Recherche fondamentale

Chaque poisson zèbre reçoit une lésion du télencéphale, la moitié des individus ayant d'abord été mis en surnutrition pour reproduire le surpoids et l'hyperglycémie. 160 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tués un, deux ou trois jours après la lésion pour analyse des tissus. Le porteur affirme n'attendre aucune nuisance notable, ni douleur ni stress, en s'appuyant sur des travaux antérieurs où, écrit-il, ces informations n'ont pas été rapportées. Il prévoit malgré tout des points limites, dont les mouvements circulaires, l'incapacité à se nourrir et une flottabilité anormale, qui déclenchent la mise à mort.

Objectifs

Les maladies métaboliques (ex: diabète/obésité) constituent un enjeu majeur de Santé Publique à l’échelle mondiale car leurs prévalences augmentent depuis plusieurs décennies. De façon intéressante, il a été démontré que ces pathologies étaient associées à des perturbations de l’homéostasie cérébrale (troubles de la mémoire, perte de substance grise) favorisant entre autres les accidents vasculaires cérébraux et aggravant leurs conséquences neurologiques. Plus largement, ces perturbations métaboliques semblent être délétères pour le fonctionnement du cerveau. De façon intéressante, lors des dommages cérébraux, ces pathologies ont un impact négatif sur la taille des lésions et la récupération fonctionnelle (élocution, locomotion, sensibilité, ...). Cependant, les impacts réels de lces perturbations métaboliques sur les mécanismes propres à la réparation cérébrale ne sont pas bien connus. Les objectifs du projet sont de comprendre l'impact du surpoids sur les mécanismes de réparation cérébrale en utilisant le poisson zèbre. Cet animal est un modèle reconnu de plasticité et de réparation cérébrales. C'est aussi un modèle permettant de mimer des situations de surpoids associés à une hyperglycémie. Dans ce contexte, nos sous-objectifs sont de déterminer l'impact de ce surpoids sur la mort cellulaire à la suite d'une lésion cérébrale, (2) sur l'angiogenèse régénérative (création de nouveaux vaisseaux), (3) sur le recrutement de la microglie au site de la lésion, et enfin (4) la neurogenèse régénérative permettant de générer de nouveaux neurones pour remplacer ceux qui sont morts à la suite de la lésion.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu et affectés par des désordres métaboliques et la surnutrition lors d'un dommage cérébral. Il pourrait permettre d'identifier des problèmes de réparation induite lors de ces maladies métaboliques (ex: suractivation microgliale, problème d'activation des cellules souches). Ainsi, cette meilleure compréhension du fonctionnement régénératif en condition de perturbations métaboliques pourrait permettre de mettre en œuvre des thérapies favorisant ou limitant ces processus (ex: limiter la mort cellulaire, limiter la neuroinflammation, favoriser la neurogenèse). A terme, ce projet a pour but de favoriser la réparation cérébrale dans des conditions qui lui sont délétères (ex: hyperglycémie) afin de limiter les conséquences de dommages cérébraux.

Procédures

La moitié des animaux seront surnutris de façon volontaire (non forcée). L'ensemble des animaux contrôles et surnutris sera lésé au niveau du télencéphale puis euthanasié 1,2 ou 3 jours après la lésion (à la fin du protocole de nutrition) afin de déterminer l'impact de la surnutrition sur les différentes phases de la réparation cérébrale.

Impact sur les animaux

Des expériences précédentes sur les modèles de lésions chez le poisson zèbre n'ont pas révélé de nuisances notables (ex: surmortalité, troubles du comportement, stress, douleur). Il en est de même sur les modèles de surnutrition chez le poisson zèbre. Aussi, même si des lésions cérébrales chez le poisson zèbre en condition de désordres métaboliques (entre autres surpoids) pourraient impacter certains processus régénératifs, nous n'attendons pas de nuisances et/ou effets indésirables entrainant des douleurs ou stress par rapport aux données précédentes de la littérature pour lesquelles ces informations importantes n’ont pas été rapportées, ni même observées au laboratoire. Nous hypothésons que les cinétiques de réparation vont être ralenties par rapport à une situation contrôle. Les nuisances associées aux lésions peuvent être du stress, des modifications du comportement et une mortalité. Ces nuisances sont exceptionnelles et n'ont que rarement été rapportées dans la littérature.

Devenir

A la fin de l'expérimentation, tous les animaux seront euthanasiés pour analyse tissulaire par immunohistochimie.

Remplacement

La complexité des processus physiologiques se déroulant lors de la réparation cérébrale ne sont pas modélisables par des techniques in vitro. Les processus de réparation impliquent plusieurs types cellulaires: microglies, oligodendrocytes, macrophages, cellules endothéliales, neurones, et cellules souches neurales. De plus, plusieurs processus physiologiques se mettent en place lors de la réparation : hypoxie, inflammation, stress oxydatif, sécrétion de facteurs trophiques et neurotrophiques ainsi qu'endothéliaux. A l'heure actuelle, nous ne pouvons réaliser des procédures in vitro permettant d'intégrer l'ensemble de ces acteurs cellulaires et de signalisation.

Réduction

Chaque expérimentation sera scindée dans la mesure du possible en deux expériences indépendantes. Cela permettra de ne pas utiliser l'ensemble des animaux si nous observons que les résultats obtenus sont suffisamment étayés. De plus, si jamais une souffrance ou une mortalité inattendue venait à apparaitre, cela éviterait de relancer une expérimentation avec le deuxième groupe d'animaux. Des analyses statistiques et une étude bibliographique ont été réalisées pour déterminer le nombre d'animaux.

Raffinement

Les animaux seront observés plusieurs fois par jour dans leur aquarium. Après lésion, ils seront observés de façon intensive dans les premières 30 minutes, puis une fois toutes les heures. Tout signe de souffrance ou de comportement anormal sera rapporté au vétérinaire référent afin de prendre les mesures adéquates. Un espace suffisant limitant au maximum les contraintes subies et permettant un comportement normal sera assuré. Les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie générale par une personne qualifiée. Différents points limites spécifiques tels qu'un comportement anormal (mouvements circulaires), nutrition anormale (voire incapacité à se nourrir), flottabilité anormale, couleur anormale seront analysés. Si un de ces paramètres ou points limites est atteint, nous en ferons part au vétérinaire pour arrêt de l’expérimentation et par conséquent euthanasie pour limiter les souffrances de l’animal (sédation profonde puis euthanasie). Les données bibliographiques et notre expérience du modèle ne rapporte pas de comportements de souffrance anormale, de modification de la prise alimentaire, du comportement locomoteur notable, et de stress que ce soit à la suite d'une lésion ou d'une surnutrition.

Choix des espèces

Le poisson zèbre partage de 70 à 85 % de gènes en commun avec l’espèce humaine, impliqués dans les processus physiologiques et pathophysiologiques, respectivement. La situation de surpoids/obésité associé à une hyperglycémie peut être mimée en mettant les animaux en surnutrition. Ceci permet de mimer les conditions pathologiques du surpoids/obésité humaine. De plus, c’est également un modèle de réparation cérébrale reconnu avec des processus de réparation similaires à ceux des mammifères. Des animaux sexuellement matures du même âge entre les groupes (âge entre 3 et 18 mois)

320 souris Nude, dépourvues des défenses immunitaires qui leur permettraient de rejeter des cellules humaines, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales mammaires dans la glande ou dans la veine de la queue, quatre injections de traitement, une mesure de tumeur trois fois par semaine, et jusqu'à douze séances d'imagerie sous anesthésie dans un second établissement. La question posée porte sur le rôle d'un transporteur d'acides gras dans la progression du cancer du sein triple négatif. Le porteur présente la souris Nude comme "l'un des rares modèles" permettant de greffer des tumeurs humaines sans rejet, et justifie l'âge retenu, six semaines, par la comparabilité avec les données déjà publiées.

Objectifs

Le cancer du sein est le premier cancer en termes d’incidence et en termes de mortalité chez les femmes. Dans le contexte du cancer du sein, le constituant majoritaire de l’environnement entourant la tumeur est le tissu adipeux, dont les adipocytes constituent une majeure partie. Le développement tumoral s’accompagne de besoins énergétiques important et les cellules tumorales disposent de plusieurs sources d’énergie, dont les lipides. Il a été montré une expression importante d’un transporteur d’acides gras par les cellules tumorales mammaires les plus agressives entraînant une captation élevée d’acides gras et augmentant leur agressivité. En exprimant ce transporteur, les cellules tumorales pourraient potentialiser leur capacité à former des métastases en favorisant leur captation d’acides gras apportant une source d’énergie importante permettant à ces cellules tumorales de migrer et survivre à distance de la tumeur mammaire. Cette participation au processus métastatique semble être une caractéristique commune à plusieurs types de cancers et, cliniquement, les chercheurs ont observé que la présence de cellules exprimant ce transporteur d’acides gras était corrélée avec des tumeurs très agressives et un mauvais pronostic. Ces résultats suggèrent donc que ce transporteur d’acides gras est une « signature » des cellules qui ont le potentiel de former des métastases. L’objectif de ce projet est de déterminer le rôle de cette protéine dans la progression du cancer du sein. Le projet se déroulera dans deux établissements en raison de l’indisponibilité de certains équipements d’imagerie dans l’établissement principale. Cette demande complémentaire concerne un projet préalablement autorisé dans lequel une étape nécéssite une expertise spécifique non disponible en interne, aucun animal supplémentaire n'est donc ajouté par rapport au projet principal.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier le rôle d’un transporteur d’acides gras dans la progression tumorale et métastatique mammaire. A travers la compréhension de son rôle et des conséquences de son inhibition sur le développement du cancer du sein nous pourrons mettre en évidence que cette protéine est une cible thérapeutique intéressante dans le cancer du sein, particulièrement dans les cancers les plus agressifs et notamment au stade métastatique. Cela ouvrira de nouvelles voies thérapeutiques dans le traitement du cancer du sein triple négatif. De plus, ce transporteur se retrouve surexprimé non seulement dans le cancer du sein mais dans d’autres cancers également, la compréhension de son rôle dans la progression cancéreuse et comme potentielle nouvelle cible thérapeutique est donc également intéressante et potentiellement applicable dans le cadre d’autres types de cancer.

Procédures

Le modèle animal utilisé dans le projet dispose d’un système immunitaire déficient réduisant sa capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rends plus sensible aux infections. Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques liés à la mise en place des modèles de cancers mammaires et à leurs traitements. Les différents gestes réalisés sur les souris incluront au maximum les étapes suivantes en fonction des questions scientifiques : i) Injections unique orthotopiques (15 seconde/animal) dans la glande mammaire après traitement hormonale dans l’eau de boisson (15 jours) ou ii) intraveineuse de cellules tumorales sur animal vigile (15 seconde/animal) iii) Suivi du poids et de la croissance tumorale mesure de la taille de la tumeur 3 fois par semaine sur animal vigile (2 minutes/animal) iv) Injection intrapéritonéale des traitements sur animal vigile (1x/semaine, 2min/animal pendant 28 jours soit 4 injections/animal) v) Transport vers un autre établissement et imagerie sur animal anesthésié (12 séance maximum, 30 min) vii) Euthanasie selon une méthode réglementaire à la fin de la procédure et prélèvements des tumeurs et des organes pour analyse.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables attendus dans ce projet sont : 1) L’immunodéficience du modèle animal réduisant sa capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rend plus sensibles aux infections. 2) Le stress de la nouveauté (néophobie) lors des changements de conditions (traitement dans l’eau de boisson, nouveau régime alimentaire, ou encore lors du transport vers un autre site pour l’imagerie) 3) Le stress et le risque de lésion au niveau de la queue ou de la glande mammaire suite aux injections des cellules tumorales. 4) Le risque d’une croissance tumorale importante pouvant entrainer dans les cas les plus sérieux : une nécrose des tissus (peu probable d’après notre expérience sur le modèle), des difficultés de mobilité, ou encore une perte de poids. 5) Les risques liés aux anesthésies (hypothermie, hypoventilation, arrêt cardio-respiratoire, etc.) durant l’imagerie.

Devenir

A la fin des différents actes et de la période de maintien prévu, l’ensemble des animaux (n=320) sont euthanasiés par une méthode réglementaire en vue de réaliser les différents prélèvements au sein du dernier établissement où ils seront hébergés. Les tumeurs et les organes seront récupérés et analysés.

Remplacement

Les études in vitro déjà menées ont permis de sélectionner/affiner au mieux les conditions expérimentales du projet afin de réduire au maximum le nombre d’animaux impliqués dans cette étude. En effet, cette étude doit être conduite in vivo car celle-ci prend en considération la tumeur, son environnement ainsi que l’ensemble des interactions mises en jeu. Ainsi, il n’y a pas de modèles alternatifs au modèle animal permettant de recréer l’ensemble des acteurs impliqués dans le développement tumoral et l’action des traitements proposés. Nous avons besoin d’un modèle qui mime ce qui se passe en clinique chez les patients traités. Travailler sur des cultures cellulaires ne permet pas de répondre à ce que sera l’efficacité d’un médicament sur une tumeur en trois dimensions et avec son microenvironnement. C’est pourquoi, le modèle de xénogreffe ou d’injection en intraveineux chez la souris permet de créer un modèle d’étude qui se rapproche de celui observé chez les patients.

Réduction

Le projet impliquera un total de 320 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Notre procédure expérimentale a été affinée pour éviter l'utilisation inutile de souris. Chaque groupe de traitement comportera 10 souris au total. Par ailleurs, l'analyse statistique sera réalisée avec les tests adaptés. Pour ce faire, nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, formation, suivi, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, suivi, etc.).

Choix des espèces

Justification de l’espèce : La souris est un mammifère comme l’Homme, la souris Nude est l’un des rares modèles permettant de créer des xénogreffes de tumeurs humaines sans qu’il n’y ait de rejet du non-soi (modèle immunodéficient). La souris est le modèle le plus utilisé en première ligne et il permet d’acquérir un grand nombre d’information dans un temps relativement court. Description du ou des modèle(s) : Nous utiliserons des souris Nude qui présentent une mutation de leur système immunitaire. Les souris peuvent ainsi recevoir des cellules d’une autre espèce et les cellules injectées pourront proliférer sans être rejetées. Justification du stade de développement : Livraison des animaux âgés de 4 semaines. Début de l’expérimentation après deux semaines d’acclimatation soit à 6 semaines ; ce stade est couramment utilisé dans la littérature ce qui nous permettra de comparer nos résultats avec les données publiées.

Le criblage d'anticorps et de cellules immunitaires modifiées détenus par le laboratoire tient lieu d'objectif, avec l'évaluation un à un de "candidats médicaments" anticancéreux puis de leurs combinaisons. 2 380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse de la tumeur et du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune est pucée, reçoit une greffe de tumeur humaine ou murine sous la peau ou dans le cerveau, puis jusqu'à trois injections sur trois mois, le suivi pouvant durer neuf mois. Les greffes sous-cutanées peuvent se développer jusqu'à l'inflammation, la nécrose ou l'ulcération, et le porteur conclut que le recours aux modèles animaux est "indispensable" tout en revendiquant un engagement à minimiser leur nombre.

Objectifs

Il est essentiel de rechercher de nouvelles thérapies contre le cancer pour améliorer les chances de survie des patients et réduire les effets secondaires des traitements actuels. Dans cette perspective, notre projet se concentre sur l'évaluation de divers médicaments potentiels pour le traitement du cancer Dans le domaine des traitements médicaux contre le cancer, il existe une approche qui consiste à exploiter le potentiel du système immunitaire pour combattre le cancer. Cette méthode comprend l'utilisation d'anticorps, qui sont essentiellement des protéines conçues pour cibler et neutraliser des substances spécifiques dans le corps, y compris les cellules cancéreuses. En outre, il est possible de manipuler génétiquement certaines cellules du système immunitaire pour qu'elles soient équipées d'un récepteur spécial, appelé récepteur antigénique chimérique (CAR), qui leur permet de reconnaître et d'attaquer spécifiquement les cellules cancéreuses. En somme, ces approches thérapeutiques visent à armer l'organisme pour qu'il puisse mieux lutter contre le cancer. Nous évaluerons également des thérapies combinées, en associant les traitements les plus prometteurs, sur des modèles murins portant différentes formes de cancer. Le projet se divise en trois phases : (1) Évaluation de l'efficacité des médicaments candidats, y compris les anticorps traditionnels et les formulations modifiées, ainsi que les approches innovantes avec les cellules immunitaires modifiées. (2) Évaluation des médicaments candidats en combinaison, pour maximiser leur efficacité en utilisant différents types d'anticorps et/ou en y ajoutant les cellules immunitaires modifiées. (3) Si nécessaire, création de nouveaux modèles animaux pour approfondir la recherche sur les thérapies anti-cancéreuses

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples et promettent de contribuer de manière significative à la recherche et au traitement du cancer : 1- Compréhension des capacités thérapeutiques de chaque « candidats médicaments » : Ce projet permettra une évaluation complète des différents formats d'anticorps en notre possession, , ainsi que des cellules du système immunitaire modifiées. Cette compréhension approfondie des avantages et des limites de ces « candidats médicaments » guidera le développement de thérapies plus efficaces contre le cancer. 2- Optimisation des traitements anticancéreux : En identifiant les « candidats médicaments » les plus prometteurs pour cibler spécifiquement les cellules tumorales, ce projet contribuera à l'optimisation des traitements anticancéreux. 3- Diversité des approches thérapeutiques : L'évaluation de diverses approches élargira le champ des options thérapeutiques disponibles pour les patients atteints de cancer. Cela ouvre la porte à des traitements plus personnalisés et adaptés aux caractéristiques spécifiques de chaque tumeur. 4- Amélioration de la recherche en cancérologie : Les données générées par ce projet enrichiront la base de connaissances en cancérologie. Elles serviront de référence pour d'autres chercheurs. 5- Réduction de la toxicité des traitements : En développant des thérapies plus ciblées, ce projet vise à réduire la toxicité des traitements anticancéreux, ce qui améliorera la qualité de vie des patients. Les résultats de ce projet pourraient déboucher sur des traitements anticancéreux innovants et prometteurs qui devront être évalués dans des essais cliniques ultérieurs. En fin de compte, ce projet contribuera à faire progresser la lutte contre le cancer en élargissant notre compréhension des stratégies thérapeutiques et en ouvrant la voie à des traitements plus efficaces, mieux tolérés et plus adaptés aux besoins individuels des patients.

Procédures

Les animaux dans le cadre de ce projet seront soumis à une série d'interventions destinées à évaluer l'efficacité de divers "candidats médicaments" dans le traitement du cancer : - Pose de puce en souscutané pour l’identification des animaux (moins de 1 minutes - 1 fois) -Xénogreffes sous-cutanées et intracérébrales (moins de 1minutes - 1 fois par animal) : Les animaux seront implantés avec des xénogreffes portant des lignées tumorales humaines ou murines. Les xénogreffes peuvent être sous-cutanées ou intracérébrales, en fonction des modèles expérimentaux. - Administrations des candidats médicaments : Les candidats médicaments seront administrés aux animaux, et la manière dont cela se fait dépendra de leur formulation. Jusque 3 injections sur une période de 3 mois seront réalisées (durée injection moins de 1 minutes). - Suivi de l'efficacité thérapeutique (au cours de l’étude – durée environ 2 minutes par animal) : L'efficacité thérapeutique sera évaluée en mesurant la régression tumorale dans le cas des xénogreffes sous-cutanées, la survie des animaux pour les xénogreffes intracérébrales, ou une combinaison de ces deux indicateurs. Un maximum de 2380 animaux seront engagés dans cette procédure pour une durée maximal de 9 mois par expérimentation.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus comprennent des réactions comportementales telles que l'agitation ou l'apathie en réponse aux procédures ou aux traitements, ainsi que la possibilité de douleur et de détresse causées par des interventions chirurgicales ou autres procédures expérimentales. Les animaux ayant reçu une xénogreffe intracérébrale peuvent présenter une perte de poids et des déséquilibres lors de l'évolution de la tumeur. Les xénogreffes sous-cutanées peuvent se développer de manière significative, entraînant des problèmes tels que des inflammations, des nécroses ou des ulcérations au site de la greffe. De plus, les traitements expérimentaux peuvent influencer négativement l'alimentation et la croissance des animaux, certains pouvant perdre l'appétit ou subir une perte de poids, ce qui affecte leur santé générale.

Devenir

A la fin des procédures les animaux seront euthanasiés par des méthodes adaptées et validées pour la réalisation d’une analyse post mortem de la tumeur et du cerveau.

Remplacement

Dans un premier temps, nous effectuons des analyses in vitro des "candidats médicaments" sur des modèles cellulaires tumoraux pour évaluer leur impact sur différentes lignées tumorales. Cette étape est cruciale pour sélectionner les candidats médicaments les plus prometteurs. Nous soumettons toutes nos stratégies thérapeutiques à une évaluation in vitro visant à confirmer l’efficacité des « candidats médicaments » in-vitro Cette approche permet de réduire considérablement le recours aux tests sur animaux. Cependant, il est important de noter que les modèles in vitro ne peuvent pas totalement reproduire l'interaction complexe entre les cellules tumorales et leur microenvironnement. Pour approfondir nos recherches, l'utilisation de modèles animaux est indispensable, tout en respectant notre engagement de minimiser leur nombre. Notre objectif principal est de contribuer de manière significative à la compréhension des mécanismes tumoraux et au développement de nouvelles thérapies, en tenant compte du bien-être des animaux de laboratoire.

Réduction

Une simulation statistique a été réalisée pour déterminer le nombre minimum d’animaux par groupe, nécessaire pour observer des effets significatifs.

Raffinement

La surveillance quotidienne des souris logées en groupe dans un environnement enrichi, qui offre une variété de stimulations cognitives et motrices, ainsi que l'application de critères d'arrêt à la fois en phase d'élevage et lors des expérimentations, sont essentiels pour garantir leur bien-être. En cas de manifestations inattendues, le vétérinaire de l'installation sera immédiatement informé afin de mettre en place des traitements appropriés, qu'il s'agisse de soutien nutritionnel ou de l'administration de médicaments. L'état de santé des animaux sera étroitement surveillé tout au long de l'expérience. Le protocole d'anesthésie et d'analgésie lors des procédures chirurgicales a été élaboré de manière précise afin d’assurer que les animaux ne souffrent pas. Les animaux bénéficieront d'une période d'adaptation lors de leur arrivée à l'animalerie, de temps de récupération après une intervention chirurgicale, et d'une familiarisation progressive avec les manipulations nécessaires pour leur traitement quotidien. Tout cela vise à maintenir des conditions physiologiques optimales et à minimiser le stress et la souffrance pendant le déroulement du protocole.

Choix des espèces

Les souris sont des espèces fréquemment utilisées en recherche translationnelle, notamment dans le domaine de l'évaluation de traitements anti-cancéreux. Notre laboratoire possède une expertise avancée dans la mise en place de protocoles de xénogreffe des cellules tumorales in vivo, qu'il s'agisse d'implantations orthotopiques ou hétérotopiques, et nous maîtrisons pleinement ces modèles animaux. Les souris, en raison de leur petite taille, de leur développement rapide et de leurs similitudes marquées en termes de mécanismes moléculaires et cellulaires avec l'homme, offrent une plateforme idéale pour étudier les réponses aux traitements anti-cancéreux. Le présent projet a pour but d'étudier les effets d’un traitement anticancéreux sur des sujets pleinement matures. Les animaux étudiés seront donc des adultes (2-4 mois) au moment des expérimentations.

Maintenues à plus de 85 % de leur poids normal par une restriction alimentaire, et isolées en cage individuelle de deux à cinq semaines, les souris de ce projet doivent rester motivées par la récompense alimentaire des tâches de mémoire. 400 vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit un implant cérébral posé au cours d'une chirurgie de quatre à six heures, puis son activité cérébrale est enregistrée environ deux semaines, jusqu'à quatre heures par jour pendant son sommeil, pour étudier le rôle des astrocytes dans la consolidation de la mémoire. Le porteur qualifie la restriction alimentaire de légère et affirme, littérature à l'appui, que cette restriction et l'exercice dans les labyrinthes sont bénéfiques pour la santé et le vieillissement des souris.

Objectifs

Le but de ce projet est de tester le rôle des astrocytes dans la théorie standard des mécanismes de formation et de consolidation de la mémoire, qui attribue un rôle critique à l'hippocampe et à ses partenaires corticaux et sous-corticaux, notamment pendant le sommeil. Notre attention sera portée sur le rôle des astrocytes dans l’émergence de certains rythmes du sommeil afin de comprendre leur rôle dans la plasticité de l’hippocampe. Nous entraînerons donc des souris à effectuer des tâches de mémoire impliquant ces systèmes, nous enregistrerons l’activité cérébrale pendant l’accomplissement de ces tâches et pendant le sommeil qui précède et qui suit l’apprentissage, et nous tenterons également d'altérer les performances mnésiques en modifiant la dynamique cérébrale au moyen de mutations ciblées au niveau des cellules gliales astrocytaires. Nos expériences incluront également des groupes contrôles. Des souris seront utilisées pour toutes les étapes de ce projet. La souris est un modèle standard pour l’étude de la mémoire aussi bien en psychologie animale qu’en neurophysiologie chez l’animal libre de ses mouvements.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes astrocytaires de la formation et de la consolidation de la mémoire. Nous nous intéresserons en particulier à l’hippocampe, une structure qui chez l’homme joue un rôle clef dans la mémoire des souvenirs personnels (mémoire épisodique) et des faits généraux (mémoire sémantique), et qui est particulièrement impactée dans les troubles mnésiques liés aux maladies neurologiques, notamment l’épilepsie et la maladie d’Alzheimer. À ce titre, nos travaux précédents décrivant une méthode d’amélioration de la consolidation de la mémoire chez le rat ont été récemment répliqués chez l’homme et laissent entrevoir la possibilité de pallier certains déficits mnésiques liés à l’âge ou à la pathologie.

Procédures

Ce projet utilisera au maximum 400 souris. Pour étudier les bases neurales de la mémoire, les animaux sont entraînés à effectuer des tâches de mémoire spatiale dans une cage ouverte ou dans des labyrinthes. Si l’accomplissement de ces tâches repose sur la motivation des animaux à obtenir des récompenses alimentaires, une légère restriction alimentaire est nécessaire à leur motivation. Pour permettre une restriction précise, les animaux sont maintenus dans des cages individuelles, à proximité directe de leurs congénères, dans des cages transparentes pour assurer une contiguïté visuelle, auditive et olfactive. La littérature scientifique montre que la légère restriction alimentaire (>85% du poids normal à l’âge de l’animal) et l’exercice physique dans les labyrinthes sont bénéfiques pour un grand nombre de marqueurs de santé et de vieillissement. Les animaux reçoivent un implant chirurgical (1 fois, typiquement 4–6 h) pour pouvoir enregistrer leur activité cérébrale (typiquement pendant 2 semaines) pendant l’accomplissement de la tâche (typiquement 1h/jour d’enregistrement) ainsi que pendant le sommeil lorsque la mémoire se stabilise à long terme (typiquement 2–4h/jour d’enregistrement). Les tâches d'apprentissage peuvent inclure de phases courtes (familiarisation de 20minutes) ou longues selon la capacité de l'animal à apprendre la tâche (durée des tests : jusqu'à 2h, une fois par jour, pendant au maximum 1 mois). Dans le cas d'un apprentissage court, la phase de test dure 10 minutes et la tâche comportementale peut-être répétée 2 fois à 2 semaines d'intervalle. Les animaux concernés sont isolés de 2 à 5 semaines. Les animaux concernés par la restriction alimentaire le sont pendant 5 semaines maximum. Pour les animaux concernés, une expression intracérébrale de protéines d'intérêt sera également pratiquée (1 fois, typiquement 1–2h). Une analyse histologique permettra de vérifier les sites d’enregistrement ou d’expression.

Impact sur les animaux

Certains animaux, qui subissent une chirurgie longue, peuvent souffrir d'effets indésirables comme l'hypothermie, la déshydratation et des douleurs post-opératoires. Certains animaux peuvent être maintenus dans des cages individuelles pendant une durée limitée et peuvent être soumis à une restriction alimentaire précise. Les animaux seront étudiés pendant leur période de repos car nous souhaitons aussi enregistrer leur sommeil. Ceci constitue un désagrément mineur puisque la tache comportementale dure relativement peu de temps et leur sommeil est naturellement fragmenté comparé à l'humain.

Devenir

À l'issue de l'ensemble des procédures, les animaux seront mis à mort. La validation des enregistrements nécessite un prélèvement histologique.

Remplacement

Certains mécanismes cellulaires et moléculaires sous-tendant la mémoire (par exemple, le recrutement de nouveaux récepteurs au niveau synaptique) peuvent être défrichés in vitro. Dans le laboratoire, nous avons développé un modèle in vitro d’ondes hippocampiques qui a permis d’élaborer notre hypothèse de l’implication astrocytaire dans les ondes cérébrales du sommeil. Cependant, in vitro il n’est ni possible de reproduire un apprentissage comportemental ni de créer de façon satisfaisante un état comparable au sommeil. Tous deux nécessitent un réseau plus large que l’hippocampe qui n’est pas réalisable in vitro. De plus, certaines propriétés computationnelles de petits réseaux de neurones peuvent être testées in silico (modèles computationnels) mais les propriétés des astrocytes ne sont pas assez connues pour pouvoir en déduire des informations fiables biologiquement. In fine, l’étude des mécanismes de réseau de formation et de consolidation de la mémoire nécessite de faire des liens corrélationnels et causaux précis entre activité neuronale à grande échelle et comportements d’apprentissage et de mémoire, et ne peut se faire que sur des animaux au cours même de l’apprentissage, du sommeil et du rappel.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux, nous utiliserons des systèmes d'acquisition haute densité, permettant d'enregistrer à la fois un grand nombre d’astrocytes et des nombreux sites cérébraux (32 canaux répartis entre le circuit thalamocortical et l'hippocampe) simultanément ce qui maximisera la quantité d'information apportée par chaque animal. L'approche statistique tirera profit des tous derniers développements statistiques et analytiques du domaine. Ainsi, nos approches analytiques s’appuient sur de nombreux tests statistiques : tests paramétriques standards et tests non paramétriques.

Raffinement

Après les chirurgies, les souris seront surveillées et les points limites évalués quotidiennement pendant une semaine afin de déceler des signes de douleur sur la base de la grille d'évaluation de la douleur validée pour éviter toute souffrance des animaux. Les soins post-opératoires incluront des traitements antibiotiques, analgésiques, ainsi qu'une surveillance quotidienne des animaux. Nos expériences s'effectueront sur des animaux soit anesthésiés pour l’ajustement et l’optimisation de la position des sondes d’enregistrement, soit vigiles, libres de leurs mouvements (et non tête fixée) pour se rapprocher au mieux de la physiologie et limiter le stress. Les systèmes d’enregistrement sont miniaturisés au maximum pour s’assurer que les animaux implantés aient un comportement tout à fait normal. Pour limiter le stress dû à l’isolement, nous utiliserons des cages transparentes placées à proximité les unes des autres, de façon que les animaux puissent rester en contact visuel, auditif et olfactif.

Choix des espèces

Le rongeur est l’espèce standard pour toutes les études des bases neurophysiologiques de la mémoire. Ce sont les modèles pour lesquels les outils expérimentaux sont les plus développés (électrophysiologie à grande échelle, vecteurs viraux, optogénétiques). En outre, les souris peuvent porter une mutation génétique capable d’exprimer un marqueur fluorescent sensible au calcium et de marquer ainsi l’activité calcique des astrocytes, ce qui est à ce jour le seul moyen de suivre leur activité pendant la dynamique du cerveau au cours du sommeil. Nous utiliserons des souris adultes (2-8mois) pour lesquels, l'apprentissage et le sommeil sont bien caractérisés.

Toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, 500 souris femelles Balb/c vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont sensibilisées au gluten une fois par semaine pendant huit semaines, par injection dans l'abdomen ou par application sur la peau après provocation d'une inflammation cutanée. Un gavage déclenche ensuite la réaction allergique, avec chute de la température corporelle et douleurs stomacales attendues, la température étant relevée par voie rectale, et six prélèvements de sang sont faits au bout de la queue. Sur le remplacement, le porteur affirme que le modèle in vivo reste "irremplaçable" pour comparer les voies d'exposition et qualifie l'expérimentation animale d'"élément vital" du projet.

Objectifs

Les allergies sont répandues et ont été classées comme quatrième pathologie en termes de morbidité par l’Organisation Mondiale de la Santé. Depuis une vingtaine d’années, une augmentation constante de la prévalence de cette pathologie et notamment de la forme sévère (dite anaphylactique) a été constatée. A l’heure actuelle, les mécanismes impliqués dans le développement de la réaction allergique et les causes spécifiques de l’augmentation de leur prévalence sont peu établis. L’allergie au blé est l’une des allergies alimentaires les plus fréquentes, due principalement à un ensemble de protéines, nommé gluten. Le gluten est composé des allergènes majeurs de la céréale. Certaines études tentent de montrer l'intérêt des procédés de transformation dans la réduction des allergies. La fermentation appliquée lors de la fabrication du pain au levain peut engendrer une dégradation des protéines du gluten par certaines bactéries ou enzymes supposant ainsi une diminution de la réponse allergique. Cependant, le nombre d'études reste très limité. L'objectif de ce projet est d'évaluer la réponse allergique du gluten fermenté par une combinaison de bactéries lactiques, d'une levure ou d'une enzyme de grade alimentaire. En effet dans nos précédentes études, une bactérie et une enzyme ont été identifiées pour leur capacité à dégrader le gluten. L'influence de la voie d'exposition (percutanée ou intra-péritonéale) reste également largement à explorer. De ce fait, lors de ce projet, ces deux voies d'exposition sur le développement de l’allergie alimentaire au gluten sera évaluée. Pour cela, un examen approfondi des mécanismes immunologiques impliqués dans l’allergie au gluten et de l'influence du procédé de fermentation sera mené.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’évaluer l'impact du procédé de fermentation sur l'allergie au gluten. De ce fait, la réponse immunitaire précise sera élucidée pour chaque voie de sensibilisation (intra-péritonéale et percutanée). A terme, ce projet a pour but de permettre une compréhension plus approfondie du développement de l’allergie au gluten permettant d’améliorer la prise en charge des sujets atteints. Aussi, des solutions préventives pourront être proposées.

Procédures

Les souris seront sensibilisées 1 fois par semaine pendant 8 semaines par une injection intraperitonéale ou une application cutanée sur l'abdomen. Le déclenchement des symptômes de l'allergie sera effectué par un gavage, 7 jours après la fin de la phase de sensibilisation. Pour une injection intrapéritonéale ou un gavage oral, la durée des interventions correspond au temps d’injection ou d’administration (soit environ 10 secondes). Pour l’application cutanée sur l’abdomen ou le dépôt sur les narines, la durée d’intervention correspond au temps d’anesthésie (soit 15 à 20 minutes). Toutes les souris auront également un prévèlement de 50 microlitres (3 à 4 gouttes de sang) à l'extrémité de la queue 1 fois par semaine (de la sensibilisation 3 à la sensibilisation 8) soit 6 prélèvements au total. Ce geste dépend du débit sanguin et dure environ 30 secondes.

Impact sur les animaux

Lors de ce protocole, il est possible que les animaux aient des effets indésirables suite aux gestes pratiqués. En effet, les différents moyens de sensibilisation peuvent provoquer certaines nuisances notamment en raison de la répétabilité des gestes (1 fois par semaine pendant 8 semaines). Les souris sensibilisées par voie percutanée pourront ressentir un inconfort abdominal suite à la réalisation d’une inflammation cutanée pour permettre le passage de l’allergène. Les sensibilisations réalisées par voie intra-péritonéale peuvent également provoquer une gêne abdominale au niveau du point d’injection. La phase de déclenchement de l’allergie alimentaire (challenge), peut également contribuer à des nuissances. Une baisse de la température corporelle des animaux est généralement observée. Les souris pourront aussi ressentir des douleurs stomacales liées à l’administration de gluten. La prise de température par voie rectale peut aussi entrainer un inconfort pour les souris.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les organes pour analyse de la réponse immunologique et des marqueurs de l'allergie.

Remplacement

Dans le cas de l’allergie alimentaire, les modèles in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes et en particulier le système immunitaire. Notamment, dans le cas de l’étude de l’influence des différentes voies d'exposition, le modèle in vivo reste irremplaçable. Dans notre étude, les fermentas ont pu être testés sur un type de cellule mimant le processus de provocation, ces tests permettent de mettre en avant l'intérêt de certains échantillons. Dans l’allergie, de multiples types cellulaires peuvent être impliqués et leurs interactions peuvent avoir un rôle dans la physiopathologie. De plus, les allergies alimentaires sont caractérisées par des symptômes que seuls des modèles animaux, et en particulier les souris peuvent adéquatement reproduire. Ce projet présente enfin un réel intérêt dans la mesure où il modélise le développement de la réaction allergique au gluten et étudie l'impact d'un procédé de transformation.

Réduction

Le protocole d’allergie alimentaire est régulièrement réalisé au sein du laboratoire. De ce fait, en se basant sur les études précédentes et des tests statistiques, le nombre de souris a été déterminé à 20 souris par sous-groupe (hormis pour l'étude pilote, 10 souris par groupe seront utilisées). Le nombre d’animaux réduit au minimum permettra d’obtenir des résultats statistiquement exploitables pour la réalisation d’analyses statistiques.

Raffinement

Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l’expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux mais aussi la mise en place lors des procédures expérimentales d’analgésie et d’anesthésie permettront de minimiser l’inconfort et la douleur. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront stabulées dans les cages d’un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité). Les souris seront hébergées en nombre de 3 à 5 par cage dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube, coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique. Aussi, une étude préliminaire sera effectuée sur un nombre de souris restreint par groupe (10 souris/groupe soit 20 souris au total), pour observer l'effet de l'application/d'injection de bactéries. Cela permettra d'affiner le protocole et la prise en charge de la douleur le cas échéant.

Choix des espèces

Lors de cette étude, des souris femelles de souche Balb/c seront utilisées. Ces souches de souris constituent un modèle de choix, reconnu, dans le cadre d’étude du système immunitaire du fait de la caractérisation approfondie de ces souches. Il n’existe aujourd’hui pas de méthodes alternatives pour analyser efficacement et dans son ensemble la réaction allergique. De plus, l’allergie est caractérisée par des symptômes que seuls des modèles animaux peuvent adéquatement reproduire. Ainsi, l’expérimentation animale est un élément vital de ce projet afin de modéliser efficacement la réponse physiologique globale du système. Néanmoins, chaque fois que possible, les études sur les animaux seront remplacées par des systèmes in vitro. Des analyses phénotypiques des populations lymphocytaires (cellules spécifiques de l'allergie) seront réalisées. Les femelles Balb/c utilisées auront 3 semaines de vie à réception et 4 semaines de vie au début des interventions. Quatre semaines est l’âge idéal correspondant à des souris sevrées et adultes ayant un système immunitaire mature.