Recherche fondamentale

Dépourvues de poils par sélection, les souris SKH-1 laissent voir et mesurer les tumeurs de la peau sans rien raser. 80 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois fois par semaine pendant deux, quatre ou six mois, elles sont exposées aux UVB, en continu aux radiofréquences 5G à 26 GHz, ou aux deux, jusqu'à ce qu'apparaissent vers la seizième semaine de multiples tumeurs cutanées sur le dos, que le porteur décrit comme pouvant gêner leurs déplacements et les empêcher d'atteindre la nourriture dans la mangeoire. Toutes sont tuées pour prélever les tumeurs et la peau du dos.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer l'effet d'une exposition à la fois aux ondes radiofréquences (RF) émises par les systèmes de communications sans fil et au rayonnement solaire ultraviolet (UV) sur le développement des tumeurs cutanées chez la souris. Au cours de sa vie, l'homme est quotidiennement exposé à ces 2 types de rayonnement, possiblement cancérogène ou cancérogène connu, ce qui peut avoir des effets néfastes sur sa santé. De ce fait, l'exposition combinée et consécutive à ces deux agents physiques omniprésents dans notre environnement pourrait jouer un rôle important dans l'apparition de cancers cutanés. Avec l’arrivée de la nouvelle technologie 5G et ses fréquences plus élevées comme 26 GHz, il est crucial de savoir comment cela pourrait affecter la santé humaine, en particulier la peau. Bien qu’il soit connu que l'exposition au soleil, en particulier aux rayons UVB, endommage l'ADN et produit des substances nocives telles que des radicaux libres, nous n'avons pas encore suffisamment d'informations sur l'impact des ondes de téléphones portables à 26 GHz. Notre idée est donc que l'exposition quotidienne à ces deux facteurs pourrait potentialiser l'apparition des cancers cutanés chez l'homme.

Bénéfices attendus

Le bénéfice de ce projet est de déterminer l'impact des RF sur les cancers cutanés UVB induits. Grâce à ce projet, nous espérons obtenir une réponse claire sur les RF : i) elles n'ont pas d'effet ii) elles jouent un rôle protumoral ou au contraire iii) un rôle antitumoral. Les données obtenues permettront d’améliorer la prévention concernant la survenue des cancers cutanés et diminuer leur mortalité si les RF amplifient l’effet délétère des UV. Les cancers cutanés sont visibles, affligeants, induisant un stress psychologique important. Limiter l’apparition des cancers cutanés et leurs effets secondaires, améliorera la qualité de vie des personnes touchées et diminuera le coût en terme de santé publique.

Procédures

Les animaux sont exposés aux rayons UVB 3 fois par semaine pendant moins d'une minute et/ou aux radiofréquences (RF) en continu et cela pendant 2, 4 ou 6 mois. A l'apparition des premières tumeurs, le volume tumoral est mesuré 1 à 2 fois/semaine au pied à coulisse sur souris vigile et cela jusqu'à la fin de la phase expérimentale.

Impact sur les animaux

L'exposition répétée aux UVB provoque de multiples petites tumeurs cutanées sur le dos des souris qui vont apparaitre aux alentours de 16 semaines d'irradiation. Ces tumeurs peuvent devenir gênantes pour se déplacer ou se redresser pour attraper la nourriture dans la mangeoire. Il est également possible que la co-exposition aux RF accentue le niveau de nuisance, si comme nous le supposons les RF potentialisent les effets des UVB.

Devenir

A la fin de la procédure expérimentale, les animaux seront mis à mort afin de prélever les tumeurs et la peau du dos pour les différentes analyses biochimiques et histologiques.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires in vitro ainsi que des modèles d'épidermes pigmentés humains reconstruits in vitro pour répondre à ces questions. Cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que la formation d’une tumeur, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. De nombreux articles ont mis en évidence l'importance du microenvironnement dans le processus de carcinogènése cutanée et malheureusement, il est à ce jour, très difficile de reproduire ce microenvironnement tumoral in vitro. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire à la réalisation de ce projet a été scrupuleusement réduit au minimum en tenant compte de nos 10 ans d’expériences en matière de cancérogénèse UVB induite. En effet, les souris ne sont pas consanguines et par conséquent, nous avons toujours 2 ou 3 souris qui ne répondent pas aux irradiations ou peuvent avoir des réponses complétement atypiques par rapport au reste du groupe (croissance tumorale trop rapide ou trop lente), ce qui a été bien constaté au cours de nos précedentes expérimentations. Pour ces raisons, nous avons déterminé via des tests statistiques qu'un lot de 20 souris par condition était nécessaire pour avoir des données statistiquements exploitables à la fin de l'étude. Nous utiliserons également des lots témoins communs afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les animaux qui ne répondent pas favorablement seront néanmoins utilisés pour des prélèvements de peau et serviront de contrôle pour des analyses ultérieures.

Raffinement

Des études pilotes ont été réalisées pour raffiner l’ensemble de nos procédures expérimentales sur les animaux de manière à réduire au minimum les temps d’exposition, les temps de contention et d’isolement afin de prévenir toute douleur ou inconfort chez nos animaux. De plus, nous réalisons une surveillance quotidienne de nos animaux et nous avons mis en place des mesures conservatoires (ajout de croquettes dans les cages, biberons à longue pipette) et des points limites qui nous permettent d'agir rapidement en cas d'inconfort ou de douleur observés chez nos animaux.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle car c'est un animal de petite taille, facile à héberger et à manipuler. C'est un modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99% d'homologies entre son génome et le génome humain. Les souris SKH-1 sont bien connues pour l'étude de la cancérogénèse UVB-induite. Elles sont immunocompétentes et totalement dépourvues de poils ce qui rend la mesure et l'observation des tumeurs cutanées bien plus facile que sur d'autres modèles de souris. Les souris seront inclues dans le protocole expérimental à l'âge de 6 à 8 semaines. Ages auxquels elles sont considérées comme de jeunes adultes ayant atteint un poids de 20-25g, une maturité hormonale et un état métabolique stable.

720 rats en croissance vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun passe la période expérimentale seul en cage, dont deux fois 24 heures en cage métabolique et deux fois trois jours en cage de calorimétrie, avec deux radiographies sous isoflurane, deux prises de sang de 500 microlitres à la queue et un transport en voiture jusqu'à une plateforme distante. Ils sont nourris de régimes volontairement déficients en acides aminés indispensables, pour chercher dans leurs urines et leur sang des marqueurs de cette carence. Le porteur affirme que mesurer la croissance et le comportement alimentaire "empêche" tout remplacement par des modèles cellulaires, et présente le rat comme un modèle de l'enfant dénutri.

Objectifs

La qualité de l’apport alimentaire en protéines des régimes alimentaires dépend de leur capacité à satisfaire les besoins en acides aminés (AA) indispensables (AAI) tout au long des cycles de vie. C’est une question majeure de sécurité nutritionnelle, principalement dans les pays en voie de développement, où l’apport protéique total est modéré, voire bas. Plus généralement, la connaissance de la qualité de l’apport alimentaire en protéine est primordiale pour comparer les différentes sources de protéines, notamment dans le cadre des discussions sur le rééquilibrage des sources alimentaires végétales et animales, et la recherche de sources alternatives de protéines. La composition en AAI est variable selon les sources protéiques. En effet, les protéines d'origines animales ont un profil homogène et équilibré en AAI, alors que les protéines de céréales et les protéines de légumineuses (comme le gluten) sont déficientes en certains AAI. Les profils de référence de besoin en AAI, utilisés pour l’évaluation de la qualité protéique, initialement déterminés à partir de données de bilan azoté, ont été révisés à la hausse (Organisation pour l'alimentation et l'agriculture (FAO)/Organisation mondiale de la santé (OMS),2007) sur la base de nouvelles méthodes, rendant plus sélectifs les critères de qualité des protéines. Cependant, ces valeurs révisées restent discutées. Ainsi, lors de son rapport sur le besoin en protéines et AA en nutrition humaine, le comité (FAO/OMS) a conclu qu’aucune méthode actuelle d’estimation du besoin en AAI n’est entièrement fiable et qu'iI est donc primordial de proposer de nouvelles approches complémentaires pour préciser les valeurs des besoins et d’évaluer le statut nutritionnel protéique des différentes populations. Pour cela, la FAO a recommandé le recours à l’usage d’outils tels que la métabolomique (ensemble des métabolites), qui a notamment été appliquée avec succès pour estimer le besoin en d’autres micronutriments. L’objectif de ce projet est d’identifier les variations des profils du métabolome urinaire et plasmatique comme biomarqueurs spécifiques de la déficience en AAI et à évaluer l’efficacité de la supplémentation pour valider les biomarqueurs identifiés. Ce projet fait suite à deux projets précédents pour lesquels nous avons identifié et validé des biomarqueurs urinaires pour trois des neuf AAI. Ce projet se déroulera sur 2 sites, dont une plateforme pour évaluer leur dépense énergétique et la composition corporelle.

Bénéfices attendus

L’identification et la validation de biomarqueurs du statut en AAI permettra, à terme, de mieux définir les besoins en acides aminés indispensables. Cela servira à affiner les politiques nutritionnelles et à mieux évaluer la qualité des sources protéiques. De plus, cette étude nous renseignera sur les effets d’une supplémentation en ces acides aminés indispensables après une phase de déficience. Ces effets n’étant que peu rapportés dans la littérature, ces informations seront très utiles, notamment pour l’étude de la sous-nutrition chez l’enfant avec retard de croissance.

Procédures

Durant la période expérimentale , les animaux seront placés en cage individuelle pour permettre la mesure précise de leur prise alimentaire. Les animaux seront placés deux fois pendant la période expérimentale en cages métaboliques pendant 24h pour collecter les féces et les urines, et deux fois en cage de calorimétrie pendant 3 jours pour la mesure de dépense énergétique. La densité minérale osseuse et la longueur du tibia seront analysés par radiographie deux fois au cours de l'expérience après anesthésie gazeuse (anesthésie à l'isoflurane 2% pendant 10-15min). Deux prélèvements sanguins seront effectués au niveau de la veine de la queue de 500μl chacun .A la fin de l'expérimentation, les animaux seront mis à mort et une injection de valine 13C sera réalisée 30 minutes avant l’euthanasie (150μmol/100g poids corporel), dans le but de mesurer la synthèse protéique.

Impact sur les animaux

Durant la période expérimentale, les animaux seront placés en cage individuelle pour permettre la mesure précise de leur prise alimentaire et de leur dépense énergétique (cages de calorimétrie indirecte), ainsi que la collecte des urines et fécès (cages métaboliques), ce qui peut engendre un stress modéré dû à l’isolement des animaux. Les animaux seront transportés à la plateforme 3 jours avant d'effectuer les mesures, afin d’évaluer leur dépense énergétique par calorimétrie indirecte et leur composition corporelle. La plateforme se situe à plusieurs km de l’unité de rechercheset le transport des animaux sera réalisée en voiture ce qui peut engendrer un stress modéré. Aussi, les prélèvements sanguins lors de la procédure 2 sont susceptibles d’induire de la douleur et un stress modéré. Une injection sera réalisée 30 minutes avant la mise à mort, dans la veine caudale, sous anesthésie gazeuse dans le but de mesurer la synthèse protéique. L’anesthésie gazeuse permettra de réduire la douleur engendrée par l’injection.

Devenir

Tous les rats seront euthanasiés en fin de procédure pour réaliser des analyses sur différents tissus cibles.

Remplacement

La nécessité de mesurer les conséquences de l'ingestion d’un régime à faible teneur en AAI sur le comportement alimentaire et les paramètres de la croissance (gain de poids et composition corporelle) empêche le remplacement de l'expérimentation animale par des modèles cellulaires ou moléculaires. Les résultats de ce projet permettront de mettre en place une étude clinique chez l’enfant dénutri. Ainsi, les objectifs de ce projet ne peuvent être atteints sans avoir recours à l’animal, le rat étant un modèle pour l'humain, en particulier pour la nutrition.

Réduction

A partir des données issues d’une étude précédente, nous avons déterminé qu’un effectif de 10 rats par groupe est le nombre minimal d’animaux nécessaires pour garder une puissance statistique satisfaisante. Cette étude inclue 6 lots, correspondant à chaque AAI à étudier. L’expérimentation comprendra 80 animaux pour chaque AAI étudié.

Raffinement

Le projet impose l'hébergement des rats en cages individuelles (répondant aux normes en vigueur) pour la mesure précise de la consommation alimentaire. Les rats demeurent dans la même pièce que leurs congénères, avec lesquels ils continuent à échanger par vocalises, et ils les voient et les sentent, ce qui modère l’impact de l’isolement. De plus, les cages seront enrichies au moyen de différents objets (tunnel, d’une tasse renversée, …) . De plus, un enrichissement social est prévu : les animaux seront placés en cages collective tous les jours pendant 2 h (durant les mesures de poids corporel et de gaspillage alimentaire). Les prises de sang sont réalisées par un expérimentateur expérimenté pour cet acte technique. Des aiguilles spécifiques permettant un écoulement plus efficace du sang en sortie d’aiguille sont utilisées, ce qui permet de limiter la durée et le stress engendré par les prises de sang. Les animaux seront transportés à la plateforme en voiture pour réduire la durée du stress provoqué par le transport. De plus, un enrichissement social est prévu pour le transport : Les animaux seront regroupés en fonction des régimes en cages collectives de transport avec de l’eau en gelée et de la nourriture à disposition. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permet de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Enfin, des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis des procédures.

Choix des espèces

Comme l’humain, le rat a un régime alimentaire très diversifié, il est omnivore. De plus, l’anatomie et la physiologie de son système digestif présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’être humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. A tel point que l’Organisation des Nations Unies pour l’Alimentation et l’Agriculture (Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO) recommande les études chez l’homme, le porc ou le rat pour étudier la qualité des protéines. Notre projet s’inscrit complètement dans ce cadre. Nous utiliserons ainsi des rats en croissance comme modèle de l'enfant en croissance.

Une partie des souris part vers des séances de formation à des gestes techniques une fois l'expérience finie, 210 individus au total, les autres étant tuées pour prélever leurs tissus. 504 souris sont concernées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Exposées au dioxyde de silicium alimentaire par leur mère dès la gestation puis pendant 130 jours, elles reçoivent des gavages trois fois par semaine, neuf prélèvements de sang à la queue, un poinçon dans l'oreille, des collectes de fèces en isolement deux fois par semaine, et pour la moitié d'entre elles une injection de toxine bactérienne dont les effets sont suivis jusqu'à six heures. Le porteur espère que ces données seront prises en compte par les instances réglementaires pour encadrer l'exposition humaine aux nanoparticules alimentaires, bénéfice renvoyé au conditionnel là où l'exposition des souris et l'injection de toxine sont, elles, programmées.

Objectifs

Les nanomatériaux (composés de particules < 100 nm) sont de plus en plus présents dans le secteur de l’agroalimentaire, notamment dans les aliments en tant qu’additifs. L’exposition à ces additifs est souvent chronique (jusqu’à 1-10 mg/kg/jour en Europe) et commence très tôt, via la consommation maternelle suivie d’un passage vers le fœtus (transplacentaire) ou dans le lait. Ce projet fait suite à des résultats qui montrent qu’une exposition à l'additif E551 provoque, une altération de la fonction de barrière intestinale (mesure de perméabilité), une mise en place de désordre métabolique et une modification du microbiote. Nous avons notamment mis en évidence une forte diminution de deux souches bactériennes chez des souris mâles exposés au E551 de la vie in utero jusqu'à l'âge adulte. Il s'agit de deux souches bactériennes probiotiques Akkermansia muciniphila et Bifidobacterium pseudolongum. L'objectif de ce projet sera d'étudier si une supplémentation avec ces deux souches probiotiques sera capable de modifier la mise en place des désordres provoqués par le E551 sur la fonction de barrière, sur le métabolisme et sur la réponse immunitaire. Pour ce projet, des souris femelles seront exposées 61 jours avant la mise bas et durant la lactation au E551 à 10mg/kg. L'additif sera incorporé dans l'aliment. La descendance continuera d’être exposée à l'additif via l'aliment et sera supplémentée ou non par voie orale avec les souches probiotiques seules ou associées pendant 130 jours.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de mettre en évidence le role d'un microbiote modifié dans la mise en place d'altération de la fonction de barrière intestinale, de désordres métaboliques et immunitaires. Ce projet apportera des données utilisables pour l'évaluation des risques pour la santé humaine et animale dans l'utilisation des additifs. Cet impact pourra être pris en compte par les instances règlementaires afin d'émettre des préconisations dans l'exposition humaine aux nanoparticules alimentaires.

Procédures

Pour la supplémentation en probiotique les animaux recevront le solvant ou le probiotique (seul ou associé) par voie orale d'un geste rapide n'exédant pas 10 secondes à raison de 3 fois par semaine. Dans le cadre des mesures d'intolérance au glucose, de la glycémie, de l'insulinémie et de la perméabilité intestinale, les animaux recevront une administration orale de glucose ou d'un marqueur de perméabilité intestinale (geste rapide d'environ 10 secondes) et des prélèvements sanguins seront également réalisés au niveau de la queue (1 prélèvement pour la mesure de perméabilité, 8 prélèvements pour la glycémie-insulinémie), après application d'une crème anesthésiante locale (10 secondes/prélèvement). Des prélèvements de fécès seront aussi effectués deux fois par semaine tout au long de l’expérience. Les souris seront isolées pendant 5 minutes dans des cages sans sciure pour permettre de récolter les fèces. Enfin, la moitié des animaux seront exposés au maximum 6 h à une toxine bactérienne délivrée par injection unique nécessitant une contention de quelques secondes des animaux.

Impact sur les animaux

La mise en oeuvre de nos procédures pourra générer du stress. Après la période d'acclimatation, les animaux seront identifiés par poinçon avec contention qui entrainera inconfort et stress. Par la suite le stress sera attenué par des manipulations hebdomadaires lors du suivi de poids ou d'observations. Les administrations des probiotiques par voies orale pourra générer du stress lié à la contention et à l'introduction de la sonde. Après le gavage, les animaux seront observés pour s'assurer qu'il n'y ait pas de fausse route (vocalise, mobilité réduite), le cas échéant l'animal sera euthanasié. Ensuite la réalisation des mesures d'intolérance au glucose ou de mesure de perméabilité seront génératrices d'inconfort notamment lié à l'administration orale de glucose ou de dextran et aux prélèvements de sang après anesthésie locale. Ensuite, l'injection de LPS qui s'effectue après contention de l'individu, peut engendrer un stress lié à la manipulation de l'animal et à l'injection en elle-même. La toxine peut perturber l'état général des animaux qui seront sous surveillance constante jusqu'à la fin de l'expérimentation.

Devenir

A l'issue de toutes les procédures, tous les mâles de la descendance ainsi que les femelles reproductrices seront euthanasiés afin de récolter les échantillons tissulaires pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique du projet. Les mâles reproducteurs et les femelles de la descendances seront réutilisés pour des actions de formations à des gestes techniques.

Remplacement

Des expérimentations utilisant des méthodes cellulaires complexes tels que des organoïdes intestinaux de souris ont préalablement été réalisé au laboratoire dans une nécessité de mettre en place une approche alternative à l’expérimentation animale. Ces expérimentations ont permis d’évaluer les effets direct d’additifs alimentaires inorganiques sur l’épithélium intestinal. Par conséquent, cette approche nous permet d'avoir une réponse très ciblée uniquement au niveau tissulaire/cellulaire et non intégrée. Dans notre étude nous souhaitons étudier l’impact d’une exposition à des additifs alimentaires dès la période de périnatalité et ces conséquences sur le microbiote intestinal ainsi que sur la barrière intestinale, le système immunitaire et le métabolisme. Les modèles alternatifs tels que les organoïdes ne peuvent pas reproduire le passage transplacentaire, les échanges maternofœtals ainsi que les interactions le long des axes microbiote-intestin-système immunitaire et intestin-foie. Ce modèle alternatif n’est pas non plus adapté pour étudier la répartition des particules inorganique dans l’organisme entier après le passage de la barrière intestinale.

Réduction

Nous avons conçu nos expériences pour à la fois répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis pour cibler nos objectifs en fournissant des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux a été déterminé en se basant sur des résultats antérieurs d'études similaires. Chaque groupe expérimental sera donc constitué de 12 souris. Pour les analyses des données récoltées, des tests statistiques adaptés seront réalisés.

Raffinement

Durant l'étude les animaux seront en hébergement collectif (5 ou 3 par cage selon le stade de l'expérimentation, 1 femelle par cage avec leurs petits pendant la lactation) avec un enrichissement des cages (dispositifs de nidification en papier absorbant et maisonnette) afin de réduire l'angoisse des animaux. L'angoisse sera également attenuée par des manipulations hebdomadaires lors du suivi de poids ou d'observations. Concernant la gestion de la douleur nous appliquerons un anesthésique local sur la queue avant les prélèvements sanguins. L’identification des animaux par poinçon d’oreille permettra de réaliser un suivi individuel (observations, controles de prise de poids des animaux). Dans le cas où un animal présenterait des signes de souffrance, il sera retiré de l'étude et des soins adaptés pratiqués. Le cas échéant une euthanasie sera pratiquée. L'exposition à la toxine bactérienne peut perturber l'état général des animaux qui seront observés en continu jusqu'à leur euthanasie.

Choix des espèces

La souris est un modèle reconnu en toxicologie, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier le microbiote, l’intestin et le système immunitaire. Les souris mâles et femelles seront utilisées à l’âge adulte (8 semaines) afin qu'elles soient capables de procréer et les descendants seront utilisés au sevrage jusqu'à l’âge de 5 mois. Cela permettra d’étudier le rôle de nos deux souches probiotiques sur une exposition périnatale suivie d’une exposition post-sevrage sur le développement des fonctions intestinales et métaboliques.

Une injection de streptozotocine dans l'abdomen pour faire monter le sucre sanguin, quarante-huit heures d'attente, trois gavages d'eau ou de molécules extraites de la pomme, puis une anesthésie pour mesurer la réaction des vaisseaux. 100 rats Wistar vont être utilisés ainsi, tous tués à l'issue pour prélever leurs artères, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié seulement reçoit la streptozotocine, l'autre servant de comparaison, et le porteur attend de l'expérience une piste nutritionnelle contre les atteintes vasculaires du diabète. Il retient le rat parce qu'il fournit assez de tissu pour plusieurs dosages, ce qu'il compte comme une façon de limiter le nombre d'individus utilisés.

Objectifs

Ce projet aura pour objectif d’évaluer les effets de de l’augmentation du glucose sanguin sur la fonction vasculaire ainsi que les eventuels effets protecteurs de la consommation concommitante de molécules de pomme qui sont reconnus pour leur action bloquante sur les transporteurs du glucose. Nous chercherons donc dans un premier temps à voir l'effet du glucose sur les modifications de la protéine qui régule la fonction vasculaire et évaluer si l'ajout de bloqueurs des transporteurs du glucose permettent de réverser ces modifications.

Bénéfices attendus

Le projet doit apporter une meilleure connaissance des mécanismes de dysfonction vasculaire associée à une forte concentration de sucre dans le sang. L’étude de l’implication des mécanismes de modulation de la dysfoncion vasculaire médiée par l’augmentation de la concentration de glucose dans le sang permettra de mieux appréhender les altérations de ces tissus dans des pathologies telles que le diabète. Enfin l’utilisation de molécules de pomme permettra d’évaluer l’implication des différents transporteurs du glucose et d’éventuellement mettre en avant une stratégie nutritionnelle efficiente pour limiter les altérations liées au glucose

Procédures

La moitié des animaux recevra une injection intrapéritonéale de Streptozotocine (molécule permettant d’induire une hausse du glucose sanguin), 48 heures avant l'évaluation de la fonction vasculaire ou les prélèvements post-mortem. Les animaux avec une forte concentration de glucose dans le sang (streptozotocine) ou non seront soumis à une supplémentation orale aigue (3 traitements oraux) en eau ou en molécules issues des pommes. Une anesthésie sera réalisée et associée à une injection d’analgésique afin de réaliser des doses-réponses de molécules ayant un effet relaxant vasculaire.

Impact sur les animaux

L'induction d'une hausse de la concentration de glucose dans le sang par injection intra-péritonéale de Streptozotocine est une procédure pouvant entrainer des douleurs faibles au site d'injection. Suite à cette injection les animaux seront placés sous surveillance durant 2 heures puis seront surveillés quotidiennement. La supplémentation par voie orale (gavage) ainsi que l’induction de l’anesthésie gazeuse pouvant être source de stress ou de douleurs modérées pour l’animal, les animaux seront habitués au gavage par un manipulateur expérimenté.

Devenir

Afin de pouvoir évaluer les effets des différents transporteurs du glucose, nous devons réaliser des analyses sur les tissus des artères des animaux inclus ce qui nécessite la mise à mort des 100 rats Wistar en fin de procédure.

Remplacement

Ce projet visant à évaluer les effets du glucose sur les modifications des protéines vasculaires fait l’objet de différentes expérimentations. Des expérimentations in-vitro sont actuellement conduites pour évaluer les mécanismes de ces voies de signalisation. Par ailleurs, les études in-vitro nous ont permis d’évaluer l’intérêt de l’utilisation des 2 molécules de pomme que sont la phlorizine et la phlorétine dans la limitation des effets délétères liés au glucose. Cependant la balance entre les différentes modifications protéiques au niveau vasculaire est complexe et l’évaluation de l’effet de stratégies nutritionnelles nécessite l’utilisation de modèle in-vivo afin d’évaluer l’influence de ces différentes conditions. L’intégration d’expérimentations animales apparait donc comme nécessaire afin de compléter ce projet de recherche.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire afin de réaliser les mesures de réactivité vasculaire in-vivo tout en s’assurant de la répétabilité du résultat. Pour cela un nombre minimum de 10 animaux par condition apparait comme nécessaire. Des groupes doivent être conduits pour l’évaluations de nos différentes conditions sur la fonction vasculaire et d’autre groupes sont nécessaires pour quantifier les modifications protéiques au niveau de ces mêmes tissus.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés durant 7 jours après leur arriver à l’animalerie avant toute procédure. Afin de permettre la formation de groupes sociaux, les rats sont hébergés en cages de 3 individus avec un enrichissement du milieu (tubes, coton, bâtons à ronger). La nourriture est standard ad libitum et un accès à de l’eau fraiche. La température et l’hygrométrie sont contrôlées. Les animaux sont visités quotidiennement par un personnel formé qui contrôle le bien-être des animaux à l’aide d’une fiche intégrant les différents points limites. Afin d’éviter toute douleur, les prélévements seront réalisés sous anesthésie associée à une analgésie.

Choix des espèces

Le rat est un modèle pertinent pour l’étude du système cardiovasculaire. De plus son utilisation permet d’obtenir des quantités de tissu suffisantes pour la réalisation de plusieurs dosages biochimiques permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux nécessaires. Afin d'éviter des modifications liées au développement des animaux, les animaux seront utilisés à un stade mature (rats de 12 semaines) pour être représentatif d’une population adulte

Jusqu'à trois séances d'IRM de trois heures sous anesthésie, avec quatre prises de sang par séance et des bouchons de mousse enfoncés dans les conduits auditifs pour amortir le bruit de l'aimant : 228 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est soumise six semaines à un régime hyperlipidique qui provoque hyperlipidémie et résistance à l'insuline. L'objet est de suivre l'effet de la neuro-inflammation d'origine alimentaire sur l'activité cérébrale, le cerveau étant prélevé après la mise à mort. Le porteur qualifie pourtant ces procédures de "non-invasives" et estime que le régime n'altérera pas "drastiquement" la qualité de vie des souris.

Objectifs

L'un des plus grands défis dans un environnement obésogène tel que nos sociétés modernes est la gestion du poids à long terme, la plupart des tentatives de perte de poids se soldant par une reprise de poids ultérieure (effet "yo-yo"). Le système nerveux central joue un rôle clé dans le maintien de la balance énergétique en régulant les apports (comportement alimentaire, incluant les dimensions homéostatiques et hédoniques) et les dépenses énergétiques. La plupart des études se sont intéressées à la régulation homéostatique du comportement alimentaire. De nombreuses études ont ainsi montré chez la souris mais aussi chez l’Homme qu’une exposition chronique à un aliment riche en lipides (connue pour conduire à terme à une surchage pondéral voire une obésité) conduit à des modifications neuro-anatomiques, une neuro-inflammation, et ce particulièrement au niveau de l’hypothalamus. Malgré l'accumulation de preuves révélant les interactions entre les régulations homéostatiques et non-homéostatiques du comportement alimentaire, des données manquent sur l’effet d’une exposition chronique à une alimentation hypercalorique sur les réseaux cérébraux sous-jacents. De plus peu de données existent concernant l’effet de la neuro-inflammation induite par un régime riche en lipides sur l’activité cérébrale.

Bénéfices attendus

Les données issues de ce projet contribueront à une meilleure compréhension de l’effet de la neuro-inflammation induite par le régime hyperlipidique sur l’activité cérébrale et la connectivité fonctionnelle et éclaireront sur les mécanismes cérébraux qui sous-tendent les modifications du comportement alimentaire (y compris dans l’addiction à la nourriture, le « binge eating » ou l’anorexie). De plus, l’approche par imagerie dans le modèle animal est non seulement une méthode non-invasive mais également une approche facilement transférable à l’Homme.

Procédures

Les souris seront soumises à des anesthésies pour l'acquisition par IRM. Une session d'acquisition durera au maximum 3h et une souris réalisera au maximum 3 sessions d'acquisition. Dans la procédure 1, des prises de sang seront effectuées pour mesurer la glycémie. Elles dureront quelques secondes et seront au nombre de 4 par session d'acquisition IRM pour chaque animal. Dans la procédure 3, une partie des souris sera exposée à un régime hyperlipidique pendant 6 semaines.

Impact sur les animaux

La prise chronique sur des temps longs (>8 semaines) d’un aliment HFD conduit à une prise de poids, des perturbations métaboliques et des modifications de l’activité locomotrice et potentiellement de l’humeur. La période d’exposition au HFD de 6 semaines dans notre projet perturbera le métabolisme des animaux (hyperlipidémie, résistance à l’insuline) mais n’altérera pas drastiquement, à ce stade, la qualité de vie des animaux. Les nuisances liées à l'IRM étant de nature sonores, des protections auditives en mousse seront positionnées dans le conduit auditif des animaux afin d'éviter une dégradation de leur audition.

Devenir

A l'issue des procédures les animaux seront mis à mort selon la réglementation en vigueur. Le contrôle de l'intensité de l'inflammation par des approches de biologie moléculaire nécessite le prélèvement du cerveau et donc l'euthanasie des animaux. D'autres organes pourront être prélevés pour des analyses tissulaires post-mortem complémentaires (par ex: tractus digestif). Un entraînement et le raffinement des gestes techniques employés seront réalisés en amont des prélèvements décrits précédemment.

Remplacement

Cette étude de mesure de la neuroinflammation, de l’activité cérébrale et la de connectivité fonctionnelle entre des structures cérébrales ne peut être réalisée in vitro ni modélisée in silico. En effet, le nombre, la complexité des structures cérébrales mises en jeu, leur activité et leurs interactions dans un contexte intégré ne permet pas de réaliser cette étude sur des modèles cellulaires qui sont insuffisamment représentatifs à l'heure actuelle. De plus, dans la perspective de pouvoir transposer les données générées dans cette étude à l'Homme, l'utilisation d'animaux présentant une bonne analogie fonctionnelle ainsi qu'une bonne homologie anatomique, physiologique et génétique avec l'Homme est requise. Dans cette étude, les travaux seront menés sur la souris.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu a été déterminé grâce à des données publiées générées par les responsables du projet. Le nombre d’animaux prévu permet d’effectuer des analyses statistiques qui permettront de déterminer la pertinence de poursuite ou non de la méthode mise au point. Plus précisément, pour les différents paramètres d'imagerie considérés, des tests statistiques permettant une analyse temporelle et/ou de l'effet de traitements entre plusieurs groupes et/ou de l'effet sexe des animaux lors de mesures répétées en utilisant des tests paramétriques ou non paramétriques selon la distribution des données. Grâce à l'utilisation d'un suivi longitudinal (mesures répétées chez un même animal), le nombre total d'animaux inclus dans l'étude est réduit.

Raffinement

Les procédures expérimentales prévues sont non-invasives. Les prélèvements pour l’analyse histologique sont post-mortem. Le suivi du poids et une observation clinique quotidienne des souris permettront d’évaluer les points limites. La durée d’exposition à l’aliment HFD permet de limiter les conséquences négatives sur l’animal.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur le comportement alimentaire, notamment dans l’obésité en raison de ses réponses reproductibles permettant une robustesse des résultats générés. L’abondance des données dans la littérature sur les mécanismes de régulation de la prise alimentaire dans cette espèce permet d’autre part le raffinement des méthodes (outils analytiques disponibles évitant la mise au point de certaines méthodes sur des animaux supplémentaires). Enfin, nous disposons déjà de données préliminaires sur ce modèle animal. Nous avons décidé de travailler sur individus « jeune adulte » âgées de 7-8 semaines pour éviter les effets liés au développement d’une part et au vieillissement d’autre part.

Former des techniciens à trois examens fonctionnels et caler les protocoles : 64 souris vont être utilisées pour cela, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit les trois actes, une exploration respiratoire de 22 minutes, une échographie musculaire de 30 à 60 minutes sous anesthésie générale, puis une mesure de la force de flexion du pied sous anesthésie, avec des aiguilles de stimulation plantées dans le muscle. Le porteur signale des réveils spontanés possibles, des détresses respiratoires pendant l'anesthésie et des douleurs post-opératoires liées aux piqûres. Il présente l'opération comme un moyen de réduire "considérablement" le nombre d'animaux dans les projets à venir, et précise que ces 64 souris étaient de toute façon promises à la mort, leur génotype ne servant aucun projet.

Objectifs

L’objectif de cette demande a pour but de développer nouvelles techniques in vivo chez la souris contribuant à l'avancée de la recherche sur les maladies neuromusculaires et de former les applicateurs. La mise en place de ces études permettra d’ajouter de nouvelles évaluations et ainsi proposer aux équipes de recherche des projets plus complets. Les différents actes réalisés seront l’échographie de muscles squelettiques, l'évaluation de la fonction respiratoire et de la force générée lors d’une flexion du pied. La technique d’élastographie par échographie permet de mesurer l'élasticité des différents tissus dans un muscle d'intérêt. Cette technique, nécessitant seulement une anesthésie générale, a pour but d’observer le développement des différents tissus composant le muscle dans les modèles murins de maladies neuromusculaires. Cet examen peut être réalisé plusieurs fois permettant un suivi régulier sur un même lot expérimental. Le nombre d’animaux inclut dans les projets scientifiques sera considérablement réduit et favorisera l’obtention de meilleurs résultats en éliminant la variabilité inter-individuelle. Le pléthysmographe est une exploration fonctionnelle respiratoire. Elle mesure l’ensemble des volumes gazeux pulmonaires. Cela indiquera également la contribution du diaphragme dans le système respiratoire. Cet examen est rapide, indolore et non invasif pour l’animal. L’évaluation de la force générée lors d’une flexion plantaire consiste à mettre en évidence les défauts de contractilité musculaire. Elle se déroule sous anesthésie générale accompagnée d’un analgésique et n’est pas terminale. Ces évaluations pourront être répétées sur un même lot expérimental permettant un suivi régulier de l’évolution des symptômes de la maladie neuromusculaire. Cette technique permettra de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés dans les projets scientifiques.

Bénéfices attendus

L’objectif de cette demande a pour but de développer de nouvelles techniques in vivo contribuant à l'avancée de la recherche sur les maladies neuromusculaires et de former les applicateurs. La réalisation de cette étude pilote peut s'avérer très utile pour la détermination précise des points limites, et pour la formation complète des techniciens. Cette étude utilisant un nombre restreint d'animaux peut aider à déterminer la durée de l’acte et la fréquence des observations nécessaires des lots dans les futurs projets expérimentaux. Ce projet de formation, préliminaire aux études des équipes de recherche peut également donner une indication de la variance des réponses entre les groupes de traitement, laquelle peut être alors utilisée pour estimer plus précisément la taille appropriée des groupes des projets expérimentaux. De plus, mener une expérience pilote offre l'occasion de se familiariser avec les signes et symptômes attendus et de conseiller au mieux les concepteurs de projets par la suite.

Procédures

La totalité des animaux inclus dans ce projet seront soumis aux trois techniques d'études fonctionnelles décrites : - L'évaluation de la fonction respiratoire sera réalisée 1 seule fois par animal et durera approximativement 22 minutes. - Une échographie de muscles squelettiques réalisée également 1 seule fois par animal. L'examen durera 30 à 60 minutes et se réalise sous anesthésie générale. - L'évaluation de la force musculaire lors d'une flexion plantaire sera le dernier test effectué 1 seule fois par animal. Il nécessite l'anesthésie des animaux et l'ajout d'un anti-douleur. Il dure environ 15 à 20 minutes. Ces trois actes consitant à analyser trois paramètres physiologiques permettront d'évaluer l'efficacité d'un nouveau traîtement thérapeutique, de caractériser un nouveau modèle murin de maladies neuromusculaires. Ces équipements modernes sont similaires à ceux utilisés chez l'homme et vont permettre la réalisation d'étude complète et abouties. Le nombre d'animaux inclut dans les projet expérimentaux s'appliquant à la recherche des maladies neuromusculaires se verra considérablement réduit.

Impact sur les animaux

Lors de la pléthysmographie, seul le stress peut survenir pendant l’acte dû à la manipulation des animaux. Pendant une échographie, le réveil spontané d’un animal peut être attendu ainsi qu’une détresse respiratoire lors de l’anesthésie. Lors de l'évaluation de la force générée lors d'une flexion plantaire, les nuisances tels qu’un réveil spontané, une détresse respiratoire, des douleurs post-opératoires dues aux piqûres des aiguilles de stimulation et à la contraction involontaire appliquée peuvent être attendus. Durant la semaine de stabulation suivant l’échographie, le stress et l’inconfort dû au réveil après l’anesthésie générale est à prévoir.

Devenir

Les animaux utilisés dans cette procédure étaient initialement voués à l'euthanasie dû à un génotype sans intérêt pour les projets scientifiques. Ils seront donc euthanasiés à la fin de cette procédure.

Remplacement

Ces techniques qui permettent une analyse fonctionnelle de la physiologie animale suite à des traitements thérapeutiques ne peuvent être remplacées actuellement par des méthodes alternatives ou in vitro. Tous les projets nécessitant l'utilisation de ces techniques pour évaluer les nouveaux traitements thérapeutiques en cour de test utilisent les modèles murins qui restent une source unique et indispensable permatant l'évaluation d'une amélioration histologique et fonctionnelle induite par les traitement testés. Les modèles de culture in vitro disponibles ne permettent pas de récapituler la complexité physiologique in vivo. Cette étude permettra d’inclure au sein d’un même projet un ensemble de techniques qui amènera à la réalisation d’une recherche plus complète et aboutie.

Réduction

Cette étude pilote utilise un nombre d’animaux restreint et donnera une meilleure estimation du nombre nécessaire d’animaux dans la réalisation de ces actes au sein des projets expérimentaux. Les souris utilisées seront celles issues de la reproduction de lignées et qui étaient vouées à l'euthanasie à cause de leur mauvais génotype (sans phénotype dommageable). 10 animaux par sexe pour les groupes "jeunes" et "adultes" et 12 animaux par sexe pour le groupe "agées" sont nécessaires pour maitriser parfaitement les techniques, déterminer la taille des cohortes appropriées, la fréquence des observations nécessaires à l’établissement d’un point limite. Ce nombre est également suffisant pour déterminer la variance des réponses entre les futurs groupes de traitement. Aucun test statistique ne sera utilisé pour cette étude. Le nombre total des animaux s'inscrivant dans ce projet est de 64.

Raffinement

L’ensemble des animaux sera hébergé en pièce de stabulation dans des portoirs ventilés. Ces pièces sont équipées de cycle jour/nuit permettant un cycle de réveil et de sommeil constant et sain pour l’animal. Ils auront accès à de la nourriture et de l’eau (système d’abreuvement automatique) à volonté. Les zootechniciens de l’animalerie s’occuperont du nettoyage de la litière une fois par semaine et mettra dans chaque cage de l’enrichissement (maisonnettes et lanières de papier kraft (nid)). La température et l’hygrométrie seront contrôlés quotidiennement. Les animaux sélectionnés seront au minimum 2 et maximum 5 par cage. Aucun animal isolé ne sera choisi pour ce projet. Les animaux seront surveillés quotidiennement tout au long du projet en suivant la grille de scoring. Afin d’éviter le stress lors de la pléthysmographie, une séance d’entrainement est prévue deux jours avant. Suite aux 30 minutes d’anesthésie pendant l’échographie, seul un stress de réveil peut être ressenti par l’animal. Une semaine de stabulation sera appliquée afin de l’éviter au maximum. Si des douleurs légères post-opératoires (selon grille de scoring) sont observées après l'évaluation de la force de la flexion plantaire, une injection sous-cutanée d’analgésique sera réalisée.

Choix des espèces

La souris est le modèle commun le plus utilisé par les équipes de recherche, de l'animalerie expérimentale, œuvrant pour la recherche sur les maladies neuromusculaires. Les trois stades de développement chez les souris (jeunes/adultes/vieilles) ont été choisis afin d’expérimenter en fonction de la taille et du poids changeant des animaux, de comprendre les différents résultats obtenus pour chaque lot et de préciser les points limites pouvant être modifié avec l’âge.