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Production de souris humanisées pour le système immunitaire humain
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
5 000 souris immunodéficientes vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, chacune recevant dans la veine de la queue une injection de cellules sanguines humaines destinée à lui faire développer un système immunitaire humain. Celles de la phase de validation subissent des prélèvements de sang jusqu'à une fois par semaine et sont tuées quand les points limites sont atteints, entre quatre et douze semaines après l'injection. L'effet secondaire attendu est la maladie du greffon contre l'hôte, que le porteur décrit comme une réponse inflammatoire sévère avec altération de la peau, des organes et des poils, perte de poids et douleur. Les souris de la phase de production, elles, ne restent que deux à trois jours avant d'être expédiées à des partenaires académiques et industriels, le nombre produit correspondant au nombre commandé.
Objectifs
Les souris immunodéficientes sont depuis plusieurs décennies des modèles de choix pour la transplantation de cellules humaines pour obtenir des souris humanisées car elles sont particulièrement tolérantes à l’implantation de cellules ou tissus. Les souris sont dites « humanisées » lorsqu’elles développent un système immunitaire humain après la greffe des cellules humaines. Le développement et la production de souris humanisées par injection de cellules du sang humain consiste à proposer des modèles expérimentaux pertinents et adaptées en recherche biomédicale sur les maladies inflammatoires aux utilisateurs finaux (académiques et industriels). En effet, ce type de modèle permet l’étude de nombreuses pathologies dans lesquelles le système immunitaire joue un rôle majeur chez l’Homme dans des domaines tels que la production de cellules du sang, l’immunologie, les maladies infectieuses, la vaccination, l’oncologie et les maladies auto-immunes. Ces modèles permettent également l’amélioration de traitements et des méthodes de diagnostics notamment en oncologie, le cancer étant la première cause de mortalité prématurée, mais aussi les maladies inflammatoires chroniques et certaines maladies d’origines infectieuses. Parmi les traitements, l’immunothérapie fait partie de ces nouveaux traitements innovants qui a révolutionnée la prise en charge des patients atteints de cancer. L’oncologie n’est pas le seul domaine dans lequel l’immunothérapie a eu des effets prometteurs et encourageants, les maladies inflammatoires chroniques ainsi que certaines maladies d’origines infectieuses sont sensibles à l’immunothérapie. Le recours à ces souris humanisées devrait permettre d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques nécessitant des modèles expérimentaux au plus proche de la situation humaine et permettant l’étude des réactions inflammatoires.
Bénéfices attendus
Le développement des souris humanisées pour le système immunitaire permet d’améliorer la compréhension des mécanismes pathologiques et immunologiques, d’identifier des marqueurs biologiques caractéristiques et de développer de nouvelles cibles thérapeutiques pour l’Homme. Les modèles de souris « humanisées » sont donc des modèles très pertinents pour le développement de traitements pharmacologiques. L’un des avantages de ce modèle est le développement rapide du système immunitaire chez son hôte et la multiplication des cellules d’intérêt capable de déclencher une réponse inflammatoire. Depuis quelques décennies, le modèle humanisé est notamment très présent dans les études de nouvelles thérapies innovantes, dites immunothérapies. Il s’agit de thérapie qui se basent sur le fonctionnement du système immunitaire et de sa compréhension afin de combattre la pathologie du patient. Il n’est plus question de viser directement l’infection ou la tumeur, mais d’activer/booster le système immunitaire. De grand espoirs sont fondés notamment sur la médecine dite « personnalisée », pour laquelle ces modèles permettraient de greffer le système immunitaire et la tumeur d’un patient à des souris pour tester plusieurs thérapies avant l’administration du traitement le plus efficace au patient.
Procédures
Pour la phase de validation, une injection unique de cellules humaines sera réalisée dans la veine de la queue et, des prélèvements sanguins seront effectués à plusieurs reprise jusqu’à 1 fois par semaine post-humanisation dans la veine sous-mandibulaire. Pour la production, une injection intraveineuse unique de cellules humaines sera réalisée dans la veine de la queue. Chaque geste sera réalisé en moins d’une minute pour diminuer au maximum le stress et la douleur.
Impact sur les animaux
Au cours des procédures, les souris vont être déplacées pour être envoyées en zone de production, ou lors du transport chez le partenaire. Ces déplacements peuvent induire un certain stress par la manipulation et les bruits inhabituels. Les souris recevront une injection dans la veine de la queue, ce qui pourra engendrer un bref stress et/ou douleur. Plusieurs prélèvements de sang seront réalisés sur de petit volume et au maximum une fois par semaine, ce qui pourra aussi induire un stress et/ou une douleur transitoire. Un effet secondaire lié à l’injection de cellules humaine du sang à la souris est l’apparition de la maladie du greffon contre l’hôte, amenant de graves lésions tissulaires à travers une réponse inflammatoire sévère (altération de la peau, des organes, des poils, perte de poids et douleur).
Devenir
Les animaux de la phase de validation seront mis à mort lorsque les points limites auront été atteints. Les animaux de la production seront expédiés.
Remplacement
Pour le moment, ce type de modèle n’est pas remplaçable car il s’agit d’un modèle complexe mimant le système immunitaire humain, mélangeant de nombreux mécanismes encore méconnus qui nécessitent encore des avancées en recherche fondamentale. Actuellement, il n’existe pas d’équivalent aussi complet in vitro, ex vivo ou in silico. Par ailleurs, les souris humanisées permettent d’approcher la situation physiologique humaine en limitant le recours aux modèles de primates non-humains.
Réduction
Nous avons utilisé un test statistique afin de déterminer le nombre d’animaux à inclure dans nos sous-groupes. Les paramètres utilisés sont tirés de la recherche bibliographique et de nos données internes relatives au processus. Nous avons établi qu’un groupe d’un minimum de 60 souris sera planifié pour chaque modèle animal immunodéficient et scindé en deux groupes qui seront eux-mêmes divisés en 2 ou plusieurs sous-groupes pour tester les différentes quantités de cellules à injecter. Soit un nombre de 15 animaux par sous-groupe. Le nombre de souris à tester a été calculé en prenant en compte : • que le test devra être répété. • qu’il est possible que la greffe ne soit pas concluantes chez certains animaux. Deux paramètres nous permettrons de déterminer la quantité de cellules du sang humain à injecter la plus adaptée : • Le taux d'humanisation • Le temps d’apparition des points limites. Plus le temps d’apparition des points limites sera tardif et plus cela laissera du temps aux partenaires de faire ses études. Grâce aux résultats obtenus nous pourrons faire des analyses statistiques. Si les résultats ne sont pas concluants, des tests complémentaires pourront être menés pour évaluer la dose administrées ou l’impact d’un donneur sur l’humanisation. Grâce à la validation du protocole et à son optimisation pour une meilleure prise de la xénogreffe humaine par modèle, nous réduirons d’autant le nombre d’animaux à implanter pour obtenir le nombre de souris souhaitées. Pour la production, ce protocole sera exclusivement réalisé après réception d’une commande du partenaire afin de limiter le nombre d’animaux humanisés. Le nombre de souris produits correspondra donc au nombre de souris commandées.
Raffinement
Un hébergement sous barrière sanitaire de niveau élevé est appliqué (litière, enrichissement et congénères) associé à une surveillance quotidienne. Toutes les observations feront l'objet d'une documentation adaptée. Le maintien de conditions d’hygiènes strictes exemptes de pathogènes et d’opportunistes étant la clé pour éviter l’expression du phénotype dommageable des animaux immunodéficients et limiter les nuisances associées. Concernant les prélèvements sanguins, les animaux seront prélevés de manière répétée jusqu’à 1 fois par semaine post-humanisation au niveau de la veine sous mandibulaire pour que le prélèvement soit le moins invasif possible. Le volume maximal prélevé respectera les recommandations de 7.5% du volume sanguin de la souris afin que les souris puissent être prélevées 1 fois par semaine. L’apparition de la maladie du greffon chez les souris humanisées est également un point important. Les animaux seront donc observés quotidiennement et évalués sur leur aspect physique, leur comportement et leur poids selon une grille d’observation spécifique. Une attention particulière sera apportée à tout animal présentant des signes potentiellement avant-coureurs de la maladie du greffon pour appliquer des points limites. Pour un état observé dit « normal », les souris seront pesées 1 fois par semaine. Si l’état général de la souris se dégrade un examen clinique de la souris sera appliqué avec la mise en place d’une pesée plus régulière en fonction du développement de la maladie du greffon contre l’hôte. Après production, les souris seront expédiées aux partenaires. Pour limiter le stress occasionné par le transport, des processus d’envoi ont été établi. Pour des transports de moins de 24 heures à 48heures, tous nos colis contiennent de la litière, des l’enrichissement de l’aliment et un gel de transport. Pour les transports plus longs comme ceux en avion, la quantité d’aliment et de gel de transport est doublé.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est conditionné par les besoins scientifiques des projets de nos partenaires. La souris est simple à élever, relativement peu coûteuse à reproduire, à entretenir en grand nombre et à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. La souris est un modèle de choix pour les études précliniques en raison de sa petite taille, sa courte gestation, de sa durée de vie et de la nécessité en réactifs expérimentaux en plus faibles quantités. Les génomes des souris sont bien caractérisés et très comparables au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de souris génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de ceux-ci des modèles de choix relativement robustes pour extrapoler les résultats et en tirer des résultats pertinents pour la pathologie humaine. Que ce soit pour la validation ou la production, les souris entreront dans le protocole d’humanisation à 5 semaines d’âge jusqu’à l’atteinte des points limites pour la phase de validation, ce qui peut représenter plusieurs semaines après l’injection des cellules (entre 4 et 12 semaines post humanisation en fonction de la quantité de cellules injectées). Les souris de la phase de production entreront dans le protocole d’humanisation à 5 semaines d’âge. Elles seront ensuite envoyées aux partenaires deux à trois jours après l’injection des cellules humaines. S’agissant d’un modèle pour des études à court terme avec un développement rapide de la maladie du greffon, nous choisissons d’envoyer rapidement les animaux afin qu’ils puissent commencer leurs protocoles expérimentaux le plus tôt possible.
Evaluation de la physiopathologie de la drépanocytose au niveau centrale et périphérique dans le modèle murin Townes
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Porteuses de la drépanocytose, les souris du modèle Townes sont utilisées ici pour étudier les défauts de production des globules rouges et les obstructions de vaisseaux qui accompagnent la maladie. 524 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, une partie dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil, les autres dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles reçoivent une injection puis une série de cinq ou vingt prélèvements sanguins sous anesthésie espacés d'une semaine, ou subissent une chirurgie du muscle crémaster. Le porteur range parmi les atteintes attendues la piqûre de l'aiguille et l'angoisse liée aux pesées, sans dire ce que produit la drépanocytose elle-même chez ces souris, et indique qu'elles seront tuées pour caractériser leur moelle osseuse et leurs vaisseaux.
Objectifs
L’objectif de notre étude porte sur la compréhension des mécanismes physiopathologiques de la survenue de la drépanocytose. Ce projet s’articule autour de trois objectifs principaux : 1. Evaluer les mécanismes cellulaires et moléculaires associés à des défauts d’hématopoièse, l'ensemble des mécanismes qui assurent la production des différentes cellules sanguines, et d’érythropoïèse, l'ensemble des mécanismes qui assurent la production des globules rouges; 2. Disséquer les mécanismes cellulaires associés à la survenue des crises vaso-occlusives,des obstructions locaux de la circulation sanguine; 3.Evaluer le mécanisme d’action et l’efficacité de candidats médicaments.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques associés à la drépanocytose et d’identifier les mécanismes d’action et l’efficacité de candidats médicaments afin d’offrir dans un futur proche un nouvel arsenal thérapeutique dans la prise en charge de cette maladie.
Procédures
En fonctions des groupes expérimentaux d'appartenance, les animaux subiront: 1. une injection et une série de 5 ou 20 prélèvements sanguins sous anesthésie (3min) tous espacés de 1 semaines; 2. une chirurgie sur le cremaster sous anesthésiée.
Impact sur les animaux
Les prélèvements sanguins, les injections et l'anesthésie constitueront une nuisance pour les animaux. La piqure d'aiguille pour l’injection ainsi que les prélèvements sanguins entraînent une douleur légère de courte durée. L'ensemble des manipulations, ainsi que les pesées peuvent être source d'angoisse.
Devenir
Les souris impliquées dans ce projet feront l’objet d’une caractérisation de leur système hématopoïétique et vasculaire qui nécessitera leur mise à mort.
Remplacement
Les nombreux partenaires (cellulaires et moléculaires) des processus dynamiques d’hématopoïèse, d’érythropoïèse et de thrombose nécessitent une approche expérimentale in vivo car il n’existe pas à ce jour de système suffisamment fiable pour mimer cette complexité biologique.
Réduction
En nous appuyant sur un test d'effectif, nous utiliserons le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet, à savoir d’étudier la physiopathologie de la drépanocytose dans la moelle osseuse et dans les vaisseaux sanguins. Le calcul d’effectif sera réalisé sur la base d’une expérience pilote qui implique elle-même un nombre minimum d'individus déterminé sur la base de données de la littérature. La comparaison des différentes conditions expérimentales se fera par des tests statistiques adaptés à ces petits effectifs.
Raffinement
Le suivi des traitements se fera par des mesures utilisant un procédé peu invasif à partir de prélèvements sanguins réalisés sous anesthésie. Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, enrichissement, stabulation en groupe). Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés et afin de respecter leur instinct grégaire, les souris seront stabulées par petits groupes de 3 à 5 dans des cages dont l’environnement est enrichi à l’aide de copeaux de bois compactés, de coton et de dômes en carton. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score du bien-être.
Choix des espèces
Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proches de l’homme pour sa physiologie. Les données bibliographiques démontrent que le modèle murin est le plus adapté pour adresser les questions relatives à l’hématopoïèse, à l’érythropoiese et à la thrombose. En effet les caractéristiques moléculaires des cellules hématopoïétiques murines sont très semblables aux cellules hématopoïétiques humaines. Chez l’Homme la drépanocytose est une maladie qui se déclare dès la naissance et qui nécessite une prise en charge thérapeutique précoce. Nous utiliserons des individus sevrés avec un suivi de 4 à 24 semaines post-naissance (de jeunes à adultes).
Rôles fonctionnels de PAK1 dans la plasticité de la myéline chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une lésion démyélinisante créée par injection dans la moelle épinière, sous anesthésie, en une heure d'opération au plus : c'est la principale procédure infligée à une partie des 2 084 souris de ce projet. Toutes seront tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 044 d'entre elles et modéré pour 1 040. Les autres reçoivent cinq injections quotidiennes dans le ventre pour supprimer une protéine dans leurs oligodendrocytes, puis une partie passe huit semaines seule en cage avant un test de sociabilité de cinquante minutes, l'objet étant de comprendre comment la myéline se reforme. Le porteur décrit la souris comme un animal grégaire entretenant de fortes interactions sociales, et en isole certaines pendant huit semaines pour mesurer ce que cet isolement fait à leur myéline.
Objectifs
Dans le système nerveux central (cerveau et moelle épinière), les neurones communiquent sous forme d’influx électrique, appelé influx nerveux, transporté le long de leurs axones. Afin d’assurer le bon transport de l’information électrique, la formation de gaines isolantes autour de l’axone est essentielle. Ces gaines sont nommées ‘gaines de myéline’. Elles sont formées par des cellules appelées les ‘oligodendrocytes’ et permettent donc de moduler la vitesse de conduction de l’influx nerveux afin que les messages transmis dans le cerveau se déplacement de façon coordonnée. Ces gaines de myéline sont formées au cours du développement post-natal mais sont dynamiques et modifiées tout au long de la vie afin d’assurer l’adaptation du circuit cérébral à l’environnement. Certaines pathologies, telles que la sclérose en plaque, sont caractérisées par une perte de ces gaines, menant à une perte de l’axone et un défaut cognitif et/ou moteur en fonction du site de la perte myélinique. Il a été démontré que la gaine de myéline peut parfois se reformer spontanément, mais les mécanismes à l’origine de cette remyélinisation ne sont pas bien compris. Il a été démontré qu’une protéine A, présente dans les oligodendrocytes, est essentielle à la formation de ces gaines de myéline, de par son action sur le « cytosquelette d’actine », un des échafaudages de la cellule lui permettant d’adopter plusieurs morphologies. Une première étude de cette protéine A chez la souris a permis de valider son rôle dans la myélinisation du cerveau au cours du développement. L’objectif de ce projet est de continuer l’étude du rôle de la protéine A dans la formation des gaines de myéline chez la souris afin de mettre en évidences de nouvelles cibles thérapeutiques. En effet, nous voulons étudier en profondeur les effets la protéine A sur (1) la modulation des gaines de myéline à l’âge adulte et (2) la réparation de la myéline (remyélinisation). La validation potentielle de la protéine A en tant que cible moléculaire permettant d’actionner cette dynamique chez l’adulte représente ainsi un espoir thérapeutique très important dans plusieurs pathologies de la myéline. Selon nos résultats préliminaires la protéine A est un excellent candidat à cibler pour exercer l’un de ces rôles, voire éventuellement les deux. En effet, puisque cette protéine régule la myélinisation développementale, il est possible qu’elle contrôle également la myélinisation adaptative et, ou la remyélinisation.
Bénéfices attendus
A terme, l’étude approfondie du rôle de la protéine A dans le contrôle de la myélinisation adaptative (myélinisation adulte) et de la remyélinisation permettra de mettre en avant de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de stimuler la myélinisation et sa réparation.
Procédures
Pour obtenir les souris porteuses du génotype d’intérêt permettant cette étude, nous devons générer des accouplements de souris. Les petits issus de ces croisements seront identifiés génétiquement à un stade juvénile (prélèvement d’un petit bout de queue par une personne compétente une seule fois sur animal vigile en moins de 2 minutes). Cela permettra de sélectionner les bons animaux qui sont porteurs des gènes d’intérêt. L’ensemble des souris génétiquement modifiées, porteuses du génotype d’intérêt seront sujettes à une injection en intrapéritonéal (injection à l’âge adulte sur animal vigile, 60 jours de vie, sur cinq jours consécutifs), cela permettra de supprimer la présence de la protéine A dans les oligodendrocytes de ces souris. Puis, une partie de ces souris sera inclue dans une expérience de sociabilisation (hébergement groupé ou isolé pendant huit semaines, puis à l’issue de ces huit semaines, évaluation de la sociabilisation par un test non invasif de 50 minutes au total). Une autre partie des souris sera sujette à une chirurgie à 90 jours de vie afin de créer une lésion démyélinisante et observer comment l’absence de la protéine A affecte les capacités de la souris à remyéliniser cette lésion. Cette chirurgie sera effectuée une seule fois (une heure au total au maximum), par une personne compétente sur souris anesthésiées et analgésiées avant, pendant et après l’opération. Elles seront suivies de près en postopératoire afin de détecter au plus tôt les signes de souffrance ou d’infection potentielle. Une partie de l’étude sera effectuée sur souris sauvages, non génétiquement modifiées. Ces souris recevront un traitement thérapeutique quotidien par voie orale pendant 6 semaines. L’euthanasie des animaux sera effectuée en fin de période de maintien par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Une légère et brève douleur au moment du prélèvement de peau sur l’extrémité de la queue (1mm) pour le génotypage au stade juvénile de la souris. Un stress peut être observé chez les souris transgéniques suite à la contention et à l’injection d’une molécule en intrapéritonéal (but de ce traitement : supprimer l’expression de la protéine A dans les cellules d’intérêt. Mais les principales nuisances attendues sont liées à l’acte chirurgical lors de l’étude de la remyélinisation : injection au niveau de la moelle épinière sous anesthésie générale de la souris (risques d’hypothermie, douleur au point d’injection, hématome, risque anesthésique, saignement, infections). De plus, il est possible que les animaux soient stressés suite à l’étude en condition d’isolement. Enfin, de façon générale, les tests comportementaux peuvent représenter un stress pour les animaux : nouvel environnement et manipulation.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés : -Soit avant le sevrage puisqu’ils ne seront pas porteurs du génotype d’intérêt -Soit à des fins expérimentales pour une étude structurelle de la myéline -Soit s’ils sont devenus trop vieux pur être utilisés comme reproducteurs
Remplacement
La myéline est une structure en trois dimensions : une extension de la membrane des oligodendrocytes qui s’enroule autour d’un axone électriquement actif. Suivant le principe de remplacement, nous avons déjà étudié en détail le rôle de la protéine A de manière in vitro (sur des cellules). Cependant, il est essentiel dans le cadre de cette étude, de passer par une étude in vivo (chez la souris) de la mutation afin de pouvoir observer la formation de la myéline impactée par toutes les interactions cellulaires présentes dans le cerveau. D’autant plus que nous voulons étudier le rôle de la protéine A sur la modulation de la myéline à l’âge adulte (myélinisation dite ‘adaptative’, modulée par l’expérience sociale) et sur la remyélinisation. Les interactions sociales et leurs impacts ne peuvent être observées que sur un animal complexe susceptibles d’interagir avec des congénères.
Réduction
Nous optimiserons l’utilisation de nos animaux (2084 souris). Ainsi, le nombre d’animaux utilisés sera limité au strict nécessaire pour obtenir des données statistiquement exploitables. Toutes les expériences seront réalisées sur des mâles et des femelles afin d’évaluer la présence éventuelle d’un sex-ratio. Toutes les quantifications se feront en aveugle. Nous travaillerons en étroite collaboration avec des statisticiens pour définir toutes les tailles d’échantillons et les tests statistiques appropriés (taille des effectifs calculés avec un calcul de puissance, test statistiques fiables pour une bonne interprétation des résultats).
Raffinement
L’animalerie est agréée, les conditions d’hébergement (température, hygrométrie, éclairage et espace) et les conditions d’enrichissement de l’environnement (coton, bâtonnet à ronger), d’alimentation et soins quand nécessaires seront contrôlés. Une période d’habituation à la manipulation par l’expérimentateur d’une semaine sera effectuée avant toute procédure expérimentale pour ne pas stresser l’animal. Les animaux seront suivis régulièrement (deux fois par semaine de façon générale, tous les jours pendant une semaine après la chirurgie) et de manière adaptée aux différentes procédures par notre équipe et la zootechnie, ainsi que par notre vétérinaire. Pour la condition expérimentale d’animal hébergé de façon isolée, un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage (papier kraft, maison en carton). Les injections de cette étude seront toutes faites par des personnes compétences. La lésion de démyélinisation (chirurgie) sera pratiquée sous analgésie et anesthésie, et reste localisée pour éviter les conséquences d’une démyélinisation plus globale. Des points limites sont mis en place et respecter pour éviter toute souffrance, sans décision ou prise en charge rapide des animaux.
Choix des espèces
De toute évidence, l’étude de la myéline nécessite l’utilisation de modèles animaux vertébrés. En effet, seuls les systèmes nerveux de vertébrés sont myélinisés. De plus, puisque nous étudions une voie moléculaire spécifique dans l’établissement de la myélinisation avec une visée thérapeutique future, il est indispensable que le modèle que nous choisissions ait une forte homologie de séquence génétique de cette dite voie moléculaire avec l’Homme. Le modèle souris présente plusieurs avantages pour notre étude : c’est un vertébré dont les gènes codant la voie étudiée présentent une forte homologie de séquence avec ceux de l’Homme. La plasticité de la myéline, similaire à celle retrouvée chez l’Homme, a été bien établie chez la souris, ce qui nous permet de mener à bien nos expériences de plasticité et de sauvetage de la myéline à l’âge adulte. Les souris entretiennent de fortes interactions sociales (animal grégaire) qui vont être le étudiées ici (hébergement isolé versus hébergement en groupe). Pour la génération de lignée de souris transgénique, les souris seront mises en accouplement à partir de 8 semaines (âge de maturité sexuelle). Pour l’étude sur la myélinisation adaptative, nous induirons la délétion de l’expression de la protéine A chez le jeune adulte (à 60 jours de vie) et étudierons les conséquences de cette délétion plus tard, à 120 jours de vie. Ainsi, nous pourrons étudier comment l’absence de la protéine A influence le cerveau déjà formé (le cerveau adulte). Pour l’étude de la remyélinisation, nous induirons la délétion de l’expression de la protéine A (ou bien nous modulerons l’activité de cette protéine) chez le jeune adulte (à 60 jours de vie. Nous effectuerons la lésion démyélinisante un mois après (donc à 90 jours de vie). L’étude des animaux sera ensuite effectuée à quatre stades post-chirurgie (4, 7, 14 et 30 jours après la lésion démyélinisante), afin d’observer successivement l’évolution des différents stades mis en jeu dans la remyélinisation.
Création et caractérisation d’un modèle de souris pour l’étude d’un syndrome de retard mental d’origine génétique EU2/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 064 souris vont être utilisées, toutes tuées, dont 322 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La création de la lignée passe par deux générations d'accouplements, une biopsie d'identification sur chaque animal, une chirurgie de trente minutes sur quatorze femelles gestantes, et une chirurgie sans réveil sur jusqu'à 140 souriceaux pour préparer des tissus. Le porteur reconnaît ne pas savoir quelles atteintes attendre puisque la lignée n'existe pas encore, et avance comme hypothèses la mortalité embryonnaire ou périnatale, le retard de croissance et l'hydrocéphalie, l'électroporation des embryons pouvant à elle seule en tuer un dixième. Aucun calcul de puissance n'était possible pour la même raison, et le porteur conclut qu'un modèle murin est "nécessaire" pour compléter des expériences déjà menées en culture cellulaire et in silico.
Objectifs
Les troubles du neurodéveloppement (TND) concernent près d’une naissance sur 10 dans les pays développés. Ils constituent un groupe hétérogène d’atteintes du développement du système nerveux qui regroupe des maladies souvent invalidantes et avec peu de perspectives thérapeutiques, tels que des syndromes de retard mental, ou des déficits musculo-squelettiques. Les TNDs sont très fortement influencées par la génétique, mais plusieurs centaines de gènes de prédisposition ont été identifiés, ce qui rend indispensable la compréhension de la fonction de ces gènes pour trouver les dénominateurs communs expliquant la symptomatologie et les pistes thérapeutiques potentielles. Ce projet a pour finalité de créer des modèles de souris pour étudier une maladie causée par la mutation d'un gène qui a jusqu'à présent quasi exclusivement été étudié dans le contexte de son rôle dans la progression tumorale. Les fonctions de ce gène dans le développement du système nerveux et musculaire sont pour l’heure quasiment inconnues. L'objectif est de caractériser les fonctions de ce gène dans les neurones et les muscles pour comprendre la pathologie humaine. Pour cela, en collaboration avec une équipe américaine, nous allons générer une lignée de souris dite KO spécifique (uniquement dans les neurones) et caractériser cette lignée. Nous utiliserons également des souris pour des études cellulaires et pour des procédures chirurgicales pour étudier la connectivité cérébrale. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (EU) où auront lieu respectivement l'élevage et la production des animaux, et le prélèvement de tissus.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les causes du syndrome de retard mental en identifiant les fonctions du gène d'intérêt de l'étude, fonctions qui sont pour l’instant inconnues. Ces données permettront de mieux comprendre l’évolution de la maladie et d’améliorer le conseil génétique fourni aux familles de patients. Grâce au contact avec une association de patients, les connaissances issues de ce projet bénéficieront directement aux patients. De façon plus large, ce projet permettra de mieux comprendre les bases du développement cérébral et fournira des hypothèses pour d’autres maladies (retard mental etc...) causées par des mutations dans des gènes proches du gène d'intérêt.
Procédures
Le projet comprend la création d'une nouvelle lignée qui implique des accouplements pour créer les animaux (2 générations), puis des accouplements réguliers pour produire les animaux (nombre variable, étalé sur la durée du projet). Les animaux seront manipulés quotidiennement pour des observations non invasives et pesées. Des animaux seront mis à mort pour du prélèvement de tissus. Des animaux (14 femelles au maximum) subiront une procédure chirurgicale, d'une durée de 30 minutes, une fois pendant le projet. Des animaux (140 souriceaux au maximum) subiront une procédure chirurgicale sans réveil pour la préparation de tissus pour l'histologie.
Impact sur les animaux
S’agissant de la création d’une nouvelle lignée, les nuisances sont inconnues. Sur la base de ce qui est connu du syndrome de retard mental chez l’homme, nous pouvons émettre l’hypothèse que les nuisances ci-après peuvent survenir : mortalité embryonnaire ou périnatale, retard de croissance, hydrocéphalie. Ces nuisances peuvent entraîner du stress lié à la compétition avec le reste de la portée pour l’accès à la nourriture. Les animaux subiront une biopsie dans le but de leur identification, qui entraîne une douleur temporaire. Les animaux seront manipulés régulièrement pour le suivi de la lignée et les accouplements, entraînant un stress léger. Des femelles gestantes subiront une procédure chirurgicale avec réveil, sous anesthésie, une seule fois, d’une durée de 30 minutes. Dans de rares cas, nous pouvons observer une dystocie. Les infections sont en théorie possibles, mais en pratique jamais observées suite au respect des règles d’asepsie. La chirurgie peut entraîner une mortalité fœtale (estimée à 10 pour cent maximum des embryons électroporés). Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (EU). Dans l'EU1, les animaux seront produits et manipulés. Au moment de la mise à mort, les animaux seront transférés dans l'EU2, dont les locaux sont situés à un autre étage du même bâtiment (durée de transport 2 minutes).
Devenir
Les animaux sont des souris génétiquement modifiées et nous prédisons un phénotype dommageable. Nous ne pouvons donc pas replacer les animaux à l'issue de l'étude.
Remplacement
Ce projet est consécutif à des expériences in vitro du gène d'intérêt qui ont démontré son importance pour le développement des neurones. Les données in silico (études transcriptomiques) et les données de la littérature ont été croisées avec les données de patients. Il est à présent nécessaire de confirmer les fonctions de ce gène dans le développement cérébral en générant un modèle animal, qui permettra de reproduire les atteintes retrouvées chez les patients souffrant du syndrome. Ce modèle permettra à terme de réaliser des expériences qui ne peuvent pas être reproduites in vitro telles que des tests des fonctions cognitives ou du comportement social. Par ailleurs, l’architecture cérébrale (développement et connectivité des neurones corticaux) ne peut pas être complètement reproduite à l’aide des cultures d’organoides, qui ne permettent notamment pas d’étudier la connectivité cérébrale. Par conséquent, la création d’un modèle murin est nécessaire pour compléter les études in vitro déjà réalisées.
Réduction
Ce projet vise à créer une nouvelle lignée, par conséquent il n'est pas possible de savoir à quoi s'attendre et de faire un test de puissance statistique préalable. Pour calculer un nombre d’animaux à inclure dans le projet, des hypothèses réalistes ont été émises sur la base notamment de l'expérience préalable avec d’autres lignées. Les calculs ont été optimisés pour utiliser le moins d'animaux possibles et maximiser les informations revueillies. Selon les données collectées, nous comparerons des proportions (génotypes), ou nous comparerons des valeurs moyennes (poids en fonction de l’âge), à l'aide de tests statistiques adaptés. Concernant la génération d’animaux en vue du prélèvement de tissus, le nombre d’animaux a été calculé afin d’avoir une quantité suffisante de tissus pour conduire les expériences tout au long du projet, sans avoir d’animaux surnuméraires. Pour certaines expériences, les souriceaux seront sélectionnés par l’observation transcranienne de la fluorescence au moyen d’une lampe LED. Ceci permettra de détecter dès la naissance un éventuel problème expérimental et de ne pas réaliser de procédure inutilement sur un souriceau qui ne sera pas exploitable pour les résultats de l’étude.
Raffinement
Ce projet repose sur des procédures maitrisées par les chercheurs impliqués. Les points limites sont basés sur les phénotypes attendus d’après la pathologie chez les patients, afin de prédire au mieux et le plus tôt possible des manifestations conduisant à la mise en place de traitements ou à l’arrêt de la procédure. L’approche chirurgicale sera réalisée selon les standards de la médecine vétérinaire (asepsie, anesthésie et analgésie). Un soin particulier sera porté à la récupération postopératoire, et à la limitation du stress autour de la période de la naissance. Pour limiter la perte de données et tirer plus d’informations par animal, l’équipe de recherche utilise des outils d’imagerie et d’analyse qui ont été optimisés afin d’obtenir un maximum d’information concernant les patterns de connectivité corticale. Le transport des souriceaux entre établissements utilisateurs est rapide puisque les deux sont situés dans le même bâtiment. Les animaux seront placés dans une cage de transport et mis dans un sac opaque, amenés dans l’EU2 (transport 2 minutes), où la mise à mort sera réalisée immédiatement afin de limiter le stress lié à un nouvel environnement. Les animaux seront traités individuellement, pendant que le reste de la portée sera isolée dans un portoir ventilé qui procure une isolation visuelle, acoustique et olfactive.
Choix des espèces
La souris présente les avantages suivants : - un cerveau comparable au cerveau humain, notamment en ce qui concerne l’organisation du cortex cérébral, - un développement embryonnaire rapide (21 jours) et un développement postnatal court (21 jours pour des circuits neuronaux « matures »), - Une petite taille adaptée à des préparations histologiques, - la possibilité de modifier l’expression de gènes par croisement de lignées transgéniques déjà existantes. Les animaux seront sélectionnés à l’âge de maturité sexuelle (6 semaines chez les mâles, 7 semaines chez les femelles) et utilisés en reproduction préférentiellement jusqu’à l’âge de 6 mois, après quoi la fertilité diminue et les animaux seront réformés. En cas de besoin les animaux pourront être mis en reproduction après 6 mois, en l’absence de reproducteurs plus jeunes disponibles. Les tissus seront prélevés à des âges standards dans la communauté scientifique, et selon les phénotypes exprimés : jour embryonnaire E15.5 , jour postnatal P1, jour postnatal P10-P12, au moment du sevrage , et au jour P45 ou au-delà. Pour les expériences de culture de cellules musculaires, les animaux seront utilisés entre le jour postnatal P4 et P7.
Caractérisation d’une protéine par imagerie par résonance magnétique (IRM) dans un modèle murin de sepsis.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Trois séances d'imagerie d'environ une heure chacune, anesthésie comprise, et quatre prises de sang dans la veine de la queue avec un risque de saignement, d'infection ou de nécrose des tissus : 63 rats vont être utilisés, tous tués pour prélever organes et sang. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Une injection unique de lipopolysaccharide dans l'abdomen déclenche une inflammation généralisée qui reproduit un sepsis, avec perte de poids, baisse de mobilité et réduction des interactions sociales, pour tester si une protéine protège la barrière entre le sang et le cerveau. Le porteur retient le rat parce que c'est l'espèce déjà utilisée sur ce modèle et parce que sa taille donne de meilleures images que la souris, et situe un éventuel premier essai chez l'être humain dans les cinq prochaines années.
Objectifs
Le sepsis est une réaction inflammatoire exagérée qui force le corps à s’attaquer à ses propres tissus et organes. Il peut se produire en réponse de n’importe quelle infection, que ce soit par la présence d’une bactérie, d’un virus ou d’un parasite dans le corps. La forme la plus grave est le choc septique qui est une cause fréquente de décès. Cette inflammation entraîne des problèmes dans tout le corps, jusqu’à la baisse de la pression sanguine qui peut causer des défaillances d'organes. Si cette défaillance atteint le cerveau et les vaisseaux sanguins qui l’alimentent il peut y avoir des conséquences graves pour les patients, en accélérant l'apparition de problèmes de mémoire à long terme. Si l’inflammation reste excessive et continue dans le temps, elle va endommager la barrière qui sépare le sang et le cerveau entraînant un gonflement du cerveau et l'activation de certaines cellules immunitaires qui vont accentuer l'inflammation au niveau du cerveau. De plus, il peut y avoir des problèmes avec la circulation sanguine et provoquer des saignements dans le cerveau. Pour traiter le choc septique, on utilise des antibiotiques et on traite l'infection initiale. On s'assure aussi que la pression sanguine reste normale pour que les organes fonctionnent de manière normale. Actuellement, il n'y a pas de traitement spécifique pour traiter les problèmes qui touchent les vaisseaux altérés par cette maladie, ni l'inflammation du cerveau. Notre équipe de recherche étudie une protéine qui pourrait aider à conserver la fonction des vaisseaux pendant l'inflammation et empêcher les problèmes qu’elle provoque. Pour cela, nous utilisons un modèle chez le rat chez qui nous allons injecter une substance appelée Lipopolysaccharide (LPS) pour provoquer l'inflammation au niveau du cerveau. Nous allons faire des images IRM du cerveau de ces animaux pour voir si la protéine d’intérêt peut empêcher les problèmes liés à l'inflammation dans le cerveau, en mesurant la diminution du gonflement du cerveau et de la circulation sanguine cérébrale.
Bénéfices attendus
Cette étude vise à examiner comment la protéine agit dans la réponse de la barrière entre le sang et le cerveau en cas d'inflammation dans tout le corps. Avant de pouvoir envisager de tester cette protéine chez l'homme, il est important de vérifier son efficacité dans le traitement de l'infection grave chez le rat. Les résultats attendus aideront à mieux comprendre comment traiter ce genre d'inflammation chez les humains et à réduire le risque de développer des troubles de la mémoire graves. Il est possible qu'une première phase d'essais chez l'homme puisse être envisagée dans les cinq prochaines années.
Procédures
L’ensemble des gestes réalisés sur les animaux, le seront par des personnes formés à la manipulation expérimentale du petit animal. Dans cette étude, nous avons besoin d'endormir les animaux pour les examens d'imagerie. Les animaux seront imagés 3 fois au cours de ce projet. Un protocole d’imagerie dure environ 1h de l’anesthésie au placement de l’animal dans sa cage de réveil. Pour induire l’anesthésie générale, nous injecterons au niveau abdominal un produit dont on ajustera la concentration en fonction du poids de l’animal. Après 5 minutes et confirmation de l'anesthésie générale, un prélèvement de sang sera effectué au niveau de la veine de la queue, ce geste expérimental prend 2 à 3 minutes. Nous allons mesurer dans ce prélèvement les différentes protéines impactées par la protéine d’intérêt pour voir si elle a bien effet. Ce prélèvement sera réalisé 3 fois au cours de ce projet. Un 4ème prélèvement sera effectué, lors de la dernière étape du projet, toujours sous anesthésie générale. La mise en place du modèle expérimental est réalisée par une injection unique de Lipopolysaccharide au niveau abdominal.
Impact sur les animaux
Nous utiliserons des injections dans la cavité abdominale pour administrer la protéine d’intérêt, le produit pour déclencher la maladie inflammatoire ainsi que pour le mélange pour l’anesthésie. Lors de ces injections l’animal est tenu dans les mains de l’opérateur avec les gestes préconisés pour limiter le stress et la douleur de l’animal lors de l’injection. L'injection du produit d'anesthésie peut être répétée avec une concentration plus faible pendant l'examen d'imagerie dans le cas où l'animal commence à se réveiller. Le LPS est une substance qui provoque une réaction inflammatoire généralisée semblable à celle observée dans le sepsis et peut entraîner à court terme une perte de poids, une réduction de la mobilité et des interactions sociales chez les animaux. Le fait de répéter les prélèvements sanguins au niveau de la queue peut entrainer soit des saignements, soit une infection qui peut aller jusqu’à la nécrose c’est-à-dire à la mort des tissus.
Devenir
L'ensemble des animaux inclus dans ce projet seront euthanasiés pour effectuer des prélèvements d'organes et de sang. Ces prélèvements seront utilisés pour une analyse tissulaire au niveau microscopique afin d'évaluer le rôle protecteur de la protéine. Plus particulièrement pour les prélèvements de cerveau, nous allons les comparer aux données obtenues par imagerie.
Remplacement
L'inflammation du cerveau est un phénomène complexe résultant de l'interaction de différents types cellulaires et la barrière qui sépare le sang du cerveau. Cette interaction est encore partiellement connue. L'approche avec des modèles théoriques ou de remplacement ne permet pas de rendre compte de façon fiable de ces différentes interactions. Le modèle animal utilisé sera celui le plus validé à l'heure actuelle pour l'étude de l'inflammation du cerveau.
Réduction
Le nombre d'animaux pour ce projet été déterminé à l’aide d’outils mathématiques spécialisés pour permettre une analyse cohérente et juste des données obtenues. De plus, comme nous allons utiliser les animaux dans les différentes conditions expérimentales, les données obtenues chez les animaux en bonne santé seront comparées à celles récoltés sur ces mêmes animaux mais après le déclenchement de l’inflammation par le LPS. Ceci va nous permettre d’obtenir des résultats dans les différentes conditions expérimentales avec moins d’animaux en plus de la réutilisation des animaux utilisés pour l'étude pilote. L’étude pilote va permettre d'ajuster le nombre d'animaux en fonction de la variabilité qui peut exister entre les animaux. En effet, s’il existe des différences ou non dans les mesures réalisées dans le groupe d’animaux sains, nous saurons s’il est nécessaire d’ajuster le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats cohérents et fiables. De plus, les données d'imagerie seront analysées au fur et à mesure, si les résultats sont satisfaisants avec moins d'animaux que prévu, les protocoles d'imagerie seront arrêtés afin de réduire le nombre d'animaux utilisés sur la totalité du projet.
Raffinement
Une période minimale d'acclimation de 7 jours à la réception des animaux du fournisseur sera respectée. Le milieu des cages sera enrichi et le nombre d'individus par cage sera adapté à leur taille mais aucun animal ne sera laissé seul en cage. La profondeur de l’anesthésie est vérifiée par l’absence de mouvement par pression sur la patte. Une évaluation en temps réel de l'anesthésie sera réalisée pendant les protocoles d’imagerie. Si la fonction respiratoire se dégrade et se maintient dégradée, le protocole d'imagerie sera interrompu pour permettre une surveillance accrue de l'animal dans une cage de réveil dédiée placée sous une lampe chauffante. Pour garantir un maintien de la température corporelle pendant le protocole d'imagerie, l’animal est réchauffé pendant tout le protocole d’imagerie. Pour les animaux qui ne sont pas euthanasiés à l'issue du protocole d'imagerie, la phase de réveil sera réalisée sous lampe chauffante puis remplacement dans leur cage d'origine. Les animaux seront observés quotidiennement par le personnel de l’animalerie et les points limites seront étudiés par les responsables de projet 2 fois par semaine pour s’assurer du bien-être des animaux et qu’ils soient traités avec le plus grand respect et le moins de douleurs possible. Si la mise en place d’un traitement anti-douleur ne permet de pas d’améliorer le bien-être animal, le protocole d’euthanasié sera réalisé.
Choix des espèces
Nous utiliserons des rats pour cette étude car c'est l'espèce utilisée dans les études sur ce modèle pathologique. Le rat est une espèce couramment utilisée pour les travaux d'expertise par imagerie chez le petit animal et les outils utilisés sont dédiés à cette espèce. De plus, c’est une espèce de plus grande taille par rapport à la souris ce qui permet d’avoir une qualité d’image supérieure avec plus de détails et précision pour les expérimentations d’imagerie préclinique. Nous utiliserons des animaux âgés de 10 à 12 semaines pesant entre 400 et 600g. Le stade de développement des animaux correspond à de jeunes adultes afin de mimer au mieux les conditions pathologiques retrouvées chez l'Homme.
Évaluation thérapeutique du blocage des récepteurs de chimiokines sur la douleur cornéenne chronique dans un modèle murin.
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
La cornée abrasée sous anesthésie puis exposée à des molécules inflammatoires, ou les glandes lacrymales retirées en quinze minutes de chirurgie : 1 600 souris mâles subissent l'un de ces deux modèles de douleur oculaire. Toutes sont tuées pour prélèvements et analyses post-mortem, 1 000 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 600 un niveau léger. Le porteur attend les mêmes sensations que chez les patients humains, picotements, démangeaisons, brûlures, impression de corps étranger et sensibilité accrue à la lumière, et fait passer aux souris des tests de sensibilité cornéenne sur animal éveillé, une à quatre fois selon le modèle. L'effectif de 1 600 est présenté comme le fruit d'un calcul de puissance, sans que le nombre de groupes ni la répartition entre les deux modèles ne soient donnés, et rien n'indique combien de souris subissent l'ablation des glandes lacrymales.
Objectifs
La douleur oculaire est un symptôme d'alerte en réaction à une inflammation ou un traumatisme, affectant particulièrement la cornée, la sclérotique et la conjonctive. La douleur oculaire est remarquable par la variabilité de l'intensité qu'elle peut générer, allant d'une simple gêne oculaire à une douleur intense, voire insupportable. les douleurs chroniques de la surface oculaire entraînent, au-delà de la souffrance exprimée par les patients, une réelle altération de leur qualité de vie puisqu'on estime que près de 60 pour cent des patients sont gênés dans leurs activités quotidiennes. Diverses maladies inflammatoires ou infectieuses, des troubles neurologiques et des interventions chirurgicales oculaires peuvent être la cause sous-jacente de douleur cornéenne chronique. Dans les cas pathologiques graves, les lésions des nerfs cornéens peuvent entraîner une sensibilité accrue à la lumière et/ou des douleurs, une altération des fonctions physiques et sociales, une privation de sommeil, une anxiété et une dépression. Le poids des maladies de la surface oculaire, associant des symptômes douloureux intenses, des comorbidités émotionnelles et des altérations psychosociales, nous a conduit à en étudier les mécanismes sous-jacents. Une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués est un des enjeux cruciaux pour le développement de nouvelles stratégies de prise en charge et thérapeutiques efficaces pour soulager la douleur oculaire chronique.
Bénéfices attendus
Les douleurs chroniques de la surface oculaire entraînent, au-delà de la souffrance exprimée par les patients, une réelle altération de leur qualité de vie puisqu'on estime que près de 60 pour cent des patients sont gênés dans leurs activités quotidiennes. La prise en charge de la douleur chronique oculaire est actuellement un enjeu majeur alors que les traitements restent peu efficaces. Le bénéfice de ce projet est d’aboutir à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués, principalement inflammatoires et neurogènes, qui sont des enjeux cruciaux pour le développement de stratégies de prise en charge et thérapeutiques efficaces pour soulager la douleur oculaire.
Procédures
Deux modèles seront mis en œuvre dans le cadre de ce projet. Le modèle de douleur inflammatoire est induit par l’abrasion de la cornée effectuée sous anesthésie et analgésie (1 fois -10 minutes) associé à l’instillation de molécule inflammatoires le jour de l’abrasion lors de la même anesthésie (quelques secondes) et une seconde fois 3 jours après sur animal vigile par simple contention (quelques secondes). Le modèle de sécheresse oculaire est induit par exérèse des glandes lacrymales. Cette chirurgie est effectuée sous anesthésie et analgésie et dure au maximum 15 minutes. Ces modèles reproduisant le contexte de la maladie étudiée sont réalisés sous anesthésie et analgésie dans le respect des normes et recommandations concernant le bien-être animal et l’éthique en vigueur Dans toutes les procédures, les animaux seront soumis à des tests de sensibilité cornéenne, d’imagerie de la cornée, avant, durant et après la mise en place des modèles mimant ces douleurs. Ces tests ne durent qu’entre 1 à 5 minutes. Ils seront réalisés 2 fois chez les souris modèles de douleur inflammatoire, 4 fois chez les souris modèles de sécheresse oculaire. - Test de sensibilité cornéenne : animal vigile (pas d’anesthésie), durée du test : 1 minutes/session - Imagerie de la cornée par biomicroscopie : animal anesthésié, 1 injection d’anesthésique et le test dure 3 minutes. - Imagerie de la cornée par imagerie confocale in vivo : animal anesthésié, durée du test : 5 minutes. Les examens ophtalmologiques se feront à l’aide de techniques non invasives (lampe à fente, biomicroscope). Ces examens sont réalisés chez l’Homme par un ophtalmologiste sous anesthésie locale et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Le test de la sensibilité cornéenne se fera chez l’animal vigile contrairement aux études d’imagerie de la cornée qui nécessitent une immobilisation complète de l’animal et qui seront alors pratiqués sous anesthésie générale. Toutes les procédures comprennent une euthanasie qui sera réalisé selon une méthode réglementaire effectuée sous anesthésie générale et analgésie en vue des différents prélèvements pour analyses.
Impact sur les animaux
Des contentions de courtes durées et les injections sur animal vigile nécessaires aux anesthésies pourront être sources de stress ou d’inconfort pour l’animal. Les nuisances attendues dans les modèles de sécheresse oculaire sont celles observées chez l’Homme à savoir des picotements, des démangeaisons, des sensations de brulure, de corps étrangers dans l’œil, une sensibilité accrue à la lumière. L'anesthésie durant la chirurgie peut entrainer une détresse respiratoire ou cardiaque, une hypothermie. Les tests pratiqués peuvent engendrer une gêne transitoire de courte durée comme on peut le constater chez l’Homme
Devenir
Des prélèvements et analyses post-mortem sont nécessaires ce qui implique l’euthanasie des animaux à la fin de chaque procédure.
Remplacement
À l’heure actuelle, ce projet nécessite l’utilisation d’animaux car aucune alternative in vitro ne peut mimer la pathologie de sécheresse et douleur oculaire qui lui est liée. La complexité et l’interaction du circuit mis en jeu (cornée, ganglions trigéminés et cerveau) et activité du système immunitaire inné ne peuvent également être étudiés et remplacés par un modèle vitro. Bien que les questions soulevées par ce projet visent à mieux comprendre les mécanismes physiologiques mis en jeu dans cette pathologie chez l’Homme, il est d’abord nécessaire d’élucider ces points clés à travers l’utilisation d’un modèle rongeur. De plus, une veille bibliographique réalisée confirme qu’à l’heure actuelle, aucun model in silico n’existe pour répondre à ces questions.
Réduction
Nous utiliserons au maximum 1600 animaux dans ce projet. Afin de respecter la règle de réduction, notre étude portera sur plusieurs structures (cornée, ganglion trigéminal, cerveaux,) de chaque animal. Nous utiliserons un nombre limité de souris et de groupes tout en gardant la significativité des résultats via une analyse statistique adaptée. Ces effectifs ont été établis grâce à une calcul de puissance statistique.
Raffinement
Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront reçus une semaine avant le début des expérimentations. L’hébergement des animaux est effectué en confinement adapté à la stabulation de lignés de souris. Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux : présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compacté, tube en carton) et maintien des animaux en groupe de 5 congénères afin d’éviter le stress de l’isolement. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. La température de la zone d’hébergement est maintenue à température règlementaire et suit un cycle d’éclairage non inversé 12h jour/12h nuit. Les animaux seront observés et manipulés quotidiennement afin de minimiser le stress et la douleur qui seront évalués à l’aide de points limites validés par le comité local du bien-être animal en concertation avec les responsables de l’animalerie. Toute observation anormale sera notée dans un tableau des points limites et nous suivrons l’échelle décisionnelle que nous avons définie. L’application de cette échelle permettra de modifier la procédure en cours avec l’administration d’un traitement antalgique, et/ou de décaler dans le temps les actes prévus par la suite ou enfin d'euthanasier l’animal en dernier recours. Pour éviter toute souffrance les procédures de chirurgie se feront sous anesthésie générale associée à un protocole analgésique en pré-, per- et post-opératoire. Aucun acte ne sera entrepris avant que l’animal ne soit stabilisé pour ces différentes constantes. Les tests d’imageries qui peuvent induire un stress et nécessitent que l’animal soit immobile seront réalisés sous anesthésie générale légère.
Choix des espèces
Le développement de modèles précliniques chez la souris est hautement reconnu et utilisé en routine pour la recherche portant sur la douleur oculaire. La souris de laboratoire est l'animal de choix car (1) elle possède les structures oculaires et cérébrales adéquates, (2) nous avons accès à tous les outils génétiques requis. Ce projet nécessite l’utilisation de souris mâles adultes sauvages C57BL/6J, de souris mâles adultes issus des lignées transgéniques. Ces animaux arriveront à l’animalerie à l’âge de 7 semaines (poids environs 20-25g) afin de respecter une semaine d’acclimatation et seront utilisés à l’âge de 8 semaines (âge de la maturité sexuel). Cela permettra de travailler sur des souris adultes tout en évitant des biais liés au changement physiologique de l’animal vieillissant. En effet l’ensemble des procédures de ce projet durant entre 3 à 11 semaines maximum. Les souris auront donc au maximum 19 semaines en sortie de procédure.
Etude de l’altération liée à l’âge du récepteur aux œstrogènes alpha a, conséquences pour la protection artérielle féminine.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leurs tissus, 720 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 120 sous anesthésie sans réveil. 240 femelles sont ovariectomisées à trois, douze ou vingt-deux mois, opération de vingt-cinq minutes, puis gardées deux semaines avant la mise à mort. 360 femelles et 180 mâles reçoivent une capsule à libération prolongée posée sous la peau, et 180 femelles y ajoutent une pompe osmotique qui les rend hypertendues, urinant tant que les cages doivent être changées plus souvent, avec une atteinte possible du cœur, des reins, des rétines et du cerveau. Le porteur écrit qu'aucun système de culture cellulaire n'a reproduit les variations hormonales de la ménopause et qu'il n'y a donc "pas d'autre alternative" que l'animal vivant, pour un projet qui vise à tester l'estetrol comme traitement hormonal.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de décès chez les femmes après la ménopause. Le vieillissement joue un rôle majeur dans les altérations des artères, entraînant un risque accru de maladies cardiovasculaires chez les hommes comme chez les femmes. Les différences des facteurs de risque de maladies cardiovasculaires entre les hommes et les femmes sont largement attribuées aux œstrogènes. La ménopause est marquée par la fin définitive des cycles menstruels et l'arrêt de la production d'œstrogènes par les ovaires. Cependant, les rôles respectifs du vieillissement vasculaire et de la diminution des hormones sexuelles après la ménopause sur le risque cardiovasculaire sont controversés. Les œstrogènes classiques confèrent une protection contre les maladies cardiovasculaires s’ils sont débutés à un stade précoce de la ménopause chez les femmes avant 60 ans, alors qu’ils sont délétères s’ils sont administrés après 70 ans. L’estetrol, une hormone naturellement produite durant la grossesse est actuellement évaluée chez l’Homme, pour le traitement hormonal de la ménopause. Ce projet a pour objectifs d’établir l'effet du vieillissement sur la réponse à ces hormones notamment sur la protection artérielle. Cette recherche revêt une importance particulière dans le contexte de la santé cardiovasculaire féminine, ouvrant la voie à de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
Compte tenu du vieillissement rapide de la population, les femmes passent plus de 30 % de leur vie en post-ménopause. La ménopause est associée à un risque accru d'ostéoporose ainsi que de maladies cardiovasculaires et métaboliques. Le traitement hormonal de la ménopause est très efficace pour réduire ces symptômes. Cependant, les résultats négatifs d’une étude américaine ont participé à de nouvelles orientations concernant la prescription du traitement hormonal de la ménopause, par les médecins. De nouvelles études ont montré que l'utilisation du traitement hormonal de la ménopause chez les femmes plus jeunes ou chez les femmes ménopausées précocement avait un effet bénéfique sur le système cardiovasculaire. L’amélioration du traitement de la ménopause revêt donc une importance majeure pour la santé des femmes. Les principaux objectifs du projet sont : 1) mieux caractériser la perte de protection artérielle avec l'âge. 2) proposer de nouvelles alternatives pour le traitement de la ménopause.
Procédures
240 femelles seront ovariectomisées à 3 mois, 12 mois et 22 mois (60 par groupe d’âge) et 120 femelles de 3 mois, 12 mois, 22 mois (40 par groupe d’âge) seront gardées intactes. Elles seront gardées 2 semaines en stabulation avant d’être sacrifiées pour réaliser des analyses. L’ovariectomie est évaluée à 25 minutes par souris. 180 mâles subiront une pose de capsule à libération prolongée de molécule ou une opération factice, 360 femelles subiront une pose de capsule à libération prolongée de molécule. La pause de la capsule est estimée à 15 minutes. 180 femelles subiront une pose de pompe osmotique en plus de la capsule à libération prolongée ou une opération factice permettant de mimer les effets inflammatoires dus à l’opération elle-même.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront un très faible stress engendré par la contention. La piqure d’analgésique entrainera une très faible douleur due à la piqûre. Le modèle d’ovariectomie ainsi que la pose de la petite capsule de diffusion de molécules (pellets) ont pour effet attendu une douleur modérée liée aux effets de la chirurgie soulagée par des analgésiques et un stress modéré lié aux manipulations. Tous les animaux seront pesés avant la chirurgie, y compris ceux qui subiront une opération factice. Les animaux seront pesés quotidiennement jusqu’à récupération du poids initial. Le modèle d’hypertension artérielle a pour effet attendu une douleur modérée liée aux effets de la chirurgie soulagée par des analgésiques et un stress modéré lié aux manipulations. Il peut y avoir une atteinte des organes cibles que sont le cœur, les reins, les rétines et le cerveau. Toute manipulation sera réalisée dans un environnement calme, et par un manipulateur qualifié pour limiter la durée de chaque manipulation. La douleur ou l’inconfort de l’animal sera évalué régulièrement jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Devenir
Il est nécessaire de mettre à mettre à mort tous les animaux afin de récupérer les tissus pour analyses.
Remplacement
L’ensemble des effets étudiés étant des effets physiologiques ou pathologiques, il n’y a pas d’autre alternative d’étude que l’utilisation d’animaux vivants. En général, les expériences de remplacement ne peuvent pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu au cours des évènements pathologiques tels que le vieillissement, la menopause ou encore l’hypertension. Aucun système de culture cellulaire n'a pu reproduire les variations hormonales de la menopause. Il n’est donc pas possible de mettre en place des approches in vitro pour réaliser ce projet. C'est pourquoi nous aurons recours au modèle animal, en choisissant la souris comme modèle classique de mammifère, et comme modèle expérimental établi, avec de nombreux outils génétiques disponibles, un temps de génération court et des portées de grande taille.
Réduction
Réduction : le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes (test statistique ANOVA à deux facteurs). Le logiciel G power nous a permi d'établir un nombre de 10 animaux par groupe. Si les conclusions sont pertinentes avec 8 animaux par groupe nous cloturerons le protocole. Nous prélevons un maximum d'organes d'intérêt par animal afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Nous prendrons toutes les dispositions nécessaires pour limiter au maximum les nuisances, attendues ou non, liées aux manipulations des animaux et procédures de l’étude. Pour limiter les nuisances et effets indésirables liées à l’ovariectomie, au traitement par pellets ainsi qu’à l’hypertension, nous reproduirons un protocole d’étude déjà réalisé et décrit dans plusieurs études concernant ces modèles chez des souris. Pour réduire le stress des animaux lié aux manipulations, une période d’acclimatation de 7 jours est prévue avant la première procédure. Toute manipulation sera réalisée dans un environnement calme, et par un manipulateur qualifié pour limiter la durée de chaque manipulation. Les animaux seront élevés en cages enrichies et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Les souris hypertendues urinent beaucoup. Pour cette raison, le nombre d'animaux par cage est limité à 3 et les cages sont changées plus fréquemment et dès que nécessaire. Un traitement antalgique sera administré à l’animal 10 minutes avant l’anesthésie et jusqu’à deux jours après l’opération, en fonction de la douleur observée. Les chirurgies seront préférentiellement réalisées le matin afin d’assurer le suivi tout au long de la journée de l’opération. La douleur ou l’inconfort de l’animal sera évalué 2 fois par jour, pendant les deux jours suivants les procédures opératoires. L’observation sera ensuite quotidienne, week-end compris, avec l’aide du personnel de l’animalerie. Par ailleurs, si des signes comportementaux indiquent une douleur modérée, un traitement antalgique sera administré à une dose plus ou moins importante selon les signes cliniques observés (protocole de gestion de la douleur détaillé en annexe). En cas de signe clinique indiquant une douleur sévère définissant un point limite, la souris sera mise à mort pour éviter toute prolongation de sa souffrance.
Choix des espèces
La souris est le seul modèle permettant à la fois de réaliser des expériences physiologiques et d’utiliser des méthodes de modifications génétiques permettant de comprendre les mécanismes impliqués. De plus, les modèles d’ovariectomie et d'hypertension artérielle utilisés au cours de ce projet ont été établi et validé par la communauté scientifique depuis plusieurs décennies. Des souris adultes âgées de 3, 12 et 22 mois seront utilisées afin d’étudier la perte éventuelle de réponse aux hormones avec l’âge. Des souris âgées de 12 mois sont idéales pour se placer en milieu de vie et mimer les effets de la ménopause.
Génération de truites IRF7-/- (Interferon Regulatory Factor) au moyen de l’édition du génome en vue de développer des vaccins de protection virale chez la truite
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Privées de deux gènes de l'immunité par édition du génome, des truites arc-en-ciel doivent fournir à la filière truiticole des lignées cellulaires capables de multiplier des virus pour fabriquer des vaccins. 1 504 individus vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, et le porteur admet que cette perte d'immunité peut les faire souffrir si une infection se déclare. Quatre femelles matures subissent trois séances de pression abdominale, une par jour, pour en extraire les œufs, puis sont tuées parce que l'élevage de grandes truites coûte cher et que les installations ne permettent pas de les garder ensuite. Mille cinq cents alevins subissent un prélèvement de nageoire sous anesthésie pour génotypage, ceux qui ne portent pas la mutation invalidante sont tués, et 125 homozygotes sont envoyés dans un autre laboratoire où des lignées cellulaires seront établies à partir de leurs cellules.
Objectifs
Ce projet vise à mieux comprendre, en les invalidant par modification structurelle ciblée, le rôle de deux gènes de l'immunité dans la réponse antivirale innée des poissons. Ce projet cherche à constituer un savoir théorique dont nous voulons qu’il conduise à des pratiques innovantes au service de la production piscicole. Un des objectifs pratiques de ce projet est d’isoler, à partir d’animaux n'ayant plus ces deux gènes, des lignées cellulaires tolérantes aux virus, ce qui permettrait leur réplication massive in vitro en vue de la production de vaccins antiviraux dont bénéficierait le cheptel truiticole.
Bénéfices attendus
Notre projet à pour finalité pratique de contribuer à l'éléboration de vaccins antiviraux en créant des lignées cellulaires génétiquement modifiées capables de propager des virus et donc les antigènes viraux nécessaires à la réponse vaccinale. Il conribuera aussi au dévelopement de méthode de diagnostic viral.
Procédures
Les femelles sexuellement matures (4 au total) subiront sous anesthésie des pressions abdominales afin d'extraire des oeufs qui seront injectés avec des ARNs guide et cas9. Chaque femelle subira 3 séances de pressions abdominales : une séance par jour pendant trois jours consécutifs. Une séance de pression abdominales ne dure jamais plus de trente secondes. Pour déterminer le génotype de chaque alevin (primo injectés, de premère et de seconde génération) un seul prélèvement mineur de la nageoire caudale sera effectué sous anesthésie.Cette opération classiquement réalisée lors d'un génotypage dure quelques secondes et l'alevin est immédiatement remis dans un bac de réveil et son comportement est observé.
Impact sur les animaux
Nous ne pouvons pas exclure que des mutations se produisent hors des deux gènes cibles et provoquent un phénotype dommageable sans rapport avec l'immunité. Ce risque est très limité car les sites potentiels de mutagénèse ont été choisis en raison de leur unicité dans le génome lequel est complètement séquencé chez la truite. Par ailleurs, il est possible que la privation des gènes cibles par génie génétique s’accompagne d’une altération de l’immunité qui conduise à une souffrance indésirable des poissons si une pathologie infectieuse se développe, malgré les mesures prophylactiques prises. En ce qui concerne l'anesthésie, elle est très courte : lorsque l'animal manifeste une perte totale d'équilibre et de réaction au toucher, il est rincé à l'eau d'élevage pour limiter la diffusion du produit et le stress physiologique qui pourrait l'accompagner. Le prélèvement d'un fragment de nageoire, qu'implique le génotypage, est réalisé sur un tissu non innervé, il n'y a donc pas de douleur directement liée à ce prélèvement. Enfin, l'isolement transitoire des alevins lors du génotypage peut être aussi un facteur de stress pour ces derniers. Nous limitons sa durée et mettons deux alevins dans un bac qu'une cloison transparente divise en deux compartiments ; de cette manière la perception visuelle d'un congénère est maintenue.
Devenir
les truites femelles sexuellement matures subissant le prélèvement des oeufs pour les fécondations in vitro seront euthanasiées. Ces truites seront euthanasiées parce que le coût d'élévage de truites de grande taille (adulte) est élevé et parce que nos structures d'élevage sont trop modestes pour permettre une stabulation des animaux post-expérimentation. Les alevins issus des oeufs injectés et qui ne présentent pas de mutation invalidante seront également euthanasiés selon les procédures en vigueur. Les animaux F0 et les 4 lignées ( première et deuxième génération) sont gardés seulement le temps prévu pour ce projet ; après quoi ils seront également euthanasiées sauf ~ 125 animaux (homozygotes pour une mutation invalidante) qui seront envoyés dans un autre laboratoire pour l'établissement de lignées cellulaires.
Remplacement
L'étude fonctionnelle "systémique" d'un gène par invalidation ou modification ciblée de celui-ci ne peut se faire que sur des organismes entiers . Un modèle cellulaire ferait par trop abstraction des régulations supracellulaires (interactions cellulaires multiples) et supratissulaires (regulations endocrines...)
Réduction
Réduire : les effectifs (femelles sexuellement matures, embryons injectés et alevins génotypés) sont réduits au maximum pour obtenir 2X 2 lignés F2 distinctes (i.e. présentant des mutations différentes) pour les deux gènes étudiés. Ainsi nous utiliserons seulement 4 femelles ovulantes dont chacune servira à l'obtention de trois pontes successives. De plus nous comptons limiter le pool de sauvegarde des F0 mutants à partir duquel seront générées les lignés F2 à seulement10 individus.
Raffinement
Les animaux seront toujours élevés dans les conditions optimales pour l’espèce (photopériode, qualité d’eau, densité et alimentation). Le prélèvement des oeufs se fera sous anesthésie selon une procédure établie et approuvée. Si des animaux (F0, F1 ou F2) devaient présenter une anomalie morphologique ou comportementale alors ils seraient immédiatement mis à mort selon les procédures d’euthanasie en vigueur. Par ailleurs les animaux modifiés par édition du génome (F0, F1 et F2) sont placés dans un milieu enrichi artificiellement qui mime l'environnement naturel notamment en plaçant des leurres végétaux.
Choix des espèces
La truite arc en ciel (Oncorhynchus mykiss) est une espèce robuste dont l'élevage et la reproduction sont bien maitrisés en pisciculture. L'espèce est grégaire et supporte des densités d'élevage importantes. Il s'agit en outre d'une espèce d'intérêt agronomique représentant 95 % de la production piscicole française. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement diffusée dans la communauté scientifique (environ 50 000 références). Plus spécifiquement notre intention est de produire des antigènes viraux dans des lignées cellulaire en vue de la fabrication de préparations vaccinales. Il va de soi que cette entreprise n'est possible que dans des cellules specifiquement permissives à l'infectivité, donc des cellules de truites. La production des oeufs se fera à partir de femelles (4) sexuellement matures et ovulantes. ces oeufs après fécondation, seront injectés avec les outils moléculaires réalisant les modifications génétiques désirées. Le génotypage se fera sur des alevins dérivant d'oeufs injectés (500), de première génération (500) et de seconde génération (500).
Rôle des vésicules extracellulaires dans le développement du diabète
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
Deux injections intraveineuses à sept jours d'intervalle, huit mesures de pression artérielle de dix minutes, six gouttes de sang prélevées, un capteur de télémétrie implanté sous la peau en vingt minutes, une fibrillation atriale déclenchée, une analyse de composition corporelle, deux prélèvements de tissus sur animal vivant. 288 souris Swiss vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance modéré, 72 d'entre elles vivant seules en cage depuis l'implantation du capteur jusqu'à la fin de l'étude, soit vingt et un jours. Le porteur leur injecte des vésicules extracellulaires prélevées chez des patients diabétiques, pour voir si elles provoquent chez l'animal la résistance à l'insuline qu'elles provoquent en culture cellulaire. Toutes sont tuées pour prélever des tissus.
Objectifs
Les patients souffrant d’obésité sont confrontés à un risque plus accru de développer des maladies cardiovasculaires et le diabète de type 2. Ce risque est d’autant plus élevé que la majorité de ces patients développent une résistance à l’insuline, une hormone qui permet l’absorption et le stockage du glucose dans les organes tels que le foie, le tissu adipeux et le muscle squelettique. Outre le développement du diabète de type 2, la résistance à l’insuline est, à long terme, responsable de plusieurs complications métaboliques telles qu’une dyslipidémie, une athérosclérose ou une hypertension artérielle. La résistance à l’insuline étant un état pathologique silencieux, il devient nécessaire de développer de nouveaux outils de diagnostic de l’apparition de la résistance à l’insuline chez les patients obèses. Dans ce contexte, nous nous intéressons aux vésicules extracellulaires (VEs) libérées par les cellules de l’organisme. Ces VEs, impliquées dans la communication entre les cellules, sont considérées comme de nouveaux biomarqueurs de différentes maladies. Des travaux préalablement réalisés in vitro au sein de notre laboratoire ont démontré que les VEs circulantes de patients diabétiques induisent une résistance à l’insuline dans les cellules du foie et du tissu adipeux par des mécanismes bien distincts, ainsi qu’une accumulation de graisse. Ces effets ne sont pas observés avec les VEs circulantes de sujets sans diabète. La question posée ici est de vérifier si les VEs de patients diabétiques induisent également la résistance à l’insuline in vivo. L’objectif de ce projet est d’évaluer l‘implication des VEs de patients non diabétiques ou diabétiques, dans le développement in vivo du diabète chez la souris et les mécanismes mis en jeu.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus permettront de mieux comprendre les mécanismes par lesquels les VEs participent aux altérations métaboliques associées au diabète. A long terme, ces résultats permettront de développer de nouveaux outils de diagnostic de l’apparition de la résistance à l’insuline chez les patients obèses et d’aborder de nouvelles stratégies thérapeutiques et préventives du diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires associées.
Procédures
SEPT INTERVENTIONS : (i) Injections intraveineuses : 2 injections (une injection tous les 7 jours dans toutes les procédures), durée de chaque injection < 5 min. (ii) Mesure pression artérielle : 8 mesures (8 jours), durée : 10 min/mesure (iii) Prélèvement de sang : 6 prélèvements d’une goutte de sang par souris à la fin du régime, durée de chaque prélèvement < 1 min. (iv) Implantation sous-cutanée : 1 implantation/animal, durée 20 min (v) Induction d’une fibrillation atriale : une fois, durée 20 min/animal. (vi) Analyse composition corporelle : une fois, durée 20 min/animal. (vii) Prélèvement tissulaire sur animal vivant : deux fois, durée 10 min/animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les souris seront les suivants : 1) Stress associé aux manipulations (échographie, IRM, prise de la pression artérielle sur animal éveillé, prise de poids, prise de la température avec une caméra thermographique, et injection de vésicules extracellulaires). Concerne tous les animaux ; 2) Stress et douleur (prise en charge avec une analgésie) associés à la chirurgie après l’implantation du capteur pour la télémétrie (concerne 72 animaux) ; 3) Douleur (prise en charge avec une analgésie) associés au prélèvement des tissus concerne 72 souris ; 4) Stress associé à l’isolement des souris après l’implantation du capteur pour la télémétrie et jusqu’à la fin de la procédure (concerne 72 animaux).
Devenir
Tous les animaux utilisés seront euthanasiés pour prélever des tissues qui permettront compléter les objectives initiales de l’étude.
Remplacement
Il n’existe aucun moyen de remplacer de telles études qui englobent l’ensemble de l’organisme dans sa réponse physiopathologique, et seule l’expérimentation animale permet un suivi complet des altérations métaboliques et cardiovasculaires associées au diabète, comme la résistance à l'insuline.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris à celui requis pour obtenir une validation statistique des résultats. Le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental a été déterminé pour chaque expérience en fonction des données de la littérature, de notre expérience avec ces modèles maitrisés au laboratoire depuis plusieurs années et à l’aide d'un logiciel statistique. Également, afin de réduire le nombre d’animaux, nous utiliserons un même animal pour plusieurs mesures.
Raffinement
Pour favoriser la sociabilisation des animaux, nous mettrons au maximum 4 animaux par cage. Les animaux concernés par l’analyse des paramètres cardiaques par télémétrie seront placés dans des cages individuelles à partir de l’implantation du capteur télémétrique et seront maintenues dans ces conditions nécessaires pour permettre l’analyse individuelle dans les plateformes d’enregistrement jusqu’à la fin de l'étude, c’est-à-dire 21 jours. Pendant cette période, l’isolement des animaux sera compensé par de l’enrichissement. Ainsi, dans la cage, les animaux auront à disposition des cabanes pour se cacher, grimper et faciliter leur accès à la nourriture. La mise en place de pointes limites adaptées aux différentes manipulations décrites dans chaque procédure permettra d’assurer que les animaux soient dans les meilleures conditions pendant la durée de l’étude.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie pour cette étude est la souris Swiss. Comme en témoignent les résultats publiés par notre laboratoire, ces souris sont un bon modèle pour l’étude des maladies métaboliques et cardiovasculaires. Les souris seront utilisées à l’âge de 8 semaines, pour lequel les animaux sont considérés comme jeunes adultes. A partir des 8 semaines d’âge, les rongeurs montrent une fonction métabolique du glucose optimale pour évaluer une possible altération avec le traitement de l’étude. En effet, le déclin de la fonction métabolique est décrit à partir de 10 semaines d’âge chez la souris.
SALIVE Activités des protéines salivaires de triatomes
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
264 souris femelles vont être utilisées, chacune pour une seule injection de dix microlitres sous la peau et une survie de deux ou six heures. La moitié est tuée au bout de deux heures, l'autre au bout de six, pour prélever la peau et les ganglions lymphatiques, un carré de peau d'un centimètre carré ayant été rasé la veille. Le produit injecté contient des protéines de la salive du triatome, un insecte suceur de sang vecteur de la maladie de Chagas, dont le porteur veut mesurer les effets anti-inflammatoires et anticoagulants dans la peau. Il n'exclut pas une réaction proche d'une réaction allergique, et son raffinement se réduit à l'hébergement enrichi, à la surveillance quotidienne et à des points limites qu'il ne nomme pas.
Objectifs
Le projet a pour objectif d'évaluer les activités antiinflammatoires/immuno-régulatrices/anticoagulantes de protéines de la salive des triatomes dans la peau de souris.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera une meilleure connaissance des activités pharmacologiques, anticoagulantes, antiinflammatoires et immunitaire de la salive de l'insecte hématophage (qui se nourrit de sang) Rhodnius sp. responsable de la transmission de Trypanosoma cruzi, agent de la maladie de Chagas. Ceci pourra contribuer à proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour limiter le passage de T. cruzi chez l'homme.
Procédures
Une injection de moins d'1 seconde sous cutanée unique de 10µl de sérum physiologique contenant des protéines salivaires de triatome, d’histamine ou de sérum physiologique sera réalisée sur souris vigile. La moitié des animaux sera euthanasiée après 2 heures, l’autre moitié après 6 heures pour prélèvement et analyse des tissus d’intérêt (peau et ganglions lymphatiques). Une surface de 1 cm2 de peau sera rasée 24h avant l’inoculation pour faciliter le prélèvement des tissus. Un total de 264 animaux sera utilisé.
Impact sur les animaux
Bien que nous nous attendions à avoir des activités fortement anti-inflammatoires, nous ne pouvons pas exclure une réaction inflammatoire précoce associée à des cellules immunitaires (comme des mastocytes et des éosinophiles) qui pourrait s'apparenter à une réaction allergique. Le suivi de l'expérience étant au maximum de 6h, une surveillance constante des animaux au cours de la procédure sera réalisée.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés pour prélèvement histologique (peau et ganglion) et analyse cellulaire
Remplacement
Le recours aux animaux se justifie dans la mesure où il n'existe actuellement aucun autre modèle alternatif permettant d’étudier la réponse immunitaire de façon physiologique. Les études physiologiques portant sur des informations immunitaires complexes et interdépendantes ne peuvent être réalisées que chez des animaux vivants, dans un système intégré.
Réduction
Le nombre de souris (264) avec 12 animaux par sous-groupe est déterminé de façon à avoir une puissance statistique suffisante pour valider le résultat observé (6 groupes, 2 doses, 2 temps). 264 souris : (12 souris x 5 groupes test x 2 concentrations x 2 temps) + (12 souris x 1 groupe contrôle x 2 temps) Seules des souris femelles seront utilisées pour 1/ pour faciliter l'hébergement 2/ pour comparer aux données internes toutes produites sur femelles. Une analyse statistique multifactorielle ad hoc ser a réalisée
Raffinement
Les souris sont dans un environnement adapté à leurs besoins (dimensions de la cage, nourriture, enrichissement, température et cycle jour/nuit). Entre autres, elles seront hébergées dans un environnement enrichi, avec un substrat pour faire leur nid et des objets à ronger. Une surveillance journalière des animaux est réalisée par un personnel compétent qui connait bien cette espèce. Les points limites établis seront suivis
Choix des espèces
Le modèle biologique choisi est la souris (Mus musculus). La souris est l’espèce animale la plus étudiée en expérimentation animale. Les connaissances accumulées par la communauté scientifique ont ainsi permis d’identifier et de caractériser de nombreux mécanismes immunitaires. Tous les protocoles immunohistologiques utilisés dans ce projet de recherche ont été optimisés et validés pour la souris. Des souris femelles au stade adulte seront analysées, pour avoir un système immunitaire complètement fonctionnel.
Elevage d’une lignée murine modèle de cancer du tissu mammaire au phenotype dommageable
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Vingt-quatre naissances par mois pendant cinq ans, soit 1 440 souris produites par quatre cages d'accouplement maintenues en continu : cet élevage transmet à la moitié des animaux, 720 individus, un transgène qui leur fait développer spontanément des tumeurs mammaires. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger, ce qui couvre la biopsie de queue avant quatorze jours et la goutte de sang prélevée par poinçon de joue à trente jours, sans couvrir le développement tumoral lui-même, que le porteur décrit comme pouvant provoquer douleurs, dégradation physique et mort. La tumeur est palpée puis mesurée une fois par semaine à partir de cinq mois, et l'animal est tué lorsqu'elle atteint un centimètre cube. Les animaux non tués rejoignent d'autres projets en utilisation continue, 144 environ étant tués parce que leur génotype ne convient à aucun protocole ou parce qu'ils ont fini de reproduire, et le porteur affirme que les souris transgéniques sont "l'unique moyen" de suivre les cellules qui l'intéressent dans un "organisme entier".
Objectifs
Le programme de travail repose sur l’observation fondamentale que les cellules myéloïdes, une population du système immunitaire, sont impliquées dans le développement tumoral et la résistance aux thérapies anti-cancéreuses. L'étude de l'impact des thérapies conventionnelles ainsi que les nouvelles immunothérapies sur ces populations de macrophages sont nécessaires pour comprendre comment ces populations interviennent dans les résistances à ces thérapies et donc à la rechute tumorale. La complexité des interactions cellulaires intervenant dans ces processus nécessite l'utilisation de modèles animaux developpant des cancers de manière relativement controlée mais le plus proche de ce que l'on peut observer chez l'homme.
Bénéfices attendus
Le cancer du sein touche plus de 2 millions de femmes dans le monde avec 670.000 décès recensés en 2022. Il touche les femmes sans distinction d'âge et représente donc un enjeu de santé publique majeur. Le besoin de recherche scientifique sur ce cancer est nécessaire. Comprendre le rôle des macrophages dans le developement des cancers et la resistance aux thérapie anti-cancéreuses (radiothérapie, chimiothérapie, immunothérapies) est capitale. Ces thérapies sont actuellement les seules armes que nous possédons pour traiter les patients et pourtant dans encore trop de cas ces thérapies ne font que prolonger la durée de vie et souffrent d'effet secondaires très lourds. Le modèle de souris utilisé est un modèle qui reproduit de façon relativement fidèle, les différents stades de cancer du sein que l'on peut observer chez l'homme. C'est donc un modèle très utile pour tester et developper de nouvelles approches thérapeutiques.
Procédures
En raison du developpement pontanée de tumeur de nos modèles transgéniques, nous réaliserons un suivi de croissance tumorale par palpation puis avec pied à coulisse sur animal vigile 1 fois par semaine à partir de 5 mois d'àge : 1min par animal pour mesure de la masse tumorale. Pour assurer l’identification génétique de nos animaux, les animaux subiront une biopsie au niveau de la queue avant 14 jours d'âge - 1 min par animal et un prelevement de sang 1 goutte par poinçon de joue à 30 jours d'âge - 2min par animal sur animal vigile.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une biopsie de l’extrémité de la queue et un prélèvement de sang (quelques gouttes) pour génotypage. Ces gestes peuvent engendrer des douleurs légères de courte durée et un stress chez l’animal. Les prélèvements sanguins peuvent également provoquer un hématome dans de rare cas. Les effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont majoritairement liés à l'apparition spontanée de tumeurs mammaires. Les animaux vont alors subir le développement d'une ou plusieurs tumeurs pouvant amener à la dégradation de la condition physique, du stress, des douleurs et un developpement tumoral pouvant provoquer la mort.
Devenir
Les animaux produit par cet elevage seront utilisés dans le cadre de projet en cours et futurs dans le cadre d'une utilisation continue. Dans quelques cas (animaux du mauvais génotype ne pouvant pas être inclus dans un autre projet de recherche et anciens reproducteurs), les animaux seront euthanasiés. Evalué à 10 pourcent soit 144 animaux
Remplacement
Le modèle animal de cancer du sein permet d'apprehender la complexité des interactions entre les macrophages et l'environnement tumoral en réponse aux thérapies. L'utilisation d'animaux est donc nécessaire. Cependant nous utilisons dans certains cas ce modèle pour des expériences de cocultures in vitro des cellules tumorales, permettant de tester plusieurs conditions à partir d'un seul animal.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux générés dans cet elevage, nous faisons particulièrement attention aux génotypes des parents afin qu'un maximum des descendants ait le bon genotype. Nous controlons le nombre de couple afin de ne pas générer d'excédent de stock. Les animaux dont le genotype ne correspond pas sont dans la plupart des cas utilisés dans le cadre d'autres projets déclarés afin de ne pas produire d'animaux inutilement. Cette utilisation rentre dans le cadre d'une utilisation continue. Dans l'ensemble 4 cages d'accouplement sont maintenues en continue. A raison d'une porté de 6 par mois, ceci represente au mieux 24 animaux par mois soit sur 5 ans un elevage de 1440 animaux. La présence du transgène chez la femelle induit un phénotype dommageable amplifié par la gestation et donc l’atteinte des points limites (taille de tumeur) ne permet pas d’aboutir jusqu’à la délivrance et sevrage de la descendance. Ainsi, les accouplements se feront uniquement avec des males heterozygote pour le transgène au phenotype dommageable, le genotype dommageable ne touchera que 720 animaux sur 5 ans.
Raffinement
Les animaux sont hébergés conformément à la réglementation avec température et hygrométrie contrôlée, cycle jour/nuit 12/12, avec au maximum 6 animaux par cages. Chaque cage contient au moins deux éléments d'enrichissement : nid en carton et bâton à ronger. La surveillance quotidienne du bien-être animal est prise en charge par un personnel dédié au soin et à l’expérimentation. Ce modèle tumoral est sans risque infectieux. Nous mettons en place un point limite et la surveillance de ces derniers dont les critères limite considérablement l'emergence de signe de souffrance liés au developement de la tumeur. En effet, un suivi de la charge tumorale 1 fois par semaine à partir de 5 mois d'âge est mis en place. Lorsque la tumeur atteint 1cm3 critère point limite, l'animal en elevage est euthanasié. Pour diminuer le stress, les conditions globales d'hébergement des animaux ne changent pas outre des conditions de raffinement supplémentaires si necessaire. Tout animal blessé ou montrant des situations d'inconfort indépendante du contexte tumoral sera euthanasié. Une surveillance accrue sera réalisée lors des prélèvements de tissu pour génotypage : une compression de la zone d'incision sera effectuée pour stopper les petits saignements, le regroupement et la prise en charge des souriceaux par la mère seront vérifiés
Choix des espèces
Nous étudions la mobilisation d'un grand nombre de cellules immunitaires à travers les tissus et l'impact de drogues anti-tumorales sur l'organisme entier. Les souris transgéniques utilisées sont l'unique moyen d'obtenir les outils permettant de tracker les cellules d'intérêts par des techniques d'imagerie dans le modèle de tumeur mammaire spontanné Les animaux sont utilisés entre 7 et 14 jours de vie pour le génotypage, 1 mois de vie pour le prélèvement sanguin puis dans ce modèle, les tumeurs deviennent palpable entre 6 et 12 mois d’âge.
Conséquences de la dysbiose intestinale liée à l’âge sur les défenses immunitaires contre les infections respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Pour vérifier si le microbiote intestinal de souris âgées transmet une sensibilité accrue aux infections respiratoires, 1 653 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées. Trois semaines d'antibiotiques dans l'eau de boisson, un gavage de matières fécales sur animal éveillé, puis une infection par le pneumocoque ou le virus grippal déposée dans le nez sous anesthésie générale. Le porteur prévoit la mise à mort vingt-quatre heures après le pneumocoque et quatre jours après la grippe, en indiquant que ce calendrier précède l'apparition des signes cliniques, tout en décrivant une perte de poids qui commence dès le deuxième ou le troisième jour. Au-delà de ces délais peuvent survenir prostration, tremblements, respiration laborieuse et hypothermie, et une perte de poids de 20 % déclenche la mise à mort.
Objectifs
Les personnes âgées sont sensibles aux infections respiratoires. Des travaux récents montrent que le microbiote intestinal intervient dans les mécanismes de défense contre les infections, dont les infections respiratoires. Le microbiote intestinal produit de nombreux métabolites qui diffusent dans le sang et activent le système immunitaire dans les poumons. La fonction du microbiote intestinal (dysbiose) chute avec l’âge. Nous proposons que la dysbiose liée à l’âge participe à la susceptibilité des personnes âgées aux infections respiratoires virales et bactériennes. A notre connaissance, cette hypothèse de travail n’a pas encore été étudiée. Afin de valider cette hypothèse, notre premier objectif sera de démontrer que le microbiote intestinal isolé de souris âgées transmet une susceptibilité accrue à l’infection chez des souris receveuses jeunes. Pour cela, des expériences de transfert de flore fécale seront réalisées. Brièvement, des souris dépourvues en flore intestinale ou préalablement traitées avec une large gamme d’antibiotiques (afin d’éliminer le microbiote résiduel) recevront du microbiote (fèces) de souris âgées ou de souris jeunes. Les souris colonisées seront ensuite infectées avec le pneumocoque (première cause de pneumonie bactérienne chez l’homme) ou le viral grippal. Nous déterminerons la charge bactérienne et virale dans les poumons. Nous nous attendons à ce que les souris ayant reçu le microbiote de souris âgées soient plus sensibles à l’infection par rapport aux souris ayant reçu le microbiote de souris jeunes. Nous déterminerons la composition du microbiote et quantifierons les métabolites microbiens (fèces et sang) des souris colonisées. Nous corrélerons ces données avec les paramètres infectieux. Cela nous permettra d’identifier des candidats potentiellement impliqués dans la défense contre l’infection. Les candidats identifiés seront ensuite testés dans nos modèles d’infection. La demande concerne la procédure de colonisation des souris, le suivi des souris colonisées, l’infection des souris avec le pneumocoque ou le virus grippal, la quantification de la charge infectieuse et l’analyse des mécanismes immunologiques sous-tendant la susceptibilité à l’infection. La demande concerne également des procédures expérimentales visant à valider les candidats à potentiel thérapeutique issus de nos recherches. Il pourra s'agir de métabolites dont la production chute massivement chez la souris/individu âgé(e).
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre pourquoi les personnes âgées sont sensibles aux infections respiratoires. Ce projet pourrait permettre d’identifier des métabolites microbiens (dérivés du microbiote intestinal) capables, à distance, d’activer certaines cellules du système immunitaire et de favoriser la défense contre les infections respiratoires. Outre l’intérêt fondamental, des retombées thérapeutiques sont attendues de ce projet.
Procédures
Le traitement aux antibiotiques (ajoutés dans l’eau de boisson) durera trois semaines. La colonisation des souris sera réalisée par gavage sur animaux vigiles. Les souris seront infectées deux à trois semaines après colonisation. L’infection sera réalisée par voie intra-nasale sous anesthésie générale. Les souris seront euthanasiées avant l’apparition des signes cliniques liés à l’infection (24 heures près l’infection par le pneumocoque et 4 jours après infection par le virus grippal). Ce choix maximise les données obtenues à partir de chaque animal, afin de limiter l'utilisation d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal. Pour le traitement, en fonction de la nature du ou des métabolites, ces derniers seront administrés par gavage ou dans l’eau de boisson. Les doses correspondront à des doses physiologiques. Outre les paramètres cliniques, des études de pharmacocinétique et de biodistribution seront menées par prélèvements de sang et dans différents organes.
Impact sur les animaux
Un stress momentané est possible suite à la colonisation (gavage sur animaux vigiles). Dans nos conditions expérimentales, les animaux infectés par le virus grippal commencent à perdre du poids à partir du 3ème jour. Le sacrifice a lieu 4 jours après l’infection, avant l’apparition des signes cliniques. Lors de l’infection par le pneumocoque, les animaux commencent à perdre du poids au 2ème jour. La mise à mort des animaux a lieu 1 jour après l’infection. Les conséquences de l’infection peuvent se traduire par des signes légers ou modérés tels que la diminution des soins et une consistance anormale des fèces. Des signes sévères de mal-être post-infection peuvent aussi survenir au-delà de 5 jours (virus grippal) et de 2 jours (pneumocoque) tels que la prostration, tremblement, poil piqué associé à une ligne dorsale marquée, respiration laborieuse (fréquence et type significativement modifiés), état général apathique, hypothermie, et perte de poids.
Devenir
Les animaux sont euthanisés selon la procédure en vigueur à l'issue de chaque procédure.
Remplacement
Les expériences ont été planifiées en tenant compte de la règle des 3 R. L’étude des effets physiopathologiques de l’infection par le pneumocoque ou le virus grippal et de l’efficacité des transferts de flore nécessitent l’utilisation d’organisme entier, et ne laissent pas la possibilité de remplacer les animaux utilisés par des systèmes cellulaires. Suite à l’infection respiratoire, le système immunitaire s’active et conduit à une inflammation. Celle-ci se traduit par le recrutement et l’activation de nombreux types cellulaires et par la production de facteurs solubles (cytokines, chimiokines etc). Cette réaction est sous la dépendance d'un réseau complexe de cellules et de facteurs solubles qui ne peut pas être reproduite in vitro. Par ailleurs, les effets des transferts de flore fécale ne peuvent être évalués qu’in vivo. Le modèle souris est pertinent pour ce type d’étude.
Réduction
Il n’existe pas de méthode de substitution pour étudier les effets physiopathologiques de l’infection par le virus grippal ou le pneumocoque et pour évaluer l’efficacité de médicaments lors de l’infection. Il en est de même pour l’étude du microbiote intestinal et de ces interactions avec les cellules immunitaires du poumon. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres modèles n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’informations. Le modèle souris est particulièrement pertinent pour ce type d’étude.
Raffinement
Le raffinement est obtenu par (i) la mise au point de procédures rigoureuses, (ii) la formation du personnel, (iii) un suivi quotidien de l’état de santé des animaux (iv) le recours à des procédures non invasives et non douloureuses. Pour les procédures induisant une douleur, les animaux seront anesthésiés. Les animaux seront sous surveillance rapprochée pendant la durée de l’étude. Les conséquences de l’infection peuvent se traduire par des signes légers ou modérés tels que la diminution des soins et une consistance anormale des fèces. Tout signe éventuel de détresse (signes sévères) incluant prostration, changement du comportement de l’animal (diminution des soins, animal prostré), tremblement, poil piqué associé à une ligne dorsale marquée, consistance anormale des fèces associée à une distension de l’abdomen, respiration laborieuse (fréquence et type significativement modifiés), état général apathique, hypothermie fera l’objet d’une attention particulière. Si une perte de poids supérieure à 20% survenait, ou un signe évident de souffrance, les animaux concernés seront euthanasiés selon la procédure en vigueur. Les points limites sont définis selon les directives de l’OCDE (document ENV/JM/MONO(2000)7) et incluent notamment : perte de poids supérieure ou égale à 20% par rapport au poids initial, hypothermie, problèmes ambulatoires, accès à la nourriture et à l’eau, difficulté à respirer, automutilation, blessure ou plaie etc. Afin de réduire le stress, le milieu sera enrichi avec du matériel de nidification. Les procédures sont réalisées dans une zone calme différente de la pièce d’hébergement. Les animaux seront manipulés avec délicatesse (de préférence par le même expérimentateur). Outre le respect de la règle des R, ces précautions sont importantes pour éviter tout biais sur les résultats expérimentaux.
Choix des espèces
La souris représente un modèle de choix pour modéliser les infections respiratoires. Par ailleurs, même si la composition du microbiote varie entre une souris et un humain, il y a de nombreux points communs sur leur activité métabolique, notamment les produits issus de la fermentation. De nombreux métabolites communs sont retrouvés chez la souris et l’homme.