Recherche fondamentale
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Analyse des anomalies de cellules du cerveau dans un modèle de lésions cérébrales induites par la naissance prématurée chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Injectés d'interleukine 1 bêta pendant leurs cinq premiers jours de vie pour provoquer une inflammation cérébrale, des souriceaux peuvent en mourir dans 5 à 10 % des cas. 3 508 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements de cerveau. Le projet teste un traitement donné au sevrage pour éliminer les cellules microgliales, puis évalue à 2 mois la mémoire par un test de peur qui associe une sonnerie à trois chocs électriques à la patte, et le comportement social par le choix entre un congénère inconnu et un objet. Une partie des souris subit à 45 jours une incision de la peau du crâne et une perforation de l'os pour l'injection d'un produit qui lèse le cerveau, opération qui peut entraîner, dans 10 % des cas, des infections, des troubles de la conscience persistants ou des troubles moteurs. Le porteur retient des souris blanches pour la taille des portées et les "qualités maternelles" des mères, censées limiter le stress des souriceaux injectés sans anesthésie.
Objectifs
La prématurité est la première cause de mortalité et de handicap chez les enfants de moins de 5 ans. Un lien causal entre infection maternelle et naissance prématurée a été mis en évidence. En effet, une réaction inflammatoire chez le fœtus peut entrainer une inflammation cérébrale et par conséquent, des lésions cérébrales connues sous le nom d’encéphalopathie du prématuré. Ces lésions favorisent ensuite l’apparition de troubles du développement neurologique, en particulier les troubles du spectre autistique. Parmi les acteurs clés de l'inflammation cérébrale, on retrouve les cellules microgliales ou microglies, cellules immunitaires résidentes du cerveau. La morphologie et les fonctions des microglies sont altérées lors d’un stimulus inflammatoire précoce, conduisant notamment à des altérations moléculaires et comportementales (diminution du comportement social) caractéristiques des troubles du développement neurologique. De plus, il a été montré dans des modèles animaux associant une inflammation néonatale à une deuxième agression cérébrale, cette fois à l’âge adulte, un phénomène de sensibilisation, aggravant l’intensité de cette 2ème agression. Le remplacement spontané de ces cellules microgliales altérée par de nouvelles cellules, après leur élimination par un traitement médicamenteux (que l'on nomme recolonisation microgliale), pourrait contribuer à la correction de certaines de ces anomalies dont le rétablissement de la maturité des neurones et du comportement social. Les objectifs de cette étude sont donc d’abord de préciser les conséquences de cette inflammation précoce sur la mise en place des structures cérébrales et le comportement chez les adultes des deux sexes, de déterminer le potentiel de ce traitement quant à la correction de ces troubles neurologiques, et ensuite d’étudier le rôle des cellules microgliales dans la sensibilisation à une 2ème agression à l’âge adulte, et de déterminer le potentiel thérapeutique de la recolonisation microgliale dans ce contexte.
Bénéfices attendus
Grâce à ce modèle souris d’inflammation précoce, nous déterminerons pour la première fois l'efficacité de l’élimination de cellules microgliales cérébrales altérées et leur remplacement pour traiter les troubles du développement neurologique. Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur la capacité de cette approche à être appliquée dans une stratégie médicale précise. De plus, nous déterminerons pour la première fois l'efficacité de la stratégie de renouvellement des microglies sur l’intensité des lésions cérébrales pouvant survenir à l’âge adulte dans ce modèle de trouble du neuro développement en fonction du sexe. Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur la capacité de cette approche à être appliquée dans une stratégie médicale précise.
Procédures
Les injections réalisées sur les souriceaux d’une molécule inflammatoire connue, l'interleukine-1beta (IL-1β), durant les 5 premiers jours de vie peuvent causer une douleur transitoire et locale. La séparation de leur mère le temps des injections peut causer un stress transitoire. Le traitement testé sera ensuite administré dans l’alimentation au sevrage des animaux à la troisième semaine de vie et pendant 3 semaines. Les animaux seront soumis à deux tests afin d’évaluer leur mémoire et leur comportement social à 2 mois. Pour la mémoire, les animaux recevront un léger choc électrique suite à une sonnerie à 3 reprises. Deux jours plus tard, ils seront placés dans cet environnement et leur comportement de peur lors du retentissement de cette sonnerie, se traduisant par une immobilisation de l’animal, sera évalué. En termes de comportement social, les souris auront le choix d’interagir avec un nouvel animal ou avec un objet, une préférence pour l’interaction avec l’animal est attendue. L’interaction avec le nouvel animal devrait susciter l’intérêt et constituera le critère d’évaluation (reniflements, etc.). Des animaux seront aussi soumis, à 45 jours de vie, à une chirurgie pour injection intracranienne d'un produit créant une lésion du cerveau : sous anesthésie générale, la peau du crâne est incisé, une perforation de l'os du crâne est réalisée, puis le produit en question est injecté dans le cerveau. A l’issue de la chirurgie, les animaux seront maintenus vivant 5 jours avant euthanasie pour réalisation d’analyses. Enfin, des animaux subiront une chirurgie à 60 jours afin de mesurer l’activité neuronale dans différentes zones du cerveau. Pour cela, les animaux seront endormis et un antidouleur leur sera administré. L’imagerie est ensuite effectuée. L’animal est ensuite euthanasié.
Impact sur les animaux
Pour les souriceaux durant la première semaine de vie, les injections peuvent causer une douleur transitoire et locale. Les injections induisent une inflammation, par conséquent les souriceaux peuvent présenter des signes de déshydratation, ont un retard de croissance, et un retard dans la pousse du pelage par rapport aux souris contrôles. Ces effets perdurent environ 2 semaines. Les injections peuvent également, mais rarement, entraîner une hémorragie interne dans l’abdomen, ou leur mort dans 5 à 10% des cas. Pour cette raison, l'apparition d'hémorragie sera particulièrement surveillée entre le premier et le 5e jour de vie. Bien que les injections durant les premiers jours de vie soient des gestes très rapides, ils peuvent induire un stress lié à la séparation avec la mère pendant ce laps de temps. Concernant le traitement médicamenteux pour éliminer les cellules microgliales, il sera administré pendant 3 semaines dans le régime alimentaire ou par injection pendant 5 jours selon les résultats d’une étude préliminaire. Les effets indésirables qui pourraient survenir incluent un changement de la structure du visage et du crâne. Les tests comportementaux peuvent également induire un stress chez l’animal, en particulier le test comprenant un choc à la patte. Pour cela, nous avons déterminé les durées minimales nécessaire afin d’étudier ces comportements pour minimiser la présence de nos animaux dans des environnements qui pourraient impacter leur bien-être. La chirurgie n’induira pas de nuisances, l’animal étant endormi par anesthésie et sa douleur contrôlée par un antidouleur, il est ensuite euthanasié. Concernant les injections intracrâniennes du produit créant une lésion cérébrale, il s’agit d’une chirurgie pouvant entrainer des douleurs (incision de la peau du crâne et perforation de l'os du crâne) qui sera pris en charge par administration d'un traitement antidouleur, et dans de rares cas (10%) : - des infections du site opératoire - des troubles de la conscience persistants - des troubles moteurs. Ces complications peuvent entrainer un défaut d’hydratation et d’alimentation des animaux. Une surveillance spécifique est donc mise en place post procédure.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés aux stades d’intérêt (Jour 42 et 60 après leur naissance) pour les analyses. Les prélèvements de cerveaux permettront d'étudier de manière approfondie l’inflammation cérébrale et l’efficacité du traitement pour la protection du cerveau en développement.
Remplacement
L’étude de la complexité de la réponse inflammatoire au niveau cérébral, ses conséquences et son traitement requiert l’utilisation d’un organisme vivant complet avec une maintenance du milieu physiologique et des interactions entre les différentes cellules et organes à plusieurs stades de développement. Pour cela, cette étude n’est envisageable qu’in vivo.
Réduction
Le nombre minimum d’animaux est utilisé pour traiter des données statistiquement exploitables. De ce fait, il est nécessaire d’avoir n=10 animaux par groupe expérimental, avec 10% d’animaux supplémentaires dans les groupes recevant la molécule inflammatoire, compte-tenu de la mortalité probable due à l’inflammation. Une seule et même analyse sera dupliquée seulement en cas de variabilité. Les études de mises au point de nos techniques sont également indispensables et comptent le nombre minimum d'animaux. Les analyses requièrent des processus de préparation différentes, un seul et même prélèvement ne peut donc pas servir pour plusieurs analyses.
Raffinement
Les mères et les souriceaux sont hébergés dans des cages enrichies en essuie-tout pour qu’elles puissent y faire leur nid. Les femelles souris blanches ont d’excellentes qualités maternelles, ce qui constitue un bon choix pour minimiser le stress des souriceaux qui subiront la procédure d’injection, même si c’est un acte peu douloureux, réalisé sur animal sans nécessité d’anesthésie. Après le sevrage les animaux seront hébergés avec un maximum de 6 animaux par cage. Pendant les 5 jours d’injection, on surveillera la fréquence respiratoire, la recoloration des extrémités, et le tonus ; à distance de l’inflammation on réalisera une surveillance régulière pour détecter une fluctuation importante du poids ou des troubles du comportement (isolement, agressivité). Si l’un de ces points limites est atteint, les animaux concernés seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. À la fin de l’étude les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires.
Choix des espèces
Le choix de la souris est pertinent d’un point de vue scientifique en termes de reproductibilité, des connaissances biologiques de l’espèce et du temps de reproduction. L’administration de l’interleukine-1β permettra d’étudier les voies impliquées dans la neuroinflammation et établir des stratégies neuroprotectrices. Cette inflammation au niveau du cerveau pendant les 5 premiers jours de vie permet de simuler une inflammation pendant la grossesse chez l’Homme. Suite à l’inflammation, les cellules altérées dans le cerveau seront éliminées par un traitement chez les souris avant l’adolescence et remplacées spontanément par des nouvelles cellules. La correction des troubles structuraux et comportementaux sera ensuite étudiée à l’âge adulte (2 mois). En plus d’une connaissance bien établie sur le développement neurologique chez la souris, les souris blanches présentent de nombreux avantages pour une étude développementale tels que le nombre de souriceaux par portée, qui permet de réduire le nombre de femelles gestantes, ainsi que les qualités maternelles de la mère.
Etude transcriptionnelle des stades de la spermatogenèse par synchronisation chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Un médicament proposé à la bouche avec une pipette chaque jour, dès le lendemain de la naissance et jusqu'au huitième jour de vie : 105 jeunes souris mâles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Toutes sont tuées entre 70 et 84 jours par surdose d'anesthésique suivie d'une perfusion de fixateur histologique, pour prélever les testicules. Le blocage puis la relance de la différenciation des spermatogonies servent à synchroniser la spermatogenèse et à lire jour après jour les gènes exprimés, les retombées annoncées sur l'infertilité humaine et sur un contraceptif masculin restant au conditionnel. Le porteur affirme que seule une approche expérimentale sur des animaux répond à ces questions, la souris partageant selon lui 99 % d'identité de gènes avec l'être humain et les mécanismes de l'acide rétinoïque étant conservés dans le testicule.
Objectifs
La spermatogenèse décrit le processus de production des spermatozoïdes à partir des spermatogonies. Il se déroule dans les tubes séminifères du testicule, débute à la naissance et se poursuit jusqu'à l'age adulte. Il s'agit d'un processus asynchrone permettant une production continue de spermatozoïdes. Le fait que ce processus soit asynchrone rend son etude difficile. En synchronisant les testicules des animaux avec 2 médicaments on s'assure de pouvoir étudier précisément chaque étape de la spermatogenèse. Les testicules des animaux traités servent à réaliser des analyses qui permettent de mettre en évidence les gènes exprimés.
Bénéfices attendus
Dans la mesure où les médicaments utilisés ici agissent sur la différenciation des spermatogonies de la même manière chez l'homme et chez la souris, il est logique de penser que les mécanismes régissant la spermatogenèse qui sont découverts dans ce projet sont pertinents pour l'Homme. Ainsi, en identifiant les gènes nécessaires à la différenciation des spermatogonies, nous obtiendrons des pistes pour évaluer des cas d'infertilité Humaine, qui sont en augmentation constante dans le monde. De plus, la possibilité de perturber temporairement la signalisation de l'acide rétinoïque représente également une stratégie pour développer de nouveaux contraceptifs masculins non chirurgicaux.
Procédures
Toutes les interventions décrites ci-dessous nécessitent d’immobiliser les souris avec la main (contention non traumatisante de 20 à 30 secondes). L'administration de médicament pour bloquer la différenciation des spermatogonies est réalisée quotidiennement de l’âge de 2 jours jusqu'à l'âge de 8 jours. L'administration de médicament pour rétablir et synchroniser la différentiation des spermatogonies est réalisée 1 fois à l’âge de 8 jours. L'administration d’anesthésique/analgésique en dose létale pour perfuser un fixateur histologique (étape finale de mise à mort) est réalisée entre l’âge de 70 jours et 84 jours. Les souris sont sous anesthésie générale profonde en moins de 5 minutes. La perfusion qui dure 10 minutes résulte en la mort de l’animal.
Impact sur les animaux
Il y a une nuisance liée au fait que les souriceaux sont manipulés à partir du jour suivant leur naissance. Ils reçoivent quotidiennement un médicament par voie orale (à l'aide d'une pipette). La pointe de la pipette est proposée à la bouche du souriceau jusqu'à ce qu'il commence à boire. En ce qui concerne l'administration du 2ème médicament ou d’anesthésique, la douleur est similaire à celle provoquée par l'introduction d'une aiguille sous la peau.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure pour prélèvements de tissus en vue d'analyses
Remplacement
La spermatogenèse est un processus complexe qui fait intervenir plusieurs types cellulaires du testicule. Les interactions entre les cellules somatiques et des cellules germinales sont essentielles pour assurer une production continue de spermatozoïdes. Notre étude vise à examiner le profil d’expression des gènes impliqués dans la spermatogenèse dans un contexte physiologique où ces interactions cellulaires sont préservées. Il est important de souligner que seule une approche expérimentale impliquant des animaux permet de répondre à ces questions. Le remplacement par un système in vitro (1er R de la règle des 3R) est impossible.
Réduction
Dans le cadre de ce projet, nous ferons usage de souris issus d'un fond génétique mixte. Étant donné que notre étude se concentre sur la spermatogenèse, seuls les mâles (statistiquement, représentant la moitié des naissances) sont employés dans les expériences. Nous réalisons une analyse des testicules jour après jour pendant deux cycles complets de spermatogenèse, s'étalant sur une période de 15 jours. Le nombre d’animaux est calculé de manière à respecter les principes de réduction du nombre d'animaux utilisés, tout en garantissant la qualité et la robustesse statistique des résultats obtenus. Le projet est arrété dès que nous obtenons 3 animaux dont le testicule contient 1 des 12 stades du cycle de l'épithélium séminifère.
Raffinement
Toutes les mesures requises sont mises en place pour assurer le bien-être des animaux. Un nid de coton ou un nid végétal est ajouté dans chaque cage pour diminuer le stress de l’animal et faciliter la thermorégulation de l’animal, comme cela est fait dans toutes les cages. Nous surveillons régulièrement le bien-être et l’état de santé des animaux et nous apportons des soins appropriés en cas de besoin, notamment l'administration d'analgésiques. Toute modification de leur comportement indiquant une souffrance ou de l'anxiété est immédiatement signalée aux responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) afin de prendre les mesures correctives nécessaires. Les manipulations et les traitements sont effectués par un expérimentateur qualifié afin de minimiser toute perturbation potentielle pour les animaux. Nous appliquons le principe du raffinement (troisième "R" de la règle des 3R) dans notre projet en optimisant les conditions de travail avec les animaux.
Choix des espèces
Notre étude vise à identifier les gènes exprimés lors de la spermatogenèse dans un système physiologique, notamment dans ses fonctions paracrines (entre les différents types cellulaires du testicule) et endocrines (dans l'organisme entier). Seule une approche expérimentale avec des animaux permet de répondre à ces questions. D’autre part la souris possède 99% d’identité de gènes avec l’Homme, et les mécanismes cellulaires à l’œuvre et impliquant l’acide rétinoïque dans le testicule de souris sont conservés dans le testicule de l’Homme. Dans ce projet, nous utilisons des souris mâles provenant d'un fond génétique mixte. Pour couvrir la totalité des stades de la spermatogenèse nous prélevons les testicules tous les jours à partir de l'age de 70 jours, pendant 15 jours.
Etude des effets cardiovasculaires de l’infection au Sars- Cov2 dans des modèles murins EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système respiratoire
Modifiées par transgénèse pour exprimer le récepteur humain du SARS-CoV-2, les souris de ce projet sont rendues infectables par un virus qui provoque chez elles une maladie pulmonaire et parfois intestinale. 1 680 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 562 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent un prélèvement caudal pour génotypage, des administrations intranasales sous anesthésie, jusqu'à trois semaines d'hypoxie chronique, une chirurgie du cou avec injection intratrachéale et jusqu'à cinq injections intrapéritonéales. Le porteur indique que les conséquences peuvent aller de la perte de poids et de la diarrhée à l'affaiblissement, la malnutrition puis la mort, et que la mise à mort finale sert à mesurer la pression pulmonaire sous anesthésie avant de prélever les tissus.
Objectifs
L’objectif de notre recherche est de mieux comprendre les altérations vasculaires et cardiaques liées à l'infection au SARS-Cov2. Nous allons utiliser des modèles murins (des souris transgéniques exprimant le récepteur humain du virus) afin de pouvoir suivre in vivo les effets de l'infection et de l'inflammation induite par cette infection. Notre but est d'augmenter les connaissances sur les conséquences au long cours du Covid19 pour améliorer la prise en charge des patients. Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2) car des étapes ne peuvent pas être réalisées dans l'établissement d'origine et nécessite l'utilisation d'un établissement secondaire. Aucun animal supplémentaire n'est ajouté par rapport au projet principal déjà autorisé 1/2.
Bénéfices attendus
Ces études nous permettront d’évaluer au long cours les altérations de la fonction cardiovasculaire à la suite d’une infection au SARS-Cov2. Nous utiliserons 2 lignées de souris afin de déterminer les mécanismes impliqués dans ces effets. Les résultats serviront à mieux comprendre été prévenir les conséquences pulmonaires, vasculaires et cardiaques du Covid19.
Procédures
Chaque animal sera soumis une seule fois dans sa vie à un prélèvement caudal pour génotypage (EU1). Cet acte ne dure que quelques secondes. Certaines souris seront soumises à une administration intra-nasale sous anesthésie pendant 15 minutes (EU1). Certaines souris recevront dans l’eau de boisson un anti-hypertenseur pendant 10 jours (EU1). Certaines souris seront étudiées par échocardiographie effectuée sous anesthésie pendant 20 minutes (EU2). La pression artérielle sera aussi mesurée à la queue sur animaux vigiles (procédure indolore) après accoutumance à la contention pendant 5 jours (EU2). Certaines souris seront en plus soumises à une hypoxie chronique pendant 3 semaines avant l’étape finale (EU2). Pour les procédures chirurgicales sous anesthésie, la douleur sera évitée par l’administration d’anesthésiques et d’analgésiques (EU2). Certaines souris subiront une petite chirurgie au niveau du cou comprenant une anesthésie et une analgésie pendant 15 minutes et une injection intra-trachéale avant l’étape finale (EU2). Certaines souris recevront 1 à 5 injections intrapéritonéales (1 par jour) ou administrations intranasales sous anesthésie générale pendant 15 minutes avant l’étape finale (EU2). Pour toutes les souris, l’étape finale sera une procédure chirurgicale effectuée sous anesthésie avec analgésie pendant 15 minutes avant l’euthanasie (EU2).
Impact sur les animaux
Le transport des animaux entre les 2 sites peut engendrer une anxiété temporaire. L’infection induit une maladie pulmonaire et chez certains animaux une maladie intestinale avec des conséquences qui peuvent être très sévères selon la lignée murine: les plus forts sont la perte de poids, la diarrhée, l’affaiblissement allant jusqu’à la malnutrition puis la mort. les souris seront soumises à un stress hypoxique. L'hypertension pulmonaire induite par l’hypoxie chronique est modérée chez la souris normale mais pourrait être sévère chez les souris post infection induisant un stress physique. Un stress (peur ou détresse) des animaux est possible lors de l’acclimatation à la prise de pression systémique vigile. L’anesthésie peut induire des effets tels que l’hypothermie, des difficultés respiratoires ou dans les cas les plus critiques un arrêt cardio-respiratoire. La procédure chirurgicale peut également être source d’hémorragie ou de douleur post-opératoire. Les procédures d’injection peuvent potentiellement conduire à des infections.
Devenir
Les 1680 animaux inclus dans ce projet seront euthanasiés en fin d’expérimentation à l’issue d’une mesure de la pression pulmonaire sous anesthésie dans l'EU2. Les animaux sont utilisés à des fins expérimentales qui nécessitent leur euthanasie afin de pouvoir mesurer leurs paramètres hémodynamiques et étudier les tissus. Ce projet est multisite, aucun animal supplémentaire n'est ajouté par rapport au projet 1/2.
Remplacement
Pour comprendre les conséquences au niveau de la fonction et de la structure des vaisseaux pulmonaires de l’infection au SARS-Cov2, il est nécessaire d’infecter des animaux afin d’être dans les conditions les plus proches des patients et afin de conserver l’ensemble des phénomènes intervenants dans la régulation des vaisseaux pulmonaires : inflammatoires (interactions cellules immunes et cellules vasculaires), vasculaires (interactions des cellules vasculaires entre elles), respiratoires (hypoxie locale) et éventuellement nerveux. Les études in vitro ne permettent pas d’évaluer les conséquences de façon intégratives. De plus, la régulation de la pression artérielle pulmonaire ou systémique et de la fonction cardiaque ne peuvent être évaluées qu'in vivo. Cependant, une fois ces conséquences tissulaires et cellulaires identifiées in vivo, les voies et les molécules impliquées seront étudiées in vitro sur des cellules en culture (cellules vasculaires en culture) infectées ou non.
Réduction
1680 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Ces expériences n'ont jamais été réalisées ni en France, ni dans le monde, par d'autres équipes dans un protocole expérimental semblable.
Raffinement
Les volumes injectés sont les plus petits possibles en accord avec le poids de l’animal. Le poids des animaux est suivi tout au long des procédures. Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec eau et nourriture ad libitum et une température et hygrométrie constantes. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés à plusieurs et le milieu est enrichi. Les conditions d'hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l'espèce concernée dans les 2 établissements utilisateurs. Pendant l’ensemble des procédures, une surveillance quotidienne sera effectuée et le poids des animaux sera mesuré régulièrement. Les points limites seront évalués selon une grille de suivi. Après infection, les souris seront observées quotidiennement et pesées tous les jours pendant 1 semaine, puis toutes les semaines. La douleur sera soulagée par l’administration d’analgésique systémique au cours de la procédure finale. Si le comportement d'un animal est altéré, il sera pesé avec un point limite à 20 pour cent de perte de poids. Une perte de sang importante, des signes de souffrance (prostration, poil hérissé, yeux fermés) qui se maintiennent, une prostration, une incapacité à se déplacer, des yeux larmoyants et exorbités constituent également des points limites. Les infections éventuelles seront traitées localement par application de crème antibiotique.
Choix des espèces
Nous effectuons des expériences avec des souris modifiées par transgénèse afin d’humaniser les souris pour en faire un modèle d’étude de l’infection au SARS-Cov2 dont la pertinence a été démontrée comme modèle pour étudier les effets liés au Covid19. Ces modèles de souris sont plus connus et plus facilement utilisables pour des études in vivo et pour les analyses d’organes que les autres modèles animaux existants (e.g. furet). Les études sur les effets de l’infection au SARS-Cov2 seront effectuées au stade adulte, lorsque le développement pulmonaire, vasculaire et cardiaque est fini, après l'âge de 8 semaines. Les études sont débutées sur des animaux à l’état adulte (2-5 mois) mais pas âgé permettant une étude au long cours sur plusieurs mois afin d'éviter d’avoir des effets liés à l’âge en fin d’étude.
Etude exploratoire : Validation de la dose optimale de ciclosporine et des modalités d’administration dans le cadre d’immunosuppression chez le porc
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Caler la dose de ciclosporine et son mode d'administration pour de futurs projets : 6 porcelets de 8 à 14 kg sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis gardés en vie pour être réutilisés. Ils subissent jusqu'à huit prélèvements sanguins sous tranquillisation, un gavage de ciclosporine étant envisagé en dernière option, et le traitement immunosuppresseur les rend plus vulnérables aux infections. Le porteur décrit une douleur modérée lors des tranquillisations tout en classant l'ensemble du projet en gravité légère. Il affirme que ce modèle s'applique à des situations où l'animal est "indispensable", comme la création de tumeurs de grande taille destinées à tester des exérèses chirurgicales.
Objectifs
Dans le domaine de la recherche en cancérologie et thérapie cellulaire, il est essentiel d'utiliser un modèle animal pour tester la faisabilité, la sécurité et la fonctionnalité des nouvelles thérapies. Notre projet a pour les objectifs : - Établir un modèle de porc immunosupprimé et étudier plus finement le niveau d'immunosuppression. - Valider la posologie de la ciclosporine pour permettre la réalisation d'autres projets de recherche. - Valider une nouvelle préparation de médicament pour faciliter son administration. - Valider le dosage de ciclosporine en interne.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet nous permettront de mieux caractériser le modèle d’un porc immunosupprimé qui sera utilisé lors de prochaines études, et également de réduire le nombre d’animaux dans les futurs projets . En effet, il n'est pas facile d'atteindre les résultats d'immunosuppression attendus avec les doses théoriques sans avoir testé auparavant. Cela s'explique par la complexité des réponses biologiques et de la forte variabilité interindividuelle, ce qui rend crucial le besoin de vérifier l'efficacité des doses sur un modèle expérimental avant de les appliquer à grande échelle. Par conséquent, la phase de test préalable revêt une importance pour garantir la sécurité et l'efficacité des traitements immunosuppresseurs.
Procédures
Les animaux sont soumis à 8 prélèvements sanguins maximum, sous anesthésie, avec une durée maximum de 10 minutes. Si l’étude est reconduite à une durée égale, les animaux seront soumis également à 8 prélèvements sanguins maximum.
Impact sur les animaux
La principale nuisance attendue chez les animaux est le léger stress et la douleur modérée lors de réalisation des tranquillisations des animaux pour la réalisation des prélèvements sanguins. De plus, il est envisageable d’utiliser la méthode de gavage pour administration de ciclosporine (dernière option), ce qui peut induire du stress chez les animaux.
Devenir
Dans ce projet, les actes techniques à mettre en place sont peu invasifs. Ainsi, les animaux seront gardés en vie à l'issue de leur procédure, afin de pouvoir être réutilisés, prenant en compte un temps de repos suffisant ainsi que leur état de santé.
Remplacement
Notre but est de caractériser un modèle animal déjà décrit dans la littérature, avec les conditions de notre laboratoire. Ce modèle s’applique à des situations où l’animal est indispensable, comme la création de tumeurs de grande taille en vue de tester des moyens d’exérère chirurgicale, pour lesquelles il n’existe pas de moyen de remplacement actuellement.
Réduction
Au total, 6 animaux seront utilisés (3 et 3). Ce nombre d'animaux se trouve réduit au minimum nécessaire pour l'obtention de données suffisamment fiables, afin de valider le modèle animal pour les futurs projets . Grâce à cette étude exploratoire, nous prévoyons une réduction significative du nombre d'animaux utilisés, car les résultats obtenus faciliteront l'implantation des tumeurs ou des tissus, notamment dans le cas de greffes. Cela nous permettra d'optimiser l'utilisation des ressources et de limiter le nombre d'animaux nécessaires pour les études futures.
Raffinement
Afin de permettre aux animaux de s’adapter à leur environnement et de s’assurer de leur bon état de santé, une période d’acclimatation adaptée à l’espèce et au stade physiologique sera dispensée avant début de traitement. Tout au long de leur hébergement, les animaux auront des conditions d'hébergement adaptées et optimales. La taille des cages est deux fois supérieure aux normes exigées par la loi, elles sont équipées d’un tapis de couchage confortable et d’une litière épaisse.). Les paramètres d'ambiance, l'aliment, l'abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les animaux seront hébergés collectivement en groupes harmonieux. Un programme spécifique d’habituation à la manipulation par l’homme est en place. Les porcs disposeront d'un environnement enrichi (exemples : objets à manipuler de type ballon, chaîne associée à une balle en plastique etc, permettant à l'animal de jouer. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement par un personnel habilité et habitué à travailler avec des porcs. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s'il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d'un traitement thérapeutique. L’administration du traitement prescrit devra être réalisée par une personne habilitée. Un renforcement positif sera également réalisé pour obtenir leur coopération lors des opérations courantes ou de soins. Les animaux suivront également un programme de socialisation afin de réduire le stress engendré par les actes. Quant au traitement à la ciclosporine, les animaux seront plus vulnérables aux infections. Par conséquent, un équipement de protection individuelle propre sera utilisé pour prévenir l’infection. De plus, des analyses de sang, y compris une formule sanguine et une biochimie, permettront de surveiller les effets secondaires et, si nécessaire, d'ajuster la dose de ciclosporine.
Choix des espèces
Les porcs sont largement utilisés dans la recherche en cancérologie et thérapie cellulaire, en raison de leur ressemblance anatomique avec l'homme ainsi que de leur taille, qui permet de réaliser des projets dans des conditions proches de l’homme. Les jeunes animaux pesant entre 8 et 14 kg seront utilisés pour reproduire les conditions similaires à celles prévues dans les futurs projets.
Ventricule droit et insuffisance cardiaque
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
Pendant le test d'effort, les rats reçoivent des chocs électriques, l'épreuve étant arrêtée au bout de trois chocs en trente secondes ou de cinq chocs en une minute. 210 rats Wistar mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une injection unique déclenche chez eux une insuffisance cardiaque droite qui peut entraîner leur mort, puis un traitement est initié quatre semaines plus tard pendant dix ou soixante jours, avec IRM et échocardiographie sous anesthésie, mesure de la fonction rénale, test d'effort sur animal vigile, et enfin un cathétérisme cardiaque de vingt minutes sans réveil dont le porteur indique que l'animal peut mourir pendant l'examen. Les rats perdant plus de 15 % de leur poids sont tués, et le porteur retient de jeunes adultes de 200 à 220 grammes pour leur "meilleure résistance à la toxicité de la molécule".
Objectifs
Malgré des améliorations thérapeutiques majeures sur les 30 dernières années, l’insuffisance cardiaque (IC) reste associée à une mortalité et un taux de réhospitalisation à 1 an élevés. Les traitements actuellement disponibles sont efficaces pour améliorer la fonction ventriculaire gauche. Aucune thérapeutique n’a démontré son efficacité pour améliorer la fonction ventriculaire droite dans l’IC. Les gliflozines (ou SGLT2 inhibiteurs) sont des traitements qui ont récemment prouvé leur efficacité, administré seul ou en association avec des traitements classique de l’IC, pour réduire la mortalité cardiovasculaire et/ou le risque d’hospitalisation pour IC. L’effet sur la fonction ventriculaire droite de cette classe thérapeutique n’a jamais été étudié. Étant donné les mécanismes d’action connus de cette classe thérapeutique, nous faisons l’hypothèse que les gliflozines ont un effet bénéfique sur la fonction ventriculaire droite dans l’IC. En utilisant un modèle expérimental de dysfonction ventriculaire droite chez le rat, nous allons étudier si les gliflozines sont capables d’améliorer celle-ci et déterminer les mécanismes impliqués. Cela permettra d’approfondir la compréhension des mécanismes physiopathologiques impliqués avec l’objectif de développer de nouvelles stratégies pharmacologiques pour améliorer la prise en charge et le pronostic des patients IC.
Bénéfices attendus
Le modèle utilisé et le design expérimental nous permettra d’étudier l’aggravation de la dysfonction ventriculaire droite ainsi que les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la progression de la dysfonction ventriculaire droite afin d’identifier/d’évaluer de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Les Rat Wistar subiront une injection unique d'une molécule qui entraine une dysfonction du ventrciule droit au J1 de l'étude. Puis 4 groupe aurons quatre semaines après induction de l’IC droite, un traitement sera initié puis mise à mort après 10 jours de traitement et 4 autre groupe aurons quatre semaines après induction de l’IC droite, un traitement sera initié puis mise à mort après 60 jours de traitement .Chaque injection de traitement serais de quelques secondes par animal. L'analyse des effets fonctionnels (IRM et échocardiographie cardiaque) qui sera effectuée sous anesthésie pour une durée de 10 minutes/rat. La fonction rénale sera évaluée sous anesthésie gazeuse 10 minutes/rat maximum pour l'injection du traceur fluorescent suivie d'un test à l'effort qui sera effectué sur les animaux vigiles. Le protocole invasif (cathétérisme cardiaque) sera réalise sur des animaux profondément anesthésiés et sera sans réveil(durée 20 minutes / rats ).
Impact sur les animaux
Les procédures sont classées modère . L'injection de la molécule entrainera potentiellement une dysfonction du ventrciule droit .Les deux procédures mènent à une insuffisance cardiaque. qui peut entraine le décès de l'animal. Les naissances des tests d'effort sont une fatigue de l'animal qui est évalué par des chocs électriques, mais tout cela est prise en compte avec une fiche procédure qui d'écrit les points limite du test. Arrêt du test à l'effort au bout de 3 chocs électriques en 30 secondes ou de 5 chocs électrique en 1 minute. On replace l'animal dans sa cage une fois le test fini ou les points limite définie dans le protocole dépasser. Pour le cathétérisme cardiaque, l'animal subira une chirurgie pour insertion d'un capteur de pression dans la carotide pour obtenir les pressions volume au niveau du coeur du rat, chaque animal sera mise à mort à la fin du test. Il se peut que l'animal décède lors du test ce cathétérisme cardiaque.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque série d’expérimentations suite au cathétérisme cardiaque pour prélèvement d'organes.
Remplacement
Dans l’objectif de limiter le nombre d'animaux utilisés dans ce projet, nous mettrons en place certaines expériences in vitro (tests de prolifération de cellules, interactions cellules-cellules). Cependant, l’utilisation des animaux est rendue nécessaire, car il n’existe pas à ce jour de modèle d’IC in vitro et encore moins de modèle d’IC droite in vitro. Les études fonctionnelles in vivo de notre projet ne peuvent pas être remplacées par des études in vitro à cause de la complexité de la pathogenèse de l’IC droite. En effet, des études dans notre modèle animal sont nécessaires pour comprendre les altérations globales cardiaques lors du développement de l’IC droite et son traitement (altérations simultanées des lymphatiques, des cellules immunitaires, des fibroblastes et du métabolisme des cardiomyocytes, modifications progressives de l’hémodynamique ventriculaire gauche et droite). Ainsi, les procédures expérimentales ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude, nous réaliserons séquentiellement des mesures non-invasives de la fonction cardiaque droite par échocardiographie, IRM, de la fonction rénale, de la capacité d'exercice. A la phase terminale nous avons également mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements et des analyses ex vivo au moment de la mise à mort. De plus, nous avons réalisé des tests statistiques appropriés pour calculer le nombre de rats (n=24 par groupe) nécessaires afin de détecter une différence de 10%. Des résultats historiques obtenues lors des expériences précédemment effectuées dans le laboratoire ont démontré qu’un nombre de 24 animaux par groupe sont nécessaires pour des évaluations fonctionnelles telles que l’échocardiographie/IRM. Il faut souligner que l’analyse répétée en échocardiographie ou en IRM sur le même animal au cours d’une étude permet également de diminuer le nombre d’animaux par groupe nécessaire pour démontrer un effet significatif. Concernant l’induction de l’IC droite, un suivi de la survie post-administration dune sera mis en place afin d’affiner et donc de limiter le nombre d'animaux par groupe.
Raffinement
Tout au long de l’étude, les animaux seront nourris ad libitum et hébergés en groupes sociaux stables dans des portoirs conventionnés au nombre maximum de 4 par cage avec de l’enrichissement (Tunel, Kraft Paper). Les animaux seront maintenus avec un environnement contrôlé et stabilisé (température de 21°C , hydrométrie à 55% et luminosité à 100 lux avec une durée de cycle de lumière normal soit 12h/12h). Afin de limiter le stress occasionné par le transport, une période d’acclimatation d’une semaine après réception des rats sera observée avant le début des protocoles. Les conditions de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Ainsi, un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement durant toute la durée du protocole expérimental, ce qui permettra de déceler un éventuel signe de souffrance. Notre grille d’évaluation des point limites pour le bien-être animal est utilisé quand un animal présente un état de mal être ou de souffrance, il est exclu de l'étude et euthanasié en fonction de son score et de la discussion avec les membres de la cellule SBEA . Les rats perdant plus de 15 % de leur poids seront euthanasiés.
Choix des espèces
Les expériences in vivo, ne peuvent pas être remplacées par des études in-vitro, qui nécessite des études fonctionnelles et physiopathologiques sur un modèle intégré. Ainsi, les procédures expérimentales ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous allons dans ce projet utiliser essentiellement des rats, ce qui diminuera les variations dans les réponses immunitaires, et permettra une meilleure comparaison entre nos modèles. Chaque animal est identifié de façon individuelle par une puce d’identification Les rats mâles Wistar jeunes adultes (200-220 g) seront utilisés pour induire l’IC droite. Cet âge est justifié par la meilleure résistance des animaux à la toxicité de la molécule, permettant de limiter au maximum le nombre d'animaux utilisés.
Investigation de l’activité antibactérienne d’anticorps polyclonaux dans un modèle murin de sepsis
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Infectées par Pseudomonas jusqu'au sepsis, les souris traversent quarante-huit heures que le porteur décrit comme les plus critiques en douleur et en mortalité, le modèle conduisant à la mort de l'animal en l'absence de traitement. 560 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'objet est de tester l'activité antibactérienne d'anticorps polyclonaux contre une bactérie responsable de près de 10 % des infections nosocomiales et souvent résistante aux antibiotiques. Le porteur annonce une analgésie et une surveillance trois fois par jour pendant les deux premiers jours, sans préciser la dose bactérienne administrée, le nombre de groupes, ni le calcul qui aboutit à 560 souris, dont il écrit seulement que l'effectif "doit permettre de faire des analyses statistiques robustes".
Objectifs
Pseudomonas est une bactérie responsable de près de 10% des infections nosocomiales. Les infections à pseudomonas sont en augmentation et sont généralement associées à des résistances aux antibiotiques. Elles représentent ainsi une réélle menace pour la santé publique. L'objectif de ce projet est d'évaluer l'activité antibactérienne d'anticorps polyclonaux dans un modèle murin de sepsis (réponse inflammatoire généralisée associée à une infection grave).
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de valider l'activité antibactérienne des anticorps polyclonaux et de proposer une alternative thérapeutique dans un domaine ou le besoin médical est important. Ce projet pourrait aussi ouvrir la voie à de nouvelles stratégies de lutte contre les infections bactériennes.
Procédures
Les traitements se feront par voie intrapéritonéale ou sous-cutanée. Une contention légère sera faite par du personnel qualifié sur les souris pour l'administration des traitements, afin de ne pas engendrer de stress sur les souris. Ces manipulations ainsi que les piqures ne dureront que quelques secondes et la souris sera rapidement remise avec ses congénères.
Impact sur les animaux
Le modèle utilisé ici conduit à la mort de l’animal en l'absence de traitement. Il s'accompagne d'une l’inflammation locale et systémique, source de douleur et d’inconfort. Il est donc classé comme procédure sévère. Les premières 48 heures qui suivent le challenge bactérien sont les plus critiques en termes de douleur et de mortalité. A partir de 48h, l’état des souris s’améliore avec une chute des nuisances et de la mortalité.
Devenir
Après chaque expérimentation, les animaux seront mis à mort et des organes d’intérêt pourront être récupérés pour compléter les analyses.
Remplacement
Si des tests in vitro permettent d'évaluer l'activité des nouvelles thérapies, les études chez l'animal restent indispensables pour valider leur potentiel thérapeutique dans un environnement physiologique. Ces études permettent aussi de repérer une éventuelle toxicité des traitements et éclairent sur les modes d'action engagés.
Réduction
Le nombre d'animaux prend en compte le besoin de réduction (règle des 3R) et les contraintes statistiques liées au modèle et aux analyses qui seront réalisées. Le nombre d’individus par cohorte doit permettre de faire des analyses statistiques robustes.
Raffinement
Une étape d’acclimatation de 12 jours minimum sera systématiquement réalisée à l’arrivée des animaux pour éliminer le stress dû au transport et permettre l’habituation aux nouveaux locaux et personnels animaliers avant tout acte sur l’animal. En outre, les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Le nombre d’animaux par cage est de 5 pour limiter le stress de la surpopulation. Des frisottis sont placés dans la cage pour permettre aux souris de s’enfouir et se cacher. Des signes cliniques et points limites ont été définis afin de monitorer objectivement la souffrance des animaux au cours du modèle. La douleur sera évitée par injection d'analgésiques en fonction des signes cliniques observés ou en euthanasiant les animaux. Les premières 48h qui suivent le challenge bactérien sont les plus critiques en termes de douleur et de mortalité. Une attention particulière sera donc apportée durant cette période avec une surveillance des souris 3 fois par jour. Cette surveillance pourra être renforcée avec augmentation de la fréquence des passages si besoin. Une analgésie sera aussi appliquée 3 fois par jour durant les 48 premières heures du modèle (la première injection sera réalisée 15 minutes avant le challenge bactérien). A partir de 48h environ, l’état des souris traitées doit s’améliorer. L'analgésie sera alors décidée en fonction de l'état des animaux en prenant en compte les éléments suivants: morphologie générale, poids, paupières, aspect des larmes, aspect de la zone urogénitale, apathie, comportement en groupe, activité de la respiration.
Choix des espèces
Le modèle de sepsis décrit dans ce projet a été validé et caractérisé dans des publications. Nous travaillerons avec des souris femelles (les souris femelles étant plus légères elles permettent d'utiliser moins d'anticorps).
Effet de la mise en groupe des mères et de la mise à l’extérieur des lapereaux sur les profils épigénétiques sanguins de lapins de chair (1/2).
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
240 lapins de chair vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une prise de sang unique à l'oreille de moins de cinq minutes à partir de soixante-dix jours d'âge, avant leur départ à l'abattoir à soixante-dix-sept jours. 120 d'entre eux sont transportés par camion, par dix dans des caisses en plastique ajouré, de l'élevage en bâtiment vers l'élevage extérieur, un trajet de quinze minutes reporté au-delà de 25 °C parce que les lapins supportent mal la chaleur. Le porteur décrit un élevage cunicole français majoritairement en cages grillagées de moins de 0,5 m², sans enrichissement et à 45 kg par mètre carré, où les lapins ne peuvent ni ronger, ni bondir, ni se dresser, ni brouter, et il attend de ce projet des connaissances sur leur mémoire cellulaire. Il affirme qu'il n'est "pas pertinent" de recourir à des méthodes sans animaux, celles-ci ne reproduisant pas les conditions de vie d'un animal.
Objectifs
Contexte : Le mode d’élevage des animaux est aujourd’hui critiqué par la société car jugé non respectueux du bien-être animal. En France, l’élevage de lapins est réalisé en grande majorité dans des cages grillagées de petite taille (
Bénéfices attendus
L’objectif principal du projet est l’acquisition de connaissances sur l’impact de l’environnement d’élevage de lapins sur leur mémoire cellulaire. Cette acquisition de connaissance pourra à terme, et dans sa mesure, aider la filière à améliorer le bien-être et la santé des animaux en proposant des systèmes d’élevage adaptées à la physiologie et aux besoins des animaux. Une potentielle application possible serait le développement de biomarqueurs sanguins des conditions d’élevages des animaux, qui pourraient permettre une traçabilité.
Procédures
Les interventions contraignantes sont les suivantes : Pour 240 lapins maximum, une prise de sang unique d'un petit volume de sang réalisée à 70 jours d’âge minimum (durée < 5 minutes).
Impact sur les animaux
Certaines actions sont stressantes pour les animaux : (a) la contention et la douleur liée à l’introduction d’une aiguille pour la prise de sang, (b) l'élevage en semi plein-air avec un accès libre à une pâture herbagée expose les lapins aux conditions extérieures et peut engendrer un stress thermique pendant le printemps.
Devenir
L'expérience ne nécessite pas de mise à mort. Après la prise de sang, les lapins poursuivront leur élevage puis intégreront la chaîne alimentaire à 77 jours d’âge (vente à un abattoir commercial).
Remplacement
Le projet vise à caractériser l’impact de changements de méthodes d’élevage sur la mémoire cellulaire des animaux. Il n’est pas pertinent dans ce cadre d’utiliser des méthodes (in vitro, simulations) alternatives car elles ne récapitulent pas les conditions de vie d’un animal.
Réduction
Quatre lots de 60 animaux sont prévus (soit 240), pour en prélever 50 par lots en fin de croissances toute en tenant compte de pertes éventuelles lots de la croissance. Nous estimons que des groupes de 50 animaux nous permettrons de détecter des changements de l’ADN.
Raffinement
Les méthodes de prélèvements employées sont peu invasives (prise de sang à l’oreille), et sont mises en œuvre par un personnel formé et disposant des autorisations nécessaires à l'expérimentation animale, et expérimenté dans la manipulation des lapins, utilisant une contention manuelle douce et rassurante pour l'animal. Le parcours herbagé sera équipé de 2 zones d’ombrage de 2m² chacun pour limiter le stress thermique. En cas de pic de chaleur, seront aussi mis en place l'arrosage du bâtiment et une brumisation / aspersion sur le parcours, ainsi que des ventilateurs à l'intérieur du bâtiment. L'état de santé (présence de diarrhées, poil piqué, animal abattu) sera surveillé au quotidien. Les animaux malades qui ne présenteraient pas de perspectives de guérison seront euthanasiés. Les traitements seront décidés selon les recommandations du vétérinaire sanitaire. Les animaux seront vaccinés contre la myxomatose et la maladie hémorragique du lapin (VHD1 et 2). Les 120 lapins transportés de l'établissement 1 vers l'établissement 2 seront placés par dix dans des caisses de transport en plastique ajouré, homologuée pour le transport des lapins. Le camion de transport est ventilé, le trajet fait 15 minutes. Le transport sera reporté en cas de température extérieure supérieur à 25°C car les lapins sont très sensibles au stress thermique.
Choix des espèces
Les travaux ont un objectif d’acquisition de connaissances dans le cadre de changement de systèmes d’élevages de la filière de production de lapins française. Il n’est donc pas pertinent de choisir une autre espèce animale que le lapin. Les animaux seront utilisés entre le sevrage (35 jours) et la fin de l’engraissement (77 jours), pour se rapprocher les plus des conditions usuelles d’élevages dans la filière.
Développement de méthodes IRM pour la caractérisation des cicatrices d’infarctus du myocarde chez des modèles ovins (MEMRI)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Un infarctus du myocarde leur est provoqué sous rayons X, puis viennent, six semaines plus tard, trois heures d'IRM au manganèse, à sept semaines quatre-vingt-dix minutes d'IRM au gadolinium suivies d'une échographie et d'un scanner, à huit semaines une angiographie et une cartographie de contact de quatre-vingt-dix minutes chacune. 60 moutons adultes vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec une prise de sang de cinq millilitres avant chaque IRM et une première séance d'imagerie de trois heures avant l'infarctus. Le porteur qualifie la cicatrice cardiaque de non douloureuse, tout en signalant que la pose et le retrait des cathéters peuvent provoquer des saignements et que la cartographie de contact peut déclencher des tachycardies ventriculaires, un défibrillateur restant à proximité pour éviter le décès des animaux pendant les examens. Tous sont tués à la fin pour que leur cœur soit prélevé et analysé en IRM haute résolution, cartographie optique et histologie.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de développer des méthodes IRM innovantes afin d’améliorer la détection des cicatrices d’infarctus du myocarde. Les méthodes IRM développées ont pour but de détecter le tissu cardiaque vivant à l’intérieur et/ou autour de la cicatrice, et de permettre ainsi une meilleure évaluation des risques liés aux troubles du rythme cardiaque. Les données IRM seront validées en comparant avec d’autres examens d’imagerie (angiographie, échocardiographie, scanner) ainsi que des données de mesures de l’activité électrique (électrophysiologie) et de la structure du tissu (histologie).
Bénéfices attendus
Ces développements de méthodes ont pour but rendre l’examen IRM plus sensible (utilisation d’agents de contraste, amélioration de la résolution) et plus rapide (méthodes d’accélération de l’acquisition et/ou de la reconstruction des images). Ces méthodes ont pour ambition d'améliorer la caractérisation des cicatrices d’infarctus et donc de mieux diagnostiquer les troubles du rythme cardiaque chez les patients atteints d’infarctus du myocarde. Elle vise également à permettre de mieux cibler les régions du cœur à traiter, ce qui permettra de réduire les durées des procédures d’ablation chez les patients. Ces nouvelles méthodes d’imagerie pourront être directement utilisables sur l’ensemble des IRM cliniques.
Procédures
Les animaux auront une induction d’infarctus du myocarde sous fluoroscopie (imagerie à rayon X), ce qui donnera lieu à une cicatrice cardiaque non douloureuse. Les cicatrices seront analysées par des méthodes non-invasives utilisées en clinique et sous anesthésie générale avec l’administration d’une thérapie antidouleur appropriée: IRM, angiographie, échographie, scanner, cartographie de contact. Trois sessions d’imagerie seront effectuées: un examen IRM avant l’infarctus (180 min) avec injection d’agents de contraste à base de manganèse et de gadolinium, un examen IRM du manganèse (180 min) à 6 semaines après l’infarctus, un examen IRM du gadolinium (90 min) suivi d’un examen échographique (30 min) et scanner (45 min) à 7 semaines après l’infarctus. Avant chaque examen IRM, une prise de sang sera effectuée (5 ml) pour mesurer l’hématocrite (mesure de la portion du sang occupée par les cellules). A 8 semaines après l’infarctus, un protocole d’angiographie sera effectué pour déterminer l’état d’irrigation sanguine du cœur après l’infarctus (90 min), suivi d’une cartographie de contact (90 min) guidé par fluoroscopie pour mesurer les signaux électriques à la surface du cœur.
Impact sur les animaux
La pose et le retrait des cathéters pour la cartographie peuvent conduire à des saignements aux sites d’introduction. Les anesthésies générales peuvent impactées légèrement le bien-être animal en induisant une légère désorientation ou une apathie (absence d’énergie) transitoire lors du réveil. Lors des examens d’imagerie non-invasive (échocardiographie, IRM) ou mini-invasive (cartographie de contact), le bien-être animal peut être également impacté par la pose de cathéters: au niveau de la patte avant (pour la perfusion de médicaments et d’agents de contraste), au niveau de la veine fémorale et de l’abord sous-sternum (guide pour la cartographie de contact). Les procédures de cartographie de contact peuvent comporter des effets indésirables cardiaques tels que des déclenchements de tachycardie ventriculaire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour effectuer des analyses complémentaires sur le cœur prélevé (IRM haute résolution, cartographie optique haute résolution, analyse tissulaire).
Remplacement
Le développement des séquences IRM sera effectué sur des objets tests. Néanmoins, la recherche en cardiologie qui vise à améliorer la prise en charge des patients nécessite l’utilisation de modèles animaux. En effet, il n’existe pas de méthode alternative pour étudier les mécanismes pathologiques de l’infarctus du myocarde et les risques associés aux troubles du rythme cardiaque. Les méthodes IRM développées nécessitent une validation par des méthodes invasives telles que les mesures de l’activité électrique (électrophysiologie) et l’analyse de la structure du tissu (histologie). Les résultats obtenus par les méthodes d’imagerie, les mesures de l’activité électrique et la caractérisation tissulaire permettront d’améliorer la compréhension des mécanismes pathologiques liés aux infarctus du myocarde et d’enrichir la base de données pour créer des modèles de cœurs « numériques » grâce à la modélisation informatique, et à terme de limiter l’utilisation de l’expérimentation animale.
Réduction
Dans le but de réduire le nombre d’animaux, plusieurs modalités seront mis en œuvres afin d’obtenir le maximum de données expérimentales dans ce projet tels que l’IRM avec injections d’agents de contraste, le scanner, la coronarographie, la cartographie de contact. De plus, un calcul de puissance statistique a été effectué pour déterminer le minimum d’animaux pour avoir des résultats significatifs.
Raffinement
Une attention permanente sera portée au bien-être des animaux tout au long du protocole, en particulier par une surveillance quotidienne (surveillance du comportement des animaux, de la température et de l’hygrométrie de la zone d’hébergement) et par l’enrichissement du milieu ainsi que le groupe social adapté. Lors des examens, les animaux seront sous anesthésie générale avec un protocole antidouleur approprié ainsi qu’une surveillance accrue (électrocardiogramme, capteur de pression, sonde de température, capteur de saturation en oxygène). Pendant l’anesthésie générale, une hydratation continue sera assurée ainsi que les molécules nécessaires aux protocoles (agents de contraste pendant l’imagerie, des anti-arythmiques). Un défibrillateur diphasique sera à proximité en cas d’urgence afin d’éviter le décès précoce des animaux lors des examens. Si l’état de l’animal le nécessite, les responsables de projet et/ou les vétérinaires pourront intervenir pour adapter le protocole antidouleur ou interrompre la procédure.
Choix des espèces
Les modèles de gros animaux offrent la possibilité d'étudier la pertinence clinique de nouvelles techniques de diagnostic en raison de leurs similitudes fonctionnelles et structurelles avec le cœur humain. Les ovins seront utilisés à l’âge adulte (12 mois) car ils ont un cœur avec une taille et des caractéristiques physiologiques proche de celle de l’Homme.
Prélèvement des tissus pour la caractérisation génétique (génotypage) et gestion des mutations entrainant des nuisances chez des modèles animaux génétiquement modifiés.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
Poissons zèbres : 12500
162 500 animaux non-humains vont être utilisés pour un seul geste chacun, trois millimètres de queue ou d'oreille coupés en cinq secondes chez 150 000 souris vigiles, quatre millimètres carrés de nageoire caudale prélevés sous anesthésie chez 12 500 poissons zèbres. Les procédures sont déclarées légères pour 156 750 d'entre eux et modérées pour 5 750, ce dernier niveau correspondant aux lignées dont les mutations provoquent, selon le porteur, "des douleurs, de l'inconfort, des difficultés à se déplacer et pour certaines des mortalités". Le projet relève de la gestion d'élevage, identifier génétiquement les animaux produits et repérer les lignées dont les mutations nuisent, pour constituer les lots destinés à d'autres projets. Le porteur écarte la pommade anesthésiante, qui allongerait l'intervention et pourrait gêner le génotypage, ainsi que l'analgésie par injection, et estime à 60 000 les animaux gardés vivants sur cinq ans pour renouveler les reproducteurs ou partir en expérimentation, les autres étant tués quand leur combinaison de gènes ne sert ni à l'élevage ni aux expériences.
Objectifs
L'établissement utilisateur est constitué de deux instituts de recherche qui s’intéressent à différents domaines (neuroscience, cardiologie, génétique, physiologie, cancérologie,...). Dans le cadre des projets utilisant des animaux à fins scientifiques (soumis indépendamment à des demandes d’autorisation de projet), des modèles animaux précliniques génétiquement modifiés sont développés et élevés. Dans ce but, il est important de détecter et gérer les pathologies induites par les mutations dans les élevages (appelé phénotypes dommageables) de ces modèles et de bien caractériser génétiquement les animaux produits (appelé : le génotypage). L’ensemble permet un élevage adapté pour constituer les lots expérimentaux et maintenir une production régulière et optimisée aux besoins des scientifiques de ces instituts.
Bénéfices attendus
Pour le bénéfice direct, ce projet permet d'optimiser la gestion et l’élevage des modèles animaux génétiquement modifiés qui seront mis à disposition des chercheurs pour les expérimentations qui seront faites à l'issue de ce projet. Il permet également de prendre en charge rapidement et donc de minimiser les souffrances qui pourraient être induites par les mutations des modèles animaux. Il y a également un bénéfice indirect, car les modèles précliniques génétiquement modifiés permettent de reproduire chez l’animal des pathologies humaines. Ce projet permet la caractérisation génétique ces modèles qui sont ensuite utilisés sur des projets dont l’objectif est la compréhension ou le traitement de ces pathologies et pour notre établissement dans de nombreux domaines (neuroscience, cardiologie, génétique, physiologie, cancérologie, …)
Procédures
Les souris vigiles seront prélevées d’un petit bout de tissu à l’oreille ou à la queue (3mm maximum de tissu), l’intervention dure 5 secondes et se fait une seule fois par animal. Les poissons subiront une anesthésie par balnéation suivie d’un prélèvement d’une portion de 4mm² (5% maximum) de la partie cartilagineuse de la nageoire caudale, capable de régénération complète en 20 jours. Des mutations chez des souris génétiquement modifiées peuvent entrainer des nuisances (phénotype dommageable) durant l’élevage chez l’animal. Elles apparaissent à différents temps de la vie de l’animal et sont directement pris en charge. Il y a également une procédure spécifique pour évaluer le bien-être des animaux lors de la création d'une lignée génétiquement altérée. Elle est non invasive et est basé sur l’observation de paramètres zootechniques et physiologiques en élevage.
Impact sur les animaux
Les nuisances lors d'un prélèvement de tissu pour le génotypage sont essentiellement du stress léger lors de la contention, de la pêche par épuisette ou de la sédation (poisson) et de la douleur légère lors de la coupe du tissu. En fonction du modèle de pathologie, les mutations entrainant un phénotype dommageable, induisent en général et à des degrés divers, des douleurs, de l’inconfort, des difficultés à se déplacer et pour certaines des mortalités selon le génotype. La procédure d'évaluation du bien-être des animaux est sans douleur sauf si un phénotype s'avère dommageable par cette évaluation. Cette demande de projet traite ces nuisances pour en minimiser aux maximum les souffrances animales.
Devenir
Les procédures d'évaluation et de gestion des phénotypes dommageables s'appliquent durant toute la vie des animaux. Les animaux pourront être mis à mort en élevage pour la gestion de la colonie ou bien partir en utilisation continue en expérimentation. Pour les procédures de prélèvement de tissus pour la caractérisation génétique des animaux le devenir peut-être soit la mise à mort car la combinaison de gènes n’est pas utilisable pour les expérimentations et l’élevage, soit les animaux sont gardés en vie pour renouveler les reproducteurs en élevage ou sont utilisés sur des projets expérimentaux prévus pour ces animaux (estimé à 60000 animaux sur 5 ans).
Remplacement
Ce projet est nécessaire pour la production et la mise à disposition d’animaux modèles génétiquement altérés pour des projets scientifiques . Les modèles animaux sont justifiés par la nécessité de caractériser des mécanismes ou pathologies complexes qui font intervenir plusieurs grands systèmes biologiques entre eux (en neuroscience, cardiologie, oncologie par exemple). Les chercheurs des instituts développent ces modèles le plus souvent après avoir testé leurs hypothèses sur des systèmes moléculaires et cellulaires et justifié le remplacement dans leurs demandes d’autorisation de projet expérimentaux. Dans l’institut nous encourageons l’utilisation de modèles alternatifs. Par exemple une équipe a mis en place des organoïdes intestinaux qui leurs a permis de développer et consolider leurs hypothèses avant le passage sur leurs modèles de souris génétiquement modifiées. Des modèles cellulaires sont également utilisés. Enfin les projets des instituts explorent les mécanismes de pathologies complexes faisant intervenir de nombreux tissus et interactions cellulaires, le recours à l’animal dans son ensemble est indispensable.
Réduction
Les animaux produits, issus de ce projet, et utilisés en expérimentation font tous l’objet d’une analyse statistique pour permettre la détermination des lots expérimentaux et l’analyse des résultats. Chaque chercheur a défini ses outils et échantillons pour ses expérimentations qui sont évalués indépendamment. L’enjeu et l’objectif majeur d’une réduction consistent à optimiser les élevages et à limiter la surproduction d’animaux non utilisés dans les projets scientifiques. Pour cela, les chercheurs définissent et mettent en place les accouplements avec les zootechniciens pour des objectifs de production adaptés aux projets scientifiques. La production est suivie avec des rapports trimestriels avec des indicateurs de productivité adaptés. Chaque trimestre, la production peut donc être revue et réajustée. Elle sera réduite au strict besoin, limitant le nombre de prélèvements de tissus pour génotypage. Nous cherchons au maximum à optimiser les schémas d’accouplements (mutations portées par les parents) pour réduire le génotypage ou éviter l’apparition d’un phénotype dommageable. Nous favorisons les élevages qui fournissent 100% d’animaux utiles ce qui permet de réduire le nombre d’animaux à produire d’une part et d’autre part permet de ne pas génotyper tous les individus. Pour le génotypage en gestion de colonie, nous recherchons systématiquement les lignées non ou peu utilisées. La production de ces lignées est soit fortement réduite, soit arrêtée. Elles sont en parallèle sécurisées par cryoconservation des gamètes ou des embryons. Il est compliqué d’apprécier l’impact de ces mesures sur la réduction mais il est aisé de comprendre qu’elles concourent toutes à l’optimisation de la production aux seuls animaux qui seront utilisés dans les projets scientifiques ou en gestion de colonies et donc de réduire le nombre d’animaux à génotyper ou exprimant le phénotype dommageable. Enfin, nous cherchons à améliorer nos pratiques. Tout d’abord, si le prélèvement invasif est indispensable, nous nous orienterons vers la coupe à l’oreille par rapport à la coupe de queue plus douloureuse et nous sommes en cours de mise au point de la technique de prélèvement de follicule de poil considérée sans douleur que nous espérons pouvoir mettre progressivement en place dans les années à venir. La procédure d'évaluation du bien-être des animaux est basée sur les recommandations du guide Européen sur les animaux génétiquement altérés soit 14 animaux sur 2 générations.
Raffinement
Les techniques de prélèvement de tissus pour le génotypage sont effectuées en routine et le geste est très court et précis. La douleur est légère. Le raffinement est de s’assurer d'un process cadré et éprouvé, appliqué par des zootechniciens expérimentés pour réduire le stress des animaux, l’intensité et la durée de la douleur induite. L’utilisation de pommade anesthésiante n’est pas envisagée pour éviter une intervention plus longue et le produit pourrait interférer avec la technique de génotypage. L’analgésie par injection n’est aussi pas recommandée car la piqûre augmente la nuisance sur l’animal. Toutefois, les éléments suivants sont mis en place : manipulation par un zootechnicien expérimenté, le poste de prélèvement est codifié et préparé en amont pour éviter les gestes parasites pendant le prélèvement pour réduire le stress des animaux. L’animal est pris en contention et la biopsie est rapidement et précisément effectuée avec un matériel désinfecté et aiguisé pour réduire le temps et intensité de douleur. L’animal, remis dans sa cage est observé. En cas de mauvaise reprise de l’activité ce qui constitue le principal point limite, il sera pris en charge. Les observations quotidiennes permettent de s’assurer de la bonne cicatrisation. En cas de mauvaise cicatrisation (point limite) des pommades cicatrisantes peuvent être utilisées. Chez le poisson un raffinement particulier est apporté aux conditions d’isolement maintenues dans le système d’hébergement en circulation, maintenant des paramètres d’eau stables. Le point limite est de s’assurer de la bonne nage des poissons. Pour le raffinement des phénotypes dommageables, les lignées sont aujourd’hui bien connues et le phénotype bien caractérisé. La stratégie de raffinement est de mettre en place le plus tôt possible une procédure de surveillance de l’apparition des nuisances (le caractère spécifique du phénotype ne nécessite pas l’utilisation d’une grille pour la détermination du point limite). Il peut s’agir également d’avoir une procédure d’hébergement adapté avec l’ajout d’un enrichissement ou des manipulations très douces pour les lignées modèles d’épilepsie par exemple. La procédure d’évaluation du bien-être animal est non invasive et sans douleur basée sur l’utilisation d’une grille de paramètres zootechniques et physiologiques. Le risque est la détection d‘un phénotype dommageable qui sera immédiatement pris en charge et classifié selon la procédure sur la gestion des phénotypes dommageables.
Choix des espèces
La création de modèles pour comprendre des pathologies humaines est très développée chez la souris car les outils pour générer ces modèles génétiquement modifiés sont très efficaces. D’autre part, la souris est un mammifère avec de nombreuses similitudes dans les processus biologiques avec l’homme. Son temps de génération est considéré court (3 mois) et son élevage simple en laboratoire. Le poisson-zèbre est un modèle incontournable pour la recherche : une fécondation et un développement embryonnaire externe rapide et transparent, la facilité d’accès au matériel génétique permettant le développement des techniques d’ingénierie génétique. Son génome présente 70% d’homologie avec celui de l’homme (85% pour les gènes impliqués dans des pathologies humaines), il présente également des capacités originales de régénération des tissus (système nerveux, rétine, cœur, etc.) qui en font un modèle idéal pour la compréhension de ces mécanismes, pouvant aboutir à l’identification de pistes thérapeutiques majeures transposables chez l’homme. Pour les biopsies : souris à partir de 14 jours jusqu'à 4 semaines maximum. L'essentiel des lignées sont génotypées à 14 jours pour permettre d'avoir le résultat de génotypage au sevrage et de sélectionner uniquement les animaux d'intérêt à l’âge adulte. La biopsie de nageoire : majoritairement jeune adulte entre 1 et 3 mois avant maturité sexuelle afin de ne conserver que les animaux de génotype d'intérêt à l'âge adulte, des animaux plus vieux peuvent être concernés en cas de doute ou erreur sur le génotype.
Utilisation de sondes fluorescentes chez la souris pour une meilleure compréhension des mécanismes de distribution et d’internalisation des récepteurs
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une chirurgie du cou pour cathétériser l'artère carotide, avec un risque d'atteinte du nerf vague et de rupture de vaisseau, précède une perfusion de cinq minutes de sondes fluorescentes. 24 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie générale, les animaux étant tués avant tout réveil. Le porteur écrit que l'exposition aux sondes "sera rapidement suivie de la mise à mort des animaux ce qui devrait limiter toute nuisance potentielle", présentant ainsi la mise à mort comme une mesure de protection. Cinq des 24 souris sont affectées au "réapprentissage des gestes de chirurgie" et ne rejoignent le projet que si l'opération réussit, quatre servent à fixer la dose, et les quinze dernières aux trois sondes à tester.
Objectifs
L'accident vasculaire cérébral (AVC) est la deuxième cause de décès et la troisième cause d'invalidité dans le monde. Lorsqu'une personne subit un AVC, une hormone appelée angiotensine II est produite en plus grande quantité. En se fixant sur son récepteur, cette hormone va induire une contraction des vaisseaux sanguins ce qui va réduire l’apport de sang au cerveau et donc augmenter la gravité de l'AVC. Certains nouveaux candidats médicaments sont capables de faire rentrer ces récepteurs hormonaux à l’intérieur des cellules, les rendant donc inaccessibles pour l’angiotensine II. Ceci permettrait de prévenir la contraction des vaisseaux sanguins cérébraux. Cette internalisation des récepteurs pourrait donc participer à une protection cérébrovasculaire en cas d’AVC. Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons développé et testé sur cellules, des outils fluorescents spécifiques permettant de localiser avec précision ces récepteurs. L’objectif de ce projet est de tester ces outils fluorescents pour visualiser in vivo la distribution et l’internalisation des récepteurs dans les vaisseaux cérébraux notamment en définissant les doses des outils fluorescents à utiliser in vivo.
Bénéfices attendus
Ce projet préliminaire nous permettra de fixer la dose des sondes à utiliser in vivo puis de valider la méthodologie d’évaluation de la distribution des récepteurs. L’étude de cette distribution des récepteurs est importante pour comprendre et caractériser les mécanismes et les effets de certains traitements de l’accident vasculaire cérébral.
Procédures
Les souris subiront une chirurgie carotidienne pour cathétérisation de l’artère carotide puis une infusion de 5 minutes via ce cathéter sera effectuée. L’expérimentation n’excédra pas 1h.
Impact sur les animaux
risques d’atteintes du nerf vague lors du cathétérisme de l’artère carotide L’exposition à ces sondes (durée de perfusion de 5 minutes) sera rapidement suivie de la mise à mort des animaux ce qui devrait limiter toute nuisance potentielle dues à ces molécules.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin de récupérer le cerveau et le sang pour des analyses.
Remplacement
Pas de remplacement possible car l’objectif est de visualiser et étudier la distribution des récepteurs de l'angiotensine II directement au niveau du tissu cérébral et cérébrovasculaire. Les outils fluorescents spécifiques que nous souhaitons tester ont été synthétisées et purifiées par des laboratoires partenaires. Leur caractérisation pharmacologique complète a été réalisée sur des modèles cellulaires et ex vivo (artère cérébrale isolée perfusée) qui permettent d’estimer les doses nécessaires à notre objectif.
Réduction
Afin de réduire au maximum l’utilisation d’animaux, la détermination de la dose à administrer sera déterminée dans un premier temps pour un seul outil fluorescent. La dose à utiliser pour les 2 autres outils fluorescents sera basée sur l’utilisation de la première car nos études préliminaires montrent une affinité équivalente pour nos 3 outils fluorescents. Le nombre total d’animaux pour ce projet sera de 24 : 5 souris dédiées au réapprentissage des gestes de chirurgie (si succès de la chirurgie, ces souris seront incluses dans le projet), 4 souris afin déterminer la dose des sondes à utiliser (2 souris pour 2 doses différentes) et enfin 15 souris (5 souris pour chacune des 3 sondes à tester). Ce projet étant un test préliminaire, aucun test statistique n’a été utilisé.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en portoir avec des cages ventilées et filtrées, à 5 souris par cage. Ces cages seront enrichies (tunnel en polycarbonate, buchette de peuplier…) – période d’acclimataion minimale de 1 semaine. Pendant toute la durée de la chirugie et jusqu’à la mise à mort de l’animal, la profondeur de l’anesthésie sera régulièrement contrôlée par l’absence de reflexe de retrait de la patte aux pincements interdigitaux et absence du réflexe cornéen ; un anti-douleur sera administré 1 h avant le début de la chirurgie ; la température corporelle sera contrôlée via une sonde rectale et maintenue à 37°C; la cornée sera protégée par un gel ophtalmique ; la durée d’utilisation des animaux sera limitée à 1h sous anesthésie, avec contrôles des paramètres vitaux à des valeurs physiologiques. Les animaux seront mis à mort par surdose d’anesthésie en cas de lésion du nerf vague ou d’une rupture d’un vaisseau avec hémorragie trop importante lors de la chirurgie.
Choix des espèces
Les souris utlisées seront des C57Bl/6j mâles agées de 10 semaines, poids entre 20 et 30g). C’est ce même modèle de souris qui a été utilisé pour les études cérebrovasculaires et cardiovasculaires précedentes, afin de permettre la comparaison. Cet âge correspond à un stage adulte jeune chez qui la pose d’un cathéter dans l’artère carotide est facilitée par rapport à des animaux plus jeunes.
Elevage de lignées murines génétiquement modifiées pour l’étude du développement des cellules hématopoïétiques.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Immunodéficientes par construction génétique, les souris de ces lignées développent des tumeurs à partir de deux mois et succombent entre trois et six mois à l'envahissement de la cage thoracique. 412 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 300 d'entre elles et sévère pour 112, l'objet du projet étant d'élever ces lignées pour étudier le développement des cellules souches du sang. Les actes déclarés se limitent à une biopsie de phalange entre le septième et le dixième jour après la naissance, sur des nouveau-nés, et à une surveillance quotidienne des doubles mutants pour repérer les signes d'anémie sévère, alimentation et mobilité réduites, croissance altérée, blancheur des pattes. Toutes les souris à phénotype dommageable sont tuées avant deux mois, avant l'apparition des tumeurs, et leurs cellules hématopoïétiques sont analysées, y compris chez des fœtus prélevés à partir du treizième jour de gestation.
Objectifs
Les cellules du sang assurant l’oxygénation des tissus et la défense immunitaire se développent à partir d’un petit nombre de cellules appelées : cellules souches hématopoïétiques (CSH). L’ensemble des mécanismes biologiques qui contrôlent le pool de CSH au cours de la vie ainsi que la différenciation de ces CSH en cellules du sang ne sont pas totalement élucidés. D’autre part la perturbation de ces mécanismes participe au développement de maladies auto-immunes et de leucémies chez l’homme. Aussi une meilleure compréhension de la biologie de ces cellules permettra de développer des cibles et des stratégies thérapeutiques pour les pathologies humaines. Nous nous intéressons plus particulièrement à une famille de protéines responsable de pathologies hématopoïétiques humaines notamment dans certaines leucémies. Ce projet vise à déterminer le rôle de ces protéines dans le développement précoce des cellules souches hématopoïétiques en utilisant des souris génétiquement invalidées pour ces protéines. Ce projet consiste à l'élever des lignées de souris génétiquement modifiées qui présentent un phénotype dommageable avec une baisse de l'immunité et le développement de tumeur.
Bénéfices attendus
L'étude de souris déficientes pour des protéines impliquées dans l'immunité et le développement de tumeurs thymiques, nous permettra de définir les rôles de ces protéines durant la mise en place du système sanguin, ce qui à notre connaissance n’est pas été élucidé. La compréhension du développement des cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques est importante pour élucider les mécanismes moléculaires impliqués dans les pathologies du sang (telles que l’anémie, les maladies auto-immunes et les leucémies) et pour améliorer les techniques d’expansion de ces cellules lors de greffe de cellules hématopoïétiques dans le cadre de thérapies anti-cancéreuses.
Procédures
Les souris déficientes pour les protéines étudiées dans cet élevage ont une immunité réduite (immunodéficientes) et développent des tumeurs après l'âge de 2 mois.La biopsie de phalange se fait entre 7 et 10 jours.
Impact sur les animaux
Les souris immunodéficientes sont plus suceptibles aux infections d'opportunistes pour prévenir de cela ces animaux seront élevés dans des conditions les plus aspetiques possibles. Les souris développant des tumeurs susccombent entre 3 et 6 mois suite à l'envahissement de la cage thoraxique par la tumeur. Ces animaux seront euthanasiés bien avant le développement de ces tumeurs à l'âge de 2 mois. L’effet indésirable est la nuisance du prélèvement des phalanges entre le 7ieme et le 10ieme jours postpartum qui génère une douleur légère de courte durée.
Devenir
Toutes les souris à phénotype dommageable produites seront mises à mort avant le développement de tumeurs et utilisées pour l'analyse des cellules hématopoïétiques.
Remplacement
La mise en place du système sanguin nécessitent des interactions cellulaires ainsi que des migrations de cellules hématopoïétiques dans l'organisme, ces mouvements cellulaires ne peuvent pas être remplacés par des systèmes ex-vivo. L'utilisation d'organismes vivants est donc nécessaire.
Réduction
Nous allons réduire le nombre d’animaux avec un phénotype dommageable en adaptant les croissements de souris et en limitant les croissements qui produisent ces souris. Les foetus possèdent un nombre réduit de cellules hématopoïétiques réduisant ainsi le nombre de cellules pouvant être analysées par individu, pour cela nous envisageons d’utiliser 12 fœtus /génotype et par stade de développement. Autour de la naissance, le nombre de cellules hématopoïétiques est déjà plus important et à ces stades de développement 10 animaux /génotypes seront suffisant pour les analyses de tissus et de populations hématopoïétiques. Les animaux de 30 jours ont une taille proche de l’adulte et les cellules hématopoïétiques sont présentes en plus grand nombre, les expériences seront réalisées sur 6 animaux à phénotypes dommageables. Les cellules et tissus hématopoïétiques issus des foetus et des animaux seront comparés à des animaux contrôles sauvages et hétérozygotes de phénotype non dommageable.
Raffinement
Pour réduire au minimum les nuisances liées à l’immunodéficience des souris, nous allons héberger ces animaux dans un environnement le plus aseptique possible (cages ventilées et filtrées et manipulation des animaux sous hotte). Et pour éviter les souffrances des animaux développant des tumeurs thymiques, nous euthanasierons ces animaux avant l’apparition des tumeurs et des douleurs liées à celles-ci à l’âge de 2 mois. Dans ces conditions d’élevages et d’après les utilisations décrites pour ces animaux ne souffrent pas de surinfection ou de douleurs tumorales. Les animaux doubles mutants feront l'objet d'une observation accrue par observation quotidienne jusqu'a 10 jours puis tous les 2 jours pour détecter des signes de souffrances liés à une anémie sévère (alimentation et mobilité réduite, croissance des nouveau-nés altéré, blancheur des pattes) et en cas de souffrance les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux modèles de choix facilement modifiables génétiquement et pour lesquels nous disposons d’un grand nombre d’outils moléculaires ( ex : Anticorps, cytokines…) permettant l’étude des cellules hématopoïétiques. Le développement des cellules hématopoïétiques murines débute chez l’embryon à partir de l’émergence des cellules sanguines au stade embryonnaire (E) 9,5 jusqu’au stade de jeune adulte (2 mois). Les stades de développement utilisés dans ce projet sont les stades embryonnaires 13,5 ; 14,5; 15,5; 16,5 et 18,5 jours post-coïtum, les nouveau-nés à la naissance (P0) et à 1 jour (P1) ainsi que les jeunes à 10, 30 et 60 jours après la naissance.
Évaluation des effets thérapeutiques cardiaques d’un nouveau virus adéno-associé
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Trente-deux souris sont cathétérisées jusque dans le cœur par la veine jugulaire, sous anesthésie générale, et ne sont pas réveillées. 126 souris au total vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 94 d'entre elles et modéré pour 32. Baguées et biopsiées à trois semaines pour vérifier leur statut génétique, elles reçoivent une injection de virus adéno-associé à sept semaines, puis de trois à cinq électrocardiogrammes et un examen échographique, certaines jusqu'à l'âge de soixante semaines. Le porteur justifie la mise à mort systématique après cathétérisme par l'impossibilité de suturer la veine jugulaire, qu'il faut donc ligaturer, et par le risque que le cathéter lèse les valves cardiaques et provoque une insuffisance cardiaque droite.
Objectifs
L'objectif général du projet est d'évaluer les effets thérapeutiques d'un virus adéno-associé sur un modèle de souris présentant des troubles de la conduction de l'influx électrique cardiaque liés à une perte de fonction d'un gène impliqué dans cette conduction. Chez les humains, les mutations conduisant à une perte de fonction de ce gène sont à l'origine de pathologies génétiques responsables de morts subites (syndrome de Brugada et troubles de la conduction cardiaque) pour lesquelles il n'existe pas de thérapie préventive. Le virus adéno-associé a été montré, dans un modèle cellulaire, comme étant susceptible d'avoir un intérêt thérapeutique. Les objectifs spécifiques du projet sont d'évaluer les effets du virus adéno-associé sur : 1. la vitesse de conduction de l'influx électrique cardiaque, à l'aide d'enregistrements de l'électrocardiogramme ; 2. la survenue d'arythmies ventriculaires ; 3. l'apparition de fibrose cardiaque secondaire à la perte de fonction du gène de la conduction au cours du vieillissement. Ces deux derniers objectifs ne seront réalisés que si le virus adéno-associé permet une amélioration de la vitesse de conduction de l'influx électrique cardiaque.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du virus adéno-associé sont une amélioration significative, voire une restauration complète de la vitesse de conduction de l'influx électrique cardiaque, et une disparition des arythmies ventriculaires et du remodelage fibrotique cardiaque.
Procédures
Trois semaines après la naissance, les souris seront baguées et biopsiées (afin de vérifier leur statut génétique) sous anesthésie générale. Dans une première étape du projet, 32 souris seront soumises à une injection du virus adéno-associé à l'âge de 7 semaines, à 3 enregistrements de l'électrocardiogramme à l'âge de 7 (durée de 3 min), 9 (3 min) puis 12 semaines (15 min), et un examen échocardiographique (15-20 min) à 12 semaines, réalisés sous anesthésie générale. En fonction des résultats obtenus dans la première étape, 32 autres souris seront soumises à une injection du virus adéno-associé à l'âge de 7 semaines et 2 enregistrements de l'électrocardiogramme (durée de 3 min) à l'âge de 7 puis 9 semaines, réalisés sous anesthésie générale, puis une exploration électrophysiologique par cathétérisme intracardiaque, d'une durée de 20-30 min, réalisée sous anesthésie générale et analgésie locale, sans réveil. Enfin, en fonction des résultats obtenus dans l'étape 1, 20 souris supplémentaires seront soumises à une injection du virus adéno-associé à l'âge de 7 semaines, à 5 enregistrements de l'électrocardiogramme (durée de 3 min) à l'âge de 7, 9, 30, 45 et 60 semaines et 1 examen échocardiographique (15-20 min) à 60 semaines, sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Le modèle de souris utilisé dans ce projet est étudié depuis de nombreuses années. Ces souris présentent un trouble de la conduction de l'influx électrique cardiaque qui augmente progressivement avec l'âge, comme les patients, mais qui ne conduisent pas à des blocs complets de la conduction comme observé chez certains patients ou à la survenue de tachycardies ventriculaires sévères et/ou fibrillation ventriculaire comme observé chez d'autres patients. Elles se développent normalement et ne présentent pas de signes notables de souffrance. L'injection des virus adéno-associés sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie locale au point d'injection afin d'éviter stress et douleur. Les examens réalisés pour étudier les effets cardiaques des virus adéno-associés (enregistrement de l'électrocardiogramme et échographie) ne sont pas des techniques générant de la douleur mais ils seront cependant réalisés sous anesthésie générale pour éviter tout stress des souris et les maintenir en position stable. Pour les mêmes raisons, l'exploration électrophysiologique par cathétérisme intracardiaque sera également réalisée sous anesthésie. Cette procédure entraine une douleur au niveau du point de ponction cutanée pour cathétériser la veine jugulaire, qui sera prévenue par une anesthésie locale, comme cela est fait chez les patients. En ce qui concerne le virus adéno-associé, une étude antérieure a montré qu'il n'entraine pas d'effet indésirable chez des souris sauvages aux doses conduisant à un effet bénéfique dans le modèle cellulaire.
Devenir
A l'issue de la procédure 2 (effets du virus adéno-associé sur la fonction cardiaque), les souris seront mises à mort à la fin de l'examen échographique afin de prélever leur cœur pour des examens immunohistochimiques. A l'issue de la procédure 3 (exploration fonctionnelle par cathétérisme intracardiaque), les souris sont systématiquement mises à mort parce que cette procédure peut avoir des conséquences néfastes sur la souris. En effet, il est possible, mais difficile de suturer la veine jugulaire après avoir retiré le cathéter, ce qui nous oblige à la ligaturer pour éviter les hémorragies, perturbant ainsi le retour veineux depuis la tête de l'animal. Par ailleurs, bien que les cathéters aient un diamètre très faible (1/3-1/2 mm), ils sont suffisamment gros pour léser les valves cardiaques, ce qui peut induire une insuffisance cardiaque droite à plus ou moins long terme. La mise à mort des souris permet en outre de prélever le cœur pour des études biochimiques. A l'issue de la procédure 4 (effets à long terme du virus adéno-associé), les souris seront mises à mort à la fin de l'examen échographique afin de prélever leur cœur pour des examens histologiques.
Remplacement
Cette étude fait suite à une étude in vitro réalisée avec un modèle cellulaire, puis une étude in vivo chez la souris sauvage qui montrent que la surexpression du virus adéno-associé entraine une augmentation de l'expression du gène cible. Ces études sont à la base de ce projet réalisé sur un modèle pertinent pour la pathologie humaine. Seule l'expérimentation réalisée sur des animaux vivants peut permettre de démontrer une efficacité du traitement sur la fonction cardiaque : l'observation d'un effet bénéfique sur un modèle cellulaire est un pré-requis mais ne préjuge en rien de l'efficacité in vivo. Très spécifiquement dans le cadre de ce projet, les effets protecteurs de ce traitement sur les anomalies structurales du myocarde (fibrose) apparaissant au cours du vieillissement ne peuvent être appréhendés que sur l'animal vivant.
Réduction
Plusieurs investigations seront réalisées sur les mêmes animaux (électrocardiographie et échocardiographie), afin de limiter la multiplication de groupes expérimentaux et d’animaux nécessaires. Le projet est organisé en deux étapes successives. La seconde étape ne sera réalisée que si la première démontre que les souris traitées avec le virus adéno-associé présentent une amélioration significative de leur conduction cardiaque. Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum tout en conciliant une puissance statistique suffisante à une interprétation la plus juste des données obtenues. Leur taille a été déterminée à l'aide du logiciel de statistiques Sigmastat sur la base de notre expérience antérieure. Une analyse statistique des résultats sera réalisée avec le même logiciel.
Raffinement
Lors du sevrage, le prélèvement d'une biopsie pour déterminer le statut génétique des souris est réalisé sous anesthésie générale. Les souris sont hébergées en cages ventilées enrichies de tunnels ou de cabanes pour se camoufler et/ou de frisottis pour fabriquer des nids. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Lors des examens électrocardiographiques et échographiques, ainsi que lors de la mise à mort, les animaux sont sous anesthésie générale. L'exploration fonctionnelle par cathétérisme intracardiaque est réalisée sous anesthésie générale et analgésie. Lors des anesthésies, la température corporelle est maintenue à l'aide d'un tapis chauffant rétrocontrôlé par une sonde rectale. A l'issue des procédures nécessitant une anesthésie, les souris sont placées dans des cages placées sur des tapis chauffants et surveillées de façon accrue jusqu'à leur réveil complet. Afin d’éviter toute douleur ou souffrance des souris, des signes cliniques (avec score de gravité) ont été définis pour chaque procédure et définissent les points limites au-delà desquels l’expérimentation est arrêtée et l’animal euthanasié sous anesthésie.
Choix des espèces
Le modèle de souris utilisé est le seul modèle murin de perte de fonction du gène de la conduction. Ce modèle est bien caractérisé et représente un bon modèle des pathologies humaines résultant des mutations "perte de fonction" de ce gène. Les souris seront injectées avec les virus adéno-associés à l'âge de 7 semaines, puis étudiées jusqu'à l'âge de 12 semaines dans la première étape, et de 60 semaines dans la seconde, parce que ces pathologies ne touchent que très rarement les enfants et les adolescents. Les souris utilisées seront des mâles et des femelles dans des proportions comparables parce que les pathologies d'intérêt chez l'humain touchent tous les genres. L'injection du virus à l'âge de 7 semaines permet, d'une part, de réduire la quantité d'AAV9 injectée et, d'autre part, d'obtenir une expression optimale de l'AAV9 avant d'en étudier les effets cardiaques chez les jeunes souris adultes (9, puis 12 semaines). Si le traitement s'avère efficace sur la conduction de l'influx électrique cardiaque, l'étude réalisée à l'âge de 60 semaines permettra de déterminer ses effets à long terme sur l'apparition de fibrose cardiaque observé normalement chez ces souris.