Recherche fondamentale

Pour vérifier, dans une étude qualifiée de pilote, si un AVC provoque des altérations dans des régions du cerveau non connectées à la zone lésée, 432 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune subit une chirurgie d'environ quarante-cinq minutes pour déclencher l'infarctus cortical, puis une perfusion intracardiaque de vingt minutes sous anesthésie. Le porteur qualifie le modèle de peu invasif et annonce qu'il ne s'accompagne "typiquement" pas de symptômes majeurs, tout en prévoyant douleur et perte de poids après l'opération. La douleur est notée jusqu'au deuxième jour selon une grille à cinq critères, dont l'aspect de la plaie et les changements de poids, l'animal qui ne montre aucun signe passant ensuite à un suivi hebdomadaire.

Objectifs

Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) sont une cause majeure de déficits moteurs à long-terme et de déficits cognitifs. Certains symptômes se manifestent tardivement et ne sont pas forcément liés à la région initialement lésée, suggérant qu’un AVC dans une région spécifique peut aussi causer des modifications dans d’autres régions du cerveau. Des altérations dans des régions directement connectées à la zone infarcie ont déjà été corrélées à l’apparition de troubles tardifs. Cependant, les régions associées aux fonctions impactées (les fonctions de mémoire par exemple) ne sont pas toujours directement connectées à la région lésée. Nous émettons donc l’hypothèse que des modifications pourraient donc ne pas se restreindre aux régions connectées à l’infarctus primaire mais s’étendre spatialement et temporellement dans le cerveau. Dans cette étude pilote, nous voulons induire un AVC limité à une région précise du cerveau d’un modèle murin afin d’étudier l’impact de la lésion dans d’autres régions du cerveau, pas directement connectées à la zone infarcie. Si notre hypothèse est confirmée, nous aurions identifié un des mécanismes qui pourraient sous-tendre la manifestation de symptômes fonctionnellement liés à des zones non connectées dans un modèle murin.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider notre observation préliminaire qui vise à mieux comprendre les mécanismes sous-tendant les troubles de mémoire qui se manifestent tardivement après un AVC, même quand la région initialement lésée n’est pas impliquée dans les fonctions mnésiques. Nous émettons l’hypothèse que l’altération d’un mécanisme cellulaire associé à la mémoire ainsi qu’un état inflammatoire pourraient être présents dans des régions non directement connectées à la zone infarcie. Si notre hypothèse est confirmée, nous effectuerons une étude complète qui pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux troubles cognitifs post-AVC.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie peu invasive pour induire l’AVC sous anesthésie générale (environ 45 minutes). Ils seront enfin soumis à une perfusion intracardiaque toujours sous anesthésie générale (20 minutes). Tous les animaux sont concernés.

Impact sur les animaux

La méthode utilisée induit un infarctus cortical limité et typiquement ne s’accompagne pas de symptômes majeurs, ce qui rend le modèle facilement utilisable et limite la souffrance animale. Cependant, suite à la procédure chirurgicale, une douleur ainsi qu’une perte de poids peuvent survenir. Les animaux seront observés quotidiennement pendant deux jours. La douleur sera évaluée jusqu’à J2 après chirurgie selon une grille d’évaluation, organisée selon 5 grands critères : apparence physique, comportement non provoqué, changements de poids corporel, la locomotion ou encore l’aspect de la plaie. Si après deux jours l’animal ne montre aucun signe de souffrance, il sera suivi ensuite une fois par semaine. En cas de détérioration ou de souffrance animale, l’animal sera pris en charge par l’utilisateur ou par la vétérinaire.

Devenir

A l’issue de toutes les expériences, les animaux ne seront pas gardés du fait des techniques/procédures subies et seront de ce fait mis à mort.

Remplacement

L’AVC sera induit par la méthode la moins invasive disponible actuellement pour reproduire certain aspects de la pathologie humaine. Aujourd’hui ils n’existent pas des modèles in vitro (cultures cellulaires, organoïdes) pour étudier des conséquences anatomiques et cellulaires induites par un AVC dans les régions non lésées initialement et donc pas de méthode alternative permettant de REMPLACER les animaux. En effet, cette étude nécessite la complexité et la connectivité du cerveau adulte.

Réduction

Le nombre de souris a été évalué sur la base de travaux précédents en tenant compte des divers problèmes que nous pourrions rencontrer au cours des différentes phases expérimentales (problèmes au cours de la chirurgie, la perfusion,des expériences d’électrophysiologie et d’immunohistochimie), ainsi que de la variabilité des résultats. Le déroulement des expériences est organisé afin de limiter au maximum le nombre d’animaux. Nous adapterons d’abord le protocole afin d’avoir une lésion initiale reproductible, de taille maximale limitée au cortex, et seulement ensuite les autres expériences seront réalisées.

Raffinement

Des mesures de RAFFINEMENT seront mises en place durant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés au sein d'un établissement utilisateur agréé dans des conditions d’hébergement favorisant leur bien-être. Ils seront placés dans des cages enrichies, au nombre de 4-5 animaux par cage. Ils seront stabulés dans une animalerie thermorégulée avec hygrométrie. L’accès à la nourriture et à l’eau sera ad libitum et un changement de litière sera effectué chaque semaine. Dans une étude précédente, le nombre d’animaux qui ont montré des signes de souffrance dû à l’induction de l’AVC était très limité (moins de 3%). Nous nous attendons à ce que la lésion soit plus petite avec un temps d’illumination plus court et donc que ce pourcentage se rapproche de zéro. Si l’animal présente des signes de douleur au cours de l’expérimentation, l’animal sera pris en charge par l’expérimentateur. Si nous n’observons pas d’amélioration de l’état de l’animal, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable.

Choix des espèces

Le modèle envisagé a déjà été induit chez la souris et il a été démontré que les AVC s’accompagnaient de modifications dans des structures du cerveau pas initialement lésées, mais connecté à la région infarcie. Ce modèle permet de produire des tranches de cerveau pour réaliser des études d’électrophysiologie et d’immunohistochimie afin d’explorer des modifications dans d’autres régions du cerveau pas encore étudiées. Nous utiliserons des souris âgées de 16-24 semaines. Cette tranche d’âge permet d’étudier les conséquences d’un AVC chez un animal adulte et correspond à un jeune adulte chez l’homme.

La moitié des ratons sont retirés de la cage de leur mère trois heures par jour, du deuxième au douzième jour après la naissance. 160 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour le prélèvement de tissus nerveux. Le protocole cherche à reproduire chez le rat les effets de la prématurité humaine, puis à enregistrer l'activité des neurones de la moelle épinière et de l'hippocampe, le porteur décrivant lui-même ce stress comme installant une anxiété chronique et des troubles durables de l'adaptation au stress. Les mères ne retournent pas à la reproduction et sont tuées après le sevrage, parce que la séparation a altéré le fonctionnement de leur système nerveux.

Objectifs

Pendant très longtemps, la douleur du nouveau-né a été ignorée et négligée lors de sa prise en charge. Ce n’est qu’au début des années 90 que ce problème a commencé à être pris en compte en clinique humaine et de nombreux progrès restent à faire. Les nouveaux nés ressentent non seulement la douleur mais sont extrêmement sensibles aux stimulations aversives. Ceci est d’autant plus vrai pour les enfants nés prématurés (nés avant la 35ème semaine de grossesse) dont la prévalence mondiale était de 9.6 % en 2005. La prématurité conduit ces enfants à développer parfois des troubles moteurs et comportementaux et une hypersensibilité douloureuse pouvant perdurer à l’âge adulte. La séparation maternelle néonatale (SMN, 3h/jour du 2ème au 12ème jour post-natal) est un stress postnatal qui a été décrit comme un modèle reflétant la prématurité humaine. De nombreux travaux ont montré que les animaux exposés à ce stress postnatal présentaient des hypersensibilités douloureuses des troubles des comportements sociaux, une modification de la perception douloureuse au niveau de la moelle épinière ainsi que des déficits cognitifs. Dans ce contexte, nous cherchons à affiner notre compréhension de l’impact de la séparation maternelle néonatale sur le codage de l’information nociceptive par les structures nerveuses spinales et supraspinales. L’objectif est de caractériser les modifications fonctionnelles au niveau neuronal qui rend compte des symptômes observés.

Bénéfices attendus

L’ensemble de ces travaux nous permettra de mieux comprendre les phénomènes de sensibilisation nociceptive ainsi que des déficits cognitifs qui semblent se mettre en place durablement suite à des épisodes de stress non douloureux durant la période néonatale en utilisant le modèle de séparation maternelle néonatale. Nous répondrons à la question d'une origine d'un dysfonctionnement de communication nerveuse expliquant les symptômes qui façonne l’expérience douloureuse et augmente le risque de développer une neuropathologie chronique selon les études épidémiologiques sur le sujet.

Procédures

La moitié des animaux sera soumis au protocole de séparation maternelle néonatale : séparation des ratons de la cage de leur mère 3h/j du 2ème au 12ème jour post-natal.

Impact sur les animaux

La séparation maternelle neonatale chez le rat est un modèle classique de stress psycho-social et a donc des conséquences sur le comportement des animaux (expression de symptomes d'anxiété chronique et troubles de l'adaptation au stress). Les ratons sont placés sous une lampe rouge chauffante avant d’éviter tout risque d’hypothermie. Le protocole de SMN est également connu pour augmenter les comportements maternels après retours de ratons dans la cage de la mère. Après sevrage, la mère ne réintègrera pas le processus de reproduction mais sera euthanasiée puisque la séparation maternelle altère le fonctionnement de son système nerveux, ce qui induit au niveau comportemental une anxiété accrue.

Devenir

Les enregistrements electrphysiologiques nécassitant le prélèvement de tissus nerveux, tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Ce projet portant sur l’étude d’un système intégré et mature, il nous a été impossible de remplacer l’utilisation d’animaux par des tests in-vitro.

Réduction

Nous prévoyons un nombre d’animaux suffisant pour d’obtenir des résultats exploitables en termes statistiques. Le nombre d’animaux prend en compte les deux sites d’enregistrement nécessaires (moelle épinière et hippocampe) ainsi que les variabilités interindividuelles nécessitant un certain nombre d’animaux pour obtenir des résultats statistiquement significatifs lors des tests paramétriques.

Raffinement

Notre étude s'interesse à l'impact de l'environement sur les nouveaux-nés. Pour pouvoir comparer nos groupes d'animaux, il nous faut un environnement enrichi tout en étant le plus homogène possible. Ceci nous permets d'étudier uniquement l'impact de la séparation maternelle. Les animaux sont ainsi hébergés en cage collectives afin de préserver les interactions sociales avec leurs congénères et ont constamment à leur disposition de la frisure pour nid, un bâton à ronger et un tunnel. Ils sont placés en conditions de températures et hygrométrie contrôlées, en cycle jour/nuit de 12h/12h avec eau et nourriture ad libitum. Durant la séparation maternelle néonatale, les ratons sont placés sous une lampe rouge chauffante afin d'éviter toute hypothermie.

Choix des espèces

Nos précédentes études étant réalisées sur le rat, nous conserverons ce modèle qui est bien caractérisé sur le plan comportemental. Le modèle de séparation a déjà été bien décrit et caractérisé chez cette espèce, permettant ainsi de confirmer la robustesse des résultats obtenus. De plus le modèle chez le rat nous permet de modéliser l’état de développement d’un fœtus lors du 3e trimestre de gestation, puisqu’à la naissance le système nerveux du rat est au même niveau de maturation que celui du fœtus au début du 3e trimestre de gestation. Les évènements de maturation ayant lieu lors du 3e trimestre de gestation chez l’homme, correspondent à ceux qui ont lieu lors des 2 à 3 premières semaines de vie post natales chez le rat. Nous utiliserons des rats agés de 30 et 50 jours postnataux, une période qui correspond à la phase de maturité du système nociceptif. Les précédentes études portant sur l’hypersensibilités nociceptives des animaux séparés maternels chez le rat jeune et adulte, le projet continuera sur cette ligne en faisant des enregistrements électrophysiologiques in vitro chez des animaux à un stade de développement équivalent

3 024 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des cellules tumorales injectées sous la peau ou directement dans le pancréas par chirurgie, puis jusqu'à six prélèvements de sang sous anesthésie. Le porteur reconnaît une douleur modérée au réveil et pendant la croissance de l'adénocarcinome pancréatique, et justifie l'effectif par le "standard de la littérature internationale". Il écrit que les organoïdes remplaceront l'expérimentation animale "à moyen/long terme", tout en concluant que le recours aux animaux non-humains revêt ici "un caractère obligatoire".

Objectifs

Ce projet a pour but d’étudier l’impact de l’hétérogénéité des macrophages sur le développement tumoral, la réponse immunitaire et l’efficacité anti-tumorale d’immunothérapies déjà existantes. Le but ultime est l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et le développement de nouveaux traitements plus spécifiques et efficaces que ceux existants. Il a été établi depuis des décennies que l’abondance des macrophages dans les tumeurs était un marqueur de pronostic pour les patients atteints de cancer et ce quel que soit le cancer considéré. En clair, plus la tumeur contient de macrophages, plus le pronostic est mauvais. Mais ces observations cliniques restent en grande partie inexpliquées en raison de notre méconnaissance des fonctions des macrophages associés aux tumeurs (TAM). Récemment, des approches moléculaires ont révélé une très grande plasticité des macrophages dans les tissus sains mais également dans les tumeurs avec la co-existence de diverses sous-populations de TAM. L’objectif principal de ce projet est la caractérisation des phénotypes et fonctions de tous les TAM dans différents modèles murins de cancer. La cartographie des TAM murins sera ensuite utilisée pour analyser les données humaines existantes afin d’identifier ces différentes sous-populations et mettre en évidence de potentielles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’étudier l’impact de l’hétérogénéité des macrophages sur le développement tumoral, la réponse immunitaire et l’efficacité anti-tumorale d’immunothérapies déjà existantes. Le but ultime est l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et le développement de nouveaux traitements plus spécifiques et efficaces que ceux existants.

Procédures

Les animaux seront soumis à des chirurgies sous anesthésie générale pour l'injection orthotopique de cellules tumorales dans le pancréas. Cette injection durera moins de 15 minutes et sera faite une seule fois. Les injections sous la peau de cellules tumorales seront faites sous anesthésie, une seule fois et dureront moins de 5 minutes. Les animaux pourront avoir des prélèvements de sang sous anesthésie, durée moins d'une minute, nombre maximum: 6.

Impact sur les animaux

L'injection en sous-cutanée de tumeur entraînera une gêne légère et transitoire à l'injection puis modérée après croissance. L'injection dans le pancréas pourra entraîner une douleur modérée au réveil et lors de la croissance des tumeurs. Etant donné que la tumeur croit en orthotopique dans le pancréas, les conséquences seront modérées pour les animaux (adénocarcinome pancréatique), légère perte d'appétit possible avec perte de poids. Les prélèvements de sang entraîneront un inconfort léger et transitoire dû à la préhension et à l'anesthésie.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour analyses des tumeurs et organes post-mortem.

Remplacement

Ce projet nécessite l’établissement de tumeurs dans des conditions réelles pour la mise en évidence de sous-populations d’intérêt. Nous travaillons d’ailleurs en parallèle sur une approche de type « organoïdes » avec laquelle des tumeurs sont re-créées en 3 dimensions dans des boites de Pétri pour créer des avatars de patients. Bien que ces approches soient très clairement vouéés à un développement exponentiel et remplaceront à n’en pas douter l’expérimentation animale à moyen/long terme, elles ne peuvent à l’heure actuelle s’y substituer et il est très difficile de résumer le microenvironnement tumoral naturel qui engendre la diversité de phénotypes cellulaires observés chez les patients. De plus, notre stratégie de suivi temporel de la différentiation de monocytes naïfs en macrophages associés aux tumeurs nécessite l’interaction de ces cellules avec les cellules tumorales tout au long du développement de la maladie. L’utilisation de modèles animaux pour ce projet revêt donc un caractère obligatoire.

Réduction

Le nombre d'animaux analysés dans les groupes expériementaux est réduit à son minimum pour pouvoir tirer des conclusions solides des expériences proposées. Il est conforme au standard de la littérature internationale. Même si cela nécessite l'utilisation de nombreux animaux, cela garantit la validité scientifique des résultats obtenus et justifie ce nombre. Les nombres minimuax ont été déterminés gra^ce à des tests statistiques.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe sociaux dans un environnement enrichi (sizzlenests + maisons en carton). Les souris seront sous surveillance quotidienne de la part de l’équipe de recherche pour une évaluation clinique adaptée. Toutes les injections seront faites sous anesthésie locale ou générale . Les souris auront un examen clinique et seront pesées quotidiennement. Les points limite seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.

Choix des espèces

- Génétique proche de celle de l’Homme - Modèles de devenir des types cellulaires impliqués dans le cancer performants et originaux - Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité et l’effet des traitements sur la réponse anti-tumorale dans leur globalité. Animaux à maturité sexuelle, entre 6 et 12 semaines du fait de la population de patients.

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune recevant cinq injections intrapéritonéales en cinq jours, deux échocardiographies de trente minutes sous sédation et une ligature de l'artère coronaire gauche sous intubation, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La chirurgie provoque un infarctus du myocarde, dont le projet veut suivre la réparation en inactivant un gène chez l'animal adulte. Les retombées annoncées pour les cœurs humains endommagés sont renvoyées au long terme. Le porteur écrit s'attendre à "une légère douleur en raison de l'incision de la peau et de la dissection d'un seul petit muscle intercostal".

Objectifs

La cardiopathie ischémique et l’infarctus du myocarde sont des causes majeures de mortalité dans nos sociétés. Nous proposons d’étudier l' impact du gène de notre intéret dans le processus de réparation tissulaire post infarctus du myocarde. La létalité embryonnaire des animaux deficients du gène a empêché la vérification de cette hypothèse. Nous allons développer plusieurs modèles de souris transgéniques permettant l’induction d’une inactivation spécifique du gène de notre interet chez les souris adultes, permettant ainsi de répondre à ces objectifs et de mener les études par: - un suivi clinique et échographique des animaux, - une étude des processus de régénération cellulaire, de néovascularisation, de régulation de l’inflammation par la définition des types cellulaires et des voies de signalisation moléculaires impliqués. Notre projet représente une analyse approfondie de la signalisation médiée par ce gène dans le processus de l’homéostasie du myocarde et la réparation du coeur. Nous étudierons le rôle du gène au cours de l’infarctus du myocarde par une multitude d’approches génétiques: en induisant une délétion conditionnelle du gène de notre interet dans 1) les cellules progénitrices myéloïdes et vasculaires, 2) les cellules vasculaires uniquement, et 3) les cardiomyocytes, en utilisant un système inductible pour le knock-out chez les animaux sains et adultes.

Bénéfices attendus

Dans l’ensemble, ces expériences permettront de déterminer les voies de signalisation dépendant du gène de notre interet après un infarctus du myocarde et impliquées dans la régénération et la réparation du coeur et d’identifier les processus moléculaires activés par ces voies de signalisation. A long terme, ces données permettront de développer de nouvelles approches pour le traitement des coeurs endommagés suite à un infarctus du myocarde.en

Procédures

Pour chaque souris: 1) 5 injections intra-péritonéales (30 secondes) pendant 5 jours consécutifs pour chaque souris. 2) 2 mesures échocardiographiques (30 minutes), realisées sous sédation (Isoflurane 2%) et en ventilation spontanée pour chaque souris. 3) 1 chirurgie de l'artère coronaire gauche sous anesthésié avec l’isoflurane et intubation (30min).

Impact sur les animaux

Pour chaque souris: 1) 5 injections intra-péritonéales (30 secondes) pendant 5 jours consécutifs pour chaque souris. Les injections intra-péritonéales sont des gestes n'impliquant qu'une contention de courte durée (30 secondes) et une douleur légère. 2) 2 mesures échocardiographiques (30 minutes), realisées sous sédation (Isoflurane 2%) et en ventilation spontanée pour chaque souris. Nous n'avons jamais constaté aucune nuisance grave du à ce examen. 3) 1 chirurgie de l'artère coronaire gauche sous anesthésié avec l’isoflurane et intubation (30min). Apparition possible de angoisse, du stress, et des douleurs suite à l'intervention chirurgicale. On peut s'attendre à une légère douleur en raison de l'incision de la peau et de la dissection d'un seul petit muscle intercostal.

Devenir

Au terme de l'examen final, les souris sont mises à mort , le coeur est prelevé, pésé puis conservé pour analyses (immuno)histochimiques et moleculaires ulterieures.

Remplacement

L’homéostasie et le remodelage cardiaque sont des processus complexes. Bien qu’il existe des modèles in vitro, l’interaction entre différentes populations cellulaires (cardiomyocytes, cellules endothéliales, cellules immunitaires) ne peut être mimée par une approche in vitro. Après avoir déclenché un infarctus, il est important de suivre le coeur dans son environnement, ses échanges avec d’autres organes. En outre, les lignées transgéniques utilisées nous permettent d’observer, après l’infarctus, l’activation immédiate de voies de signalisation, d’identifier les cellules répondant à ces voies de signalisation. L'emploi d’un modèle animal comme la souris récapitulant la physiopathologie du coeur chez le mammifère est donc essentiel, en raison de ses similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. En effet, nous essayons de comprendre la fonction de gènes spécifiques dans la réparation du coeur. Notre projet s'appuie fortement sur des organismes génétiquement modifiés. La communauté scientifique a déjà généré un grand nombre de souches génétiquement modifiées qui peuvent être utilisées en combinaison avec des lignées générées dans notre laboratoire pour répondre à ces questions scientifiques (analyse de tissus-spécifiques de la fonction des gènes par l'intermédiaire du système Cre-lox). Notre stratégie est bien conçue pour une prise en compte des objectifs de remplacement, car nous avons déjà validé toutes les analyses moléculaires dans des systèmes de culture cellulaire ou purement biochimiques.

Réduction

Dans un souci de réduction du nombre d'animaux utilisés, le nombre d'animaux pour chaque expérience sera limité à celui nécessaire à la validation d'un effet significatif. Les mêmes animaux seront utilisés à la fois pour les études echocardiographiques et la réalisation des analyses histologiques et moléculaires.

Raffinement

Dans le sens du raffinement, l’anesthésie et l’analgésie seront utilisées comme premières méthodes pour limiter autant que possible la souffrance potentielle des animaux. Des points limites (PL) précises et adaptés seront évalués quotidiennement. Ils permettent l’arrêt de la procédure (mise à mort) dans tous les cas d’aggravation ou d’anomalies cités.

Choix des espèces

Les souris sont utilisées comme modèle car leur physiologie et leurs mécanismes de réparation correspondent étroitement à ceux de l'homme. Les animaux adultes seront utilisés (25g, âgés de 24 à 30 semaines). Le choix de animaux adultes est justifie par le fait que les maladies cardiovasculaires concernent en majorité des adultes. L'autre raison pour le choix de souris adultes concerne la chirurgie d'un IDM laquelle est possible que avec des animaux adultes pour raison de leur plus grande taille.