24 seront testées pour l'érection par injection d’une autre molécule qui agit différemment mais a les mêmes effets (30 min max) juste avant perfusion. 24 femelles seront testées pour l'éjaculation par stimulation mécanique génitale (30 min max) juste avant perfusion.
Impact sur les animaux
Les procédures chirurgicales (injections de virus) peuvent conduire à de légères douleurs. L’infection au niveau des sutures est rare mais possible. L’utilisation de l’isoflurane peut induire des anomalies cardiovasculaires et respiratoires qui seront monitorés visuellement lors des chirurgies. Les injections peuvent induire un léger stress transitoire, mais les composés injectés sont décrits dans la littérature pour ne pas induire d’effets délétères aux doses choisies. La contention des animaux peut également engendrer un stress chez l'animal. Enfin, la stimulation électrique du pénis est sans douleur, les paramètres de stimulation proviennent de la bibliographie. Cependant, une irritation du pénis est possible. Pour la stimulation mécanique des parties génitales de la femelle, une irritation au niveau de la stimulation est également possible.
Devenir
L'expérience que nous réalisons avec le virus nous permet de tracer les réseaux de neurones impliqués dans la fonction sexuelle. Afin de visualiser ces réseaux nous avons besoin d'euthanasier les animaux pour récupérer les tissus d'intérêt.
Remplacement
La fonction sexuelle est possible grâce à l’interaction de multiples systèmes : hormonal, sensoriel, nerveux. L’étude de cette fonction nécessite donc un organisme entier. De plus, Il n’existe pas de modélisation de ce système qui permettrait d'étudier les réseaux neuronaux impliqués dans la fonction sexuelle. S’agissant d’un nouveau projet, nous avons besoin d’apprendre à réaliser les procédures chirurgicales. Nous réaliserons les premières mises au point de chirurgies sur cadavre : notamment repérer et disséquer les structures d'intérêt. Concernant la mise au point des injections de virus, nous avons besoin d'animaux vivants pour faire migrer le virus et visualiser les réseaux tracés dans les tissus d'intérêt après euthanasie de l'animal.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, plusieurs étapes de cette pré-étude seront faites sur les mêmes animaux. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque procédure a été déterminé de manière à avoir des résultats statistiquement significatifs, avec les tests adaptés, et le moins d’animaux possible. En cas de surestimation du nombre d’animaux dans une procédure, nous n’inclurons évidemment pas d’animaux supplémentaire dans la procédure.
Raffinement
Pour une pratique plus éthique, les chirurgies ont été mise au point préalablement sur des cadavres récupérés auprès d’autres chercheurs. Cette formation a été faite sous la tutelle de notre vétérinaire. Les premières chirurgies seront aussi faites en sa présence pour limiter les erreurs pouvant engendrer des douleurs. De plus, nous avons prévu une analgésie pré-opératoire, ainsi qu’une analgésie post-opératoire pendant 3 jours. Les animaux seront surveillés quotidiennement et des soins seront apportés en cas de signes de mal être ou douleur avec un contact du vétérinaire et de la structure du bien-être de l’animal dès le lendemain ou le jour même suivant le problème rencontré. Si l’animal présente des signes de douleurs pendant plus de 48h ou sur demande du vétérinaire, les animaux concernés seront euthanasiés. L’environnement des animaux sera enrichi avec des tunnels et des matériels de nidification. Pour la contention des animaux, une phase d’habituation quotidienne avec récompense sera mise en place avant le début de l’expérimentation.
Choix des espèces
Le rongeur est un modèle facile à héberger, dont la reproduction est rapide et dont la physiologie reste malgré ses différences, proche de celle de l’humain. Le rat est particulièrement compatible avec notre projet car sa taille supérieure à celle de la souris permet de faciliter les chirurgies comme l’injection de virus et les lésions de moelle épinière, que nous réaliserons plus tard dans notre étude. De plus, il existe de nombreux points communs entre le rat et l’humain quant à la réparation cellulaire de la moelle épinière. Nous utiliserons des animaux adultes car ils doivent être sexuellement actifs (6 à 8 semaines au début des expérimentations)
Enregistrement et contrôle optogenetique des activités neuronales néonatales chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
276 souris vont être utilisées, dont 252 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère : chaque nouveau-né, âgé de trois à six jours, subit une chirurgie du cerveau de trente minutes pour la pose d'électrodes et d'une barre de tête, puis deux heures d'enregistrement pendant son sommeil. En amont, les mères gestantes sont opérées de l'abdomen pour que leurs embryons reçoivent une injection intracrânienne. Le porteur range parmi les effets indésirables la douleur, le stress et la faim des nouveau-nés, et le stress ou la douleur des femelles. Toutes sont tuées et leur cerveau prélevé pour localiser les électrodes, l'apport annoncé étant de servir de référence à d'autres travaux sur les pathologies néonatales.
Objectifs
Après la mise en place des neurones de l'embryon, le cerveau subit un processus de maturation spécifique impliquant des activités spontanées,ne dépendant pas de stimuli externes à l’individu. Chez l’homme ce processus de maturation se met en place lors du 3e trimestre de grossesse, chez le rongeur, lors des deux premières semaines Post-Natales (PN). Ces activités néonatales (ANs), orchestrées par une catégorie spécifique de neurones, jouent un rôle important dans la mise en place des circuits du cérébraux et leurs fonctions ultérieures. Cependant les mécanismes impliqués sont encore mal connus et sont sujets à controverse. Cette question est d’autant plus importante qu’il existe des pathologies neurologiques graves avec retard mental et épilepsies affectant les enfants dès la naissance. Or, une majorité de ces pathologies affectent de façon directe ou indirecte la classe de neurones qui orchestrent ces ANs. Notre but est donc de comprendre, pendant la première semaine de vie comment s'organise l'activité de ces neurones chez la souris en développement et de comprendre quelle est leur influence sur la mise en place des circuits. Pour ce faire, nous utilisons une technique de biologie moléculaire qui nous permet d'activer ces neurones à la demande par la lumière lors des enregistrements de l'activité cérébrale de la souris nouveau-née en sommeil.
Bénéfices attendus
Pour mieux comprendre comment, dans la période qui entoure la naissance, le cerveau se prépare aux premières expériences sensorielles, il est important de déterminer le rôle respectif des grandes classes de neurones dans la maturation du cerveau et de ses circuits. La théorie en vigueur sur l'action d'une certaine classe neurones (neurones inhibiteurs) à ces âges précoces est de plus en plus remise en cause, ce qui nous interroge sur les mécanismes fondamentaux du développement du cerveau. Or, des dysfonctionnements de cette même classe de neurones sont impliqués dans un tres grand nombre de troubles neurologiques infantiles (troubles du spectre autistique, épilepsies, retard mental). En déterminant la fonction de cette classe de neurones lors du développement du cerveau sain, cette étude servira donc de référence à d'autres travaux sur les pathologies néonatales.
Procédures
Un groupe de souris gestantes, porteuses des embryons à traiter, subira une chirurgie abdominale sous anesthésie gazeuse, anesthésie locale et analgésie. Leurs embryons, sous l'influence de ces traitements, subiront une injection intracrânienne. Après la naissance ces animaux subiront une chirurgie du cerveau (30 minutes) afin de préparer le placement d'électrodes et d'une barre de tête. Ceci se fera sous anesthésie gazeuse, anesthésie locale et analgésie. Une demi-heure plus tard, toujours sous analgésie, l'activité cérébrale sera enregistrée pour un maximum de 2h alors que la souris nouveau-née dort.
Impact sur les animaux
La chirurgie des nouveau-nés peut avoir des effets indésirables, tels qu'une douleur, un stress ou la faim. La chirurgie des souris gestantes peut induire du stress ou de la de la douleur.
Devenir
Les animaux seront mis a mort et les cerveaux prélevés post-mortem pour prendre des images des structures cérébrales et reveler la localisation des electrodes.
Remplacement
L'étude des activités neuronales dans la periode de la naissance nécessite l'observation de systèmes neuronaux intacts, en phase de sommeil lent et d'être correlés aux activités motrices de l'individu (contractions spontanées ou sursauts physiologiques du nourisson). Il est donc impossible de la réaliser sur un modèle informatique ou les modèles récents d'alternative à l'experimentation animale (s cellules souches). La souris présente davantage de bénéfices étant donné l’accessibilité expérimentale (la réalisation de mutation génétique est plus simple que sur d’autres modèles). A ce jour, aucune étude n'a été faite pour enregistrer et manipuler par électrophysiologie et optogénétique l’activité cérébrale des souris nouveau-nées. Nous avons opté pour l’utilisation de souris plutôt que de rat étant donné que les modèles transgéniques qui nous intéressent ne sont disponibles que chez la souris. La souris présente aussi davantage de bénéfices étant donné l’accessibilité expérimentale et la facilité d'élevage.
Réduction
Les chirurgies sont réalisées sous anesthesie gaseuse, locale et sous analgésie pour réduire au minimum la souffrance potentielle causée par ces procédures. Les enregistrements des nouveaux-nés sont ausi faits sous analgésie. L’avancée technologique concernant la miniaturisation des systèmes électroniques et d’électrodes permet d’enregistrer un grand nombre de neurones, sur de multiples sites simultanément. Ces progrès nous permettent de diminuer fortement le nombre de souris utilisées. Les données obtenues au cours du projet seront mises à disposition de la communauté scientifique pour analyses complémentaires et utilisation dans des modèles computationnels. Les animaux sont preparés par petites series de 4 ou 5 (une portée à la fois) et les resultats analysés au fur et à mesure, ce qui permet d'ajuster le nombre final d'animaux utilisés, la procedure s'arretant des que le nombre d'animaux requis est atteint. Nous utilisons à la fois des males et des femelles. Le nombre d'animaux à utiliser a été déterminé par calculs statistiques (calculs de puissance) établis sur la base de données publiées par notre groupe et d'autres laboratoires.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en animalerie conventionnelle (température, luminosité, cycle jour-nuit et hygrométrie contrôlée) avec accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. L’hébergement respecte les groupes sociaux. Les animaux font l'objet d'un suivi quotidien par les expérimentateurs et les zootechniciens, et leurs conditions d'hébergement sont enrichies (matériaux pour nidification, tunnels, dômes). Le bien-être des animaux, qu'il s'agisse des souris gestantes comme de leur progéniture, sera évalué réguliérement (croissance staturo-pondérale, aspect général, comportement). Nous procédons à un suivi post-opératoire lors duquel le bien être des animaux est évalué et traité (anesthésie et analgésie appropriée). Les nouveau-nés, sont maintenus en condition proche de celles de la portée, (maintien de la température corporelle, contension légère avec du cotton , nourrissage de lait maternisé).
Choix des espèces
Nous avons opté pour l’utilisation de la souris car cette espèce présente des similitudes neuronales et cognitives suffisantes pour assurer la pertinence des investigations menées par rapport au cerveau humain. C'est également l'espèce de choix pour modéliser les pathologies neurologiques du développement, représentant un bon équilibre entre les bénéfices (disponibilité d'outils de biologie moléculaire, de génétique, facilite d'élevage, pertinence par rapport aux pathologies chez l'humain) et les dommages éventuels (souffrance liée aux conditions d'élevage ou d'expérimentation). Ceci nous permet d'apporter des connaissances complémentaires à la communauté scientifique et permet une reproduction idéale des résultats. Enfin, les patrons électrophysiologiques des souris nouveau-nées sont fortement similaires à ceux observés chez l'enfant prématuré et le nourrisson. Les souris sont étudiées entre 3 et 6 jours post-nataux, inclus.
Recherche de nouveaux traitements pour l’insuffisance cardiaque chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une pompe micro-osmotique implantée sous la peau diffuse en continu la substance qui provoque l'hypertrophie du cœur, et une souris sur cinq meurt subitement avant la fin du protocole. 3 456 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec deux échocardiographies sous anesthésie et des injections quotidiennes pendant quatorze jours. Le porteur indique que ces souris ne présentent pas de signes liés à l'hypertrophie, tout en reconnaissant un taux de mortalité élevé par mort subite qu'il déclare impossible à anticiper ou à empêcher. Toutes sont tuées sous anesthésie profonde pour prélever le cœur et le sang.
Objectifs
L’insuffisance cardiaque est une maladie qui affecte plus d’un million de personnes en France avec un taux de mortalité élevé. Quelle que soit l’origine de l’insuffisance cardiaque (hypertension, vieillissement…), cette dernière est associée à une altération du muscle cardiaque nottamment à cause du développement d'une fibrose cardiaque. Dans le contexte du vieillissement et de l’hypertension artérielle, il existe une augmentation de la masse cardiaque, nommée hypertrophie cardiaque. Ce remodelage hypertrophique est à la source de différentes formes d’insuffisance cardiaque très prévalentes chez les sujets les plus âgés et pourtant sans aucun traitement spécifique. En effet, il n’existe actuellement aucune stratégie thérapeutique anti-fibrotique efficace qui pourrait compléter les traitements actuels pour l’insuffisance cardiaque. Il a été démontré q'une nouvelle population de cellules résidant dans le coeur serait capable de participer à la fibrose en réponse à un stress hypertrophique. Ces cellules expriment à leur surface des récepteurs impliqués dans la fibrose, il y aurait donc interet à les cibler. Les enjeux scientifiques sont donc maintenant d'obtenir des inhibiteurs de ces récepteurs et de tester leur capacité à empecher le developpement de la fibrose cardiaque. Ce projet sera considéré comme un début de programme de développement pré-clinique pouvant soutenir le passage ultérieur chez l'homme.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer le bénéfice d'une nouvelle approche thérapeutique qui pourrait empecher le développement de la fibrose cardiaque. A terme, ceci conduira à développer des nouveaux traitements pour lutter contre le développement de l’insuffisance cardiaque, une pathologie qui touchent des millions de patients et qui impacte fortement leur qualité de vie au quotidien.
Procédures
Dans un premier temps, réaliser une échocardiographie sous anesthésie générale durant 10 minutes sur tous les animaux afin de mesurer la fonction cardiaque de base. Dans un second temps, implanter une pompe micro-osmotique en sous cutanée pour tous les animaux et sous anesthésie générale, cette intervention dure environ 5 minutes. Injecter le traitement quotidiennement en intrapéritonéal ou bien l'administrer par voie orale pendant 14 jours. A la fin de l'expérience, réaliser une deuxième échocardiographie pour mesurer la fonction cardiaque. Ce geste sera réalisé sur l’ensemble des animaux sous anesthésie générale. Le coeur sera prélevé après mise à mort sous anesthésie profonde pour une étude histologique et moléculaire.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont liés à l’expérimentation, principalement l’inconfort lié à la préhension des animaux et la douleur au point d’injection. Il y a également les effets indérisables liés à la chirurgie (pompes micro-osmotiques) et au stress lié à l’induction de la fibrose. De meme, les souris ne présentent pas des signes liés à l'hypertrophie mais le taux de mortalité est elevé. il s'agit d'une mort subite, qui est impossible à anticiper ou à empecher cette mortalité. L’échocardiographie est un examen non invasive et indolore, cependant, l'isoflurane pourrait induire un stress.
Devenir
A l’issue des différents gestes techniques réalisés sur le même animal sous anesthésie générale et sous couverture analgésique (imagerie échocardiographie, implantation des pompes micro-osmotiques, injection du traitement en intrapéritonéal) tous les animaux seront mis à mort sous anesthésie profonde dans le but de prélever le coeur et le sang pour différents types d'analyse.
Remplacement
Les molécules à étudier ont fait l’objet de tests prélimaires in vitro qui nous ont permis d’identifier les cibles thérapeutiques impliquées dans l’hypertrophie et d’évaluer la puissance des inhibiteurs dans des tests d’activation cellulaire. Notre projet nécessite d'utiliser un modèle in vivo en raison d’une approche physiopathologique du système cardiovasculaire intégrée sur animal entier. La réalisation de ce projet constitue une des étapes précliniques indispensables avant l’application chez l’homme de ces approches thérapeutiques
Réduction
La physiopathologie ainsi que la cinétique du modèle (hypertrophie) sont bien connues et ont été bien étudiées ce qui permet de mieux définir la durée des expériences et éviter la mise à mort des animaux à différents temps après la chirurgie. Le nombre d'animaux nécessaire a été défini en fonction du type d’analyses nécessaires pour tester l’efficacité des traitements et nous avons pris en compte la mortalité des souris hypertrophiées (20%) durant le protocole de telle sorte que les résultats obtenus soient suffisants statistiquement pour conclure sur l'efficacité de nos approches thérapeutiques. Les données seront analysées avec des tests statistiques non paramétriques. Les analyses sont généralement réalisées avec un nombre minimal de 6 animaux survivants par groupe. Les méthodes d'imagerie qui seront utilisées étant non invasives et non douloureuses, les animaux pourront être suivis au cours du temps (J0 et J+14) et les paramètres étudiés seront mesurés chez le même animal.
Raffinement
Le suivi quotidien des animaux par un personnel qualifié et la mise en place de points limites adaptés permettront d’identifier et de limiter toute souffrance et douleur, d’abord par l’injection des antalgiques et par une mise à mort anticipée selon les méthodes réglementaires, si nécessaire. L'ensemble des chirurgies de ce projet sera réalisé sous anesthésie générale associée à une analgésie péri-opératoire.
Choix des espèces
La recherche clinique sur l’hypertrophie chez l’homme est limitée pour des raisons éthiques, c’est pourquoi le recours aux modèles animaux est devenu indispensable pour élucider les mécanismes mis en jeu. La souris est un modèle de choix, la structure des tissus musculaires et cardiaques murins est très proche de celle de l’homme. Les mêmes populations de cellules souches sont présentes. Des souris jeunes adultes (agées de 8 à 12 semaines) car leur système cardiovasculaire est bien developpé.
Etude des effets de 25 à 100 composés sur le traitement de la dermatite atopique chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Vingt-cinq à cent composés seront criblés en cinq ans par un laboratoire de dermatologie qui vient d'en évaluer 58 sur la période précédente, dont huit sont passés en essais cliniques. 1 400 souris vont être utilisées pour cela, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le dos rasé sous anesthésie, 1 200 d'entre elles reçoivent vingt-deux applications d'un agent chimique sur quarante-deux jours pour déclencher une dermatite atopique, avec inflammation, œdème, grattage et sécheresse cutanée, puis toutes sont traitées quotidiennement pendant sept jours et placées vingt minutes dans un dispositif qui compte leurs grattages. Un prélèvement de sang précède la mise à mort, et le tri des composés les plus efficaces pour un développement chez l'être humain constitue la finalité déclarée du projet.
Objectifs
Les recherches que nous menons dans le domaine de la Dermatologie contribuent à développer de nouveaux produits permettant le traitement de pathologies telles que l’inflammation cutanée, la cicatrisation, le psoriasis et la dermatite atopique. L’objectif de ce projet d’une durée de 5 ans est d’étudier les effets de 25 à 100 nouveaux composés, composés naturels ou non, modifiés chimiquement ou non, sur le traitement de dermatite atopique induite chez la souris, afin de sélectionner les plus efficaces pour un développement en clinique chez l’Homme. Ce nouveau projet fait suite à un précédent projet qui nous a permis, sur 5 ans également, d’évaluer les effets de 58 composés, 8 de ces 58 composés étant actuellement en phase d’essais cliniques chez l’Homme. Ces nouveaux composés à évaluer seront administrés, après induction chimique de la dermatite atopique, par application cutanée ou par voie orale pendant 7 jours consécutifs, à 1 seule ou 4 doses, et leurs effets seront comparés à ceux d’une référence pharmaceutique utilisée chez l’Homme qui sera choisie en fonction de la classe pharmacologique des composés à évaluer et de la voie de traitement envisagée. Un suivi régulier du poids des animaux, du scorage de la sévérité de la dermatite atopique et de l’utilisation de l’enrichissement seront effectués tout au long de l’expérimentation. Les effets des composés seront évalués au niveau comportemental après le dernier traitement effectué. Après cette évaluation comportementale, un prélèvement sanguin sera effectué sous anesthésie générale pour le dosage de biomarqueurs sanguins, puis les animaux seront euthanasiés afin de réaliser un prélèvement cutané pour la réalisation d’analyses biologiques.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité de nouveaux composés en cours de développement sur le traitement de la dermatite atopique, et de sélectionner ceux ayant montré la plus grande efficacité pour leur évaluation chez l’Homme. L’évaluation des effets de ces composés se fera par des observations régulières avec scorage de différents paramètres pour suivre l’évolution de la sévérité de la dermatite atopique, par l’évolution pondérale des animaux, le score d’utilisation de l’enrichissement mis à disposition des animaux et une évaluation comportementale permettant de caractériser les effets de ces composés, notamment sur le nombre de grattages effectués par les animaux. Le dosage de biomarqueurs circulants à partir d’un prélèvement sanguin effectué à la fin des traitements, et des analyses biologiques de prélèvements cutanés effectués au large de la région d’induction de la dermatite atopique permettront également de caractériser les effets de ces composés. Les données issues de ce projet sont d’un intérêt majeur pour déterminer les effets biologiques sur le traitement de la dermatite atopique de ces nouveaux composés in vivo dans un modèle préclinique avant d’envisager des études cliniques chez l’Homme. Un précédent projet réalisé sur 5 ans a permis d’évaluer les effets de 58 composés, 8 de ces 58 composés étant actuellement en phase d’essais cliniques chez l’Homme. Compte-tenu de l’augmentation constante de l’incidence de la dermatite atopique dans la population européenne et mondiale, le développement de nouveaux composés présente un enjeu socio-économique certain afin de développer des traitements efficaces contre cette pathologie chez l’Homme.
Procédures
Le rasage du dos de l’ensemble des 1400 souris nécessaires à la réalisation de ce projet sera effectué sous anesthésie générale afin de ne pas léser le tissu cutané. Il sera réalisé une seule fois en 1 minute environ pour chaque souris. 1200 des 1400 souris seront soumises à l’induction de dermatite atopique par application cutanée répétée d’un agent chimique inducteur de cette pathologie chez la souris. Ces applications, au nombre de 22 au total par souris sur les 42 jours de l’expérimentation, seront effectuées en 1 minute environ sur souris vigiles. La totalité des 1400 souris sera traitée avec les composés à évaluer, les composés pharmaceutiques de référence ou un véhicule neutre (placebo), par application cutanée ou par administration orale. Les traitements seront effectués quotidiennement pendant 7 jours en 1 minute environ pour chaque souris, sur souris vigiles. Une évaluation du comportement de l’ensemble des 1400 souris sera réalisée 24 heures après le dernier traitement effectué afin de caractériser les effets des traitements sur la sphère comportementale au travers de différents paramètres dont le nombre et la durée des grattages et l’activité exploratoire des souris. Ce test sera effectué 1 seule fois pendant 20 minutes, sur souris vigiles. Un prélèvement de sang terminal sera effectué sur la totalité des 1400 souris placées sous anesthésie générale avant leur euthanasie pour le dosage de biomarqueurs circulants.
Impact sur les animaux
L’induction de la dermatite atopique, pathologie inflammatoire, effectuée après rasage préalable du dos effectué sous anesthésie, va engendrer chez la souris une douleur légère à modérée au cours des 6 semaines d’induction de cette pathologie par applications cutanées d’un agent inducteur, en raison du développement d’une inflammation, d’un œdème, d'un grattage et d’une sécheresse cutanée au niveau de la région d’application de l’agent inducteur de cette pathologie. Une légère perte de poids transitoire sera également observée uniquement au cours de la première semaine d’induction de la dermatite atopique. Les pesées répétées au cours de l’expérimentation engendreront une gêne très limitée dans le temps, ne nécessitant que quelques secondes pour être effectuées. Le traitement quotidien des souris par application cutanée ou par voie orale avec les composés à évaluer au cours de la dernière semaine d’étude va induire un stress passager, quelques minutes quotidiennement, et la réalisation de l’évaluation comportementale effectuée le dernier jour de l’étude, nécessitant de placer les souris individuellement pendant 20 minutes dans le dispositif expérimental utilisé, va engendrer un stress modéré pendant ces 20 minutes de test. Le prélèvement de sang terminal, effectué immédiatement avant l’euthanasie des animaux en une minute environ, sera réalisé sous anesthésie générale profonde.
Devenir
A l’issue de l’unique procédure expérimentale permettant l’induction de dermatite atopique puis le traitement et le suivi de celle-ci et l’évaluation comportementale, les souris seront euthanasiées. Un prélèvement cutané sera réalisé au large de la zone d’induction de la dermatite atopique pour la réalisation d’analyses qui permettront de caractériser les effets des traitements effectués sur la réparation du tissu cutané.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Le modèle de dermatite atopique nécessite une durée de plusieurs semaines pour son induction et une période de traitement sur plusieurs jours, il n’est donc pas possible d’utiliser de modèle in vitro (culture de cellules cutanées) ou ex vivo (explants cutanés) qui ne pourraient pas être maintenus dans un état physiologique pendant toute cette durée. De plus, l’évaluation de la dermatite atopique induite se faisant par observation macroscopique de différents paramètres au niveau du tissu cutané, il n’est pas possible de faire ce type d’étude in vitro ou ex vivo qui ne tiendrait pas compte des effets sur la réponse immunitaire via la circulation sanguine ne pouvant être reproduite sur de tels modèles in vitro ou ex vivo.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé à partir des résultats des nombreuses études précédemment menées par notre laboratoire sur ce modèle expérimental de dermatite atopique ayant montré des effets "forts" de traitements en première intention sur le score de sévérité de la dermatite atopique et les paramètres comportementaux évalués à la fin des expérimentations. L'utilisation d'un logiciel adapté a permis de définir pour chacune des 2 modalités expérimentales envisagées, que pour 7 groupes expérimentaux, un effectif total de 56 animaux est nécessaire, soit 8 animaux par groupe expérimental. A l’issue des expérimentations, une analyse statistique de l’ensemble des données générées sera réalisée pour comparer les résultats entre les différents groupes expérimentaux.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction de la dermatite atopique. Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, un scorage de la sévérité de la dermatite atopique et de l’utilisation de l’enrichissement seront effectués une fois par semaine avant traitement puis quotidiennement pendant le maintien de l’induction de la dermatite atopique et la période de traitement. Leur poids sera mesuré 3 fois par semaine au cours de la période d’induction de la dermatite atopique avant traitement puis quotidiennement pendant le maintien de l’induction de la dermatite atopique et la période de traitement. Les souris seront hébergées par 2 dans des cages adaptées à leur taille, avec des bâtonnets de coton placés dans leur cage comme enrichissement (2 par souris) pour assurer leur bien-être et permettant également de définir un score d’utilisation de l’enrichissement. Elles seront placées en cycle de lumière inversé pour observer leur comportement pendant leur phase active et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie), et aussi pour évaluer l’influence des traitements sur leur activité (chronopharmacologie). Si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal atteint ou de 15% entre 2 pesées est observée, ou si des signes de toxicité des traitements, d’ulcération cutanée ou des modifications du comportement des animaux sont observés, ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant d’induire des pathologies cutanées représentatives des pathologies cutanées à traiter chez l’Homme. La souche de souris utilisée est largement décrite dans la littérature scientifique pour les études dans le domaine de la Dermatologie et plus spécifiquement sur la dermatite atopique. Suite à l’induction de cette pathologie elle exprime en effet différents biomarqueurs d’intérêt et paramètres comportementaux, permettant ainsi une bonne transposition des résultats obtenus. Les animaux seront de jeunes souris âgées de 6 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur la dermatite atopique (généralement 6 à 8 semaines), et de souris utilisées lors d’études précédentes menées dans notre laboratoire selon le même protocole expérimental et ayant donné des résultats représentatifs, reproductibles et significatifs.
Impact des lipides post prandiaux sur l’homéostasie métabolique au cours de la stéatopathie métabolique
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 220 après vingt-quatre semaines de régime enrichi en graisses et en sucre. Chacune subit trois à cinq jeûnes de quatre heures, autant de gavages, et six prélèvements de sang en deux heures obtenus en coupant le bout de la queue puis en grattant la croûte à mesure qu'elle se reforme. Le porteur décrit le gavage comme "désagréable mais pas douloureux" et affirme que le régime gras et sucré "n'engendre aucune contrainte" pour les animaux. Le projet promet un dosage prédictif qui "permettrait" un meilleur suivi des patients atteints de stéatopathie métabolique, quand les vingt-quatre semaines de régime et les gavages sont, eux, programmés.
Objectifs
L’obésité peut entraîner des complications hépatiques nécessitant une prise en charge thérapeutique des patients. Ces complications sont regroupées sous le terme de NAFLD pour maladie du foie non alcoolique ou plus récemment MASLD pour dysfonction métabolique associées aux maladies du foie gras. La MASLD s’étend de la stéatose isolée et réversible (accumulation de gouttelettes lipidiques dans les hépatocytes) à l’inflammation hépatique ou stéatohépatite (MASH), la fibrose, la cirrhose et le cancer du foie. Si une stéatose qui reste bénigne est observée chez quasiment toutes les personnes obèses, l’évolution de la maladie vers des formes plus sévères n’est observée que chez certains patients. A l’heure actuelle, il n’y a pas de critères fiables permettant de prédire l’évolution de la pathologie chez les patients présentant des lésions précoces. L’impact de l’alimentation dans la MASLD et en particulier des lipides est clairement démontré. Toutefois, là encore tous les patients ayant des dyslipidémies ne développent pas des formes sévères de MASLD. Or, un des biais dans toutes ces analyses est le fait qu’elles soient toujours faites chez l’individu à jeun. Or après un repas, le métabolisme des lipides peut varier transitoirement en fonction de la sensibilité des patients. Basé sur ce concept, une étude clinique a été faite chez l’homme et à prouvé que les lipides modifiés juste après la prise d’un repas et appelés lipides post-prandiaux sont plus délétères chez des patients avec une MASLD avancée qu’avec une simple stéatose. Notre projet consiste à comprendre dans notre modèle murin, l’effet de ces lipides post-prandiaux sur les différentes cellules et organes métaboliques. La compréhension de ces mécanismes à des stades précoces de la maladie est essentielle pour disposer de marqueurs prédictifs de l’évolution des lésions hépatiques et améliorer le suivi des patients.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à documenter le rôle des lipides post prandiaux et leur impact sur les différents organes métaboliques au cours du développement de la MASLD. Cette compréhension permettrait de proposer ces dosages de lipides post-prandiaux, ou leurs cibles identifiées par notre étude, pour améliorer la prédiction de l’évolution des lésions hépatiques au cours de la MASLD et assurer un meilleur suivi des patients.
Procédures
220 souris seront soumises à un régime enrichi en graisses et sucre pendant 24 semaines. 360 souris seront soumises à un jeun imposé de 4h. Ce jeun sera effectué 3 fois pour 280 souris et 5 fois pour 80 souris. 280 souris auront 3 gavages par voie orale et 80 souris auront 5 gavages. Le temps de gavage tient entre 20 et 30 secondes. Les 360 souris auront un prélèvement de 6 gouttes de sang en l’espace de 2 heures représentant une quantité inférieure à 100 microlitres de sang.
Impact sur les animaux
Les régimes enrichis en graisses et sucre n’engendrent aucune contrainte pour les animaux. Le jeun imposé de 4h, le matin, correspond à une période digestive. Aucun effet indésirable n’est attendu. Le prélèvement de 6 gouttes de sang en 2 heures au niveau de la queue va engendrer pour les animaux un inconfort modéré pendant et après le prélèvement. On évalue la gêne et la douleur à ce qui se passe lors d’une piqure puis lors « d’un grattage d’une croutte ». Le gavage des animaux vigiles pour éviter une fausse route avec des canules souples minimise les lésions mécaniques. Le geste est désagréable mais pas douloureux. Les injections intra-péritonéales correspondent à la nuisance d’une piqure, le produit injecté n’étant pas agressif.
Devenir
A l’issu des procédures, les souris sont euthanasiés, différents tissus sont prélevés (vésicule biliaire, foie, tissu adipeux, muscle, intestins) afin de réaliser des analyses biochimiques, des analyses de sous types cellulaires ou de l'histologie.
Remplacement
Nous étudions dans notre modèle d’obésité l’impact d’un repas et des conséquences métaboliques qu’il engendre. Les approches expérimentales in vivo permettent d’intégrer les interactions entre alimentation, métabolisme et réponse des organes impliqués dans le métabolisme y compris l’absorption intestinale. L’ensemble de ces mécanismes ne sont pas actuellement accessibles par des techniques in vitro ou par des études in silico. Le seul modèle auquel nous pouvons avoir recours pour étudier les effets sur ces différents organes est donc l’animal.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux euthanasiés, nous avons estimé le nombre d’individus à utiliser par groupe sur la base des quelques données disponibles sur les lipides post-prandiaux. Afin d’observer des différences significatives parmi ces lipides nous avons estimé que 8 souris par groupe d’étude étaient nécessaires pour obtenir des résultats significatifs lorsque l’on suit ces lipides 5 fois après le repas et que ce nombre était de 10 souris par groupe si on limitait à l’étude à 3 temps d’étude après le repas.
Raffinement
Nous veillerons à ce que la réalisation de ce projet soit conforme aux exigences de raffinement liées à l’expérimentation animale. Les souris seront hébergées par 4 ou par 5. L’enrichissement sera constitué d’un tunnel en plastique et une quantité de sciure augmentée pour favoriser l’enfouissement. Une surveillance quotidienne des animaux est réalisée. Les souris seront pesées toutes les semaines. La longueur des dents sera vérifiée lors des pesées et coupées avec des ciseaux, si nécessaire. Tout au long des procédures, les souris seront examinées régulièrement pour détecter des signes de de détresse (changements dans la respiration, poil rêche comportement inhabituel, posture voûtée, perte de poids). Le temps de manipulation des souris vigiles sera minimisé au maximum afin de limiter le stress et l’angoisse des souris. Les gavages seront réalisés sur souris vigiles pour éviter les fausses routes et réalisés avec un volume réduit et des canules de gavage fines et courtes bien adaptées au modèle murin et à la taille de l’animal. Les gavages seront réalisés par le même ingénieur, formé à cette technique, tout du long du protocole pour limiter le stress des animaux. Le jeûne imposé de 4h sera le matin, en période digestive avec un libre à un biberon d’eau. Lors du prélèvement des gouttes de sang, la coupure initiale au niveau de la queue sera réduite au minimum (de l’ordre du mm) puis comprimée par une compresse qui arrête le saignement. La récupération des 5 autres gouttes de sang se fera en ‘grattant la croûte’ nouvellement formée. Une compresse sera réappliquée en pression après chaque prélèvement. La surveillance de la bonne cicatrisation au point de prélèvement sera faite dans le cadre de la surveillance quotidienne des animaux. L’injection en intra-péritonéale est réalisée sans application préalable de lidocaïne afin d’éviter le stress de 2 contentions successives.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car les mécanismes cellulaires développés dans la pathologie sont proches de ceux observés chez l’Homme même si le stade n’évolue pas vers les formes les plus sévères. Le modèle de MASLD chez la souris est bien décrit dans la littérature et c’est un modèle largement utilisé par la communauté scientifique pour étudier cette pathologie. Ce projet vise à étudier le rôle des lipides post-prandiaux au cours de l’obésité chez l’adulte. Des souris adulte, agées de 6 semaines seront utilisées.
Effets de l’absence des adipocytes bruns chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Dépourvues d'adipocytes bruns et beiges par modification génétique, ces souris sont plus petites que la normale, inclinent la tête et tournent parfois en rond dans leur cage. 3 902 vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont hébergées de une à vingt-quatre semaines à des températures dérogatoires, reçoivent des injections, subissent une intervention chirurgicale sans réveil et un prélèvement de sang juste avant la mise à mort, le porteur écrivant qu'"aucune autre espèce ne peut donc être utilisée". Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure, pour prélever leurs tissus adipeux.
Objectifs
Il existe deux types de tissu adipeux ou graisse corporelle chez les mammifères : le tissu adipeux blanc et le tissu adipeux brun, dont les rôles sont différents. Le tissu adipeux blanc est composé de cellules adipeuses ou adipocytes blancs qui stockent les calories en excès sous forme de graisses et constitue la principale réserve d’énergie de l’organisme. Le tissu adipeux brun composé d’adipocytes bruns, au contraire, est spécialisé dans la dépense énergétique : il brûle les graisses et le sucre en produisant de la chaleur. La capacité du tissu adipeux à générer de la chaleur est régulée par le système nerveux. Lors d’une exposition au froid, les nerfs présents dans le tissu adipeux libèrent un messager chimique qui agit sur les adipocytes. Cela va entraîner l’activation des adipocytes bruns dans le tissu adipeux brun, l’apparition dans le tissu adipeux blanc d’adipocytes dits beiges qui sont capables eux aussi de produire de la chaleur, et la dégradation des graisses dans tous les adipocytes pour fournir de l’énergie. Dans ce projet, nous utiliserons des souris dans lesquelles les adipocytes bruns et beiges sont absents et les adipocytes blancs sont préservés. Nous étudierons ces souris à différentes températures d’hébergement ainsi que leur réponse à différents composés pharmacologiques qui modulent l’activité thermogénique et métabolique des adipocytes.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’analyser les conséquences de l’absence des adipocytes bruns et beiges sur la physiologie du tissu adipeux et de dissocier leurs effets métaboliques, à la fois au niveau local et systémique, de ceux des adipocytes blancs. Cela nous permettra de mieux définir leur potentiel thérapeutique pour le traitement des maladies métaboliques comme l’obésité.
Procédures
Une intervention chirugicale sans réveil sous anesthésie et analgésie sera réalisée. Les interventions réalisées sur animaux vigiles seront les suivantes : une injection (intrapéritonéale et/ou sous-cutanée), un prélèvement de sang effectué juste avant la mise à mort et un hébergement à température expérimentale pendant 1 à 24 semaines.
Impact sur les animaux
Les souris dans lesquelles les adipocytes bruns et beiges sont absents sont plus petites, elles présentent un phénotype d’inclinaison de la tête et tournent parfois en rond dans leur cage. La contention pour effectuer les injections et prélèvements sanguins peut entraîner un stress ponctuel. Les injections et prélèvements sanguins entrainent une douleur légère. Les animaux sont hébergés dans des conditions de température dérogatoire.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de prélever les tissus adipeux pour analyse histologique.
Remplacement
Pour satisfaire au remplacement, les études in vitro sont réalisées sur des lignées cellulaires d’adipocytes au lieu de cellules primaires isolées à partir des animaux. Cependant, pour comprendre les fonctions des adipocytes thermogéniques, il est indispensable de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents types cellulaires présents dans le tissu adipeux et entre les différents organes.
Réduction
Le nombre minimum d’animaux nécessaire a été établi en nous appuyant sur les probabilités génétiques et des schémas d’accouplement optimisés. Le nombre minimum d’animaux nécessaire pour les analyses tissulaires que nous envisageons a été déterminé par des calculs statistiques basés sur un calcul de puissance associé à l’utilisation de tests de significativité statistique.
Raffinement
Pour satisfaire au raffinement, nous serons particulièrement attentifs à tout changement physique ou de comportement. Le suivi pondéral des souris sera également un bon indicateur de leur état général. Dans le cas d’une injection intrapéritonéale, nous surveillerons l’aspect du site d’injection. Le suivi sanitaire quotidien et nos visites régulières (dont la fréquence est adaptée à la procédure) permettront de déceler précocement tout signe de douleur, de souffrance ou d’angoisse, de détecter l’atteinte des points limites et d’appliquer, le cas échéant, les critères d’arrêt définis dans nos grilles d’observation.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris car notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriées à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. De plus, nous étudions les cellules immunitaires du tissu adipeux brun et nous disposons déjà des modèles génétiques murins permettant l’expansion du tissu et l’élimination spécifique de différentes populations de cellules immunitaires. Enfin, les données in vivo de la littérature sont obtenues essentiellement sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour faire les différentes analyses biologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Nous utiliserons des animaux âgés de 1 à 24 semaines car le tissu adipeux brun est très actif à la naissance et son activité diminue ensuite avec l’âge.