Recherche fondamentale
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Etude des effets d’un peptide à visée thérapeutique dans la régulation de l’homéostasie énergétique au cours de l’obésité associée au diabète de type 2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
792 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est rendue obèse et diabétique par trois mois de régime hypercalorique, puis reçoit sept prélèvements sanguins par la queue coupée aux ciseaux, une mini-pompe osmotique implantée sous la peau, trente injections sur dix semaines et, pour certaines, un cathéter posé dans la veine jugulaire au cours d'une chirurgie de 45 minutes. Cinq jours d'isolement en cage servent à mesurer la prise alimentaire, avec le stress et la perte de poids que le porteur en attend. Il conclut que seul un "modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l'animal entier" permet de comprendre l'effet du peptide testé sur l'obésité et le diabète.
Objectifs
Ce projet permettra d'étudier la régulation de l’expression d'une séléno protéine au niveau de l'hypothalamus. Cette protéine anti-oxydante pourrait jouer un rôle dans le maintien de l’homéostasie énergétique, un défaut de son activité pourrait contribuer au développement de l’obésité et ses comorbidités, notamment le diabète de type 2. Ce projet permettra également de tester les effets d'un nouveau peptide thérapeutique, capable de mimer l'activité de la séléno protéine, pour le traitement de l’obésité et du diabète de type 2. Cette étude pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement de ces pathologies.
Bénéfices attendus
L'obésité et le diabète de type 2 connaissent une progression significative et synchrone depuis 30 ans de sorte que la pandémie actuellement observée au niveau mondial constitue un réel enjeu de santé publique. Des études récentes ont révélé que l’hypothalamus de sujets obèses est soumis à un stress oxydatif et inflammatoire permanent, suggérant que des facteurs de contrôle de ce stress pourraient être impliqués dans l’homéostasie énergétique et constituer des cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement de l’obésité associée au diabète de type 2. Le peptide que nous allons tester présente plusieurs avantages qui peuvent en faire un outil thérapeutique très intéressant pour combattre l'obésité et le diabète de type 2 qui lui est associé. En effet, ce peptide atteind le cerveau et pénètre dans les cellules pour réduire le stress oxydant en général. Il peut agir aussi bien au niveau central que dans des tissus périphériques impliqués dans le contrôle du métabolisme énergétique. Les études intégrées que nous projetons de réaliser requièrent des analyses in vivo qui pourront déboucher sur des applications chez des patients atteints d'obésité et de diabète de type 2.
Procédures
Une partie des souris sera nourrie avec un régime hypercalorique pendant 3 mois, ainsi ces animaux deviendront obèses et diabétiques. Des prélévements de sang seront effectués à partir de la queue des animaux qui resteront libres de leurs mouvements (7 prélèvements par animal, chacun des prélévements prendra moins d'une minute). L'implantation de mini-pompes osmotiques sous la peau des animaux, afin de délivrer un composé en permanence, sera effectuée sur souris anesthésiées et toutes les précautions d'usage seront suivies pour minimiser la douleur. Au total, l'intervention durera 10 min par souris. Les mini-pompes osmotiques sont implantées pour des traitements d'un mois. Les traitements par injection (3 par semaine) dureront 10 semaines. Certains animaux seront opérés pour placer un cathéter dans la veine jugulaire. Ils seront opérés une fois, la chirurgie sous anesthésie générale dure 45 minutes. Après 1 semaine de repos ces animaux suivront un autre test : ils seront libres de leurs mouvements et porteront un collier. Pendant 2 heures nous mesurerons leur glycémie 16 fois et nous prélèverons un petit volume de sang (au bout de la queue, 7 fois). Il n’y aura qu’un seul test de ce type pour ces animaux.
Impact sur les animaux
#1. Régime hypercalorique : Après 2 mois de régime hypercalorique les animaux ont un surpoids et présentent les premiers signes d'apparition du diabète de type 2. #2. Tests effectués sur les animaux : le gavage, l’injection intra-péritonéale et les prélèvements sanguins peuvent stresser les animaux. La queue des animaux sera coupée au ciseau, cela entraine une douleur. #3. Mesure de la prise alimentaire : les animaux seront isolés 5 jours, cela entrainera un stress et une possible perte de poids. #4. Pose d’un cathéter dans la veine jugulaire : plusieurs effets indésirables sont possibles. Des souris peuvent mal supporter l'anesthésie. La chirurgie peut entrainer des douleurs et des problèmes de récupération. #5. Mesure du renouvellement du glucose : le risque est de créer une hypoglycémie lors du test, si les niveaux de perfusion d’insuline et de glucose ne sont pas optimaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, car nous avons besoin de prélever leurs organes pour les analyser ultérieurement.
Remplacement
Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre de comprendre, de façon globale, les effets du peptide thérapeutique dans la dérégulation de l’homéostasie énérgétique au cours de l’obésité, associée au diabète de type 2, et d’établir des comparaisons pertinentes avec des données qui pourraient être obtenues chez l’homme.
Réduction
En accord avec des expériences antérieures et pour limiter le nombre d'animaux utilisés, les processus physiologiques étudiés seront analysés sur des lots de 12 souris par condition de traitement. Ces effectifs nous assureront d’obtenir des données statistiquement analysables. L’effectif des groupes d’animaux pourra être diminué à 10 lors des études concernant la régulation de la protéine, tout en conservant des données statistiquement fiables. De plus, les procédures, n’impliquant pas d’effet néfaste à long terme, pourront être menées successivement sur les mêmes animaux intercalées avec des périodes de repos au cours desquelles les paramètres physiologiques et le bien-être des souris seront régulièrement évalués. Au cours de ce projet, plusieurs peptides seront examinés d'abord in vitro dans des cultures de neurones. Ils seront sélectionnés pour leur capacité neuro-protectrices, les plus prometteurs seront étudiés chez la souris obèse. Cette approche réduira sigificativement le nombre d'animaux qui seront utilisés.
Raffinement
L’ensemble des actes pouvant entraîner une douleur sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale selon la méthode la plus adaptée) afin d’en minimiser l’impact au maximum. De plus, les animaux recevront un traitement analgésique pour prévenir la douleur. Le bien-être de l’animal sera évalué quotidiennement par le personnel de l'animalerie. Au cours des expérimentations, une observation continue des animaux nous permettra d’arrêter le protocole en cas de souffrance.
Choix des espèces
Les souris ont une physiologie métabolique proche de l'Homme notamment en ce qui concerne la régulation de la glycémie; et sont souvent utilisées comme modèles de pathologies humaines, comme l'obésité et le diabète de type 2. De plus, nous voulons tester l'effet d'un peptide thérapeutique sur un modèle animal, dans la perspective de le tester ensuite dans une phase clinique humaine. Au cours de cette étude, la physiologie adulte sera étudiée. Les souris seront donc âgées d’au moins 8 semaines lors des expérimentations.
Etude des doses limites de l’essentialité de l’acide linoléique et de sa capacité à être remplacé par l’acide pentadécanoïque chez le rat Wistar
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- Oncologie
168 jeunes rates surnuméraires seront transférées vers d'autres projets de recherche et d'enseignement, les mères et les ratons mâles étant tués au terme des régimes pour prélever foie, tissus adipeux et cerveau. 403 rats vont être utilisés au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les rates sont soumises pendant la gestation puis l'allaitement à des régimes carencés ou surchargés en acide linoléique, leurs ratons continuant ces régimes jusqu'à 4 ou 5 mois, avec des prélèvements sanguins toutes les deux semaines et des tests comportementaux répétés vingt fois en cinq jours. Le porteur annonce chez les rats carencés une croissance ralentie et des troubles cognitifs, chez les rats en surcharge une inflammation et une stéatose hépatique, et affirme dans la même page que ces perturbations n'induiront ni mal-être ni anxiété ni douleur.
Objectifs
Cette étude de recherche fondamentale s'inscrit dans le domaine des liens entre consommation alimentaire de lipides et santé (lipides-nutrition-santé). L’objectif est de mieux définir les bonnes doses de consommation de certains acides gras, en prévention des pathologies nutritionnelles (obésité, diabète de type 2…). L’étude s’intéresse en particulier à l’acide linoléique, qui est un acide gras d’origine végétale uniquement, et que l’animal (dont l’homme) doit consommer de manière indispensable. Le caractère indispensable de cet acide gras dans l’alimentation humaine est démontré depuis longtemps, mais la dose optimale d’apport de cet acide gras reste très controversée. En fonction des modèles d’étude, des doses alimentaires utilisées et du temps de traitement, cet acide gras peut devenir délétère pour la santé et induire l’accumulation de graisses au niveau hépatique (stéatose ou foie gras) ou au niveau des tissus adipeux (obésité), et contribuer ainsi à une inflammation chronique, source de problèmes cardio-vasculaires à terme. Le 1er objectif de cette étude est donc de définir la limite maximale d’apport alimentaire de cet acide gras, au-dessus de laquelle ses effets deviennent délétères sur le long terme. Pour cela, des rates gestantes puis les ratons issus de ces mères seront nourris par des doses croissantes en acide linoléique, depuis la période gestationnelle chez la mère jusqu’à l’âge de 4-5 mois. Les effets potentiellement délétères de chaque dose seront observés. De plus, il est apparu récemment dans la littérature scientifique qu’un acide gras spécifiquement retrouvé dans les produits laitiers et principalement dans le lait, l’acide pentadécanoïque, montre un réel intérêt par sa “proximité biochimique et métabolique” à l’acide linoléique et son potentiel “rôle de remplacement” dans le cas d’une carence. Le second objectif de cette étude est donc de montrer la capacité potentielle de l’acide pentadécanoïque alimentaire à se substituer à l’acide linoléique (en situation de carence) et à assurer certaines fonctions structurales et physiologiques similaires. Pour cela, des rates gestantes puis les ratons issus de ces mères seront nourris par des régimes carencés en acide linoléique mais supplémentés en acide pentadécanoïque, depuis la période gestationnelle chez la mère jusqu’à l’âge de 4-5 mois.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus au terme de cette étude sont : (i) Définir un seuil limite d’excès nutritionnel d'acide linoléique (ii) De mieux comprendre les mécanismes sous-jacents de la mise en place de la stéatose hépatique d’un excès nutritionnel d'acide linoléique. (iii) De caractériser les effets de l’acide pentadécanoïque en nutrition, effets potentiellement indispensables. (iv) De mettre en exergue le potentiel rôle de substitution de l’acide pentadécanoïque aux acides gras essentiels (acide linolénique, acide linoléique) et selon quelles doses. Ces bénéfices représentent de réels enjeux de santé publique d’un point de vue nutritionnel, dans la réévaluation des apports nutritionnels conseillés en acide linoléique mais également pour la consommation de produits laitiers. Le bénéfice attendu premièrement d’apport des connaissances sur l’apport de l’acide pentadécanoïque en nutrition et définir si cet acide gras peut être une voie de substitution d’acide gras essentiels historiques en situation de carence. Le second bénéfice est de découvrir lors d’une situation de surcharge en acide linoléique, à partir de quelle dose cet acide gras peut nuire à la santé en induisant une stéatose hépatique chez le rat.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à différents régimes supplémentés en divers acides gras pendant 5 mois. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur tous les animaux toutes les 2 semaines. Ces prélèvements seront rapides, de l'ordre de quelques secondes le temps de récolter les volumes nécessaires. Des tests comportementaux seront réalisés sur les animaux selon 2 période : (i) un premier test pendant 5 jours consécutifs, avec 4 essais par jour (avec 5 minutes d'intervalle entre les essais) chaque essai durant 60 secondes. (ii) Un deuxième test sur une semaine avec 3 répétitions du test : 1 test par jour, avec 2 jours d’intervalle entre chaque test, chaque essai durant 5 minutes.
Impact sur les animaux
Chez les animaux carencés, une légère diminution de la croissance des ratons et l'apparition de troubles cognitifs en absence d’acides gras indispensables est possible. Ces perturbations (diminution croissance et trouble cognitifs) n'induiront pas de mal-être, anxiété ou douleur chez les animaux. Les animaux carencés subiront des tests comportementaux pouvant induire du stress, de l'anxiété et de la fatigue Chez les animaux en surcharge, la mise en place d'une inflammation de bas grade ainsi que d'une stéatose hépatique est possible. Ces perturbations (inflammation et stéatose) peuvent induire une hyperlipidémie et une hépatomégalie potentielle qui ne sont pas léthales et qui n'induiront pas de mal-être, anxiété ou douleur apparente chez les animaux.
Devenir
Les ratons femelles (surnuméraires) seront réutilisées par d’autres chercheurs pour d’autres projets, de recherche et d’enseignement. Les rates mères après gestation et sevrage ainsi que les ratons mâles seront euthanasiées au terme des régimes afin de récolter les échantillons biologiques nécessaires pour nos analyses (foie, tissus adipeux, cerveaux).
Remplacement
L’effet recherché dans cette étude est d’ordre nutritionnel et nécessite donc l’analyse d’un organisme dans son ensemble. En effet, les nutriments diffusent dans le « corps entier » après digestion-absorption des aliments et leurs impacts physiologiques ou physiopathologiques concernent de multiples organes qui interagissent entre eux pour former un système biologique complexe. La substitution totale et complète d'un tel système physiologique ou physiopathologique par d'autres méthodes alternatives n'est donc pas possible.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque condition (8 rats par condition) a été calculé par analyse de la puissance statistique nécessaire pour pouvoir comparer les paramètres étudiés, soit par des tests paramétriques (si la distribution des données le permet), soit par des tests non paramétriques. Ce nombre d’animaux représente la limite basse pour laquelle les effets induits au terme du projet permettront d’observer un effet statistiquement significatif. Dans un souci de bien-être animal, les ratons surnuméraires (femelles) obtenus seront réutilisés par d’autres chercheurs pour d’autres projets, de recherche et d’enseignement.
Raffinement
Les rats seront logés par 3 pour favoriser le lien social, dans des cages de tailles suffisantes pour réduire le stress et permettre l’expression d’un comportement normal des animaux. La supplémentation en acides gras s’effectuera par le biais du régime (ad libitum), contrairement à un gavage récurrent qui engendrerait un stress de l’animal. Un suivi quotidien des animaux sera mené durant toute le projet, afin de déceler tout signe d'angoisse, de douleur ou de souffrance. L'activité physique, la position de l'animal, l'aspect du pelage et le comportement vis-à-vis des congénères seront observés. Le suivi hebdomadaire du poids de l'animal et de la consommation de nourriture seront également utilisés pour déceler tout état de souffrance ou d'angoisse.
Choix des espèces
Historiquement, les expérimentations montrant le caractère indispensable d’acides gras ont été réalisé en utilisant le rat comme modèle et plus récemment d’autres études de carences ont été réalisé sur ce même modèle. De plus ce même modèle animal a été utilisé dans l’étude des effets induits par une surcharge en acide linoléique. Des études menées sur d’autres modèles notamment chez la souris, n’ont pas montré de résultats similaires. Le rat est donc un bon modèle pour étudier l’induction d’une carence ou d’une surcharge en acides gras. Ce modèle permet le prélèvement d’organes ou tissus suffisamment volumineux pour réaliser les analyses biochimiques prévues. Les rates soumises aux différents régimes seront gestantes puis allaitantes. Ensuite, les ratons seront nourris avec les différents régimes après la période de sevrage, soit environ 3-4 semaines après la naissance. Ils seront nourris avec ces régimes pendant 14 ou 17 semaines puis euthanasiés. L’induction de la surcharge ou de la carence doit débuter chez les rates gestantes afin d’observer un effet significatif chez les ratons issus de ces mères. L’âge final des ratons correspond au temps nécessaire pour observer la carence ou la surcharge.
Etude du rôle du système à peptide RFamide PrRP/GPR10 dans la modulation de la nociception et de la douleur à l’aide de souris génétiquement modifiées. (2/2)
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- Système nerveux
Une biopsie de la queue entre 5 et 7 jours de vie, puis pour 1 248 d'entre elles une injection de tamoxifène et un phénotypage comportemental : 1 754 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Selon le lot, elles subissent ensuite jusqu'à 84 tests de douleur répartis sur 42 jours, ou une chirurgie de la patte droite suivie de tests répétés pendant sept semaines. Le porteur indique que ces procédures peuvent abaisser le seuil douloureux et provoquer inflammation, œdème, infection des sutures et troubles de la locomotion, l'objectif étant de caractériser un récepteur impliqué dans l'hyperalgésie induite par les opiacés. Les souriceaux au mauvais génotype sont tués au sortir de l'élevage, les autres à l'issue de leur procédure, aucune réutilisation n'étant possible parce que la douleur infligée fausserait tout protocole ultérieur.
Objectifs
La douleur chronique est un problème de santé publique majeur. Elle diminue la qualité de vie des patients et son traitement a un impact économique considérable. Bien que des progrès importants aient été réalisés dans la compréhension des mécanismes de la douleur, peu de progrès ont été faits dans le développement de nouveaux analgésiques. Dans le cadre d’une douleur modérée à sévère, les opiacés restent à ce jour le moyen le plus efficace de traiter ces douleurs. Par contre, leurs effets indésirables sont nombreux, dont notamment la tolérance analgésique caractérisée par une diminution au cours du temps de l’effet du traitement nécessitant une augmentation des doses pour soulager le patient. La prise chronique d’opiacés entraîne également le développement d’une hypersensibilité à la douleur, ce qui sous-entend des points communs entre l’hyperalgésie induite par les opiacés et le développement de l’hyperalgésie induite par les douleurs chroniques. Les données de la littérature ainsi que nos premiers résultats indiquent qu’un récepteur spécifique serait impliqué dans ces phénomènes. Ce projet est un projet de recherche préclinique qui vise à développer de nouvelles voies thérapeutiques analgésiques peu ou pas caractérisées jusqu'à présent. Pour ce faire, nous avons récemment généré une lignée de souris chez qui nous pouvons désactiver ce récepteur. L’étude de cette lignée nous permettra notamment de mieux comprendre l’implication de ce récepteur dans la modulation de la douleur et le développement de l’hyperalgésie, mais aussi d’envisager le développement de nouveaux traitements de la douleur plus sûrs et présentant moins d’effets secondaires que les traitements existants. Ce projet est un projet multi-site se déroulerant dans 2 Etablissements Utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet, combinés aux résultats précédemment obtenus par une approche pharmacologique avec un ligand exogène (molécule synthétique pouvant se fixer au récepteur), permettront d’affiner le rôle de ce récepteur ainsi que de son ligand endogène (molécule naturellement synthétisée par les neurones et pouvant s’y fixer) dans la modulation de la nociception et le développement de l’hyperalgésie induite par les opiacés et les douleurs persistantes. Ce projet pourrait permettre à terme d’établir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de la douleur.
Procédures
Tous les animaux subiront une biopsie unique sur animal vigil à l'âge de 5 à 7 jours afin de réaliser leur génotypage (réalisée dans l'EU1). 1248 animaux du projet subiront une injection de tamoxifène et un phénotypage comportemental (réalisée dans l'EU1). Un 1er lot d’animaux subira 1 à 2 tests nociceptifs d’une durée de 15 min environ par jour pendant 12 jours ; puis 2 tests de confort nociceptif d’une durée d’1h (1 test par jour dans ce cas)(EU2). Un 2nd lot d’animaux subira 4 injections à raison d’une injection toutes les 15 min. Ces animaux subiront au total 36 tests nociceptifs d’une durée de 3 min environ espacés sur une période de 22 jours (EU2). Un 3ème lot d’animaux subira des injections pendant 11 jours. Ces animaux subiront au total 66 tests nociceptifs d’une durée de 3 min environ espacés sur une période de 4 semaines (EU2). Un 4ème lot d’animaux subira une injection dans la queue. Ces animaux subiront également au total 48 tests nociceptifs d’une durée de 3 min environ espacés sur une période de 25 jours (EU2). Un 5ème lot d’animaux subira une injection dans la queue. Ces animaux subiront également au total 84 tests nociceptifs d’une durée de 3 min environ espacés sur une période de 42 jours. Un 6ème lot d’animaux subira deux tests nociceptifs d’une durée de 10 min environ par jour pendant 7 jours puis les animaux subiront une chirurgie de la patte droite avant de réaliser les mêmes tests nociceptifs, à raison de 4 tests maximum (espacés de 4h minium) par semaine, pendant 7 semaines (EU2). Un 7ème lot d’animaux subira 2 tests nociceptifs d’une durée de 10 min environ par jour pendant 7 jours puis les animaux subiront une chirurgie de la patte droite avant de réaliser les mêmes tests nociceptifs, à raison de 2 tests par jour (espacés de 4h minium) pendant 3 semaines. Un dernier lot d’animaux subira un test nociceptif d’une durée de 3 min environ par jour pendant 7 jours puis les animaux subiront une injection avant de réaliser le même test nociceptif, tous les 15 min pendant 90 min (EU2).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pouvant apparaitre après application de nos procédures, sont une douleur modérée après la biopsie, l’abaissement du seuil douloureux, l’apparition d’inflammation / œdème / infection au niveau des points d’injection ou des sutures chirurgicales, comportements anormaux, problème de locomotion, inconfort transitoire au point d’injection.
Devenir
Les animaux issus de l'élevage ayant le génotype d'intérêt continue vers les procédures de phénotypage comportemental et ceux n'ayant pas le génotype d'intérêt sont mis à mort. Les animaux avec le génotype d'intérêt inclus dans les procédures sont mis à mort à l'issue de chacune d'elles. Aucune réutilisation d'animaux n'est possible du fait des modèles de douleur subit par les animaux qui mettraient en cause les résultats d'une nouvelle procédure si elle était réalisée.
Remplacement
Au vu de notre objectif d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, la caractérisation de la modulation de la nociception et de la douleur nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.
Réduction
Au regard des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique individuelle, nous avons pu estimer par une analyse statistique que 12 animaux de chaque sexe/groupe sont requis pour obtenir des résultats exploitables. Ainsi chaque étude de base comportera un groupe transgénique témoin et un groupe transgénique invalidé pour la protéine d'intérêt sans avoir été soumis au traitement cet un groupe de souris transgéniques obtenues par traitement. Les animaux utilisés dans des études similaires n’étant pas disponibles, en cas de réussite avec ce nouveau modèle, les animaux prévus pour les deux autres études ne seront pas utilisés. De par notre expérience du maintien des lignée de souris transgéniques incluses dans le projet, nous connaissons aussi le nombre optimal de couples reproducteurs qu'il nous faut, pour pouvoir à la fois maintenir les lignées et fournir les animaux nécessaires au bon déroulé des expériences.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cohorte, dans un milieu enrichi, et observés quotidiennement par l’expérimentateur, ou une personne compétente dans un établissement agréé de façon à maximiser leur confort et limiter une quelconque souffrance. Pour le transport des animaux, vu la courte distance entre les 2 EU (5 km), celui-ci sera effectué par véhicule personnel. Les cages seront positionnées de manière à ce qu'elles ne puissent bouger ni se renverser pendant le transport. Les conditions environnementales seront maintenues pendant le transport (on vérifiera la température du véhicule avant le transport). Les cages de transport contiendront de l'eau et la nourriture gélifiés ainsi que des enrchissements (frissure et morceaux de bois à ronger). Les souris sont habituées à l’expérimentateur et à l’expérimentation afin de limiter leur angoisse et le stress. Pour chacune des procédures, des points limites adaptés ont été définis. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et les injections d'agent inflammatoire sous anesthésie gazeuse. Pour les tests comportementaux mesurant les seuils de douleur, les animaux gardent le contrôle sur le test: le retrait de la patte de l'animal ou de la queue met fin au test, ou l’animal change de compartiment. Le test est de toute façon toujours arrêté au seuil nociceptif de l’animal et des points limites spécifiques ont été défini pour éviter toute lésion des tissus. En cas de nécessité des décisions seront prises en accord avec le vétérinaire, la Structure chargée du Bien-Etre des Animaux et/ou le personnel zootechnique de l’institut pour stopper tout signe de mal-être de l’animal.
Choix des espèces
Les objectifs du projet consistent à étudier le rôle du récepteur GPR10 dans la modulation de la nociception et de la douleur. Pour ce faire, il nous est indispensable de travailler sur un modèle entier et complexe prenant en compte les cascades de réactions, les voies de signalisation, la communication entre les organes afin d’être dans des conditions au plus proche de la complexité humaine. Le modèle murin présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences et notamment dans la compréhension des mécanismes de la douleur. En plus de sa proximité physiologique avec l’Homme, la souris possède également une forte homologie génétique faisant d’elle un bon modèle d’étude de la douleur. Par ailleurs, la souris permet des délétions conditionnelles qui est la base d’étude de ce projet. Des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines, poids supérieur à 20g) car l’étude des comportements dans nos différents modèles nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures. Pour le génotypage, les souriceaux seront utilisés entre 5 et 7 jours car la minéralisation des os de la queue ainsi que le développement de la vascularisation ne sont pas encore complets, ce qui minimise la souffrance des petits.
Effet de l’inhibition d’un transporteur du tubule proximal sur la fonction rénale des souris atteintes par la maladie Dent
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, chacune passant cinq jours en cage à métabolisme sur une grille métallique de surface réduite. Les souris génétiquement modifiées pour reproduire la maladie de Dent perdent protéines et calcium dans leurs urines et développent une fibrose rénale. À 4 mois, puis pour une partie d'entre elles à 7 et 10 mois, elles subissent une mesure de composition corporelle en tube clos, une anesthésie pour mesurer la filtration rénale avec risque d'hypothermie et de détresse respiratoire, puis un prélèvement sanguin sous-mandibulaire qui peut provoquer une hémorragie. Toutes sont tuées à 4 ou 10 mois pour prélever les reins.
Objectifs
La maladie de Dent de type 1 est une maladie rénale rare caractérisée par une perte urinaire de protéines et de calcium, la présence de calculs rénaux, et une insuffisance rénale progressive. La maladie est causée par des mutations d’une protéine appelée ClC-5. Jusqu'à présent, il n'existe pas de traitement spécifique pour cette maladie. Une souris modifiée génétiquement présentant les mêmes traits cliniques observés chez les patients a été générée. L’objectif de ce projet est d'identifier des pistes thérapeutiques pertinentes pour ralentir la progression de la maladie et freiner l’apparition de l'insuffisance rénale. Certains inhibiteurs de transporteurs du tubule proximal montrent des effets néphroprotecteurs prometteurs dans de nombreuses maladies rénales chroniques. Aucun effet délétère majeur n’a été recensé suite à l’utilisation de ces traitements dors et déjà administrés à de nombreux patients souffrant de problèmes néphrologiques. Notre objectif est d'étudier les effets d’un traitement inhibiteur ciblant un transporteur du tubule proximal sur l’évolution de la maladie de Dent de type 1.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer l’effet d’un inhibiteur ciblant un transporteur du tubule proximal afin de ralentir l’évolution de la maladie de Dent 1, une pathologie conduisant à l’insuffisance rénale. Il n’existe pour le moment que des traitements symptomatiques de la maladie., en vue d’améliorer la fonction rénale des patients atteints par cette pathologie. En faisant appel à l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés, celui-ci aura un impact significatif sur la santé humaine car il permettra d’apporter une preuve de concept sur la capacité de ce médicament, déjà disponible sur le marché et donc prescriptible, à ralentir l’apparition de l'insuffisance rénale dans le cadre de la maladie de Dent.
Procédures
Un premier lot de souris recevra ou non un traitement dans leur nourriture en croquette. Ces souris ne changeront plus de régime alimentaire jusqu'à la fin de leur vie. A 4 mois, une mesure non invasive de composition de la masse corporelle sera effectuée en plaçant les souris dans un tube clos pour la mesure (environ 2 minutes). Ensuite, une mesure de la filtration rénale sera effectuée impliquant une anesthésie, la pose d’un capteur de fluorescence maintenu par un adhésif adapté, une injection intra-veineuse du traceur fluorescent (environ 10 minutes) puis un suivi sur animal vigile d’environ 2 heures. Après, ces souris seront placées en hébergement dans une enceinte spécifique permettant de prélever l’urine durant 5 jours (3 jours d’habituation et 2 jours de d'expérience). A l’issue de cet hébergement, un prélèvement sanguin de faible volume sera réalisé sur souris vigiles (environ 1 minute). Ensuite, les animaux seront soit euthanasiés (groupe 4 mois) ou retourneront en stabulation en attendant la prochaine phase d’analyse (groupe 10 mois). En effet, le groupe 10 mois, repassera par la même série d’analyses précédemment décrites à 7 mois et à 10 mois avant euthanasie et prélèvements. Un second lot de souris recevra ou non un traitement dans leur nourriture en croquette. Ces souris ne changeront plus de régime alimentaire jusqu'à la fin de leur vie. A 4 ou 10 mois, les organes seront récupérés après l’euthanasie effectué sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
Les souris présentent un phénotype dommageable avec une diminution de la filtration rénale, une augmentation de l’excrétion de solutés tels que les protéines et le calcium, augmentation de la fibrose rénale. Toutefois, nous anticipons une amélioration progressive avec l’âge de la fonction rénale des animaux génétiquement modifiés et traités. Cependant, l’addition dans la nourriture de l’inhibiteur de transporteur du tubule proximal pourrait engendrer un léger stress des souris. Les souris seront hébergées en cage à métabolisme. Ce type d’hébergement peut générer des nuisances sur les animaux car ceux-ci sont hébergés, et ils se déplacent sur une grille métallique de surface réduite. A l’issue de leur hébergement en cage à métabolisme, les souris auront un prélèvement de sang sous-mandibulaire. Celui-ci est susceptible de causer une douleur de courte durée associée à la piqûre de l’aiguille, mais également une hémorragie. Par ailleurs, les souris seront anesthésiées pour la mesure de leur débit de filtration glomérulaire. Cette intervention est susceptible de générer une hypothermie et une détresse respiratoire. Enfin les souris seront placées dans un tube clos pour la mesure de la composition corporelle pouvant entraîner un léger stress le temps de la mesure de résonance nucléaire magnétique.
Devenir
L’ensemble des animaux devront être euthanasiés à 4 ou 10 mois pour permettre de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses.
Remplacement
Dans la mesure du possible, le remplacement des animaux pour des méthodes alternatives (par exemple des cellules en culture) est préférable. Toutefois, seules des études sur des animaux nous permettront de déterminer l’effet des traitements sur leur phénotype rénal (notamment les modifications des contenus urinaires et plasmatiques, les altérations histologiques et moléculaires des cellules rénales) en comparaison avec celui des animaux non traités.
Réduction
Ce projet a une durée de 5 ans, et nécessitera l’utilisation de 176 souris. La taille des effectifs est déterminée par notre expérience concernant ce type d’expérimentation que nous avons mené dans d’autres projets au laboratoire. Il sera par ailleurs nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats (ANOVA un ou 2 facteurs et test de student). Nous limiterons le nombre d’animaux en réalisant des expériences sur les mêmes animaux.
Raffinement
Durant leur hébergement en stabulation, les animaux auront un accès libre à la nourriture et à de l’eau filtrée, et seront placés dans des cages ventilées. L’environnement des animaux sera enrichi avec du nid végétal, des cylindres en carton, des bouts de bois et/ou des maisons. L'hébergement en cages à métabolisme sera lui aussi réalisé dans l'établissement utilisateur. Par ailleurs, la détermination quotidienne du poids, de l’apparence physique et du comportement des animaux durant leur hébergement en cages à métabolisme nous permettra de définir les points limites nécessitant une euthanasie de l’animal. De plus, la mesure de la filtration rénale sera effectuée sous anesthésie. Pour le prélèvement de leurs reins, les animaux recevront au préalable une anesthésie suivie d’une euthanasie. L’ensemble des expériences sera mené en présence de personnels hautement qualifiés dans des locaux d’hébergement respectant les standards en vigueur.
Choix des espèces
Nous avons choisi de mener nos expériences chez la souris, car seuls des modèles animaux nous permettront d’évaluer l’effet de cet inhibiteur de transporteur du tubule proximal visant à ralentir l’évolution de la maladie de Dent 1. Nous utilisons des souris mâles contrôles et transgéniques âgées de 4,7 et 10 mois afin d’évaluer l’effet du traitement sur l’évolution de la maladie.
Identification des mécanismes impliqués dans exacerbation de l’artériopathie oblitérante des membres inférieurs
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Neuf souris diabétiques sur dix auront un à cinq ongles nécrosés après la chirurgie qui leur coupe la circulation dans la patte arrière gauche. 2 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélèvement d'organes, une partie recevant en plus quatre à cinq injections dans le ventre sur cinq jours consécutifs. L'objectif déclaré est de comprendre pourquoi l'artériopathie des membres inférieurs s'aggrave chez des patients souvent diabétiques, les nouvelles thérapies annoncées restant au stade de la perspective. Le porteur prévoit de prélever un maximum d'organes pour que ces souris servent aussi à des projets sur la démence, la néphropathie ou la rétinopathie.
Objectifs
L’ischémie critique des membres inférieurs est un problème de santé publique majeur dans les pays industrialisés ; son risque est accru par la proportion croissante de patients diabétiques ou obèses. Cette pathologie a un pronostic très sombre puisque, à un an, seule la moitié des patients survivent sans amputation majeure. Plusieurs essais thérapeutiques visant à favoriser le développement de nouveaux vaisseaux pour revasculariser le membre malade ont été réalisés mais sans succès. L’objectif de notre projet est de mieux comprendre les processus pathologiques conduisant au développement de cette maladie dans le but de proposer de nouvelles thérapies.
Bénéfices attendus
Mieux comprendre les mécanismes responsables de l'aggravation de l'artériopathie oblitérante vers le stade le plus grave de la maladie c'est à dire l'ischémie chronique menaçant le membre dans le but de proposer de thérapies pour les patients atteints de cette pathologie qui sont souvent diabétiques et qui sont aujourd’hui sans options thérapeutiques.
Procédures
Une partie des souris subiront une série de 4 ou 5 injections intrapéritonéales. Toutes les souris subiront une chirurgie de 10 minutes visant à induire une ischémie du membre inférieur gauche. Toutes les souris seront anesthésiées pour être soumises à des protocoles sans réveil.
Impact sur les animaux
Administration intrapéritonéales répétées (pendant 5 jours consécutifs) pour les souris trangéniques. Surpoids, polyurie, polydipsie pour les souris diabétiques Douleur post-chirurgicale, Nécrose des ongles des orteils (1 souris C57BL/6J sauvage/10 va avoir un ongle nécrosé suite à la chirurgie d'ischémie du membre inferieur. 9 souris diabétiques sur 10 vont avoir 1 à 5 ongles nécrosés suite à la chirurgie d'ischémie du membre inferieur).
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures dans le but de prélever des organes sur lesquels nous réaliserons des analyses post mortem.
Remplacement
L‘artériopathie oblitérante des membres inférieur est une pathologie complexe mettant en jeu des interactions diverses entre de nombreux types cellulaires locaux (fibres musculaire, cellules endothéliales, péricytes, fibroblastes) et circulants (cellules sanguines diverses). Etudier l’ensemble de ces acteurs et plus encore leurs interactions ne peut pas à l'heure actuelle être réalisé uniquement par des tests in vitro. Le recours à un organisme vivant proche de l’homme est donc nécessaire.
Réduction
Le nombre d'animaux a été calculé à l'aide d'un logiciel informatique: Pour avoir 90% de chance de mettre en évidence des différences significatives entre 2 groupes, le nombre de souris par groupe doit être 10. Ce chiffre est conforté par notre propre expérience et à celle de la communauté scientifique s'intéressant aux pathologies cardiovasculaires, 10 animaux par lot et par analyse sont nécessaires pour obtenir des résultats exploitables statistiquement aussi bien pour les mesures de l'irrigation sanguine et les analyses histologiques. Pour réduire le nombre d'animaux, aucune expérience déjà publiée ne sera reproduite. Les manipulations seront réalisées par du personnel technique entrainé de façon à réduire la variabilité des résultats donc le nombre d'animaux nécessaires. Les animaux des groupes "contrôles", traités de façon identiques, mais inclus dans différentes procédures seront dès que possible utilisé dans plusieurs "expériences ou procédure". Le nombre de souris nécessaires à la réalisation de ce projet sera ainsi réduit. Le premier objectif de ce projet est de mieux caractériser la physiopathologie de l'ischémie chronique des membres inférieurs, cependant nous prévoyons de prélever un maximum d'organes pour réutiliser ces souris dans des projets s'intéressant notamment à la physiopathologie d'autres pathologies micro vasculaires comme la démence, la néphropathie, la rétinopathie.....
Raffinement
L’hébergement des animaux sera réalisé dans des conditions qui limiteront le stress et l’inconfort (animalerie agrée, personnels formés, cage de 3 à 6 animaux maximum en portoir ventilé avec libre accès à l’eau et à la nourriture ainsi qu’un environnement enrichi avec igloo cartonné et serpentins de papier à dérouler). La souffrance des animaux sera réduite par l'usage d'anesthésiques et d'antalgiques adaptés pour la réalisation des gestes douloureux et la mise en place de points limites. D'autre part, les animaux seront surveillés quotidiennement par le zootechnicien, le responsable du bien-être animal ou l'expérimentateur. Dès le début des expérimentations, une fiche de suivi « bien-être » sera créée. Le bien-être des animaux sera alors gradé ce qui permettra d'apporter dans les plus brefs délais la mesure adaptée à l'animal.
Choix des espèces
La souris est un modèle de mammifère à sang chaud dont l'organisation structurale du réseau vasculaire a de forte ressemblance avec celui de l'homme. Par ailleurs, il existe dans cette espèce des individus présentant des mutations spontanées prédisposant au diabète de type 2 (facteur de risque cardiovasculaire). Aussi, il existe des souris transgéniques permettant d'invalider certains gènes d’intérêt. Des souris adultes âgées de 8 semaines (début du protocole) à 6 mois (fin du protocole) seront utilisées. Notre objectif n'est pas d'étudier des processus développementaux mais des processus physiopathologiques. Pour être sûr de ne pas induire de phénotype lié à une anomalie du développement. L'invalidation de nos gènes d'intérêt sera induit chez des animaux âgés d'au moins 8 semaines.
Influence de la consommation d’alcool sur la consommation de cocaïne
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
240 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélèvement du cerveau. Chacun subit une chirurgie d'une demi-heure pour la pose d'un cathéter permanent dans la veine jugulaire, puis s'auto-administre cocaïne et alcool pendant environ quatre mois, avec jusqu'à trois prises de sang par ce même cathéter. Le porteur attend un taux d'attrition de 20 % sur la durée et prévoit deux cohortes de trente rats par variable testée. Il présente le choix de l'espèce comme un compromis évolutif, le rat étant assez proche de l'humain pour valoir modèle et assez éloigné des primates non-humains, qu'il range parmi les espèces plus sensibles.
Objectifs
La cocaïne est la deuxième drogue illégale la plus consommée en Europe et son utilisation a augmenté au cours des 10 dernières années. Cette consommation est souvent associée à une consommation d’alcool. Notre projet a pour but d’étudier chez le rat de laboratoire l’influence de l’alcool sur la prise de cocaïne et d’identifier la signature neurobiologique de cette influence en mesurant l'activité globale du cerveau. Selon notre hypothèse générale, l’état d’intoxication produit par l’usage d’alcool devrait non seulement inciter à une consommation accrue de cocaïne mais aussi à un affaiblissement des capacités de contrôle sur cette consommation, notamment dans les situations qui requièrent qu’un tel contrôle soit exercé. Au plan neurobiologique, l’influence de l’alcool sur la consommation de cocaïne devrait se traduire par une diminution correspondante de l’activité neuronale dans les régions du cerveau responsables du contrôle de la récompense et de la motivation.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont essentiellement d’ordre scientifique. Le premier bénéfice sera de préciser la nature de l’influence de l’état d’intoxication produit par l’usage d’alcool sur la perte de contrôle sur la consommation de cocaïne. Le second bénéfice sera d’identifier les régions du cerveau responsables de cette influence grâce à une mesure de l'activité globale du cerveau.
Procédures
Tous les rats seront soumis à une chirurgie intraveineuse de courte durée (30 min en moyenne) pour la pose d'un cathéter intraveineux à demeure. Cette chirurgie est effectuée sur couverture chauffante en conditions aseptiques alors que les animaux sont sous anesthésie chimique et sous analgésie. Un prélèvement de sang veineux (0,15 ml) sera réalisé pour mesurer l’alcoolémie et certains métabolites de la cocaïne. Ce prélèvement sera effectué via le cathéter intraveineux installé à demeure dans la jugulaire. Cette méthode de prélèvement est indolore. Ce prélèvement sera répété au maximum 3 fois, avec un intervalle d’au moins 2 semaines entre prélèvements.
Impact sur les animaux
Les animaux seront testés dans des procédures dont le degré de gravité principal est léger et qui ne dépassera pas le degré modéré. Bien que toutes les précautions soient prises afin de prévenir ou de minimiser les nuisances au maximum (anesthésie, analgésie anti-inflammatoire, conditions aseptiques, traitement antibiotique, suivi post-opératoire…), il est possible que certaines nuisances ou effets indésirables puissent survenir suite à la chirurgie ou pendant l’auto-administration de cocaïne et d’alcool. Les nuisances attendues après la chirurgie comprennent : un possible risque d'inflammation ou d'infection ; une apparition de plaies dues à un toilettage excessif de la zone opérée ; une perte des points de suture avant cicatrisation complète. Nous n’anticipons pas de nuisances particulières pendant l’auto-administration de cocaïne et d’alcool, hormis un possible risque d’infection lié à l’utilisation chronique de la voie d’administration intraveineuse. Les animaux seront sous surveillance quotidienne pour repérer et prévenir tout problème éventuel.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront euthanasiés et leurs cerveaux seront prélevés post-mortem pour effectuer une mesure de l'activité globale du cerveau.
Remplacement
Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du rat de laboratoire (Rattus Norvegicus, jeunes adultes, mâles et femelles), vivant en groupe dans un environnement enrichi contenant un tunnel en carton et un os à ronger. Ce recours à l’animal se justifie pour les raisons éthiques suivantes : 1) l’éthique humaine actuelle interdit l’utilisation d’interventions invasives chez l’homme, compliquant ainsi l’étude directe des relations causales entre usages de différentes drogues ; 2) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces relations causales ; 3) l’influence de l’usage d’alcool sur la prise de cocaïne ne peut pas être récapitulée sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire à la bonne réalisation du projet sera réduit au minimum. Ce nombre représente un compromis entre le principe de réduction, les contraintes expérimentales propres au projet et les différentes variables à tester. Pour tester chaque variable, il faudra deux cohortes de 30 rats chacune (une de mâles et une de femelles) pour un obtenir un effectif final suffisant, prenant un taux d’attrition de 20 pourcents au bout de 4 mois. Donc le nombre total d’animaux utilisés pour tester les quatre variables du projet sera égal à 240 rats.
Raffinement
Les animaux seront logés par groupe de 2 dans des cages munies d’un environnement enrichi contenant un tunnel en carton et un os à ronger afin de limiter le stress et l’ennui. Toutes les chirurgies (30 min en moyenne par animal) seront réalisées sous analgésie, sous anesthésie chimique et en conditions aseptiques sur couverture chauffante. En fin de chirurgie, l’animal recevra une injection sous-cutanée de sérum physiologique pour favoriser la réhydratation. L’animal sera ensuite placé dans une cage de réveil sur une couverture chauffante jusqu’au réveil avec libre accès à l'eau et à la nourriture. Après le réveil complet, l'animal sera relogé dans sa cage de stabulation avec son congénère. Les animaux seront sous surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter d’éventuels signes d'inconfort, de stress ou de douleur et y remédier rapidement. Nos méthodes d’interventions pour réduire ou supprimer l’inconfort ou la douleur seront gradées. Quand nous constaterons les premiers signes d'inconfort chez un animal, nous mettrons en place des mesures de nursing avec un accès facilité à l’aliment (nourriture posée sur le sol de la cage). Si cela ne suffit pas, l’animal recevra plusieurs doses d’analgésique. L'animal sera aussi réhydraté par injection sous-cutanée de sérum physiologique. Enfin, si cela ne suffit pas au rétablissement de l'animal, celui-ci sera mis à mort sans souffrance.
Choix des espèces
Le choix du rat de laboratoire (R. Norvegicus, lignée Wistar) constitue une sorte de compromis du point de vue de l'évolution biologique. Cette espèce est suffisamment proche de l'espèce humaine (même classe [Mammalia], divergence de leur ancêtre commun il y a environ 100 MYA) pour servir de modèle animal valide des phénomènes d’addiction par rapport à d’autres espèces moins sensibles éthiquement (par exemple, les invertébrés, à l’exception sans doute des céphalopodes) et en même temps suffisamment éloignée par rapport à d’autres espèces plus sensibles (par exemple les primates non-humains). Les espèces invertébrées (par exemple, C. Elegans, D. Melanogaster, A. Californica) peuvent être utilisées pour élucider certains mécanismes neuronaux ou génétiques de certains effets comportementaux des drogues mais l’organisation nerveuse et comportementale de ces espèces est beaucoup trop éloignée de celle de l’être humain pour constituer des modèles animaux valides dans le domaine des addictions. Les animaux utilisés seront tous de jeunes adultes au début des expériences (âge moyen 3 mois demi). Cette période du développement correspond à la période de plus grande vulnérabilité face à l’addiction.
Etude de la cardioprotection au cours de l’infarctus en ciblant la voie extrinsèque de l’apoptose. Influence du sexe et des hormones femelles
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Commandées chez un fournisseur à 7 ou 11 semaines pour subir un infarctus entre 12 et 14 semaines, 2 595 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 1 611 d'entre elles et sévère pour 984, toutes tuées pour prélèvement du cœur. Une ligature d'artère coronaire suivie de reperfusion leur provoque l'infarctus, certaines femelles subissant en plus une ovariectomie, la pose d'un implant hormonal et deux frottis vaginaux, dont l'un sur animal vigile. Les protocoles longs ajoutent cinq prélèvements sanguins sur animal vigile et quatre échocardiographies d'une demi-heure sous anesthésie. Sur la réduction, le porteur indique que l'analyse statistique se fera au fil des expériences afin d'arrêter d'inclure des animaux dès que la différence devient significative.
Objectifs
Le seul traitement pour sauver un patient lors de l’infarctus du myocarde est de réouvrir l’artère occluse le plus rapidement possible. Cependant, malgré des effets bénéfiques immédiats associés à l’arrêt des lésions d’ischémie, la reperfusion induit des effets indésirables, appelés lésions de reperfusion, du fait du retour brutal du sang oxygéné dans le muscle cardiaque ischémique. Il est admis que le taux de mortalité précoce (30 jours post-infarctus) est plus élevé chez les femmes que les hommes. Bien que le rôle des hormones sexuelles au cours de l’infarctus soit loin d'être univoque, de nombreuses données suggèrent que les hormones sont impliqués dans les différences liées au sexe au sein des maladies cardiovasculaires et ont été montrées cardioprotectrices. Il est essentiel de mener des recherches expérimentales pour mettre au point des stratégies thérapeutiques spécifiques aux femmes. Nous avons montré que la voie des récepteurs de mort joue un rôle crucial dans les lésions de reperfusion. Des travaux de la littérature montrent chez des femelles ovariectomisées des lésions d’infarctus plus sévères et suggèrent un lien entre hormones et mort cellulaire. Nous avons développé des stratégies thérapeutiques permettant de bloquer cette cascade de mort cellulaire au cours de l’infarctus et de la reperfusion. L’objectif de notre projet sera donc d’évaluer l’efficacité de ces stratégies thérapeutiques dans le cœur de souris femelles au cours de l’IR myocardique et d’étudier l’influence des hormones sur la mort cellulaire à court et long termes.
Bénéfices attendus
A ce jour, il n’existe aucun traitement pharmacologique disponible pour traiter les lésions de reperfusion au cours de l’infarctus. Les études jusqu’à présent n’ont considéré que de jeunes animaux de laboratoire (jeunes adultes de 8 à 12 semaines) et en majorité des mâles afin de s’affranchir de l’influence des hormones femelles qui sont décrites comme cardioprotectrices. Ce projet permettra une meilleure connaissance de la physiopathologie de l’infarctus dans le cœur de femelles, afin de pouvoir développer et de tester des stratégies thérapeutiques pour le sexe féminin, répondant à un besoin sociétal actuel compte tenu de la recrudescence des cas observés les 15 dernières années. De plus, ce projet sera le premier à étudier l’implication de la mort cellulaire dans les cœurs de souris femelles au cours de l’infarctus et sa dépendance au statut hormonal ainsi que dans l’insuffisance cardiaque post-infarctus. Puis, ce sera également la première évaluation de l’effet cardioprotecteur des nos molécules thérapeutiques dans le cœur féminin . Ce projet devrait permettre de réussir la translation vers la clinique en permettant notamment de développer un traitement de l'infarctus, destinés aux patients (2ème cause de mortalité masculine) et à des patientes (1ère cause de mortalité féminine devant le cancer du sein) à risque d’infarctus.
Procédures
In vivo court terme : 3 injections de produits anesthésiants + 1 chirurgie sous anesthésie ; 1 injection létale et 1 prélèvement sang total et cœur (10 min) In vivo court terme avec réveil : 3 injections de produits anesthésiants; 1 chirurgie sous anesthésie (selon procédure de 1h10 à 1h30) + 1 injection létale et 1 prélèvement sang total et cœur (10 min). 3 prélèvements sanguins sur animal vigile In vivo long-terme avec réveil: 5 injections de produits; 1 chirurgie sous anesthésie + 5 prélèvements sanguins sur animal vigile + 4 échocardiographies sous anesthésie gazeuse (30 min chacune) + 1 injection létale + 1 prélèvement sang total et cœur (10 min). * en plus pour les femelles: 1 frottis vaginal sur animal vigile et 1 frottis vaginal sous anesthésie . Quand ovariectomie : chirurgie sous anesthésie gazeuse (30 min); 5 injections de produits, 1 Pose d’implant (10 min);
Impact sur les animaux
- Pour le frottis vaginal, les souris subiront l'inconfort de la contention et du geste gynécologique. - Pour le protocole in vivo d’échographie, les animaux subiront le stress de la préhension par l’expérimentateur puis ils auront une anesthésie gazeuse avec une première phase d’induction le stress sera de courte durée à l’endormissement et au réveil. - Pour l’ovariectomie et la mise en place d’implants, outre le stress de préhension qui sera de courte durée avant l’anesthésie gazeuse, les animaux subiront des douleurs post-chirurgicales qui seront gérées par des antalgiques lors des phases de réveil. - Pour le protocole de chirurgie d’ischémie-reperfusion myocardique, les animaux subiront un stress lié à la contention et une douleur légère de courte durée à l’injection intramusculaire d’anesthésiques ainsi qu’un inconfort lié aux sutures. Les douleurs post- chirurgicales seront gérées avec des analgésiques. - Prélèvements sanguins : procédure réalisée sur animal vigile non anesthésié, ce qui peut constituer un stress et une douleur légère.
Devenir
L'analyse de la cardioprotection nécessite de prélever le coeur en fin de protocole expérimental et donc de mettre à mort chaque souris incluse dans ce projet.
Remplacement
Il n’y a pas d’alternatives non-animales disponibles pour ce projet. Dans le cadre du développement d’un médicament, la cardioprotection par les peptides thérapeutiques doit se mesurer à la fois en terme d’effets vasculaires et musculaires et par conséquent sur cœur entier. Les expériences in vivo à court terme permettent d’évaluer s’il y a bien un ciblage des outils pharmacologiques développés dans le tissu cardiaque après une injection intraveineuse en aigu. Les expériences in vivo avec suivi à long terme, permettent de mimer ce qui se passe dans la condition clinique chez les patients et donc d’évaluer l’effet de la molécule à long terme sur le tissu cardiaque tout en considérant la métabolisation et l’élimination des molécules mimant la situation clinique.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux, et dans la mesure du possible, plusieurs mesures seront faites sur chaque individu : échographie, dosage marqueurs sériques, analyse de la cicatrice d’infarctus par histologie. Ensuite concernant les tests statistiques : prévision à priori du nombre de souris afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les nombres de souris à inclure dans les groupes de traitement ont été définis à priori afin de garantir des résultats statistiquement significatifs avec un nombre minimal d’animaux. Pour les expériences comprenant une ligature de coronaire, un groupe Sham d'animaux (protocole complet sauf ligature) sera inclus en réduisant à n=6 souris pour chaque contingent. Ensuite, l’analyse statistique permettra de faire les comparaisons statistiques. Elle se fera au fur et à mesure des expériences afin d’arrêter d’inclure des animaux dès que la différence est significative.
Raffinement
- Conditions d’hébergement : les cages de stabulation sont enrichies (maisons en cartons) pour limiter le stress. - Chirurgie cardiaque : les protocoles ont été optimisés de manière à ce qu’ils soient le moins invasifs possible. Il est important de noter que l'utilisation de substances anesthésiques permet de limiter la souffrance des animaux pendant les procédures. - La phase de réveil permettra une récupération optimale de l’animal : réchauffement, oxygénothérapie et hydratation (poche sous-cutanée de sérum physiologique injectée dès la dernière phase de la chirurgie) et hygrométrie contrôlée. Une feuille de suivi avec grille de scores et points limites sera mise en place. - L’échographie transthoracique et l’injection d’implants sous- cutanés sont réalisées sous anesthésie gazeuse. - Pour l’ovariectomie, l’anesthésie gazeuse est complétée par l’injection d’analgésique.
Choix des espèces
L’espèce Mus musculus a été choisie pour développer les modèles d’étude de l’équipe. Les raisons sont : - Les résultats obtenus par l’équipe montrent que ce modèle est proche de l’Homme : par exemple, le Post- conditionnement ischémique est une technique cardioprotectrice qui fonctionne aussi bien chez la souris que chez l’Homme (ce n’est pas le cas pour le rat). - De plus, l’Homme et la souris possèdent 99% de gènes homologues donc le choix de la souris est très avantageux pour une étude qui permet d’étudier les effets d’une molécule qui sera développée en thérapeutique ; - Petite taille et faible prix des animaux ; - Les conditions d’hébergement compatibles avec celles proposées par l’Institut où seront réalisées les expériences. Les animaux femelles : les femelles jeunes qui seront ovariectomisées seront commandées à 7 semaines et subiront un infarctus entre 12 et 14 semaines. Pour les femelles jeunes non ovariectomisées : elles seront commandées à 11 semaines et subiront un infarctus entre 12 et 14 semaines. Les animaux mâles : seront commandés chez le fournisseur à 11 semaines pour être utilisés entre 12 et 14 semaines pour les animaux mâles jeunes.
Caractérisation et comparaison de deux modèles d’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Fabriquer chez la souris deux versions d'une insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée, puis comparer laquelle ressemble le plus à la maladie humaine : 60 souris vont être utilisées pour cela dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement du cœur. 22 reçoivent par chirurgie un réservoir sous la peau diffusant un produit en continu, 22 autres suivent cinq à neuf semaines de régime gras avec un produit pharmacologique dans l'eau de boisson. Toutes sont immobilisées deux à trois fois pendant un quart d'heure pour la mesure de pression artérielle, et endormies pour l'échocardiographie. Une grille de score portant sur l'apparence, le comportement et les signes cliniques déclenche selon le résultat une analgésie supplémentaire ou la mise à mort.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde. Parmi elles, l’insuffisance cardiaque a un pronostic grave, avec plus de 75% des hommes et plus de 50% des femmes décédant 5 ans après le diagnostic. L’insuffisance cardiaque est une incapacité du cœur à fournir suffisamment de sang à l’organisme, tout d’abord en condition d’exercice physique, puis avec l’évolution de la pathologie également au repos. Ce mauvais fonctionnement du cœur peut venir de défauts pendant sa contraction ou pendant son relâchement. Jusqu’à maintenant, une majorité d’études se sont intéressées au défaut dans la contraction cardiaque (insuffisance cardiaque à facteur d’éjection réduite). Cependant, depuis quelques années, des études cliniques ont démontré que chez les patients avec un défaut principalement dans la relaxation cardiaque (insuffisance cardiaque à facteur d’éjection préservée) la mortalité est similaire ; il s’avère que les traitements actuels, développés pour les défauts de contraction, ne sont pas adaptés. De plus, un effet lié au sexe est possible car il y a plus de femmes que d’hommes souffrant de cette maladie. Une limite majeure pour étudier les mécanismes de la maladie et développer de nouveaux traitements est le manque de modèles expérimentaux. Cette maladie étant fréquemment associée à plusieurs facteurs de risque tels l’obésité et l’hypertension, nous allons tester deux modèles qui combinent l’insuffisance cardiaque avec une obésité (génétique ou par régime gras) et une hypertension (par traitement pharmacologique). Le but de ce projet est de comparer deux modèles expérimentaux qui présentent des caractéristiques similaires à la condition clinique, et de réaliser les premières études sur les défauts au niveau des cellules.
Bénéfices attendus
L'insuffisance cardiaque est une maladie affectant plus d’1 million de personnes en France dont environ la moitié souffrent d’insuffisance cardiaque à facteur d’éjection préservée. Cela représente un coût socio-économique et humain majeur pour le système de santé en France. La fonction cardiaque et la qualité de vie chez les patients souffrant de cette maladie sont gravement altérées. En effet, le cœur de ces patients n’arrive pas à éjecter suffisamment de sang vers les organes car il n’arrive pas à se relâcher suffisamment durant la phase de relaxation. Ce dysfonctionnement conduit à une intolérance à l’exercice physique et à des effets néfastes sur d’autres organes comme les poumons (hypertension pulmonaire) et les muscles du reste du corps. Les traitements contre l’IC à fraction d’éjection réduite ne sont pas ou peu efficaces pour les patients souffrant d’IC à fraction d’éjection préservée. Il est donc essentiel de poursuivre la recherche pour mieux comprendre la maladie et trouver des traitements. Le bénéfice principal attendu de ce projet est d’établir un modèle expérimental que reproduit bien l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée. Ce modèle pourra ensuite être utilisé par différentes équipes au niveau de notre laboratoire et au niveau national et international afin de déterminer les mécanismes et tester des thérapies adaptées.
Procédures
22 animaux seront soumis à une intervention chirurgicale légère sous anesthésie et sous analgésie : implantation sous la peau d'un petit réservoir qui diffuse un médicament en continu ; durée de la chirurgie, environ 10 minutes. 22 animaux seront soumis à un régime alimentaire particulier (riche en gras) et un produit pharmacologique dans leur eau de boisson ; 5 à 9 semaines. Tous les animaux auront une mesure de la pression artérielle : mesure non invasive mais qui nécessite l'immobilisation des animaux ; durée environ 15 minutes, 2 à 3 fois. Tous les animaux auront une exploration de la structure et fonction cardiaque : mesure non invasive par échocardiographie, sous anesthésie.
Impact sur les animaux
L'implantation sous la peau du réservoir peut causer une douleur liée à l'ouverture et la suture de la peau.
Devenir
A la fin du projet, tous les animaux sont euthanasiés car nous avons besoin de prélever les cœurs ainsi que d'autres organes pour faire d'autres analyses pour caractériser les modèles.
Remplacement
Le cœur est un organe complexe, composé de plusieurs compartiments et de plusieurs tissus spécialisés. Il comporte plusieurs sortes de cellules au rôle et au propriétés spécialisées. Il n’existe actuellement aucun système cellulaire (lignées, organoïdes, organes bio-artificiels ou organs-on-a-chip) qui permette d’analyser la fonction et les défauts cardiaques. Ainsi le recours à des modèles animaux reste impératif. De plus, notre étude vise à comparer des modèles pathologiques, il est donc indispensable d’étudier le cœur intégré à l’organisme ; les modélisations par ordinateur ne sont pas suffisantes pour mimer une telle complexité. Il est donc nécessaire pour l’évaluation de la fonction cardiaque d’utiliser un mammifère entier adulte afin de s’approcher le plus possible des mécanismes physiopathologiques humains. La souris est un bon modèle car les gènes impliqués sont largement conservés.
Réduction
Une planification à l’aide de logiciels de statistiques nous a permis de déterminer le nombre d’animaux minimum nécessaires pour obtenir des résultats fiables. De plus, nous allons obtenir les données de la fonction cardiaque par des méthodes non invasives, ce qui permet de mesurer plusieurs fois sur le même animal et donc de réduire le nombre d’animaux. Le groupe de souris contrôle (sans pathologie) est commun aux deux modèles.
Raffinement
Les animaux hébergés au sein de l’animalerie seront pris en charge et observés pendant toute la durée de leur présence. Les cages des animaux seront enrichies et les animaux seront suivis par un personnel spécifiquement formé. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles, dans une pièce où les paramètres environnementaux (température, hygrométrie, lumière) et sanitaires sont contrôlés. Les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne et de pesées régulières en fonction des procédures. Une grille de score a été définie, évaluant les paramètres suivants : apparence, comportement naturel et provoqué, signes cliniques. Des points limites, en fonction du score obtenu selon cette grille, ont été décidés, menant à l’administration d’analgésie supplémentaire ou à l’euthanasie. Toutes les procédures impliquant une chirurgie sur l'animal seront pratiquées en utilisant des anesthésiques et analgésiques.
Choix des espèces
La souris est un des modèles les plus utilisés en recherche biomédicale. La structure des tissus musculaires et cardiaques de la souris sont très proches de celle de l’homme et la plupart des gènes conservés. De plus les souris se reproduisent rapidement et de nombreuses études sur l’insuffisance cardiaque ont été réalisées chez la souris ce qui nous permettra plus tard de discuter nos résultats par rapport aux autres études publiées. Des souris adultes âgées de 3 mois (adulte) seront utilisées car les maladies cardiaques se déclarent essentiellement à l’âge adulte.
Cibles cellulaires thérapeutiques dans une maladie du système immunitaire : le lupus
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Attrapées et immobilisées à la main pour recevoir jusqu'à cinq injections dans le ventre en quinze jours, certaines souris subissent en plus un prélèvement de sang sous anesthésie générale dont la cicatrisation prend vingt-quatre heures. 1 380 souris, dont une lignée génétiquement modifiée qui développe une pathologie lupique, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 480 d'entre elles et modéré pour 900. Le porteur écrit que ni douleur chronique, ni souffrance permanente, ni environnement angoissant ne sont attendus, et qualifie lui-même de "dommageable" le génotype qu'il utilise. Toutes sont tuées en fin de procédure pour analyse des organes, ceux des souris témoins servant en plus à des cultures cellulaires.
Objectifs
Le projet a pour but d'analyser l'implication de cellules immunitaires rares (les basophiles et les éosinophiles) dans le contrôle des facteurs immunitaires responsables d’une maladie inflammatoire chronique, complexe et autoimmune (quand le système immunitaire se retourne contre l'organisme lui-même) : le lupus érythémateux systémique (LES). Les traitements actuellement utilisés dans cette maladie chez les patients ne sont pas spécifiques et ont de lourds effets secondaires. Il est donc important de mieux comprendre ces maladies et de développer des approches thérapeutiques innovantes. Dans ce but, des souris génétiquement modifiées au niveau des cellules d’intérêt seront utilisées pour évaluer l’importance de ces cellules et de leurs médiateurs (des molécules qu'elles libèrent) dans le développement et le maintien de la maladie. Le projet a également pour objectif d’étudier l’efficacité thérapeutique de l'élimination de ces cellules ou de leur injection dans un modèle murin de la maladie afin de pouvoir développer l’approche chez l’humain.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet se situent à deux niveaux. Le premier niveau concerne les connaissances scientifiques car le projet permettra d’accroître la compréhension du développement du LES et les mécanismes de l’amplification de la maladie. Le deuxième niveau se situe au niveau de la santé humaine. En effet, la compréhension de ces mécanismes et la validation de nos cellules d'intérêt comme cible thérapeutique dans le lupus permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes ciblant les basophiles et/ou les éosinophiles et/ou les mécanismes décrits. Le but est d’améliorer la prise en charge des patients atteints de lupus qui n’ont pas accès à des traitements spécifiques dénués d’effets secondaires.
Procédures
Un génotype (gène absent dans une lignée de souris) dit dommageable (souris LynKO) est utilisé dans le présent projet. Ces souris développent une pathologie lupique légère mais cependant quantifiable. Les animaux utilisés dans ce projet seront soumis à 3 types d’interventions : 1- des injections dans le ventre (« intrapéritonéales ») qui induiront une douleur brève de piqûre. Ces injections sont aussi efficaces que des intraveineuses pour disperser le composé injecté dans tous le corps mais moins contraignantes pour les souris. 2- des contentions (souris attrapées et immobilisées dans une main) : cet acte induit un stress bref pour les souris, mais sont indispensables pour réaliser les injections. 3- certaines souris seront soumises à un prélèvement d’un petit volume de sang (0.1 mL) une seule fois sous anesthésie générale. Ce geste peut induire un léger inconfort pour la souris le temps que la cicatrisation de la veine soit complète (24 heures). Ce prélèvement permettra de comparer les paramètres sanguins de la maladie avant le traitement et à la fin de la procédure. Chacun des gestes réalisés durent moins de 30 secondes. L'anesthésie générale dure entre 1 et 2 minutes. Des animaux seront injectés par voie intrapéritonéale cinq fois au maximum sur une période de 15 jours. Ces interventions seront réalisées dans l’attention et la bienveillance au bien-être animal autant que faire se peut.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables induits sur les animaux seront un stress bref et des douleurs brèves. La contention des animaux induira un stress bref passager chez les animaux. Les injections induiront une légère douleur de piqûre brève. Les prélèvements sanguins (une seule fois) peuvent induire un léger inconfort pour la souris le temps que la cicatrisation de la veine soit complète (24 heures).
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés en fin de procédure afin d'en analyser les organes d'intérêts.
Remplacement
Les études des maladies de systèmes (impactant différents organes) et de leurs traitements (validés ou expérimentaux) nécessitent de pouvoir tester les hypothèses sur des organismes entiers avant de pouvoir passer chez l’humain. La localisation et l’activation des cellules d’intérêt au cours du développement des maladies étudiées ne peuvent être observées que dans des organismes entiers. Les études in vitro (dans des systèmes artificiels) ne permettent pas de reproduire la complexité des organismes ni des maladies étudiées. Malheureusement, aucune des technologies actuelles ne peut se substituer aux modèles animaux dans ce domaine. Nous ne pouvons donc pas utiliser d’autre approche que l’expérimentation animale pour les études visant à améliorer la prise en charge des patients.
Réduction
L’étude de cellules humaines ex vivo (en dehors de l'organisme) et l’analyse des échantillons de patients a permis de réduire les hypothèses de travail et ainsi de limiter le recours aux modèles animaux. Les souris contrôles des approches in vivo (dans l’organisme vivant) verront leurs organes utilisés pour des cultures cellulaires et des expériences in vitro et les organes des souris malades traitées ou non serviront de contrôles positifs ou négatifs pour des expériences ultérieures. Le nombre d’animaux nécessaires a été calculé en fonction des besoins du projet afin de pouvoir conclure scientifiquement. Le nombre d’individus à analyser par groupe d’animaux sera gardé au minimum autant que faire se peut.
Raffinement
Les animaux sont élevés en conditions standardisées afin d'éviter qu'ils soient contaminés par des agents infectieux, avec un accès illimité à l’eau et à la nourriture, et avec un contrôle de la température, du cycle jour/nuit et de l’humidité. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales pour atténuer tout stress, ne sont jamais isolés et sont toujours hébergés avec des accessoires d’enrichissements (cotons pour nidifier, jouets type maisonnette pour pouvoir se cacher). Ni douleur chronique, ni souffrance permanente, ni environnement angoissant ne sont attendus dans le présent projet. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale. La contention des animaux reste nécessaire aux injections par voie intrapéritonéale (dans le ventre) prévues ce qui engendrera un stress bref chez les animaux. Ces pratiques seront réalisées dans l’attention et la bienveillance au bien-être animal autant que faire se peut. Les souris seront observées quotidiennement afin de s’assurer de leur bien-être.
Choix des espèces
Les études d’une approche thérapeutique innovante sur un modèle de pathologie humaine doivent être réalisées sur des modèles animaux afin de justifier le passage aux tests chez l’Homme. Notre projet s’inscrit dans cet objectif et toutes les mesures permettant de limiter le nombre d’animaux utilisés ainsi que les éventuelles souffrances subies par ces animaux seront entreprises. L’espèce Mus musculus domesticus est le seul modèle de mammifères disposant des lignées modifiées génétiquement pertinentes pour les objectifs scientifiques de notre projet. Les animaux entrant en procédure auront tous un âge supérieur ou égal à 8 semaines (stade adulte). Tous les animaux seront utilisés avant 41 semaines d’âge pour éviter tout risque de souffrance des individus.
Traitement de modèles murins de la maladie d’Alzheimer par des mini-anticorps ciblant des protéines du cerveau
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Injectées dans le ventre ou dans le nez, puis soumises à des épreuves censées mesurer la mémoire, l'exploration et les comportements répétés, des souris porteuses de mutations modélisant la maladie d'Alzheimer reçoivent entre quatre et quarante injections espacées d'une semaine. 960 souris sont déclarées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour prélèvement de structures cérébrales. Le détail des procédures cite pourtant 540, puis 960, puis 2 880 souris, soit un total très supérieur à l'effectif déclaré. Aucun des tests comportementaux n'est nommé, et le porteur conclut à l'absence de souffrance attendue en s'appuyant sur des études déjà publiées.
Objectifs
La démence touche environ 50 millions de personnes dans le monde, et atteindrait 139 millions de personnes en 2050. La maladie d’Alzheimer représente 60 à 70% des démences et se classe 5ème cause de mortalité dans le monde. Seuls 4 médicaments ont été autorisés sur le marché, mais ne sont plus remboursés depuis 2018 en France dû à leur efficacité limitée. Récemment, des immunothérapies ciblant un des marqueurs de la pathologie ont été autorisées, mais leur approbation est controversée à cause de leurs effets secondaires. Il est donc urgent de mettre au point des stratégies thérapeutiques efficaces contre cette pathologie. Des anticorps produits chez les camélidés, appelés mini-anticorps et 10 fois plus petits qu’un anticorps classique, apparaissent comme outils prometteurs pour franchir les barrières entre le sang et le cerveau. Ils promettent également moins d’effets indésirables grâce à leur haute spécificité pour leur cible. Le laboratoire a ainsi développé, produit et optimisé plusieurs mini-anticorps ciblant des récepteurs connus pour être dérégulés et impliqués dans la maladie d’Alzheimer. Ce projet vise ainsi à évaluer les effets pharmacologiques des mini-anticorps dans différents modèles de la maladie d’Alzheimer. Pour cela, le projet se découpe en trois parties : (1) Evaluation de la spécificité des mini-anticorps pour les différentes cibles dans le cerveau. (2) Evaluation du passage de la barrière sang-cerveau par les différents mini-anticorps. (3) Evaluation de traitements chroniques sur des modèles de souris transgéniques Alzheimer.
Bénéfices attendus
Le projet permettrait d’évaluer les différents mini-anticorps produits et optimisés au laboratoire, et de sélectionner les mini-anticorps prometteurs dans le traitement de la maladie d’Alzheimer. Les principaux avantages de ces molécules sont leur haute spécificité, leur capacité à moduler uniquement les récepteurs impliqués dans la maladie d’Alzheimer, et peu ou pas d’effets secondaires. On souhaite donc mettre en place une nouvelle génération de stratégies thérapeutiques, qui engendreraient moins d’effets secondaires.
Procédures
L’intégralité des souris sera soumise à minima à une injection intra-péritonéale pour l’anesthésie en vue de la mise à mort, 540 souris ne seront que dans ce cas-ci. Pour étudier le passage des mini-anticorps dans le cerveau, 960 souris recevront une injection intra-péritonéale ou intra-nasale de mini-anticorps ou de tampon salin (480 souris pour chaque mode d’injection). Elles recevront aussi une injection intra-péritonéale pour l’anesthésie en vue de la mise à mort pour un temps total de 30min entre l'injection d'anesthésiques et la mise à mort. Concernant les traitements chroniques, les 2880 souris restantes recevront entre 4 et 40 injections intra-péritonéales de mini-anticorps ou de tampon salin, espacées d’une semaine. Ces mêmes souris seront également soumises à divers tests comportementaux évaluant les déficits cognitifs. Un test permettra d'évaluer la mémoire, un autre évaluera les capacités exploratoires de la souris, et un dernier test permettra de mesurer les comportements répétés. Elles recevront aussi une injection intra-péritonéale pour l’anesthésie en vue de la mise à mort pour un temps total de 30min entre l'injection d'anesthésiques et la mise à mort. Ponctuellement, une anesthésie gazeuse sera effectuée avant l’anesthésie médicamenteuse pour des prélèvements de fluides biologiques, pour une durée comprise entre 2 et 3h.
Impact sur les animaux
Une douleur légère produite par l’introduction d’une aiguille au cours de l’administration des mini-anticorps peut être attendues. L’injection par voie intra-nasale pourra induire un stress à l’animal, dû à la contention plus longue. D’après des études déjà publiées, aucune souffrance, douleur ou angoisse ne sont attendues après traitement avec des mini-anticorps.
Devenir
L’ensemble des animaux est destiné à être euthanasié afin de pouvoir prélever des structures d’intérêt pour analyse.
Remplacement
Le sujet de l’étude étant l’évaluation des effets pharmacologiques et comportementaux chez la souris, le remplacement de l’animal n’est pas envisageable. La maladie d'Alzheimer est une pathologie complexe à plusieurs échelles, moléculaire et comportementale. De même, l’évaluation d’une immunothérapie prend en compte divers critères qui doivent être translationnels à une immunothérapie sur l’Homme. En effet, il n’existe aucun modèle de recherche qui puisse mimer les effets thérapeutiques des mini-anticorps injectés et la complexité de l’organisme répondant à cette immunothérapie, d’un point de vue moléculaire et comportemental, d’où le besoin d’un modèle animal transgénique (Alzheimer).
Réduction
Les études préliminaires ont permis de réellement identifier et sélectionner les mini-anticorps prometteurs dans des traitements sur la souris, afin de réduire au maximum les études sur l’animal. Tout au long de ce projet, plusieurs étapes permettront d’affiner la sélection des mini-anticorps, ce qui diminuera le nombre de souris qui ne seront pas nécessaires pour les étapes suivantes. La dernière partie de l’étude sur l’évaluation d’un co-traitement pourra être réduite drastiquement, voire non réalisée, si les résultats n’y montrent pas un intérêt suffisant. De plus, l’utilisation de mâles et de femelles est une question de santé publique afin d’évaluer au mieux les effets du traitement qui peuvent différer entre les deux sexes, notamment dans la maladie d'Alzheimer.
Raffinement
Les données préliminaires obtenues au laboratoire et présentes dans la littérature scientifique n’indiquent aucune toxicité possible liée à l’injection de mini-anticorps. Il n’est donc pas attendu de souffrance chez les animaux qui seront injectés. Les animaux seront sous surveillance journalière par le personnel zootechnicien. Différents paramètres seront observés : les processus neuro-inflammatoires, suivi de paramètres comportementaux généraux et cognitifs, ainsi que le suivi de l’amélioration ou l’aggravation de la pathologie. Avant les tests comportementaux, les souris seront soumises à plusieurs séances d’habituation pour diminuer le stress. Au vu des données disponibles dans la littérature scientifique, aucun symptôme de douleur n’est attendu pour ces modèles de souris. Les souris seront hébergées en groupe dans un milieu enrichi, avec un accès à l’eau et la nourriture ad libitum.
Choix des espèces
Nous utilisons des modèles génétiques de souris qui développent la maladie d’Alzheimer. Ces modèles peuvent donc être utilisés pour évaluer l’évolution des déficits cognitifs lors des traitements avec les mini-anticorps. Les modèles de souris déficientes des récepteurs cibles sont indispensables pour avoir des contrôles fiables de la spécificité des mini-anticorps en vue des traitements chroniques. Les animaux seront traités à une dose unique entre 2 et 6 mois pour évaluer la spécificité des mini-anticorps et leur passage dans le cerveau. Ces âges-ci correspondent à un développement du cerveau bien achevé. D’autres animaux seront traités chroniquement à partir du sevrage et jusqu’à 11 mois d’âge au plus tard, là où les déficits cognitifs seront bien établis.
NIAGARA : Implication des noyaux paraventriculaires dans la neurogenèse hypothalamique et sensibilité au régime alimentaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour prélèvement de tissus. La moitié reçoit pendant trois jours un régime riche en graisses, une partie subit une injection dans le ventre chaque jour pendant une semaine, et des prélèvements sanguins sont faits au niveau de l'œil sous anesthésie locale. Le bénéfice annoncé reste interne à la recherche : identifier une population de cellules souches dans une région précise de l'hypothalamus et observer sa réaction au régime gras. Le porteur affirme que la flexibilité métabolique ne peut pas être reproduite en culture cellulaire et qu'il faut "utiliser l'organisme dans son ensemble".
Objectifs
Des cellules spécialisées, nommées tanycytes, se trouvent dans une partie du cerveau appelée l'hypothalamus, région qui contrôle la prise alimentaire et le métabolisme. Ces cellules agissent comme des cellules souches neurales : elles génèrent de nouveaux neurones et cellules cérébrales. Un régime riche en graisse peut perturber la formation des tanycytes et leur devenir, entraînant ainsi des problèmes métaboliques. Cependant, certains organismes ont développé des mécanismes pour s'adapter à ce type de régime et éviter l'obésité. Ce mécanisme, appelé flexibilité métabolique, est la capacité d'ajuster le métabolisme en fonction de la disponibilité des nutriments. De manière intéressante, des cellules similaires aux tanycytes ont été découvertes chez les souris résistantes à l'obésité dans une région de l’hypothalamus où ils n’ont pas encore été décrits, les noyaux paraventriculaires. Il s’agit de noyaux qui bordent le ventricule de part et d’autre de celui-ci, d’où leur nom de « paraventriculaire ». Ces cellules, renommées dans cette étude les tanycytes-like sont peu présentes voire inexistantes chez la souris de laboratoire sensibles à l'obésité. Cette découverte suscite des questions sur le rôle de ces cellules, similaires aux tanycytes, dans le contrôle du métabolisme. Cette étude a deux objectifs : 1) déterminer si les tanycyte-like, sont des cellules souches neurales et 2) déterminer si ces cellules se multiplient et produisent plus de neurones en réponse à un régime alimentaire riche en graisses uniquement chez les souris résistantes à l’obésité, (en comparaison avec de souris sensibles à l’obésité). Si c’est le cas, cela suggèrerait que les tanycyte-like donnent au cerveau de la souris résistante à l’obésité une capacité d'adaptation spéciale à des signaux extérieurs, tels que le régime alimentaire.
Bénéfices attendus
Cette recherche identifierait une nouvelle population de cellules souches neurales dans une partie spécifique du cerveau et évaluerait comment elles réagissent à différents régimes alimentaires. Cela ouvrirait la voie à de nouvelles explorations sur le rôle des noyaux paraventriculaires et des tanycyte-like dans la capacité de l’organisme à s'adapter à des régimes variés. Les résultats pourraient également expliquer pourquoi certaines souris sont plus résistantes aux problèmes métaboliques que d'autres. En fin de compte, cette étude aiderait à comprendre les mécanismes liés à des maladies métaboliques et à mieux saisir comment l'hypothalamus fonctionne dans des conditions alimentaires changeantes.
Procédures
La moitié des animaux seront soumis à un régime riche en graisse pendant 3 jours. Une partie des animaux recevra également une injection intrapéritonéale par jour pendant 7 jours d’un traceur qui permet de marquer et suivre les cellules nouvellement formées. Cette intervention ne nécessite aucun anesthésiant, mais les animaux seront surveillés les heures suivants l’injection. Des prélèvements sanguins seront réalisés au niveau de l’œil, après anesthésie locale par gel d’oxybuprocaine 0,4%. Les souris seront euthanasiées à la fin de l'expérience.
Impact sur les animaux
Nos procédures ont été précédemment testées pour minimiser tout impact négatif sur les souris. Dans une étude antérieure, un régime riche en graisses administré pendant 3 jours a entraîné une augmentation de seulement 4% du poids corporel chez les souris. Cependant, chez les souris naturellement résistantes à l‘obésité, ce régime n'a eu aucun effet sur le poids corporel. Les injections répétées du traceur pendant une semaine ne semblent pas avoir d'effets nocifs ou toxiques sur les souris, ce qui rend ces deux interventions légères et sans effets indésirables sur les animaux.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure car des prélèvements de tissus et analyses sont nécessaires post-mortem.
Remplacement
Nous souhaitons combiner des approches in vitro et in vivo pour étudier la capacité de prolifération des tanycyte-like. Pour confirmer qu'une cellule est une cellule souche neurale, nous devons utiliser les deux approches, et il est crucial d'inclure une approche sur animal entier. Les études physiologiques liées au métabolisme ne peuvent être menées qu'avec des animaux vivants, car le métabolisme est un processus complexe qui nécessite un système intégré. Ainsi, les effets du régime riche en graisses sur les cellules des noyaux paraventriculaires ne peuvent être observés qu'en examinant les cerveaux des souris. Nous devons donc confirmer à la fois in vivo et in vitro la capacité des tanycyte-like à proliférer, ainsi que leur destin cellulaire. Cela nous permettra ensuite de comprendre leur rôle potentiel dans la flexibilité métabolique. De plus, la flexibilité métabolique ne peut pas être reproduite dans des expériences de culture cellulaire, c'est pourquoi nous devons utiliser l'organisme dans son ensemble pour étudier ce phénomène.
Réduction
Nous utiliserons cinq animaux par groupe et par expérience dans notre étude, ce qui est considéré comme le nombre minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables et statistiquement significatifs. Utiliser moins d'animaux serait préjudiciable à la qualité de nos données et conduirait à une utilisation inutile d'animaux. Au final, nous estimons qu'un total de 100 animaux est nécessaire pour atteindre les objectifs de notre étude, tout en maintenant une puissance statistique suffisante. Pour analyser nos résultats sans compromettre la précision statistique, nous utiliserons une méthode adaptée aux petits échantillons qui garantira la robustesse de nos conclusions.
Raffinement
Nous surveillerons de près le poids corporel et la consommation alimentaire des animaux chaque semaine. Si des effets négatifs tels que la prostration, la non-alimentation ou des blessures étaient observés, l'animal serait retiré du groupe expérimental et euthanasié si nécessaire. Pendant toute la durée de l'expérience, nous veillerons à enrichir l'environnement des animaux avec une maisonnette et un bâtonnet à ronger. De plus, les animaux auront la possibilité de construire leur nid avec du coton pour favoriser leur bien-être. Même si les souris doivent être isolés pour évaluer la quantité de nourriture consommée, les contacts olfactifs et visuels avec leurs congénères sont conservés. Chaque cage sera équipée d'un igloo pour offrir un refuge aux animaux, ainsi que de matériel de nidification (plusieurs bâtons de ouate) et des bâtonnets de bois à ronger pour les stimuler et enrichir leur environnement. Pour les prélèvements sanguins, un gel anesthésiant sera appliqué au niveau de l’œil pour éviter toute éventuelle douleur.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme modèle biologique pour notre étude. Les souris sont largement utilisées en recherche scientifique, ce qui a permis d'accumuler des connaissances approfondies sur de nombreux aspects physiologiques et comportementaux liés à l'équilibre énergétique. Notre recherche se base sur la différence de contrôle métabolique entre deux souches de souris déjà bien caractérisées au laboratoire, ce qui constitue le fondement de notre étude. Tous les protocoles que nous utiliserons ont été spécifiquement adaptés et validés pour les souris, avec un contrôle rigoureux des paramètres vitaux. Nous travaillerons avec des souris jeunes adultes, c'est-à-dire des animaux âgés de 2 mois.
Mesure de la biodisponibilité et de la pharmacocinétique de produits pharmacologiques chez la souris – Prélèvements répétés
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Jusqu'à vingt et une administrations espacées de huit heures et dix micro-prélèvements de sang à l'extrémité de la queue, sur quarante-huit heures au minimum : 1 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour recueillir les échantillons. Le projet mesure la concentration sanguine de quatre-vingts candidats médicaments par an pendant cinq ans, à raison de trois souris par condition testée. Le porteur écrit renoncer à toute grille de score parce qu'un score obligerait à maintenir la souffrance de l'animal pour en suivre l'évolution, et prévoit la mise à mort dès 2 à 5 % d'écart de poids. Le choix de la souris tient à ce qu'elle est l'espèce la plus utilisée pour cette mesure et à ce que sa petite taille consomme moins de composé, certains candidats médicaments étant difficiles à synthétiser.
Objectifs
Pour le développement de nouveaux médicaments, il est nécessaire d'étudier le devenir de la substance active dans l'organisme, dans le but de déterminer : l’absorption, la distribution, le métabolisme et l’élimination du composé (ADME), des propriétés qui vont influencer la posologie du candidat-médicament (dose administrée et fréquence d'administration). L’objectif scientifique est de suivre la concentration sanguine de produits pharmacologiques en cours de développement chez la souris. Les produits pourront être de différentes natures (chimique, peptidique, oligo-nucléotidique) et/ou pour diverses applications : analgésie, anti-inflammatoire, antibiotique, immunodépresseur, anticancéreux, cardio-protecteur, anti-arthrosique, antidépresseurs, neuro-protecteur…
Bénéfices attendus
La mesure de la concentration sanguine au court du temps des candidats-médicaments permettra de sélectionner les plus adaptés et d’en affiner la posologie (dose et fréquence d’administration) selon les résultats de l’ADME. Ce projet s'inscrit pleinement dans les étapes indispensables au développement des candidats-médicaments. Il permet de réduire drastiquement le nombre de candidat-médicament à tester dans les études d’activité et le nombre d'études nécessaires pour mesurer ensuite l’activité des candidats-médicaments sélectionnés, tout en augmentant les probabilités d'obtenir un médicament.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections pour l'administrer les candidat-médicaments étudiés. Les candidat-médicaments et médicaments étudiés seront administrés 1 à 21 fois avec un minimum de 8h entre chaque administration. Une anesthésie de quelques minutes est nécessaire pour le rasage des animaux et pour les administrations ID, IN, IT. Afin de suivre la concentration sanguine du candidat médicament au cours du temps, un maximum de 10 micro-prélèvements de sang (environ 1min) seront réalisés à l’extrémité de la queue et sur une durée minimum de 48h.
Impact sur les animaux
Les injections entraînent une douleur légère de courte durée, de même que la section de la pointe de la queue (moins d’un demi millimètre) utilisée pour permettre les prélèvements sanguins.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses
Remplacement
Les candidats-médicaments auront été sélectionnés préalablement pour leur activité et leur innocuité sur les modèles cellulaires, ainsi que pour leur caractéristiques pharmacochimiques (solubilité, stabilité plasmatique et microsomale…). Cependant, tous les essais réalisés ne peuvent prédire avec exactitude l’ADME d’un composé car aucun modèle alternatif (bio-informatique, moléculaire et/ou cellulaire) n’est suffisamment intégré et complexe pour reproduire l’ensemble des phénomènes biologiques impliqués dans l’absorption, la distribution, la dégradation et l’élimination des médicaments. Ces phénomènes biologiques sont liés à la circulation sanguine, aux barrières biologiques et aux voies d'élimination (dégradation par le foie, élimination biliaire et rénale...) et régulent l’activité des médicaments. Pour ces raisons, une approche chez l’animale reste indispensable pour sélectionner les candidats-médicaments les plus prometteurs avant de poursuivre leur développement. La mesure de la pharmacocinétique sera réalisée chez le souris, car cette espèce est la plus utilisée pour cette approche dans le cadre du développement des candidats-médicaments.
Réduction
La réalisation des procédures par un technicien rompu à ces manipulations garantit une bonne reproductibilité et permet de limiter le nombre d’animaux à engager dans les protocoles. La procédure expérimentale parfaitement maîtrisée permet une mesure efficace à l’aide de 3 souris par condition testée. La mise en place de micro-prélèvements répétés chez un même animal permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux utilisés pour suivre la concentration sanguine des candidats médicaments. Les résultats sont exploités sous la forme de courbes cinétiques et aucune comparaison statistique n’est requise. Il est prévu de mesurer la pharmacocinétique de 80 composés chaque année sur une période de 5 ans soit un maximum de 1200 souris.
Raffinement
La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance. La souris étant un animal social, les souris seront maintenues en groupes sociaux, dans des cages enrichies d’un tube de change et de matériaux de « nidification ». Une période d'acclimatation et d'habituation de 2 semaines sera respectée mais pourra exceptionnellement être ramenée à une semaine minimum en cas de contraintes temporelles (délai de livraison, délai trop court avant une période de travaux ou avant le vide sanitaire suivant…). Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long de l’étude, avec un suivi journalier de l’état des animaux par l’expérimentateur. Les souris seront anesthésiées pour permettre certaines administrations (intranasale, intratrachéale, intradermique, intramusculaire). Les souris seront alors placées sur un tapis chauffant afin de prévenir une hypothermie durant l’anesthésie. La douleur liée aux injections est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Les animaux seront particulièrement surveillés après l’administration des candidats-médicaments ou des sondes, pour mettre en évidence tous signes de toxicité imprévue qui nécessiterait la mise à mort de l’animal. Aucun animal ne sera maintenu en vie s’il présente des signes de douleur ou d’inconfort. Pour cette même raison, aucun « scoring » n’est envisagé, car il nécessite de maintenir la souffrance de l’animal pour en évaluer l’évolution. Il arrive cependant qu’aucun signe extérieur de douleur ne puisse être observé, et que seule une perte ou absence de prise de poids soit mise en évidence. Dans ce cas, les animaux seront mis à mort dès la mise en évidence d’une différence significative (généralement dès 2 à 5% d’écart). Les micro-prélèvements de sang sont réalisés sur les animaux vigiles et non contraints (sans boite ou tube de contention), à même de signifier librement tout manquement
Choix des espèces
La mesure de la pharmacocinétique est réalisée chez la souris, car cette espèce est la plus utilisée pour cette approche dans le cadre du développement des candidats-médicaments. Certain candidat-médicament sont très difficile à synthétiser et la petite taille de la souris nécessite beaucoup moins de composé. Enfin, ce choix permet aussi de mesurer l’ADME d’un composé chez la même espèce que pour les futures études d’activités, elles-mêmes nécessitant le plus souvent le recourt à des animaux génétiquement modifiés, plus facile à trouver ou générer chez la souris. L’âge des souris sera déterminé en fonction de l’objectif scientifique et de la pathologie visée. Les souris seront âgées d’au minimum 4 semaines afin que la procédure puisse être réalisée sans remettre en cause le bien-être de l’animal.