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Etude de l’effet du pâturage séquentiel alterné mixte ovins/bovins sur le bien-être et le parasitisme des animaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Bovins : 11
Dans une ferme expérimentale qui élève des races à viande, génisses et moutons pâturent à tour de rôle les mêmes prairies, pour savoir si les bovins réduisent les parasites des ovins face à des vermifuges dont l'efficacité recule. 237 animaux non-humains, 226 moutons et 11 génisses, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger : 131 d'entre eux subissent chaque mois pendant quatre mois un prélèvement de crottes par stimulation rectale, et 31 deux prises de sang à la jugulaire ou à la queue. Le porteur prévoit qu'une "très forte infestation parasitaire" puisse toucher surtout les agneaux du troupeau témoin, sans bovins, la surveillance quotidienne devant repérer ceux à traiter. Brebis et génisses retournent ensuite au troupeau, et les agneaux "poursuivront leur engraissement" pour la viande.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier les effets du pâturage séquentiel alterné entre ovins et bovins au printemps sur le parasitisme et le bien-être des animaux. Une de nos hypothèses de travail est que les bovins apportent un bénéfice aux ovins en termes de parasitisme, y compris lors de pâturage séquentiel alterné. L’expérimentation analytique vise donc à mesurer les effets de l’introduction d’un troupeau de bovins dans le cycle de pâturage d’un troupeau ovin. Pour cela, un système mixte sera comparé à un système ovins spécialisé pris comme témoin. Seront notamment abordées les questions de la conduite au pâturage des deux espèces et la gestion des lots. L’excrétion parasitaire, les performances zootechniques du troupeau, ainsi que les conditions de travail seront observées.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus sont dans un premier temps une réduction du parasitisme chez les ovins du système mixte par rapport à ceux du système spécialisé, particulièrement chez les agneaux plus sensibles que les agnelles ou les brebis. L’objectif sera de suivre l’excrétion parasitaire du troupeau d’ovins et du troupeau de bovins (strongles, douves) et de déterminer si cette pratique peut être une alternative à la résistance au traitement anthelminthique. En ce sens elle s’insère pleinement dans la transition agroécologique en mentant à profit des processus biologiques en remplacement de molécules chimiques (anthelminthiques) dont l’efficacité est de plus en plus limitée compte tenu du développement rapide de résistances dans les populations de parasites. D’un point de vue sanitaire, les anthelminthiques de synthèse sont les médicaments couramment utilisés en médecine vétérinaire pour gérer les infestations parasitaires. Cependant, des métabolites ou des molécules non dégradées se retrouvent dans les produits dédiés à la consommation humaine (viande, lait, fromage), et peuvent impacter indirectement la santé humaine. Pour certaines molécules, des conséquences environnementales ont aussi été signalées. Des temps d’attente sont donc à respecter avant de commercialiser et consommer ces denrées alimentaires. De plus, depuis ces dernières années, une multiplication des résistances aux anthelminthiques de synthèse est observée dans les élevages ovins et caprins. Pour pallier à ces problèmes, l’exploitation dans la ration de métabolites secondaires bioactifs naturellement présents dans certains végétaux ou ressources végétales serait une méthode alternative à l’emploi des traitements chimiques. Enfin, l’aspect innovant de ce projet tient également à l’étude de la mixité en pâturage séquentiel, qui a l’intérêt de faciliter la gestion des lots au quotidien (pas de mélange simultané des espèces) et pourrait en ce sens aider au développement de la mixité ovin/bovin pour plus de résilience.
Procédures
Deux types de prélèvements sont prévus sur les animaux : i) Des prélèvements de fèces (5 grammes) auront lieu tous les mois durant les 4 mois de l’expérimentation, sur 60 brebis et 60 agneaux préférentiellement mâles (30 brebis et 30 agneaux de chaque troupeau ovin), ainsi que sur les 11 génisses. ii) Des prises de sang (10mL) seront réalisées sur les 11 génisses et sur 20 brebis (10 brebis de chaque troupeau ovin) en début et fin d’expérimentation.
Impact sur les animaux
On peut noter 3 types de nuisances attendues : tout d’abord pour effectuer des sérologies, des prises de sang seront réalisées à la veine jugulaire (ovin) ou caudale (bovin). Des hématomes peuvent apparaitre en cas de prélèvements répétés mais ceux-ci n’auront lieux qu’en début et fin d’essai soit un espacement de plus de 3 mois. Ensuite afin de réaliser des coprologies, des prélèvements de fèces auront lieu par stimulation rectale en évitant au maximum le prélèvement direct par fouille. L’ensemble des prélèvements (prise de sang + fèces) ne dure que 1 à 3 minutes par animal, et elles seront réalisées par du personnel compétent et formé. Enfin, une très forte infestation parasitaire pourrait survenir dans les troupeaux ovins, particulièrement chez les agneaux du système spécialisé. Pour cela le suivi régulier des performances et la de la santé des animaux, couplé à une surveillance quotidienne par le personnel animalier qualifié, permettra de déceler suffisamment précocement les animaux à traiter.
Devenir
Les agneaux poursuivront leur engraissement dans un schéma classique d’élevage ovin. Les brebis et les génisses retourneront dans le troupeau d’élevage de l’établissement utilisateur.
Remplacement
Aucun essai in vitro ni modélisation n’existe à ce jour pour une telle étude. L’étude in vivo est indispensable pour étudier le lien entre le parasitisme et pratiques de pâturage. De nombreuses mesures ne sont possibles qu’en expérimentation in vivo : mesures de parasitologie (évaluation de la charge parasitaire par analyses coproscopiques sur les fèces et sérologie sur prise de sang), étude des performances zootechniques (gain de poids, note d’état corporel). Ces analyses fines permettront de produire des références.
Réduction
Le nombre d’animaux a été optimisé et réduit au minimum pour i) s’assurer d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour des analyses statistiques fiables des paramètres de parasitologie (mesure de coproscopie) sur les 2 lots infestés et ii) assurer des répétitions pour obtenir la puissance statistique nécessaire pour arriver à faire le lien entre infestation parasitaire et pratiques de pâturage. Ainsi le dimensionnement a cherché à être minimaliste tout en veillant à avoir des effectifs minimaux pour reproduire les effets troupeaux. Par ailleurs, les surfaces des parcelles doivent être suffisamment grandes pour être représentatives de la diversité et capter la variabilité des prairies permanentes de montagne ici étudiées. Le nombre d’animaux permet également d’avoir un chargement adapté au potentiel de production des prairies.
Raffinement
Les animaux se trouveront dans le cadre d’une conduite d’élevage classique (pâturage à l’herbe). L’état de santé des animaux sera évalué tous les jours lors de la surveillance sur les parcelles par un animalier habilité, responsable de la mise en œuvre du protocole. Tout changement de comportement (isolement, abattement, baisse d’appétit ou refus de s’alimenter) ou tout autre comportement anormal sera signalé et pris en charge, consigné dans le cahier d’expérimentation. Les évaluations des performances zootechniques et du bien-être animal serviront également à surveiller la santé des animaux. Un diagnostic approfondi de l’animal malade sera réalisé, et si nécessaire un traitement adéquat sera administré sur avis du vétérinaire. Si aucune amélioration n’est constatée dans les jours suivants, l’animal sera sorti de la procédure.
Choix des espèces
L’étude vise à étudier la mixité ovin/bovin au pâturage. Les bovins seront de race charolaise et les ovins de race limousine et sont actuellement présentes sur la ferme expérimentale. Ces deux espèces sont l’objet d’élevage de rente et font parties des productions de viande majoritaire en France. Les suivis sur le parasitisme sont impossibles à réaliser sans l’utilisation d’animaux. Les agneaux mâles seront suivis préférentiellement car ils plus sensibles au parasitisme. Brebis allaitantes et agneaux en croissance avant sevrage
Identification d’une nouvelle cible thérapeutique pour stimuler les réponses immunitaires anti-tumorales
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Tester si une cible identifiée en culture cellulaire améliore l'effet de la radiothérapie suppose ici de greffer une tumeur à 432 souris. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées, à la fin du suivi de croissance tumorale ou pour des analyses post mortem. Après l'injection sous-cutanée de cellules tumorales viennent un gavage puis une irradiation sous anesthésie, en trois doses sur trois jours consécutifs ou en dose unique par mini-faisceaux, avec diarrhée, perte de poids et dermite possibles. Le porteur affirme que le développement de ces tumeurs n'entraîne ni douleur ni gêne et conclut que le modèle animal reste "indispensable" pour passer à la clinique.
Objectifs
L‘arsenal des traitements contre le cancer comprend la radiothérapie, la chimiothérapie et l’immunothérapie, c’est-à-dire la manipulation du système immunitaire du patient pour combattre la tumeur. Cependant, ces traitements ne sont pas efficaces contre tous les cancers ou seule une partie des patients répondent au traitement. L’efficacité du traitement dépend souvent de l’implication des cellules du système immunitaire. Ces dernières années, le rôle essentiel d’une population particulière de cellules immunitaires, appelées monocytes, a été mis en évidence. Le but de ce projet est de manipuler ces cellules afin de stimuler les réponses immunitaires contre les tumeurs, et de tester une stratégie thérapeutique permettant d’augmenter l’efficacité de la radiothérapie, la chimiothérapie et l’immunothérapie.
Bénéfices attendus
Nous avons identifié par des expériences in vitro une nouvelle cible thérapeutique potentielle qui pourrait stimuler les réponses immunitaires dans le contexte du cancer. Ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances essentielles pour évaluer l’intérêt de cette nouvelle cible thérapeutique dans un système physiologique in vivo. Ce projet permettra également de mieux comprendre l’importance des cellules immunitaires appelées monocytes dans les réponses immunitaires anti-tumorales. Ces avancées seront communiquées à la communauté scientifique dès la fin du projet. A plus long terme, ce projet ouvrira la voie à de nouvelles applications thérapeutiques chez l’homme, en particulier de nouvelles stratégies pour optimiser l'efficacité des traitements anti-tumoraux.
Procédures
Des cellules tumorales seront injectées par voie sous-cutanée à tous les animaux de ce projet (injection sur animaux vigiles1 fois au cours de l’expérience – durée du geste inf à 10 sec). Puis les animaux vigiles recevront un traitement par gavage (durée du geste inf à 10 sec) en préalable à l’irradiation. Ensuite, les animaux seront anesthésiés et ces animaux recevront un traitement de radiothérapie conventionnelle (une dose pendant 3 jours consécutifs, 3 doses au total) ou un traitement de radiothérapie par mini-faisceaux (1 dose unique) (durée de l’anesthésie pour ces irradiations : 30 min).
Impact sur les animaux
Les animaux greffés avec des cellules tumorales développeront des tumeurs sous-cutanées au niveau du flanc qui seront mesurées régulièrement. Le développement de ces tumeurs n’entrainera pas de douleur ni de gêne pour l’animal Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection de produits non irritants par voie intrapéritonéale (directement dans l’abdomen) (gêne de courte durée),celles liées au gavage oral (gêne de courte durée), et celles liées à une irradiation (possible diarrhée, perte de poids et dermite)
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin du suivi de croissance tumorale ou pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Après des premières étapes d’analyse et de validation dans un modèle de culture in vitro, nous avons formulé l’hypothèse que notre cible d’intérêt pourrait stimuler les réponses immunitaires anti-tumorales. Cette hypothèse ne peut être testée que dans un modèle in vivo, dans un système physiologique représentant un organisme vivant intégré et autonome tel que la souris. Cette étape est indispensable à la compréhension du processus biologique et à l’évaluation du potentiel thérapeutique de l’approche proposée dans ce projet. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation de modèle animal reste indispensable pour pouvoir aborder la phase d’application de nos découvertes en clinique.
Réduction
Le nombre de souris par condition est de 18 (6 par expérience, répétée 3 fois) afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante, selon la différence que l’on souhaite mettre en évidence. Dans notre expérience préalable, ces effectifs sont suffisants pour mettre en évidence des différences significatives dans des modèles expérimentaux semblables. Dans certaines expériences, plusieurs organes seront prélevés post-mortem pour des analyses, ce qui optimise le nombre de souris utilisées.
Raffinement
Dans le cadre des greffes de tumeurs, les animaux sont surveillés quotidiennement par l'équipe pour l’état général (7j/7). La radiothérapie sera réalisée sous anesthésie générale et les éventuelles douleurs soulagées par des analgésiques. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. En cas d’atteinte des points-limite les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche thérapeutique du cancer, car la physiologie de la souris est proche de celle de l’homme. D’autre part les mécanismes immunitaires sont bien caractérisés chez la souris, ce qui en fait un modèle particulièrement adapté pour étudier les réponses immunitaires anti-tumorales. La connaissance complète du génome murin permet d’utiliser de nombreux outils bien caractérisés, ce qui sera particulièrement pertinent dans le cadre de ce projet. Les souris seront utilisées à l'âge adulte (de 5 à 7 semaines) afin que les souris aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux.
Evaluation de l’efficacité thérapeutique de molécules immunomodulatrices dans des modèles expérimentaux de cancer établis chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Des cellules tumorales sont implantées sous la peau du flanc, puis chaque souris reçoit trois à six injections de produit en trois semaines, la tumeur est mesurée tous les deux jours et l'animal pesé avant et 24 heures après chaque injection. 1 080 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour tester des molécules immunostimulantes contre le cancer. Le porteur décrit une croissance tumorale en général bien tolérée, avec des lésions cutanées pouvant aller jusqu'à l'ulcération et la nécrose, et une gêne respiratoire dans le modèle de métastases pulmonaires. Toutes sont mises à mort à la fin de chaque procédure, au motif qu'elles ne peuvent être ni réutilisées, ni replacées, ni adoptées.
Objectifs
Notre organisme se défend à chaque instant contre des attaques extérieures grâce à la surveillance de notre système immunitaire. Néanmoins, en cas de cancer, ce dernier ne parvient pas à empêcher le développement de la maladie. Les traitements d’immunothérapie anticancéreuse vise donc à réactiver le système immunitaire c’est-à-dire à réapprendre aux cellules immunitaires à reconnaître et à détruire les cellules tumorales, cellules anormales à notre corps. Notre projet s’inscrit dans ce domaine par la recherche de solutions thérapeutiques innovantes qui s’attaquent à la cellule tumorale, mais également à son environnement immunitaire. Pour ce faire, nous développons des molécules immunostimulantes qui sont dans un premier temps sélectionnées in vitro à l’aide de tests cellulaires (criblage sur lignées cellulaires rapportrices et mise en œuvre de co-culture mimant les intéractions entre les cellules tumorales et les cellules immunitaires). Cependant, l’évaluation thérapeutique de molécules candidates sur des modèles in vivo demeure nécessaire pour comprendre leur mode d’action. C’est la raison pour laquelle, nous avons recours à divers modèles de tumeurs implantées chez la souris permettant de mimer la pathologie tumorale humaine. Ce projet a donc pour but de : - évaluer l’efficacité de nouvelles molécules à activité anti-cancéreuse - étudier les mécanismes mis en jeu dans la réponse immunitaire anti-tumorale - appréhender la sécurité de la molécule candidate dans des modèles expérimentaux de cancer.
Bénéfices attendus
En premier lieu, ce projet nous permettra d’établir des corrélations entre les réponses obtenues sur nos modèles cellulaires in vitro et la réponse anti-tumorale sur un organisme entier. Cela permettra ainsi de mieux comprendre les mécanismes des voies de l’immunité innée mis en œuvre dans la réponse anti-tumorale du candidat médicament et éventuellement de comprendre les mécanismes de résistance à certains traitements. D’autre part, ces expérimentations in vivo, dont le bénéfice principal attendu est une diminution significative du volume tumoral constituent un prérequis indispensable afin de consolider la preuve de l’efficacité du candidat médicament avant d’envisager son utilisation dans le cadre d’essais cliniques. Ces études précliniques permettent d’appréhender la toxicité de la molécule candidate, en identifiant les effets indésirables qui pourraient empêcher une molécule de passer en phase de développement clinique. Selon les résultats du projet, nous pourrions découvrir de nouvelles stratégies thérapeutiques bénéfiques en immuno-oncologie et proposer ainsi de nouvelles molécules à la communauté scientifique pour lutter contre le cancer chez l’homme, enjeu majeur de santé publique.
Procédures
Les animaux subiront différents types d'actes, injections ou prélèvements qui ne requièrent que quelques secondes à quelques minutes par animal. En fonction du produit thérapeutique testé, chaque animal aura : soit 3 injections ; soit 6 injections de produit avec 2 injections/semaine sur une durée de 3 semaines pour lesquels la douleur est modérée à sévère du fait de la répétition. Pour les interventions pouvant induire un stress chez l’animal, elles seront réalisées sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Pour les modèles sous-cutanés, les nuisances principales attendues sont liées à la progression tumorale (d’une durée maximale de 7 à 10 jours) qui peut s’accompagner de lésions cutanées d’intensité légère (inflammatoire) à sévère (nécrose) selon le type de tumeurs (l’ulcération de la tumeur ou perte de substance de la peau, étant la lésion la plus grave). La progression tumorale peut également engendrer une gêne dans le déplacement de la souris car l’injection des cellules tumorales génère une masse au niveau du flanc de la souris. Le volume tumoral est mesuré tous les 2 jours et un volume maximal a été déterminé comme critère d’arrêt de la procédure. Normalement, la croissance de la tumeur est bien tolérée par les souris, mais peut dans des cas rares, être associée à une perte de poids, une activité anormale, entraînant une nuisance d’intensité moyenne à sévère. Dans le cas du modèle métastatique pulmonaire, la nuisance d’intensité sévère associée à ce modèle est un inconfort respiratoire lié à la dissémination métastatique dans les poumons, observé uniquement à un stade évolutif tardif. D’éventuels effets secondaires des traitements anti-cancéreux tels que chimiothérapies ou immunothérapies sont possibles, mais il n’est pas attendu d’effet secondaire important avec les molécules évaluées dans ce projet. Quant aux effets prévus, concernant les animaux traités avec le produit thérapeutique, il est attendu une diminution du volume tumoral voire une disparition totale des tumeurs.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
Afin de mettre au point des traitements plus efficaces, seuls les modèles in vivo nous permettent de comprendre les mécanismes complexes au sein d’une tumeur, alors que l’utilisation de lignées cancéreuses en culture est insuffisante pour comprendre les relations/interactions permanentes entre les différents types cellulaires dans un organisme entier. En effet, les tests biologiques sur cellules (in vitro) permettent de connaître rapidement l’activité recherchée mais ne permettent pas d’appréhender l’efficacité d’un produit thérapeutique ni son innocuité sur un organisme entier. Le recours à des animaux est justifié par la nécessité d’avoir un système immunitaire complet pour mesurer l’index thérapeutique et la réponse immunitaire antitumorale de nos molécules. L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques occupe donc encore aujourd'hui une place centrale en immuno-oncologie.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés dans une expérimentation sera de 46 au maximum. Ce nombre est réduit à son minimum soit 6 ou 10 animaux/groupe dans le cas des modèles sous-cutanés ou 8 animaux/groupe dans le cas du modèle métastatique. Il a été déterminé à partir de publications évaluant des biomolécules d’immunothérapie sur les mêmes modèles animaux utilisés dans ces procédures et il est suffisant pour mettre en évidence des différences significatives sur le volume tumoral, notre critère majeur. Cela permet également de limiter la répétition des études (réduction du nombre d’études) et de pouvoir gérer techniquement l’expérimentation (surveillance clinique plus adaptée du fait d’un nombre limité d’animaux) tout en gardant suffisamment d’animaux par groupe pour réaliser des études statistiques significatives. Le nombre maximal d'animaux considéré pour ce projet est par conséquent de 1080 souris, sur une durée maximale de 5 ans
Raffinement
Parmi les mesures spécifiques prises, nous privilégions l’utilisation de l’anesthésie gazeuse pour la sédation car elle permet une anesthésie de très bonne qualité, sûre et réversible ainsi qu’un réveil rapide. En effet, pour minimiser le stress et la douleur liés aux injections ou aux prélèvements sanguins, les animaux sont anesthésiés lors de la mise en œuvre de ces actes. D’autre part, nous mettons en œuvre des soins per-opératoires qui contribuent à raffiner nos procédures : vérification de la profondeur d'anesthésie ; surveillance de la fréquence respiratoire ; utilisation de tapis chauffant durant l’implantation des cellules tumorales ou les injections intra-veineuses et les prélèvements sanguins ; utilisation de gel oculaire protecteur durant l’anesthésie ; utilisation d’une lampe chauffante et de fibre naturelle de coton durant la phase de réveil. Enfin, nos procédures requièrent une surveillance accrue en plus d’une surveillance quotidienne : avant et 24h après chaque injection du produit thérapeutique, les animaux sont pesés afin de mettre en évidence une éventuelle toxicité aigüe et 4h après chaque injection, les animaux sont réexaminés. Un examen clinique individuel sur chaque animal est réalisé tous les 2 ou 3 jours au cours duquel la taille des tumeurs est mesurée et l’état général de l’animal est observé. Afin de prévoir l’apparition de la douleur, nous avons établi des points limites précoces (critères d’interruption) ainsi qu’une grille de score qui déterminent les actions à mener en cas de souffrance avérée de l’animal. Cette grille prend en compte 1) le comportement de l’animal dans la cage, 2) l’apparence générale, 3) les fonctions physiologiques et 4) l’inspection et la taille de la tumeur. Grâce à cette grille de score, les éventuels signes cliniques de douleur (locale ou générale) sont détectés et un traitement local ou systémique d’analgésique est appliqué pour y remédier. Dans le cas exceptionnel de douleur non maitrisée par ces traitements post-opératoires, les animaux sont immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
La souris est actuellement l’organisme-modèle le plus utilisé en recherche biomédicale et en cancérologie : en effet, très peu de modèles en cancérologie existe chez l’espèce rat (cancer de la prostate). Elle présente de nombreux intérêts : sa taille, sa courte durée de vie et son rythme rapide de reproduction par rapport à d’autres organismes-modèles. De plus, les souris développent des pathologies tumorales spontanées ou induites, similaires à celles présentes chez l’homme (mécanismes physiopathologiques comparables, biomarqueurs similaires) et ces mammifères présentent une forte homologie phylogénétique avec l’homme (90%). Elles permettent également de produire un grand nombre d’individus identiques (syngéniques), ce qui permet d’assurer une meilleure reproductibilité des conditions expérimentales. En outre, elles présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Enfin, du fait de leur taille (20-25g) par rapport au rat, cela permet une manipulation plus aisée et de réduire les quantités de molécules à utiliser. Ces expériences seront réalisées sur des souris adultes mâtures âgées de 8 à 12 semaines. Le stade adulte ou adulte mâture est celui où les pathologies cancéreuses se développent et où le sytème immunitaire est totalement fonctionnel.
Production de souris humanisées pour le système immunitaire
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Des souriceaux nouveau-nés, des souris juvéniles sevrées et des femelles gestantes sont commandés selon la demande d'utilisateurs académiques et industriels. 5 120 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, irradiées 218 secondes ou traitées chimiquement, puis greffées par injection de cellules souches humaines sous anesthésie. Environ 80 % passent le contrôle qualité et sont expédiées vivantes aux utilisateurs finaux qui poursuivront les expériences, les autres sont tuées dans les jours qui suivent puisqu'elles ne sont plus utilisables. Le porteur présente cette production de souris humanisées comme un "service" et la range dans la règle des 3R, au motif que ces animaux réduiraient le nombre d'individus utilisés plus tard.
Objectifs
Les souris immunodéficientes sont depuis plusieurs décennies des modèles de choix pour la transplantation de cellules souches humaines capables de générer un système immunitaire humain. Le recours à ces souris humanisées permet de proposer et d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques pour une large gamme de pathologies nécessitant des modèles expérimentaux plus proches de la situation humaine. Les objectifs du présent projet sont de générer une gamme de souris humanisées pour le système immunitaire afin de les distribuer à un large panel d’utilisateurs finaux (académiques et industriels) aussi bien dans une perspective de recherche fondamentale que d’évaluation préclinique industrielle dans des domaines tels que l’hématopoïèse, l’immunologie, les maladies infectieuses, la vaccinologie, l’oncologie… Ce projet couvrira la génération de souris humanisées déjà validées en tant que "service" et également la génération de nouveaux modèles immunodéficients humanisés en tant que projet « nouveaux modèles en Recherche et Développement "R&D" ». Ceci permettra d’avoir des modèles plus adaptés aux études pré-clinique et participera à la règle des 3R sur la réduction du nombre d’individu pour des statistiques plus robustes.
Bénéfices attendus
Le recours à ces souris humanisées devrait permettre de proposer et d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques pour une large gamme de pathologies nécessitant des modèles expérimentaux plus proches de la situation humaine (souris humanisées pour des composants cellulaires et moléculaires du système hématolymphoïde).
Procédures
Procédure 1: Afin de rendre les souris permissives à la prise de greffe de cellules souches humaines, les animaux immunodéficients seront soit injectés avec une molécule chimique (1 injection par jour pendant 2 jours d’une durée de 30 secondes), soit irradiés 1 seule fois pendant 218 secondes afin de rendre accessible les niches hématopoïétiques puis, immédiatement traité avec un antibiotique pendant 2 semaines, dans le but de prévenir toute infection. Les animaux seront par la suite humanisés par une unique injection intraveineuse de cellules souches humaines, et ce, après anesthésie générale gazeuse. Cette intervention dure 3 min pour la phase d’endormissement et 30 secondes pour la phase d’injection. Enfin, le contrôle qualité du taux d’humanisation se fera suite à un unique prélèvement sanguin sur souris vigiles pour la partie « Service », ou suite à 9 prélèvements sanguins, toutes les 3 semaines sur une période de 23 semaines pour la partie « nouveaux modèles en recherche et développement "R&D". Le prélèvement sanguin dure 30 secondes par souris. Procédure 2: Afin de rendre les souriceaux permissifs à la prise de greffe de cellules souches humaines, les animaux seront irradiés 1 seule fois (durée irradiation dépendante de la souche de la souris) afin de rendre accessible les niches hématopoïétiques. Les animaux seront par la suite humanisés par une unique injection de cellules souches humaines dans le foie. Un prélèvement de phalange sera réalisé afin de permettre leur identification ainsi que leur génotypage. Enfin, le contrôle qualité du taux d’humanisation se fera à l’aide de prélèvement sanguin à entre 9 et 12 semaines après l’humanisation.
Impact sur les animaux
Les effets néfastes du pré-conditionnement apparaissent sur environ 5% des animaux adultes humanisés et tardivement (6 mois après la greffe de cellules souches humaine). Ils se manifestent souvent par une perte de poids et une modification de l’apparence (extrémités blanches) et du comportement naturel de l’animal (animal sans énergie). Les animaux seront surveillés quotidiennement pour prévenir tout inconfort animal et prendre la décision appropriée selon notre grille d’évaluation de projet. Notre surveillance sera donc accentuée à 6 mois notamment pour la partie « nouveaux modèles en recherche et développement "R&D" » puisque les souris seront observées jusqu’à 32 semaines. De plus, du stress pourra être généré lors des prises de sang et du transport des animaux vers les utilisateurs finaux.
Devenir
Pour le Service : Tous les animaux humanisés validés par le ‘contrôle qualité’ soit environ 80% des animaux produits, présentant une proportion sanguine de leucocytes d’origine humaine >20% des leucocytes totaux sont expédiés aux utilisateurs finaux (utilisation continue chez l'utilisateur final). Les animaux ne satisfaisant pas le critère requis sont écartés de tout groupe expérimental ultérieur. Ces animaux sont mis à mort dans les jours suivants le contrôle qualité car ils ne pourront plus être utilisés dans d'autres protocoles expérimentaux. Pour les nouveaux modèles : A l’issue des 32 semaines, les animaux seront mis à mort pour caractérisation du système immunitaire reconstitué (=humain).
Remplacement
Ce projet vise à produire des souris humanisées comme modèle expérimental préclinique à destination d’utilisateurs finaux des secteurs académique et industriel. Un tel modèle correspond à une attente forte pour pouvoir tester de nouvelles approches thérapeutiques transposables à l’Homme. En proposant comme modèle la souris humanisée pour le système immunitaire, nous offrons la possibilité d’utiliser un modèle expérimental préclinique permettant le criblage d’approches thérapeutiques directement adaptées à la situation humaine. Par ailleurs, les souris humanisées permettent d’approcher la situation physiologique humaine sans avoir recours aux modèles de primates non humains.
Réduction
Nous réalisons le projet d’humanisation en fonction des besoins exprimés ou pressentis de nos partenaires utilisateurs finaux. De plus, notre savoir-faire et l’optimisation de nos protocoles permettent d’utiliser peu d’animaux pour un rendement maximum. En exprimant le système immunitaire humain, la souris humanisée permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire dans ses applications ultérieures. Grâce au contrôle qualité systématique sur chaque souris implantée et au retour d’expérience qui en découle, nous optimisons sans cesse notre modèle de souris humanisée pour une meilleure prise de la xénogreffe humaine, ce qui diminue la variabilité intrinsèque au modèle et réduit d’autant le nombre d’animaux à implanter pour obtenir le nombre de souris humanisée souhaité. De plus, la génération de nouvelles lignées humanisées permettra de se rapprocher au plus près du système immunitaire humain et d’avoir des modèles plus adaptés aux études pré-clinique et participera également à la règle des 3R sur la réduction du nombre d’individu pour des statistiques plus robustes.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en zone d’expérimentation, en groupe de 5 individus maximum par cage et de même sexe. L’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Dans chaque cage, le milieu est enrichi par l’ajout de deux éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un bâtonnet de papier que les souris pourront grignoter afin de se confectionner un nid. Nous veillerons au bienêtre animal par une surveillance quotidienne des animaux par du personnel qualifié. Tout fait notable sera consigné sur une grille de score évaluant la souffrance et le stress des animaux. Les points limites sont clairement déterminés et les animaux identifiés par une alerte feront l’objet d’une surveillance accrue et des actions seront mises en place pour palier à divers problèmes tels qu’une observation bijournalière par le personnel expérimentateur ; l’ajout de gel Diet, l’ajout de coton…
Choix des espèces
Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide et bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. De plus, les conditions zootechniques actuelle et le niveau d’ingénierie génétique des souris de laboratoire sont tels qu’il est possible de construire à façon, des lignées profondément immunodéficientes, une condition sine qua non pour une prise efficace et durable de xénogreffe hématopoïétique humaine. L’âge des animaux au moment de leur inclusion dans le présent projet dépendra de la demande et de l’objectif scientifique de l’utilisateur final. Le projet pourra donc utiliser aussi bien des souriceaux nouveaux nés que des souris juvéniles après sevrage (4 à 5 semaines). Les doses, volumes et voies d’administration seront adaptés au stade de développement des animaux utilisés. Dans le cas de la procédure 1 nous pourrons : recevoir directement des souris sevrées avant envoie (juvénile) ; ou recevoir des femelles gestantes et réaliser la procédure sur les nouveau-nés une fois l’âge de 4 à 5 semaines atteint.
Étude de l’impact d’une exposition chimique aux composés organophosphorés sur l’unité neuro-vasculaire
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
Une perte de poids de plus de 15 % ou un score supérieur à 7 sur l'échelle de grimace déclenche la mise à mort. 920 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus. La moitié d'entre elles reçoit une prothèse crânienne posée en quarante-cinq minutes, puis toutes sont intoxiquées par un composé organophosphoré et passent une à trois heures par séance sous IRM ou imagerie ultrasonore. Le porteur indique que l'intoxication peut provoquer fasciculations, mâchouillements, chute du tonus musculaire, tremblements généralisés et mort, et présente ces travaux comme une réponse à la menace des armes chimiques et aux 300 000 décès annuels par pesticides.
Objectifs
Bien que très réglementée, l’utilisation de composés organophosphorés (OPs) est courante dans l’agriculture où sont utilisés des pesticides tels que le chlorpyrifos. L’incidence d’intoxication passive, active ou accidentelle avec des pesticides OPs est associée à près de 300 000 décès annuels dans le monde pour près de 3 millions de cas d’intoxication reportés. Plus inquiétant, l’utilisation en 2017 d’armes de guerres neurotoxiques contenant des OsP (Sarin en Syrie et VX en Malaisie), démontre une menace toujours actuelle pour les populations civile et militaire. Sur le plan physiopathologique, l’intoxication aigue aux OP entraîne l’inhibition irréversible des cholinestérases augmentant la concentration d’acétylcholine dans l’ensemble de l’organisme ce qui conduit à une hyperactivité du système nerveux central (SNC) qui peut engendrer des œdèmes cérébraux, de la neurodégénérescence et des crises épileptiques voir la mort. Si le traitement d’urgence permet de stabiliser les victimes, son efficacité au niveau du SNC est limitée. De plus certaines victimes peuvent être exposées à de faibles doses d’OPs sans présenter les symptômes de la phase aigue mais présentent des déficits cognitifs à long terme. Très peu d’études se sont intéressées aux effets des faibles doses sur le système neurovasculaire. Ainsi, ce projet vise à mieux comprendre l’impact d’une intoxication aux OPs au sein de l’unité neurovasculaire (UNV) à court et moyen terme. De plus, améliorer nos connaissances sur ce domaine nous permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques et diagnostiques.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales mais aussi translationnelles ou appliquées menées sur la physiopathologie des intoxications aux composés organophosphorés. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Procédures
(Souris Mus musculus ; n=460) : Modèle d’intoxication - Induction de l’intoxication +/- traitements (durée : 1h). - Evaluation de l’inflammation cérébrale et de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) par imagerie par résonnance magnétique (IRM) (durée : 1h/mesure). - Evaluation des conséquences fonctionnelles par imagerie Doppler et functional ultrason imaging (fUS) sous anesthésie (durée : 1h/mesure). (Souris Mus musculus ; n=460 ) : Modèle d’intoxication vigile - Pose de prothèse crânienne/récupération (durée : 45min). - Induction de l’intoxication +/- traitements (durée : 1h). - Evaluation des conséquences fonctionnelles par imagerie fUS vigile (durée : 1-3h/mesure).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient pour toutes les procédures : une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels et/ou cognitifs. De plus, l’intoxication aux organophosphorés est susceptible d’induire des symptômes caractéristiques tels que : l'arrêt d’activité, des fasciculations (contractions involontaires des muscles), mâchouillements/bâillements, chute du tonus musculaire, dos vouté, tremblements généralisés allant jusqu’à la mort de l’animal.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification protéiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, des approches in silico ne permettent pas d’obtenir le même niveau de sensibilité. De même, des approches in vitro ne permettent pas de reproduire la complexité d’un modèle in vivo. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées concernant la physiopathologie d’une intoxication aux OPs.
Réduction
Avant de procéder à une telle étude, une approche statistique a été réalisée afin de s’assurer d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. De plus, des méthodes d’études non-invasives telle que l’imagerie (IRM, fUS…) sont utilisées dans ce projet afin de faire un suivi longitudinal des animaux, permettant de recueillir de nombreuses données sans augmenter le nombre d’animaux. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux a été défini en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de son aisance. L’ensemble des échantillons collectés permettra un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire pour les techniques utilisées dans ce projet montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine Une fois entrés en protocole, les animaux seront pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si leur score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. L’hébergement des animaux s’effectuera au moins 7 jours avant le début des procédures pour minimiser leur stress. Les animaux sont hébergés dans des cages standards aux normes européennes (type IV. La nourriture, la boisson et la litière sont changés une fois par semaine. Néanmoins, ces changements pourront être effectués plus fréquemment si nécessaire. De plus, une maison en carton et des produits nécessaires à la nidification seront placés dans les cages des animaux. La litière et les enrichissements du milieu d'hébergement des animaux permettront de réduire leur stress et de faciliter leur thermorégulation. Durant la mise en place des modèles, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie. Après chirurgie, les souris seront placées dans des enceintes post opératoires chauffées avant d’être remises dans leurs cages propres et disposeront de croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage ou bien encore de la nourriture gélifiée pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation pendant la période post-opératoire. Des gommettes de couleurs seront collées sur les étiquettes des cages afin d’assurer une surveillance adaptée (ex : rouge après une procédure chirurgicale pour une surveillance plus importante).
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies diagnostiques et de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour non seulement étudier les effets de l’intoxication aux composés organophosphorés sur le SNC mais également pour tester l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Les animaux utilisés seront âgés de 8 à 10 semaines et auront un poids compris entre 35 et 40g lors de l’intoxication. Nous choisissons des animaux de cet âge afin de pouvoir comparer les données existantes au laboratoire et dans la littérature, puisque le modèle d’intoxication au NIMP a été développé chez des animaux ayant un stade de développement identique.
Etude chez la souris mâle d’une protéine régulatrice de la thrombose
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Pour explorer les premières heures qui suivent la formation d'un caillot, 66 souris mâles subissent une chirurgie d'une heure trente à une heure quarante-cinq destinée à provoquer une thrombose de la veine cave. Une partie est opérée sous anesthésie et tuée sans reprise de conscience, l'autre passe par des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Le porteur indique que les 48 heures suivant l'opération peuvent s'accompagner de douleur, d'un durcissement de la zone opérée et d'une occlusion intestinale, et prévoit une à deux échographies sous anesthésie. Toutes finissent par un prélèvement de sang puis une perfusion de fixateur directement dans le cœur, pour analyser les tissus.
Objectifs
La maladie thromboembolique est une maladie des veines qui se manifeste sous forme de thrombose veineuse (caillot dans une veine) ou d’embolie pulmonaire (caillot dans une artère des poumons). Cette pathologie constitue un problème de santé publique majeur en raison de sa fréquence, de sa gravité et de la difficulté à identifier une cause chez plus de la moitié des patients. Les traitements de la maladie thromboembolique reposent sur des anticoagulants qui sont associés à un risque d’hémorragie important et qui ne protègent pas contre les possibles séquelles ou récidives de la maladie. Les travaux menés au sein de notre équipe visent à identifier de nouvelles cibles responsables de la formation d’un thrombus et/ou de la récidive de la maladie. Nous avons démontré le rôle important une protéine impliquée dans la modification de la paroi de la veine. L’utilisation d’un modèle de thrombose veineuse chez la souris a permis de démontrer que cette protéine a un effet néfaste dans la formation d’un tissu cicatriciel de la veine. Cette cicatrisation inappropriée favoriserait la formation d’un second thrombus. Cependant, nous ne connaissons pas les mécanismes mis en jeu juste après la formation du premier thrombus qui expliquerait l’activation de cette protéine. Nous souhaitons donc explorer la phase précoce suivant la formation d’un premier thrombus dans cette demande d’autorisation de projet. La thrombose sera induite chez la souris par une chirurgie et l’activité de notre protéine d’intérêt sera inactivée à l’aide d’un inhibiteur. Nous évaluerons les propriétés de la paroi veineuse dans le temps (30 minutes jusqu’à 48h). Le traitement avec cet inhibiteur permettra de proposer une alternative aux thérapeutiques habituelles de la thrombose veineuse.
Bénéfices attendus
Le traitement de la maladie veineuse thromboembolique repose sur les anticoagulants qui présentent un risque hémorragique important et que les patients doivent le plus souvent prendre à vie. Le but de ce projet est de mettre en évidence de nouveaux mécanismes cellulaires et moléculaires qui permettront à moyen terme le développement de traitements adjuvants aux anticoagulants et donc une prise en charge plus personnalisée des patients.
Procédures
Afin d’induire une thrombose veineuse, les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie (durée 1h30 à 1h45). Les animaux recevront 1 à 6 administration(s) (durée 1 minute par administration), ils seront anesthésiés pour ce geste. Nous injecterons à ces animaux un analgésique et certains d’entre eux recevront également un inhibiteur de notre molécule d’intérêt. Le suivi de la formation du thrombus sera assuré par échographie doppler. Cet acte sera réalisé sous anesthésie (durée 15 minutes), 1 à 2 fois selon les groupes (intervalle 24h). Tous les animaux préalablement anesthésiés et analgésiés, auront un prélèvement sanguin unique (durée 1 minute) suivi d’une perfusion intracardiaque de fixateurs (durée 12 minutes) en vue d’analyse des tissus.
Impact sur les animaux
Dans les 48h après la chirurgie, les conséquences de la chirurgie peuvent être : (1) Douleur, durcissement de la zone de chirurgie, sensation de chaleur au niveau de la veine cave inférieure, (2) Occlusion intestinale, (3) Douleur au niveau de la zone suturée.
Devenir
Afin de réaliser des analyses biologiques et histologiques, des prélèvements d’organes vitaux et de sang seront effectués sur les souris. C’est pourquoi, les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure.
Remplacement
La maladie veineuse thromboembolique est une maladie multifactorielle impliquant le système vasculaire, les cellules circulantes (plaquettes, globules rouges et globules blancs) et les organes lymphoïdes secondaires (ganglions, rate). Les modèles in vitro ou ex silico sont encore incomplets et ne permettent pas de prendre en compte la complexité de cette pathologie.
Réduction
Concernant les groupes contrôles sans chirurgie un lot de 6 animaux est nécessaire. Concernant les groupes subissant uniquement une chirurgie et qui seront mis à mort à J0 (T= 30 min, 4h ou 6h), des lots de 10 animaux seront suffisants. Nous réaliserons des prélèvements d’organes et de sang chez ces animaux en vue d’analyses biologiques et histologiques. Concernant les groupes subissant une chirurgie et un traitement avec un inhibiteur de notre molécule d'intérêt, des groupes de 15 animaux seront nécessaire. En effet, 80% des souris subissant une chirurgie vont thromboser, nous avons réalisé une étude statistique concluant qu’un échantillon de départ d’au moins n = 15 souris est nécessaire. Les animaux seront réceptionnés sur plusieurs commandes, nous ajusterons ces commandes en fonction de nos besoins. L’utilisation de l’échographie doppler nous permettra de déterminer s’il existe une différence significative de la taille du thrombus à J2 entre les souris contrôles et celles traitées avec un inhibiteur de notre molécule d'intérêt. A mi-projet, nous ferons un point et nous stopperons l’inclusion des animaux si les analyses s’avèrent concluantes. Concrètement, nous n’achèterons plus d’animaux pour ce projet.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, nous avons mis en place des mesures de raffinement adaptées à notre modèle expérimental. Concernant les conditions d’hébergement, les animaux sont maintenus en groupes sociaux et les cages sont enrichies avec un igloo et des lanières de papier pour la nidification. Au cours de la chirurgie, nous préviendrons : - la survenue d’une infection (travail en condition aseptique) - la douleur (analgésie et anesthésie) - l’hypothermie (tapis chauffant) - la déshydratation (administration de sérum physiologique) - le desséchement oculaire (gel ophtalmique). En post-opératoire, nous utiliserons de façon systématique un gel d’hydratation qui sera supplémenté en analgésique la nuit suivant la chirurgie.
Choix des espèces
Le modèle murin de thrombose veineuse que nous souhaitons utiliser est le modèle de référence pour l’étude de la maladie veineuse thromboembolique. Il est très bien caractérisé dans la littérature, fiable, reproductible et reconnu par nos pairs. L’implication de notre molécule d'intérêt dans la survenue de la fibrose est étudiée par nos pairs à l’aide de modèle murin. L’efficacité des traitements inhibiteurs de cette molécule est couramment testée chez la souris, la posologie de ces traitement est bien caractérisée pour cette espèce. La maladie thromboembolique veineuse touche les adultes, tous les animaux que nous utiliserons serons âgés de 7 à 11 semaines. L'utilisation de jeunes adultes, dont le poids variera entre 20-30g, facilitera la chirurgie.
Cibler un corégulateur transcriptionel stéroïdien dans le tissu adipeux pour lutter contre l’obésité et les maladies métaboliques associés
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Soumises pendant seize semaines à un régime riche en graisses destiné à les rendre obèses, 752 souris subissent aussi sept injections quotidiennes d'un agoniste adrénergique, sept prélèvements sanguins à la queue en deux heures et soixante-douze heures d'isolement en cage métabolique. Toutes sont tuées à l'issue pour récupérer leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le projet cherche à savoir si la suppression d'un corégulateur transcriptionnel provoque l'obésité et le diabète de type 2, en comparant femelles et mâles. La liste des nuisances déclarées retient les injections, les prises de sang et l'isolement, sans compter l'obésité ni l'intolérance au glucose que le protocole vise pourtant à installer.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de déterminer le rôle d'un corégulateur transcriptionel stéroïdien dans la fonction et le développement des adipocytes (blancs et bruns), selon le sexe, et d'évaluer si la délétion génétique de ce facteur de transcription conduit au développement de l'obésité et de ses complications métaboliques, en particulier la résistance à l’insuline et le diabète de type 2. Pour répondre aux objectifs de ce projet, nous allons utiliser des souris femelles et mâles invalidés pour ce facteur protéique (KO) et leur contrôles (WT). Ce modèle de souris ne présente pas de phénotype dommageable dans les premiers mois de vie et ce jusqu’à 8-10 mois. Ensuite, les souris présentent une différence selon le sexe puisque les femelles KO comparées aux WT, contrairement aux mâles, développent progressivement un surpoids (+ 15 à 20%), associé à une augmentation de leur masse grasse, et à 12 mois, une intolérance au glucose sans apparition de diabète de type 2.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet de recherche est d'identifier de nouveaux acteurs moléculaires contrôlant l'activité dissipatrice d'énergie des adipocytes selon le sexe. Etant donnée que les adipocytes blancs et bruns activés sont capables de brûler efficacement les lipides et les glucides, molécules en excés dans de multiples désordres métaboliques, ce projet devrait fournir de nouvelles voies thérapeutiques pour combattre les maladies complexes telles que l'obésité et le diabète de type 2.
Procédures
Mesures non invasive de la masse grasse/maigre et de la température corporelle (deux fois, pendant
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux seront les suivantes: - Des injections intrapéritonéales (ip) d'un agoniste aux récepteurs beta3-adrénergique - Des prélèvements sanguins à l'extrémité de la queue (série de 7 prélèvements (
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour récuperer les organes.
Remplacement
Remplacement : Il est nécessaire maintenant de réaliser des études sur l’animal pour valider l’importance de facteur dans un contexte in vivo puisqu’aucune autre méthode alternative n’existe pour mimer in vitro la véritable complexité biologique des interactions entre organes participant au développement de l'obésité et de ses complications comme les maladies cardiovasculaires
Réduction
Réduction : Tous les protocoles utilisés sont bien maitrisés par les participants au projet. Cette expertise permet de définir pour chaque procédure un nombre d’animaux minimum pour obtenir des résultats reproductibles et permettant des études statistiques pertinentes.
Raffinement
Raffinement : L'environnement dans chaque cage est significativement amélioré pour minimiser le stress (un igloo par cage, plusieurs tiges de papiers). Le suivi sanitaire est réalisé selon les procédures établies par le service animalerie par les zootechniciens du centre permettant d'identifier des souris souffrantes. Des points limites stricts ont été prédéfinis afin de rapidement prendre les mesures recquises au bien-être des animaux. Enfin, l’isolement de souris sera évité hormis pour un temps limité pour les études en cage métabolique.
Choix des espèces
L'utilisation de souris se justifie par un élevage à coût modéré, un cycle de vie court, et une natalité importante. Cette espèce est majoritairement utilisée dans les études sur le développement de l'obésité et de ses complications métaboliques puisque les souris deviennent rapidement obèses (12-16 semaines) lorsqu'elles sont nourries avec un régime riche en lipide. De plus, l'obésité des souris est similaire à celle de l'homme permettant de tirer des informations pertinentes pour l'obésité humaine. Enfin, la souris est l'espèce de mammifère de choix pour réaliser des modifications génétiques (surexpression ou invalidation d'une protéine, globale ou ciblée dans un tissu). Ainsi, l’utilisation de souris (KO et WT) pour le corégulateur transcriptionel étudié va permettre de déterminer l’implication de ce facteur in vivo dans les désordres métaboliques complexes. Les animaux seront étudiés à l’âge adulte dans toutes les procédures du projet.
Impact d’une inflammation persistante de faible intensité sur le dysfonctionnement métabolique lié à l’obésité dans un modèle de souris.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Issues de couples reproducteurs eux-mêmes tués à l'issue, les souris de ce projet sont ensuite utilisées dans la procédure principale puis tuées pour le prélèvement de leurs organes. 4 500 souris au total vont être utilisées, dans des procédures allant d'un niveau de souffrance léger à modéré. 1 080 d'entre elles suivent seize semaines de régime obésogène, avec sept prélèvements de sang en deux heures répétés à trois reprises, des injections de glucose et d'insuline dans le péritoine, et deux minutes d'immobilisation vigile dans un tube de contention pour mesurer leur masse grasse. Le porteur affirme que l'utilisation d'un modèle animal est "indispensable" à des fins exploratoires et qu'"aucune autre espèce n'est aussi adaptée", en signalant par ailleurs que les lignées de souris voulues sont déjà disponibles dans son laboratoire.
Objectifs
De plus en plus de preuves relient l'inflammation aux changements métaboliques associés à l'obésité et au diabète de type 2. L'obésité est associée à une inflammation tissulaire, un facteur de risque majeur de prédiabète et de diabète de type 2, car elle entraîne à la fois une baisse de la production d’insuline et une résistance à l'insuline. Le rôle émergent de l’inflammation dans la physiopathologie du diabète de type 2 et des troubles métaboliques associés a suscité un intérêt croissant pour le ciblage de l’inflammation afin d’améliorer la prévention et le contrôle de la maladie. NLRP3 est une protéine contrôlant une voie majeure de l’inflammation. Le potentiel de NLRP3 en tant que cible thérapeutique dans le traitement de la résistance à l’insuline induite par l’obésité a été signalé dans la littérature. En effet, il a été démontré que l'obésité active le NLRP3 et que les souris déficientes en NLRP3 sont protégées contre l'obésité et la progression du diabète. Néanmoins, le rôle d’une inflammation de bas grade dans l’apparition de l’obésité n’a pas été directement étudié. Afin de déterminer l'impact direct d'une inflammation de bas grade à long terme sur l'apparition de l'obésité et la dérégulation métabolique, nous utiliserons des groupes de souris invalidées pour les composants ou activateurs de NLRP3.
Bénéfices attendus
A court terme, le projet vise à décrire de manière exhaustive le rôle de l’inflammation de faible intensité, caractérisée par une sécrétion légèrement augmentée mais persistante des cytokines inflammatoires, dans l'apparition des maladies métaboliques, dont le diabète. Pour cela, le projet vise à étudier les caractéristiques observables chez les souris conduisant à une inflammation constitutive de faible intensité afin d'explorer l'effet d'une telle inflammation sur les troubles métaboliques, notamment le diabète. À plus long terme, ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes du diabète, notamment le rôle de l’inflammation, et à contribuer à trouver de nouveaux traitements potentiels, en envisageant notamment des stratégies anti-inflammatoires.
Procédures
À l'âge de 7 à 11 semaines, 1 080 animaux seront soumis à des régimes où aucune douleur n’est anticipée, pour une durée de 16 semaines. Avant, au milieu et à la fin du régime, 1 080 souris resteront vigiles dans un tube à contention pendant 2 minutes une fois afin de mesurer la répartition de la masse maigre et de la masse grasse. Aucune anesthésie ne sera nécessaire pour cette procédure. Pour mesurer la glycémie et l’insulinémie une goutte de sang sera prélevée 7 fois sur une période de 2 heures avant, au milieu et à la fin du régime. Pour effectuer les analyses sanguines, un prélèvement de sang sera réalisé une fois avant, au milieu et à la fin du régime sur les 1 080 souris. Le génotypage sera fait grâce à de l'ADN génomique purifié extrait à partir de tissus d'animaux au servage (3 semaines). Lors de la mise à mort, un prélèvement de grande quantité de sang sera effectué afin d'étudier les marqueurs métaboliques.
Impact sur les animaux
Obésité, douleur aux sites d'injection lors des injections intra-péritonéales de glucose et d'insuline, douleur aux sites de prélèvement lors des biopsies réalisées pour le génotypage et les prélèvements sanguins.
Devenir
Les animaux utilisés comme couple reproducteur seront euthanasiés. Les animaux issus de ces reproductions seront ensuite utilisés pour la procédure 2, où ils seront euthanasiés pour récupérer des organes vitaux.
Remplacement
Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe. De plus, les études in vitro ne prennent pas en compte l'environnement nutritionnel et métabolique. Les effets chroniques du diabète ne peuvent pas être reflétés in vitro car d'autres variables physiologiques telles que les réponses hormonales et inflammatoires sont impliquées. L'utilisation d'un modèle animale est indispensable à des fins exploratoires.
Réduction
Les expériences sont conçues pour utiliser un nombre minimum d'animaux, tout en assurant qu'il soit suffisant pour permettre la réalisation des tests statistiques appropriés sur les souris mâles et femelles. L'utilisation de mâles et de femelles permet de limiter la perte d'animaux. De plus, afin de réduire le nombre de souris nécessaires, chaque animal sera soumis à un maximum d'analyses possibles.
Raffinement
Les procédures expérimentales ont été optimisées afin de minimiser l'inconfort et le stress des animaux. Leur bien-être est une priorité absolue et est pris en compte de manière scrupuleuse à toutes les étapes, notamment en ce qui concerne leurs conditions de logement. Les souris seront hébergées dans des installations appropriées avec un enrichissement systématique, et elles seront logées en groupe pour favoriser leur bien-être social. Les personnes effectuant les procédures respecteront strictement les normes éthiques lors de la manipulation et de l'euthanasie des animaux. Des critères bien définis sont établis pour limiter au minimum la souffrance animale. Pour éviter les bagarres entre mâles de portées différentes, le seul mâle né d'une même portée sera isolé dans une seule cage. Dans ce cas, des mesures d’enrichissement environnemental seront mises en place, telles que l'ajout de maisons en carton, de nids ou de bâtons de bois.
Choix des espèces
L'utilisation du modèle souris est essentielle pour éviter la duplication d'expériences inutiles en tirant parti des connaissances existantes dans la littérature et en permettant une comparaison facile des résultats pour une progression plus rapide. La souris est couramment utilisée dans les études fondamentales, notamment dans l'étude des maladies métaboliques et de l'inflammation de faible intensité dans le diabète, ce qui en fait un choix idéal pour ce projet. Les données in vivo disponibles dans la littérature sont principalement obtenues à partir d'études sur des souris, et cette espèce offre une abondance de matériel biologique pour des analyses approfondies, notamment des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce n'est aussi adaptée pour répondre aux objectifs de cette étude. De plus, des modèles murins pertinents sont déjà disponibles dans notre laboratoire, ce qui facilite la mise en œuvre de ce projet. Pour le stade de développement, il s’agit de jeunes adultes âgés de 7 à 11 semaines, ce qui correspond aux standards utilisés pour ce type d’étude métabolique.
Neurobiologie de la balance énergétique entre l’activité physique et la prise alimentaire
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées à la fin des expériences comportementales pour des analyses histologiques de leurs tissus, 1 368 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune est isolée en cage individuelle dès huit semaines, pour six à sept semaines dans le cas de 1 224 d'entre elles, et 1 176 subissent trois jours de restriction alimentaire les maintenant à 90 % de leur poids. 576 souris reçoivent en plus une chirurgie d'injection intracérébrale d'environ quatre-vingt-dix minutes. Le porteur reconnaît que l'absence d'interaction sociale peut être une source de stress, tout en présentant l'isolement comme la condition pour mesurer la prise alimentaire individuelle et pour éviter les bagarres "fréquentes chez les souris mutantes", et conclut que ses études comportementales ne sont pas aversives.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’apporter de nouvelles données concernant les mécanismes qui régulent la balance énergétique ainsi que les processus motivationnels pour des récompenses naturelles. Ce projet permettra de disséquer les circuits impliqués dans la motivation pour l'exercice physique et d’étudier des cibles potentielles dans le traitement des troubles alimentaires (obésité, anorexie).
Bénéfices attendus
Ce projet vise une meilleure compréhension de la régulation de la balance énergétique d’un point de vue motivationnel et des circuits jouant un rôle dans ce mécanisme. L’utilisation de notre modèle comportemental permettra d’approfondir les connaissances au sujet de la neurobiologie des troubles alimentaires (anorexie, obésité). A long terme, ces données pourront être utilisées pour investiguer les cibles potentielles dans le traitement de ces troubles alimentaires.
Procédures
Les animaux seront soumis à : (1)Hébergement individuel : cette condition concernera tous les animaux (1368). La durée de l’isolement sera de 6 à 7 semaines pour 1224 animaux et de 1,5 semaines pour 144 animaux. (2)Chirurgie pour injection intracérébrale : cette intervention concernera les animaux des procédures 1 et 3 : 576 animaux. La durée de ces chirurgies sera d’environ 90 min. (3)Injection sous cutanée : Les animaux ayant reçu des chirurgies pour injection intracérébrale (576 animaux) recevront 2 injections sous cutanée (analgésique et anesthésique local au niveau du crâne). Dans la procédure 4, 144 animaux recevront 1 injection (injection de micropuces permettant d’identifier les différents animaux). (4)Injection intra-péritonéale : ce geste concernera tous les animaux ayant reçu une chirurgie, soit 576 animaux. Les animaux recevront 4 injections d’analgésique (1 durant la chirurgie et 3 en post-opératoire). 192 animaux parmi ces animaux recevront aussi 2 injections durant l’étude comportementale. (5)Test comportemental : tous les animaux de cette étude seront concernés, soit 1368 animaux. Cette étude va durer 2 semaines pour les 192 animaux de la procédure 1 et 3,5 semaines pour les 1176 animaux des autres procédures. (6)Restriction alimentaire : Cette restriction sera de 3 jours et correspond au maintien à 90% de leur poids initial. Elle concernera les animaux des procédures 2, 3 et 4, soit 1176 animaux.
Impact sur les animaux
Les différents tests utilisés dans ce projet nécessitent de pouvoir étudier la prise alimentaire individuelle des souris. Celles-ci seront donc hébergées de manière individuelle dès l'âge de 8 semaines et ce jusqu'à la fin des procédures. Cette absence d’interaction sociale peut être une source de stress pour les animaux. Les injections avant les tests comportementaux peut également entrainer une douleur. Afin de diminuer la gêne engendrée par ces injections, le côté de l'animal qui sera injecté sera interverti chaque jour. La restriction alimentaire, permettant de faciliter l’apprentissage des animaux, pourrait entrainer une perte de poids supérieure à 15%. Dans ce cas, la restriction serait immédiatement arrêtée. Cependant, cette restriction ne devrait théoriquement pas entrainer cet effet indésirable parce qu’elle sera limitée à 3 jours. L'opération ne présente pas de risques majeurs et la douleur associée sera contrôlée par une anesthésie et des analgésiques adéquats. Si ces mesures sont prises correctement, il n'y a pas de signes de douleur après l'opération ou pendant la convalescence. Les traitements médicamenteux, les injections intrapéritonéales, et produits utilisés (et les doses) sont bien contrôlés en laboratoire et tolérés par les animaux.
Devenir
Les animaux de toutes les procédures seront mis à mort à la fin des expériences comportementales et des tissus seront récupérés pour procéder à des analyses histologiques.
Remplacement
Ce projet ne peut être réalisé sans l'utilisation de modèles animaux puisqu'il s'intéresse à des dimensions comportementales, non modélisables sur des modèles in vitro ou in silico. De plus l'utilisation d'invertébrés, serait incompatible avec l'étude de la motivation pour une récompense telle que l'activité physique ou la prise alimentaire.
Réduction
Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux à inclure sera de 12/groupe. Ce nombre d’animaux/groupe a été fixé (1) en utilisant des calculs de puissance nous permettant d’obtenir une différence significative pour les différentes variables d’intérêt qui seront évaluées dans l’étude et de rejeter une hypothèse nulle, et (2) en se référant à des publications du domaine (3) en prenant en compte la variabilité que nous retrouvons habituellement dans le comportement d'intérêt. Nous utiliserons 2 cohortes d'animaux (n=12/groupe/cohorte) afin de valider la reproductibilité des résultats. Nous avons regroupé dans la mesure du possible différents tests comportementaux sur les mêmes lots de souris, et avons conçus nos expériences de manière à obtenir un maximum d'informations à partir des mêmes animaux.
Raffinement
Pour le raffinement, plusieurs précautions seront prises en compte. Les souris seront hébergées dans des cages individuelles pour contrôler la consommation de nourriture et pour éviter les bagarres, fréquentes chez les souris mutantes. Les cages d’hébergement des souris seront enrichies en matériel de nidification (7 carrés de cellulose), ainsi que d’un morceau de bois à ronger et d’un tunnel en carton (comme prévu par la directive 2010/63/CE). Durant les études comportementales, les animaux seront manipulés grâce au tunnel en carton présent dans leur cage d’hébergement afin d’éviter la préhension par la queue. Les animaux, vivant dans les chambres opérantes, auront du nid provenant de leur cage d’hébergement, ainsi qu’un abri/jouet. Les chirurgies intracérébrales seront effectuées sous anesthésie générale. Les animaux recevront un traitement analgésique. Suite à la chirurgie, chaque animal est suivi quotidiennement (poids, prise alimentaire, aspect général) et une étiquette est accrochée au dos de sa carte de cage individuelle pour le personnel animalier, avec l’ensemble des informations concernant son suivi post-opératoire sur une semaine. Des points limites ont été définis par un état anormal constaté sur deux jours consécutifs (perte de poids de 15%/jour, ataxie, hypolocomotion, pelage non soigné). Si ce point est atteint, nous préviendrons immédiatement la vétérinaire de l’établissement afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude (comme la poursuite du traitement analgésique). En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera retiré de l’étude et mis à mort par dislocation cervicale afin de lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions pas soulager. Nos études comportementales ne sont pas aversives, nous ne devrons donc en théorie jamais atteindre ce point limite.
Choix des espèces
1) Ce projet nécessite l’utilisation de modèles transgéniques disponibles uniquement chez les modèles de souris. 2) Reproductibilité et comparaison avec les résultats obtenus dans le laboratoire auparavant et la communauté scientifique plus large. 3) Des modèles animaux moins évolués (par exemple, ver C. elegans ou poisson zèbre) ne peuvent convenir pour nos observations comportementales (course et prise alimentaires). Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines) qui se justifie par l’immaturité du système nerveux au cours de l’adolescence.
Recherche de traitement adjuvant à l’immunothérapie par injection d’anticorps monoclonaux anti-PD1 dans un modèle murin de tumorigenèse pulmonaire 2/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Pour tester si une supplémentation nutritionnelle et l'exercice volontaire renforcent l'effet d'une immunothérapie anticancéreuse, 84 souris mâles de cinquante semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour un prélèvement de sang et de tissus. Des cellules tumorales leur sont injectées dans la veine de la queue, puis un anticorps anti-PD1 dans le péritoine tous les quatre jours pendant trente jours, avec une imagerie hebdomadaire sous anesthésie. Les tests mesurent la force par traction sur un dynamomètre, l'animal étant tiré par la queue, la vitesse maximale de course sur tapis roulant jusqu'à l'épuisement, et l'équilibre sur un cylindre rotatif. Le porteur signale que la tumorisation pulmonaire peut provoquer des difficultés respiratoires, une léthargie et une agressivité accrue, et prévoit la mise à mort dès trois points limites notables ou un point limite sévère.
Objectifs
L’immunothérapie est une stratégie thérapeutique en plein essor, notamment dans le cancer du poumon, car elle n’induit pas de toxicité secondaire comme les traitements par radiochimiothérapie. Son efficacité reste cependant à améliorer car tous les patients ne répondent pas aux traitements d’où la nécessité de travailler sur des traitements adjuvants. Nous souhaitons combiner 2 approches pour améliorer cette efficacité : - nutritionnelle : supplémentation en acides gras polyinsaturés et en béta-hydroxybutyrate - activité physique : mise en place d’enrichissement dédié à l’augmentation de l’activité physique volontaire. Afin de répondre à cet objectif, le projet se déroulera sur 2 établissements utilisateurs (un principal et un second pour la réalisation d'imagerie optique in vivo)
Bénéfices attendus
Nous attendons à ce que nos traitements améliorent l’efficacité de l’immunothérapie. Pour voir cela, nous suivrons l’évolution du volume tumoral. Des traitements adjuvants tels qu’une supplémentation nutritionnelle ou la mise en place d’une activité physique adaptée est envisageable au cours du traitement par immunothérapie chez les patients. Il y a donc une réelle possiblité de transfert des résultats obtenus dans ce projet en clinique.
Procédures
Les supplémentations nutritionelles se feront ad libitum, par remplacement de l’eau de boisson par le béta-hydroxybutyrate et avec des croquettes pour les acides gras en débitant une semaine vant la tumorigenèse puis pendat les 30 jours du suivi tumoral. L’implantation des tumeurs sera effectuée par injection I.V dans la veine de la queue. Le suivi du volume tumoral sera réalisé par imagerie de biolomuminescence à raison d'un examen par semaine sur une durée 30jours. L’administration de l’immunothérapie sera effectuée tous les 4 jours pendant les 30 jours de tumorigenèse par injection intra-péritonéale d’anicorps anti PD-1. La tumorigenèse sera suivie par imagerie avec calcul du volume tumoral sous anesthésie à l’halothane. La mesure de la synthèse protéique sera effectuée après injection sous cutané d’un traceur (isotope stable). Le test d'agrippement sera réalisé à l'aide d'un dynamomètre munie d'une grille où la souris s'accroche, le manipulateur tire alors la souris par la queue. La mesure de la vitesse maximale de course sera effectuée sur un tapis roulant, le test s'arrête quand la souris est épuisée, elle reste alors sur une grille en bout de tapis. Le test dure en moyenne une quizaine de minutes. Une habituation au tapis de course aura leiru en amont du test. Le test d'équilibre au rotarod se déroule sur un cylindre en rotation, les souris seront habituées à cette procédure en amont. Le test dure en moyenne 2-3 minutesLe passage en echoMRI implique une légère contention des animaux dans un tube placé dans l'appareil. La mesure dure 1 minute environ. Les mesures de performances physiques ainsi que l'echoMRI auront lieu juste avant l'implantation (J0) puis à J15 et J30 post-implantation. Pour ce projet, l'ensemble des procédures se déroulera dans l'EU.1. Seule les acquisitions d'imagerie de bioluminescence seront réalisées au sein de l'EU.2.
Impact sur les animaux
La tumorigenèse peut s'accompager de difficultés respiratoires, d'une perte de poids, de comportements anormaux, tels que l'isolement social, la léthargie, l'agressivité́ accrue ou une altération de la locomotion. Les souris seront surveillées quotidiennement pour suivre leur comportement général.
Devenir
tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole pour prélèvements de sang et de tissus
Remplacement
L’utilisation d’animaux, dans ce projet est absolument nécessaire et ne peut être remplacer par l’utilisation de systèmes de culture cellulaire à 2 voire 3 dimensions. En effet, ces systèmes ne permettent pas d’aborder les relations inter-organes et de mesurer simultanément la digestibilité des acides gras polyinsaturés w3 et du béta-hydroxy-butyrate, l’évolution de la fonctionnalité musculaire, de la performance et de la mobilité, le métabolisme protéique musculaire et le statut inflammatoire circulant et enfin l’évolution du volume tumoral.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans en compromettre les objectifs. Il a été déterminé par un calcul d’échantillonnage. Le nombre de souris nécessaires à l’étude est calculé pour une différence attendue de 25% pour le volume tumoral entre les souris supplémentées en acides gras ou en béta-hydroxybutyrate + activité physique et les souris nourries avec un régime standard. Des études antérieures ont montré que la variabilité du paramètre choisi est de 14%. L’effectif est calculé pour un risque de 1ère espèce alpha de 5% et un risque de 2ème espèce béta de 5%. Ainsi, le nombre de souris nécessaires par groupe est de 8. Toutefois, afin d’anticiper une mortalité éventuelle liée à la tumorigénèse, nous avons choisi de débuter l’étude avec des groupes de 12 souris. Le nombre total de souris nécessaires à la réalisation de ce projet est donc de 84.
Raffinement
Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour éviter et réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Les souris seront hébergées par 6 dans des cages T4 (55cm x 33cm, soit 1815cm2, et 19cm de hauteur sous grille). Tous les animaux auront un accès illimité à leur régime et à l’eau de boisson. Quotidiennement, l’animalier observera le comportement général de chaque souris, son apparence et contrôlera la présence d’eau et de nourriture. Hebdomadairement, les animaux seront pesés et un contrôle de consommation sera réalisé. L’état général de l’animal sera noté sur le cahier de suivi et l’expérimentateur sera informé de toutes observations anormales. Une grille d'évaluation définissant des points limites sera mise en place. Elle permettra d'identifier des points limites notables et des points limites graves. Si un animal présente 3 points limites notables ou 1 point sévère, il sera pris une décision afin de limiter la douleur à son maximum. Les points limites et l’arbre de décision adapté à cette étude sont présentés en annexes 1 et 2. Afin de réaliser les imageries optique dans l'EU.2 les animaux seront transportés dans des cages à filtres dans un véhicule dédié. Le transport dure moins de 5min d'un site à l'autre. A leur arrivée, les animaux seront hébergés au calme dans une armoire ventilée.
Choix des espèces
Pour réaliser notre projet d’étude, nous avons choisi la souris C57BL/6 car nous allons leur injecter des cellules tumorales issues de souris C57BL/6. Le modèle de tumorigenèse est donc syngénique. De plus, ces souris sont très actives en environnement enrichi ce qui est crucial pour tester l’effet de l’activité physique volontaire. Nous avons utilisé cette espèce par le passé et validé toutes les procédures détaillées dans ce dossier avec ces souris. Chez l’homme, le cancer du poumon non à petites cellules est diagnotiqué à l’âge moyen de 65 ans. Nous utiliserons par conséquent des souris mâles adultes de 50 semaines.
Carence en vitamine D chez la souris mâle et conséquences sur la descendance.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Les souris mâles subissent une chirurgie scrotale de vingt minutes sous anesthésie pour un prélèvement de sperme, après dix semaines de régime carencé en vitamine D. 60 souris vont être utilisées et toutes tuées pour prélever leurs tissus, dans des procédures que le porteur déclare en gravité légère. Leur descendance est répartie en six groupes tués à différents âges, certains dès quatre jours après la naissance, pour analyser l'adiposité et l'empreinte épigénétique du tissu adipeux. Le porteur qualifie pourtant lui-même le prélèvement de sperme de nuisance "modérée", et l'objet du projet reste d'établir des recommandations nutritionnelles pour les hommes en âge de procréer.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’apporter des données permettant d’évaluer l’impact d’insuffisance en vitamine D chez la souris mâle, sur les trajectoires métaboliques de la descendance. Des souris mâles seront nourris pendant 10 semaines avec un régime contrôle ou un déficient en vitamine D. Les mâles carencés seront étudiés (suivi de l'evolution pondérale, prise alimentaire, impact sur le microbiote). Ces males seront ensuite accouplés avec des souris femelles nourries avec une alimentation contrôle. Ceci permettra de générer une descendance issue de pères carencés ou non. Un prélèvement de sperme sera réalisé. L'étude portera ensuite sur cette descendance. Des groupes de 10 animaux de chaque sexe sont utilisés. Au total, l'etude sur la descendance portera donc sur 6 groupes d'animaux étudiés à différents stades de leur vie (4 jours post naissance; post-sevrage et age adulte), repartis de la façon suivante : mâles après naissance, femelles après naissance, mâles post-sevrage, femelles post-sevrage, mâles adultes, femelles adultes. Sur la descendance, à l'exception des animaux mis à mort 4 jours apres la naissance, un suivi de croissance sera réalisé par pesée toutes les semaines ainsi que la quantification de la consommation alimentaire. Les animaux seront euthanasiés à différents stades afin d'etudier l’adiposité, l’expression génique du tissu adipeux et l’empreinte épigénétique du tissu adipeux. A noter qu'il est prévu de réaliser 3 cohortes de géniteurs sur la période des 3 années sur laquelle va se dérouler ce projet.
Bénéfices attendus
Les données obtenues dans le cadre de ce projet permettront de connaitre l'impact d'une déficience paternelle en vitamine D sur la descendance. Cela servira de base pour émettre des recommendations nutritionnelles aux hommes en âge de procréer.
Procédures
Les animaux femelles seront soumis à un perçage d'une oreille une fois à leur arrivée. À 9 semaines d'alimentation contrôlée, un prélèvement de fécès nécessitant de les isoler pendant ~30 minutes sera réalisé; suivi d'une prise de sang à la queue sur animal vigile à 10 semaines. Les animaux mâles recevront une chirurgie scrotale qui dure maximum 20 minutes par animale.
Impact sur les animaux
Les animaux mâles seront soumis à un régime carencé en vitamine D, aucune souffrance n'est attendue mais des nuissances peuvent survenir (nuissance de gravité légère, longue durée). Les animaux seront également maintenu en isolement lors des recueils de fécès ce qui peut constituer une source de stress (nuissance de gravité légère, courte durée). Un prélèvement de sang sera réalisé à la veine caudale (nuissance de gravité légère, courte durée). Un prélèvement de sperme sera réalisé sous anesthésie et lors d'une chirurgie scrotale (nuissance modérée, durée de la chirurgie environ 20 minutes). Enfin l'induction de l'anesthsie peut constituer une source de nuisance (nuissance de gravité légère, longue durée).
Devenir
Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'intérêt qui seront ensuite analysés.
Remplacement
Il n'existe à l'heure actuelle aucune méthode de substitution in vitro pour étudier l'impact de la nutrition périnatale. La souris est un modèle de choix car elle présente des mécanismes physiologiques proches de ceux qui sont observables chez l'homme. Le but de ce projet est de rechercher les conséquences métaboliques chez la descendance, d’une carence en vitamine D chez le mâle géniteur. Ce processus est complexe et met en jeu de nombreux organes et systèmes métaboliques, qu’il n’est pas possible de reproduire in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux est le minimum nécessaire pour étudier la variabilité biologique de la descendance (descendance issue de 10 géniteurs différents). Ce nombre minimal est également nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes, à l'aide d'un test statistique, notamment en ce qui concerne la prise de masse des animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cage de 2 pour les mâles et les femelles, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique ou en carton. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à la fin du protocole. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en focntion des observations faites permettra l'application des points limites et la mise en application de critères d'arrêt. Une anesthésie et une analgésie sont prévues lors du prélèvement de sperme.
Choix des espèces
La souris est un modèle classiquement utilisé dans les études concernant les désordres métaboliques causés par l’alimentation en raison des similitudes avec l’homme. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 8 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondant tels que le vieillissement.
Interaction du microbiote et des lymphocytes T spécifiques, les cellules MAIT, lors d’une inflammation intestinale chez la souris (Site 2/2)
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
144 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Un composé chimique ajouté à leur eau de boisson déclenche une inflammation intestinale, en trois cycles de cinq jours à concentrations croissantes, entrecoupés de quatre jours d'eau avec ou sans antibiotiques. Le porteur indique que cette inflammation peut provoquer des diarrhées et une perte d'environ 25 % du poids initial, poids retrouvé deux à sept jours après la fin du traitement. Les souris sont hébergées sur un site et transportées vers un second uniquement pour y être mises à mort, leurs organes étant ensuite analysés par histologie et par cytométrie en flux.
Objectifs
Les bactéries du système digestif (microbiote intestinal) assurent des fonctions essentielles telles que la digestion et la protection contre les agents pathogènes, mais peuvent aussi exacerber l’inflammation intestinale chez les patients atteints de maladie de Crohn ou de rectocolite hémorragique. Le système immunitaire, et notamment des globules blancs : les lymphocytes T, jouent un rôle central dans la surveillance du microbiote intestinal et dans la réduction de l’inflammation du colon. Décrypter les interactions entre les lymphocytes T et le microbiote, chez les sujets sains ouen cas d’inflammation intestinale chronique, est donc essentiel pour comprendre les nombreuses pathologies associées au microbiote. Les fonctions des lymphocytes T reposent sur leur capacité à reconnaitre des molécules microbiennes appelées antigènes. L’un de ces antigènes est produit par certaines bactéries du microbiote. Les lymphocytes reconnaissant cet antigène microbien sont activés chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, ainsi que dans les modèles d’inflammation intestinale chez la souris. Nous souhaitons maintenant déterminer le rôle des bactéries dans l'activation et dans la fonction protectrice des lymphocytes T au cours de l’inflammation du colon. L'étude permettra de mieux comprendre le mécanisme de protection des lymphocytes T au cours de cette inflammation. Le modèle de souris nécessite des conditions d’élevages particulières qui sont disponibles dans le laboratoire 1. L’euthanasie et les prélèvements d’organes seront réalisés dans le laboratoire 2.
Bénéfices attendus
Ce projet améliorera notre compréhension d’une nouvelle interaction entre le système immunitaire et les bactéries du système digestif. Cette interaction est impliquée dans l’inflammation intestinale et le projet peut donc offrir de nouvelles opportunités thérapeutiques.
Procédures
Toutes les souris recevront dans l’eau de boisson un composé chimique qui génère une inflammation intestinale pendant 3 cycles de 5 jours à des concentrations progressives. Chaque cycle est suivi de 4 jours d’eau avec ou sans traitement d’antibiotiques. Le projet est réalisé sur le site n°1 sauf l’acte de mise à mort qui est réalisé sur le site n°2.
Impact sur les animaux
L’inflammation intestinale est induite par administration d’un composé chimique dans l’eau de boisson et est associé à des effets indésirables attendus. Elle peut causer des diarrhées entrainant une perte de poids d’environ 25% du poids initial. Le poids initial est retrouvé 2-7 jours après la fin du traitement. Aucun autre effet indésirable n’est attendu pour le reste du projet, les antibiotiques utilisés n’ont jamais montré d’effet indésirable lorsqu’ils sont utilisés pour éradiquer les bactéries. De plus, la bactérie utilisée pour le projet est une bactérie naturellement présente dans le système digestif. Le transport peut engendrer un stress supplémentaire.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem : collecte des organes et analyses par histologie ou cytométrie en flux.
Remplacement
Nous avons analysé in vitro la capacité de différentes cellules humaines et murines de différents tissus à capturer l’antigène microbien qui nous intéresse et à le présenter aux lymphocytes T spécifiques. Ces informations sont utiles mais ne permettent pas de conclure quant au rôle de ces cellules dans un organisme entier. Le rôle (bénéfique ou délétère) de l’interaction hôte-microbiote ne peut pas être déterminé dans des modèles in vitro ou ex vivo. Le modèle animal est donc nécessaire à ce stade.
Réduction
Nous utiliserons des modèles d’inflammation intestinale chez la souris. Les modèles ont déjà été mis en place, limitant ainsi le nombre d’animaux à utiliser. Le nombre minimum d’animaux qu’il faut utiliser pour répondre aux questions posées a été calculé en utilisant un test statistique. Ce nombre a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats.
Raffinement
Il y aura une observation quotidienne des animaux, une observation individuelle hebdomadaire à l’occasion des interventions d’entretien (changes de cages etc…) et une observation accrue durant l’inflammation intestinale induite, susceptible d’entrainer de la douleur, de la souffrance ou du stress, et cela plusieurs fois dans la journée pour s’assurer qu’il n’y a pas d’effet délétère. En cas de déshydratation, les souris seront réhydratées par voie intra-péritonéale et un gel hydratant sera placé dans la cage. Nous utiliserons une grille de score pour évaluer de façon objective l’état des animaux et des points limites adaptés aux signes cliniques associés à l’inflammation intestinale. Les animaux seront manipulés sur plusieurs jours avant le début des procédures afin de les habituer aux manipulateurs. Les animaux seront hébergés en isolateur dans des cages standards par groupes de sexe identique (3 par cage). Du papier absorbant à déchiqueter, des buchettes de bois à grignoter et des tunnels en plastique pour se cacher seront ajoutés dans les cages. La litière sera constituée de copeaux stérilisés par irradiation. Les souris recevront ad libitum un aliment standard stérilisé par irradiation et de l’eau autoclavée. Pour le transport, les animaux seront transférés en cage de transport selon leur répartition d’origine afin de ne pas induire un stress supplémentaire dû à l’isolement ou à la cohabitation avec des nouveaux congénères. Les animaux seront transportés dans une boite de transport stérile à laquelle sera rajoutée de la litière, de l’enrichissement et de la nourriture provenant de leur cage d’hébergement. Le transport se fera dans un véhicule agréé et climatisé.
Choix des espèces
La souris est l'espèce dans laquelle les lymphocytes T ont été largement étudiés (en dehors de l’humain) et pour laquelle nous disposons d’outils moléculaires et génétiques permettant leur étude. La souris est également le modèle de choix pour l’étude de l’inflammation intestinale du fait de l’existence de modèles bien définis, de la similarité de la flore intestinale, et de la parenté génétique avec l’humain. Les souris seront utilisées à l’âge adulte car nous souhaitons que les souris aient un système immunitaire mature.