Recherche fondamentale

Un morceau d'oreille prélevé, une injection dans le ventre, puis pour certaines une injection dans la veine de la queue en boîte de contention, une injection dans la veine de l'œil sous isoflurane répétée à trois, sept et trente jours, des injections hebdomadaires sous la peau et des prises de sang à la joue chaque semaine sur animal éveillé. 910 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, greffées de cellules de leucémie humaine puis traitées par différentes préparations de cellules immunitaires. Le porteur décrit les signes attendus du développement de la leucémie, prostration, poil hérissé, yeux plissés, envahissement du sang par les cellules cancéreuses. Chaque procédure peut durer jusqu'à dix mois, au terme desquels les souris sont tuées, ou plus tôt si un point limite est atteint.

Objectifs

Les immunothérapies ont changé le paradigme du traitement du cancer en s'éloignant de la chimiothérapie cytotoxique conventionnelle. Certaines cellules immunitaires ont la capicité de tuer des cellules infectées par des pathogènes intracellulaires et des cellules tumorales. Ce projet vise à comparer l'activité anti-tumorale de différentes préparations de cellules immunitaires in vivo dans un modèle de souris immunodéficientes . L'activité anti-tumorale etudiée dans ce projet sera dirigée contre des cellules cancereueses de la moelle osseuse et du sang. Ces travaux nous permettront de mieux comprendre l'activité anti-tumorale de ces cellules immunitaire dans un modèle de tumeurs humaines chez la souris.

Bénéfices attendus

Les immunothérapies ont changé le paradigme du traitement du cancer, s'éloignant des méthodes conventionnelles de chimiothérapie cytotoxique. Cependant, les résultats de l'immunothérapie restent plus limités dans certains cancers. Il apparaît donc essentiel de développer une alternative à ces immunothérapies en utilisant des cellules immunitaires à l'origine de thérapies cellulaires. Ces protocoles d'activation différentiel des cellules immunitaires in vitro pourraient être mis en place sur une plateforme de biothérapie cellulaire en vue d'un futur essai clinique de thérapies cellulaires dans le cadre de leucémie.

Procédures

672 souris seront soumises à de la contention et auront un prélèvement de petit bout d'oreille et une injection unique au niveau du ventre (quelques seconde sur souris vigile). Parmi ces 672 souris, 96 (souris vigiles) auront une injection unique dans la veine de la queue après avoir été placé dans une boite à contention, moins d'une minute et auront aussi des prélèvements répétés de sang au niveau de la joue 1/semaine avec alternance des sites de prélévement. 288 autres souris auront une injection unique au niveau de la veine de l'oeil après anesthésie à l'isoflurane (quelques secondes),ainsi que des injections répétées sous la peau (1/semaine) sur souris vigiles, quelques secondes. Et 288 autres souris auront une injection unique dans la veine de la queue après avoir été placé dans une boite à contention (moins d'une minute) , ainsi qu' une injection au niveau de la veine l'oeil après anesthésie à l'isoflurane (quelques secondes) pouvant être répétée à J3, J7 et J30, de plus elles auront des injections répétées sous la peau (1/semaine) sur souris vigiles,(quelques secondes) et des prises de sang répétées au niveau de la joue (hebdonadaire) sur souris vigiles, quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les injections et les prélèvements seront sources de stress et de douleur (inflammation sur le site d'injection), cependant le volume injecté ou prélevé reste faible et l'acte est rapide (inférieur à une minute). Les effets indésirables attendus liés au développement de la leucémie (souffrance modérée) seront la prostration, le poil hérissé, les yeux plissés ou bridés et un envahissement du sang par les cellules cancereuses.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure (10 mois au maximum) ou avant si un point limlite est atteint.

Remplacement

Des études préliminaires in vitro avec les différentes sous type de cellules imminitaires et les différentes lignées de cellules cancereuses ont été réalisées au laboratoire, nous premettrant de limiter le nombre de conditions in vivo. Cependant, les approches in vitro ont des limites et ne permettent pas l'étude du système immunitaire, ni du dévélopement du cancer car celle-ci nécessite la présence d'un micro-environnement. C’est pourquoi le recours aux animaux est nécessaire dans notre projet pour tester l'efficacité des cellules immunitaire dans un modèle de leucémie.

Réduction

Le nombre maximal de souris utilisées dans ce projet (n=910) a été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et reproductibles. Dans toutes les procédures nous aurons besoin de 8 souris par groupe afin de définir des différences significatives. Ce projet sera réalisé de façon séquentielle : dans un premier temps les P2 et P3 seront réalisées afin de définir les conditions expérimentales optimales pour la procédure P4.

Raffinement

La bonne connaissance des modèles expérimentaux, le suivi adapté des points limites précoces et clairement définis, et la manipulation des animaux en générant le moins de stress possible par des personnes compétentes en expérimentation animale permettent de limiter au maximum toute douleur ou souffrance des souris. Les souris seront toujours herbergées dans des cages sur portoir ventilé et les expérimentation seront réalisées en condition stérile afin d'éviter des contacts microbiens qui pourraient nuire à leur bien-être. Les injections au niveau de la veine de l'oeil seront toujours précédées d'une anesthésie gazeuse qui limitera la douleur des souris. Les pélèvements sanguins se feront en altermant le site de prélèvement. Nous évaluerons l'état de bien-être ou de souffrance des animaux au minimum 3 fois par semaine (lundi, mercredi, vendredi). Nous veillerons à optimiser, enrichir l’hébergement (blocs de cotons ou tube en plastique, .....) et le maintien dans la mesure du possible des groupes sociaux et surtout au cours de la gestion des souris. Au fur et à mesure de l'apparition des tumeurs et de mises à mort des animaux, des souris se retrouveront isolées dans les cages. Ces animaux recevront un enrichissement supplémentaire (coton et igloo pour la nidification, mocreaux de bois et tube plastique pour l'enrichissement ludique). Pour la procédure de gestion, les souris gestantes seront maintenues avec le mâle géniteur.

Choix des espèces

Ce modèle est donc très pertinent car il permet de reconstituer des pathologies humaines telles que des leucémies après transfert des cellules cancereuses et de tester l'efficacité de thérapies cellulaires. Pour les accouplements, nous utiliserons des souris arrivées à maturité sexuelle (8 semaines). Dans les autres procédures, des souris âgées de 6 à 15 semaines seront utilisées afin de permettre un bon développement tumoral et permettre de tester sur des souris adultes l'efficacité de nos thérapies cellulaires.

Une souris qui convulse est tuée sur le champ, et la prostration ou les tremblements déclenchent aussi l'arrêt immédiat du protocole. 2 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, dont 1 200 fœtus sortis un par un de la corne utérine et décapités, et 720 souris porteuses d'un phénotype dommageable dont le porteur indique que 10 % meurent avant trois mois et environ 30 % avant quatre mois, de crises d'épilepsie spontanées. Une partie subit une ouverture de la cage thoracique sous anesthésie profonde pour une perfusion intracardiaque de fixateur, opération de trente minutes menée sans réveil. Ces souris ne sont produites que pour l'analyse post-mortem, aucune autre procédure expérimentale n'étant prévue, et le projet se ramène à fabriquer des individus atteints pour prélever leur cerveau.

Objectifs

Le but de ce projet est d’analyser les mécanismes moléculaires et cellulaires qui sont impactés dans un syndrome neurodéveloppemental avec retard mental, autisme, déficit moteur et épilepsie. Le gène déficitaire dans ce syndrome est exprimé dans le cerveau au cours du développement et chez l’adulte. Les modèles que nous étudions présentent une inactivation soit d’une copie, soit des deux copies du gène spécifiquement dans une population de neurones, les neurones produisant le neurotransmetteur GABA qui est le principal neurotransmetteur inhibiteur dans le cerveau. Cette approche nous a permis de montrer que la plupart des symptômes associés au syndrome dont l’épilepsie et les troubles autistiques étaient liés à l’inactivation du gène dans cette population neuronale. L’inactivation des deux copies du gène nous permet de comprendre le rôle de ce gène dans les neurones GABAergiques au cours du développement. Le but ici est maintenant de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sont impactés dans ces modèles en regardant quelles sont les sous-populations de neurones GABAergiques affectées par des études immunohistologiques et les voies moléculaires dérégulées grâce à des études moléculaires. Les animaux de cette étude sont uniquement dédiés à de l’analyse post-mortem et ne font pas l’objet d’autres procédures expérimentales. Ils font l’objet d’une demande d’autorisation de projet pour phénotype dommageable. Le modèle avec inactivation d’une copie du gène présente des épilepsies spontanées qui se déclarent à partir de 6-8 semaines tandis que le modèle avec inactivation des deux copies du gène entraine une absence de formation d’une structure du cerveau appelée striatum servant à l’exécution des mouvements. L’absence de striatum entraine des spasmes musculaires à la naissance et le décès des petits dans les premiers jours de vie. Les études sur ce modèle ne concernent donc que les foetus dans le dernier tiers de développement (à partir de 15 jours de développement embryonnaire) et jusqu’au jour de naissance, c’est-à-dire avant que le phénotype dommageable ne s’exprime.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de permettre la production de souris et de fœtus pour 2 modèles murins impliqués dans le syndrome neurodéveloppemental avec retard mental, autisme, déficit moteur et épilepsie. Ces 2 modèles présentent des phénotypes dommageables dont la caractérisation nous permettra de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques à l’origine des troubles du neurodéveloppement associés à cette pathologie.

Procédures

Une partie des souris subissent une chirurgie sans réveil pour pouvoir fixer le cerveau de manière optimale. Pour cela, une anesthésie profonde est couplée à un anti-douleur. La procédure consiste en un acte chirurgical avec une ouverture de la cage thoracique et perfusion par voie intracardique d'un agent de fixation. La procédure dure environ 30 minutes et n'est réalisée qu'une seule fois par souris, celle-ci étant sans réveil.

Impact sur les animaux

Des épilepsies apparaissent chez certains animaux dont une copie du gène a été inactivée dans les neurones GABAergiques à partir de l’âge de 6-8 semaines. Ces crises se caractérisent par des myoclonies (secousses musculaires localisées au niveau des vibrisses, de la face, des oreilles et des membres antérieurs) ainsi que des crises tonico-cloniques (une course intense, une perte d’équilibre et une chute sur le flanc accompagnée de myoclonies généralisées pendant quelques secondes). Ces crises sont généralement indolores car il y a perte de connaissance. Si la crise est forte, certaines souris peuvent aller jusqu’à la crise tonique qui se manifeste par une hypertonie des quatre membres de la souris tendus en direction de l’appendice caudal. Cette dernière peut s’accompagner de la mort de l’animal.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure car leur cerveau est prélevé pour des analyses moléculaires et histologiques

Remplacement

Pour les études concernant le cerveau, il n'existe à l'heure actuelle pas d'alternative à l'utilisation des animaux. Les organoïdes cérébraux, censés mimer la structure et les fonctions principales du cerveau, n’ont pas la capacité de répliquer toutes les structures et réseaux neuraux d’un cerveau adulte. Il n'existe donc pas encore de modèle de cerveau in vitro ou autre permettant de réaliser les analyses qui sont faites dans ce projet.

Réduction

Pour chaque étude, les effectifs ont été calculés afin d'avoir un nombre minimal d'animaux d’intéret (n=6 individus par sexe et âge) tout en ayant des résultats scientifiquement et statistiquement interprétables. Nous prévoyons de produire 10 lots par an sur 5 ans, soit 12 x 10 x 5 = 600 animaux au phénotype dommageable. Nous prévoyons des animaux supplémentaires pour compenser la perte de certains animaux lors de crises épileptiques. En effet, nous avons observé qu’environ 10% des souris décèdent lors des trois premiers mois et ~30% avant 4 mois). Basé sur une estimation de la moitié des animaux qui seront sacrifiés avant l'âge de 3 mois et l'autre après, nous aurons besoin de produire 120 animaux en plus, ce qui donne un total de 600 + 120 = 720 animaux . Nous produirons aussi des mâles au phénotype dommageable pour de nouveaux accouplements. Sachant que nous perdons environ 30% de ces mâles avant l’âge de 4 mois et que certains mâles ont du mal à se reproduire, nous estimons devoir produire en continu 6 animaux en âge de se reproduire. A cela, nous devons ajouter le même nombre de femelles qui seront aussi produites en même temps. Nous produirons donc 6 animaux x 2 sexes x 4 trimestres x 5 ans = 240 animaux. Pour les analyses des foetus, nous prévoyons de produire 10 lots par an sur 5 ans, soit 12 x 2 génotypes x 10 x 5 = 1200 foetus. Nous utiliserons donc au maximum 2160 animaux.

Raffinement

L'état général et le comportement des souris est suivi quotidiennement par l'animalier: examen de l’apparence de l’animal, de l'état du pelage, de la coloration des muqueuses, évaluation de l'état de souillure de l'arrière-train, analyse visuelle de la respiration. Le premier signe d'alerte sera une perte de poids, un arrière-train souillé et un pelage mal entretenu qui entraînera une surveillance accrue (niveau 1). Le second signe d'alerte sera la prostration (et/ou des tremblements) qui entraînera un arrêt immédiat du protocole et l'euthanasie de l'animal (niveau 3). Certains animaux avec inactivation d'une copie du gène d'intérêt pouvant présenter des crises convulsives spontanées à n’importe quel moment à partir de l’âge de 6-8 semaines. Cependant, les crises ayant tendance à apparaitre après stimulation, elles peuvent se produire lors de la manipulation de l’animal. Afin d'éviter au mieux le stress pouvant provoquer une crise chez ces animaux, ceux-ci seront manipulés avec un tunnel lors des changes de cages. Si nous observons une souris qui convulse, celle-ci sera euthanasiée. Les souris avec inactivation des deux copies du gène d'intérêt développent des spasmes musculaires (dystonie) peu après leur naissance et meurent pendant les premiers jours de vie. Ces animaux sont prélevés et mis à mort avant que le phénotype dommageable n’apparaisse. Les foetus seront sortis de la corne utérine un par un et euthanasiés par décapitation directement afin de réduire au minimum le stress lié à cette sortie. 

Choix des espèces

Cette étude vise à comprendre le rôle du gène d'intérêt dans le développement et le fonctionnement des neurones inhibiteurs GABAergiques. L’utilisation d’un modèle d’inactivation conditionnelle permet d’étudier l’impact spécifique de ce gène dans ces neurones. Cette étude requiert un modèle animal suffisamment proche de l’homme tel que la souris. Les animaux sont utilisés à différents stades pré- et postnatals : E15.5-E18.5, avant sevrage (1-12 jours) juvénile (3-6 semaines), adulte (2-4 mois). Les études nécessitent de comprendre le développement dès le stade embryonnaire et jusqu’à l’établissement de la pathologie à l’âge adulte.

Tuées à la fin du protocole pour que leurs organes soient prélevés et la quantité de produit mesurée organe par organe, 424 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une ou deux injections dans une veine ou directement dans le cerveau, cette dernière voie demandant jusqu'à une heure de préparation en cadre stéréotaxique et pouvant provoquer des douleurs, des saignements et des dommages cérébraux irréversibles. S'y ajoutent des séances de micro-scanner et d'imagerie optique sous anesthésie générale, jusqu'à deux par jour les trois premiers jours puis une par jour jusqu'au septième. Le porteur affirme qu'aucun modèle de remplacement ne permet d'évaluer la biodistribution d'un produit dans un "organisme entier" vivant, et n'envisage de garder en vie que "la ou les souris background" si cela s'avère possible.

Objectifs

D’après l’Organisation Mondiale de la Santé, la schizophrénie, la sclérose en plaque et la maladie de Charcot touche 24 millions, 1,8 millions et 500 000 personnes dans le monde respectivement. Afin de mieux comprendre les maladies neurologiques, psychiatriques ou auto immunes (comme la schizophrénie, la sclérose en plaque ou la maladie de Charcot (également appelée sclérose en plaque amyotrophique)) qui sont des maladies multifactorielles et ainsi développer de nouveaux médicaments thérapeutiques. Dans le cas de la sclérose en plaque et la maladie de Charcot, il n’existe à ce jour aucun traitement permettant de guérir la maladie. Pour la sclérose en plaque, les traitements actuels permettent seulement d’éviter les récidives des poussées et de freiner la progression de la maladie. De nouvelles recherches ont démontré l’implication de protéines rétrovirales endogènes (de la famille des rétrovirus endogènes humain gamarétroviraux HERV) dans le développement de la maladie. Ces protéines sont retrouvées dans le sang, le cerveau et /ou le liquide céphalo rachidien de patients atteints de sclérose en plaque ; cette protéine a même été retrouvée dans certains cas de Covid long. C’est pourquoi ces protéines rétrovirales endogènes semblent être un facteur clé à étudier dans le cas de sclérose en plaque mais probablement dans le cas d’autres maladies neurologiques, psychiatriques ou auto immunes. L’objectif de ce projet est de développer des anticorps ciblant ces protéines rétrovirales endogènes. Les anticorps peuvent êtres couplées a des fluorochromes ou rendu bioluminescent afin de suivre leur biodistribution. Plusieurs voies d’administration seront testés au cours de ce projet.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera dans un premier temps à avoir une meilleure compréhension de la biodistribution d’anticorps marqués et/ou de produits afin de définir la voie d’injection la plus pertinente puis dans un deuxième temps aux développements de nouveaux médicaments dans le cas de maladies neurologiques, psychiatriques ou auto-immunes et éventuellement à leur mise sur le marché dans le but de proposer de nouveaux médicaments thérapeutiques.

Procédures

Les animaux recevront une ou deux injections soit par voie intraveineuse ou par voie intracérébrale en respectant les volumes d’injections recommandés. Les injections par voie intraveineuse pourront être fait sur animal vigile et seront réalisées en quelques secondes (temps inférieur à 1 minute). Les injections par voie intraveineuse réalisées sous anesthésies et en comptant l’anesthésie dure environ 5 minutes. Les injections intracérébrales peuvent durer jusqu’à 10 minutes. Plus l’injection dans le cerveau est lente et mieux c’est pour l’animal. La chirurgie donc du placement de la souris dans le cadre stéréotaxique et la préparation à l'injection cela dure entre 30 minutes à maximum 1 heure par animal. Des examens micro scanner ou d’imagerie optique pourront être réalisés sous anesthésie générale. Un examen micro-scanner peut aller jusqu’à 20 minutes, celui de fluorescence est d’en moyenne 5 minutes, la fréquence des examens sera de maximum 2 acquisitions par jour les 3 premiers jours puis 1 acquisition par jour jusqu’au 7e jour.

Impact sur les animaux

Les animaux seront manipulés régulièrement pour différents actes avec ou sans anesthésie susceptibles d’induire un stress : pesées, injections par voie intraveineuse et acquisition d’imagerie optique. Les injections intracérébrales sont susceptibles d’induire des douleurs voire des saignements pouvant induire des dommages irréversibles dans le cerveau. Différents signes cliniques pourront être observés tels qu’une perte de poids, des troubles neurologiques ou des signes liés à la douleur. Une prise en charge analgésique avant et après injection sera donc réalisée. Des mesures spécifiques seront prise pour cette voie d’injection. Les animaux pourront présenter des réactions différentes selon les produits testés et selon les voies d’administration choisies pouvant entrainer l’apparition de signes cliniques (pertes de poids liées aux éventuelles anesthésies voire inflammation du site d’injection).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole pour pouvoir réaliser des prélèvements d’organe et réaliser une quantification des produits par organe grâce à de l'imagerie optique ex-vivo ou par d’autres techniques in vitro. Si possible, la ou les souris background pourront être gardées en vie.

Remplacement

A l’heure actuelle il n’existe aucun modèle de remplacement permettant d’évaluer la biodistribution d’un produit dans un organisme entier vivant (modélisation d’une situation clinique), le recours à l’expérimentation animale est donc nécessaire.

Réduction

L’utilisation de produits rendu fluorescent ou bioluminescent vont permettre de suivre au cours du temps la biodistribution du produit par imagerie médicale sur les mêmes animaux et donc de diminuer le nombre d’animaux utiles au projet. Une étude pilote pourra être réalisée sur un nombre limité d’animaux (2 ou 3 par groupe) pour vérifier la détection in vivo des molécules marquées et s’assurer que la technique d’injection intracérébrale n’entraine pas de signes cliniques incompatible avec l’étude. L’étude principale pourra être réalisée si lors de l’étude pilote, 90% des animaux ne présentent pas de paralysie ou lésions cérébrale incompatible avec la poursuite de l’étude (c’est-à-dire sur une étude pilote de 7 souris, 0 ou 1 souris morte est un go pour démarrer l’étude pilote) et si la molécule marquée à un niveau suffisant pour être détectable et mesurable in vivo. Afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables en réalisant des tests statistiques permettant d’étudier la biodistribution des produits testés, des groupes contenant un nombre de souris suffisant seront réalisés.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 7 jours minimum sera respectée. Les animaux seront hébergés en cage de manière collective durant toute la durée de l’étude. Sauf pour les animaux ayant subi une chirurgie, ces animaux pourront être herbergés seuls les 24 à 48h suivant la chirurgie (ou plus si nécessaire) (le temps nécessaire pour que la plaie soit cicatrisée et éviter que les souris s'arrachent et/ou se rongent les fils de suture). Selon les études les animaux background pourront être hébergés collectivement ou individuellement.

Choix des espèces

Le modèle souris a été choisi pour : -Sa taille réduit permettant l’utilisation de technique d’imagerie optique corps entier, -Car il s’agit d’une espèce couramment utilisée pour étudier la biodistribution en expérimentation animale et permettant de travailler sur des lots homogènes (âge et sexe fixés) -des souris sans poils pourront être privilégiés car l’absence de poils permet d’augmenter la sensibilité de détection de la fluorescence. Des souris de minimum 5 semaines seront utilisées au cours de ce projet (stade jeune adulte) afin de s’affranchir de la période de forte croissance de l’animal et d’avoir des animaux présentant un poids d’environ 20g

652 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Une partie est irradiée aux rayons gamma ou à un faisceau d'ions lourds, une autre reçoit une irradiation à dose létale qui détruit son système sanguin et dont la mort survient en 11 à 15 jours sans greffe, une autre encore est stérilisée par un composé reprotoxique avant de recevoir une greffe de cellules souches testiculaires ou de moelle osseuse. Les données doivent servir à estimer les risques encourus par les astronautes lors de vols dans l'espace profond, sur la fertilité masculine, le système sanguin et le cerveau, et à améliorer la composition des capsules, des vêtements et du régime alimentaire des équipages. Sur le remplacement, le porteur indique que les cultures de cellules souches ne reproduisent ni la quiescence, ni les régulations hormonales, ni la réponse inflammatoire, et que seule la greffe chez un receveur vivant démontre le caractère "souche" d'une cellule.

Objectifs

Les vols spatiaux autour de la Terre ont des effets sur la santé qui ne peuvent être extrapolés aux séjours de longue durée dans l'espace profond. La Terre protège du rayonnement cosmique, un mélange complexe de radiations dont les éléments les plus toxiques sont les ions lourds. Des irradiations X ou photons répétées à faibles doses accélèrent le vieillissement et augmentent le risque de cancers. Mais il est impossible de transposer leurs effets aux faisceaux d'ions lourds plus toxiques pour les cellules. Ce projet vise à examiner les conséquences d'expositions à faibles doses sur la fertilité masculine (production de sperme), le système sanguin (risques de cancer) et le cerveau (dysfonctionnements). En l'absence de données, les risques encourus par les astronautes peuvent être analysés chez la souris adulte. Les effets des ions lourds seront comparés à ceux après irradiation obtenus dans la première partie du projet. Ces effets ne peuvent être identifiés dans des cultures de cellules qui ne reproduisent ni les régulations hormonales, ni les réponses inflammatoires, ni les interactions entre types cellulaires. Pour minimiser le nombre de souris, des tissus d'un même animal (testicules, moelle osseuse et cerveau) seront prélevés. L'accent est mis sur les cellules souches, présentes tout au long de la vie et essentielles à la production de cellules matures telles que les cellules sanguines et les spermatozoïdes, ainsi qu'au maintien du système nerveux. L'étude comprend des expériences de greffes afin d'examiner la capacité des cellules souches irradiées, testiculaires et hématopoïétiques, à produire respectivement des spermatozoïdes ou à induire des cancers chez les souris receveuses. Après immunohistologie des cerveaux irradiés, une reconstruction 3D permettra de visualiser et quantifier la production de neurones, les interactions cellulaires et l’inflammation afin d’améliorer la compréhension des disfonctionnements cérébraux observés. Différents prélèvements de sang et de tissus seront réalisés sur les souris euthanasiées pour mettre en évidence des différences entre souris irradiées et non irradiées via des dosages biochimiques, le suivi de marqueurs de stress, et l'analyse de l’expression géniques dans les tissus d'intérêt. Les procédures se dérouleront sous anesthésie et des antalgiques sont prévus avant et après les interventions. Une grille de suivi des points limites permettra de minimiser le stress et/ou la douleur chez les animaux greffés.

Bénéfices attendus

- L'analyse in vivo des effets de faibles doses d'irradiation reste délicate. Pour les radiations, des effets dégénératifs et cancérigènes ont été démontrés, mais les mécanismes moléculaires impliqués ne sont pas totalement élucidés. L'analyse comparée des cellules souches de 3 tissus soumis à des irradiations de natures différentes apportera des éléments de réponse complémentaires. - Il n'y a pas actuellement de données sur l'innocuité de l'exposition aux ions lourds à faible dose sur les cellules souches testiculaires. Ce travail permettra d'établir si elles conservent à moyen terme leurs propriétés de production de spermatozoïdes. Leur capacité à restaurer une spermatogenèse après exposition à un faisceau 56Fe sera un argument positif en faveur du maintien d'une fertilité masculine normale dans l'espace. Ces données préliminaires permettront d'analyser ensuite le risque héréditaire potentiel (génétique et/ou épigénétique) sur la descendance. - Une analyse immunohistologique en 3D des cerveaux des animaux irradiés permettra de préciser les types de cellules nerveuses altérées et l'influence de la réponse inflammatoire dans les disfonctionnements cognitifs. - Des expériences de greffes de cellules souches hématopoïétiques irradiées (impliquées dans la production des cellules sanguines) dans des animaux receveurs sains permettront de confirmer ou infirmer leur rôle dans le développement de leucémies - Pour chaque type de cellules souches, les analyses d'expression génique permettront de déterminer s'il existe ou non une signature spécifique des faisceaux de forte énergie par rapport aux irradiations de faible énergie, en fonction de la dose. Ces données serviront de base aux études ultérieures des effets d'une exposition chronique à de faibles doses de radiations, plus proche de la réalité mais techniquement impossible actuellement. Elles devraient permettre également d'améliorer les mesures de protection des équipages (composition des capsules, vêtements, régime alimentaire).

Procédures

Des groupes de souris mâles seront exposés une seule fois à des rayons gamma ou à un faisceau d'ions lourds et d'autres ne seront pas exposés (contrôle). Les conditions d’irradiation (en groupe, à l'obscurité avec bruit limité et sur une courte durée inférieure à10 min) induisent peu de stress et les doses d'exposition ne sont pas associées à de la douleur. Les souris réintègrent pour 7 jours leurs cages d'origine et font l'objet d'une surveillance régulière avant d'être euthanasiées. Les animaux receveurs sont préalablement stérilisés par injection d'un composé reprotoxique, suivi 24h après d'une greffe de moëlle osseuse pour maintenir leur système sanguin. Après 1 mois, les cellules souches testiculaires fluorescentes sont greffées (anesthésie chimique et durée 20 minutes). Deux mois plus tard, les testicules des receveurs euthanasiés sont prélevés et analysés pour déterminer la présence de spermatozoïdes fluorescents. Le système sanguin des souris receveuses est éliminé par une seule irradiation à forte dose et de la moëlle osseuse est greffée 24 h après (durée moins de 10 min). Les cellules souches des donneurs sont greffées 24 h après sous anesthésie gazeuse par une transfusion d’une durée de 5 min. Les animaux receveurs seront euthanasiés 4 mois plus tard pour permettre le prélèvement de tissus et organes et leur analyse.

Impact sur les animaux

- Le stress généré par la séance d'irradiation. De plus pour les souris irradiées à fort dose (dose létale, la mort est attendue entre 11 et 15 jours en absence de régénération du système sanguin. Signes préalables de souffrance : des problèmes oculaires, des dermatites, une perte de poids, une prostration, un pelage terne ou des vocalisations anormales. - La greffe hématopoïétique peut échouer chez les animaux traités par l'agent reprotoxique : perte de poids, prostration, vocalisation anormale. Après la transplantation de cellules testiculaires, ces animaux sont observés quotidiennement (sur 7 jours) afin de détecter la présence éventuelle de lésions cutanées, de réactions inflammatoires (suppuration), de signes de douleur ou de stress (poils hérissés, dos vouté, vocalisation anormale), et de signes d’infection. - Les différentes injections d'anti douleurs et anesthésiques peuvent également stresser les souris.

Devenir

Les animaux irradiés et contrôles non irradiés seront euthanasiés après 5 jours, pour permettre le prélèvement de tissus en vue d'analyses cellulaires ou génétiques, ou de greffes pour ceux exprimant la protéine fluorescente. Ces expériences sont destinées à déterminer les effets induits par l'irradiation : lésions dans l'ADN non réparées, mort cellulaire, arrêt de la multiplication des cellules et réduction des capacités de régénération des cellules souches. Les animaux receveurs de greffes intratesticulaires seront euthanasiés après 2 mois pour déterminer si les cellules fluorescentes greffées ont permis la régénération d’une spermatogenèse fonctionnelle (production de gamètes). Les animaux receveurs de greffes hématopoïétiques seront euthanasiés après 4 mois pour prélever et analyser leur moelle osseuse. En absence de production de cellules sanguines fonctionnelles à partir des cellules greffées, le décès des receveurs survient habituellement dans les 2 semaines suivant la greffe. Dès la détection de signes cliniques de souffrance, les animaux seront euthanasiés; et leur moelle osseuse sera analysée.

Remplacement

1) Les modèles alternatifs de culture de cellules souches de souris ne permettent pas de modéliser leur microenvironnement en conditions physiologiques, ni de reproduire l'absence de multiplication (quiescence) d'une grande partie du stock de cellules souches. Ces modèles de substitution ne peuvent rendre compte des régulations hormonales, et de la réponse inflammatoire susceptible d'être induite après irradiation. L’utilisation d’un modèle animal reste ici nécessaire pour évaluer l’effet des radiations sur un organisme. (2) La validation ultime du caractère "souche" des cellules ne peut être établie que par transplantation (greffe) de cellules chez un receveur, qui est le seul moyen de démontrer la capacité d'une cellule à restaurer une différenciation normale (propriété des cellules souches) en conditions physiologiques et assurer une régénération tissulaire.

Réduction

Les irradiations "corps entier" associées à l’étude de 3 tissus d’un même animal permettent de limiter notablement le nombre d’animaux impliqués dans ce projet. Un programme de modélisation prenant en compte les différents paramètres importants de l’expérience est utilisé pour estimer la taille des groupes expérimentaux. Il offre le meilleur ratio de probabilité de réussite dans la comparaison de groupes de petits effectifs par des tests statistiques classiques.

Raffinement

L’irradiation corps entier n’induit pas de de stress particulier, car elle est de courte durée et réalisée en groupe. Les animaux bénéficient de conditions d'hébergement enrichies (Tunnel, coton pour la nidification) et sont maintenus par paires. Des protocoles d’anesthésie/ analgésie sont en place pour minimiser la douleur. Un suivi hebdomadaire sera effectué et en cas de signes de souffrance (d’après une grille d’évaluation de l’état général) le vétérinaire sera alerté. Un traitement symptomatique pourra être mis en place, puis une euthanasie sera pratiquée si aucune amélioration n'est observée.

Choix des espèces

La souris est le modèle mammifère le plus fréquemment utilisé à cause de ses similarités anatomiques, physiologiques et génétiques avec l’Homme. Animal de petite taille, son temps générationnel est court. C'est également un modèle de référence en radiobiologie. Les membres des équipages exposés au rayonnement cosmique sont des adultes, donc les souris seront âgées de 8 à 12 semaines. L'étude de la spermatogenèse implique que l'ensemble des animaux soient des souris mâles. Les astronautes exposés au rayonnement cosmique sont des adultes, donc les souris seront âgées de 2 à 3 mois . Les animaux receveurs destinés aux procédures 2 et 3 auront de 7 à 9 semaines pour tenir compte des chronologies expérimentales (délai de stérilisation : 1 mois; analyse post greffe : 2 à 3 mois pour la spermatogenèse, 2 à 4 mois pour l'hématopoïese).

3 036 souris boivent une eau chargée en fongicides ou en résidus de plastique, les femelles un à deux mois avant la reproduction puis pendant la gestation et l'allaitement, leur descendance dès la vie utérine et jusqu'au jour de sa mise à mort. 752 jeunes et 752 souris âgées passent des tests d'interaction sociale et d'activité, 128 femelles gestantes subissent une chirurgie de 30 à 45 minutes pour électroporer de l'ADN dans le cerveau de leurs embryons, et 92 souris reçoivent un médicament de l'hyperactivité pour confirmer qu'elles en présentent les signes. Toutes sont tuées, tissus prélevés pour y chercher des marqueurs de pathologies neurodéveloppementales ou neurodégénératives. Le porteur affirme n'avoir observé ni douleur ni souffrance aux doses réglementaires autorisées dans l'eau potable, et place le bénéfice attendu dans une révision éventuelle de cette réglementation.

Objectifs

Les objectifs du projet de recherche sont d'étudier les effets de certains polluants fréquemment détectés dans notre environnement sur le neurodéveloppement et le vieillissement. Nous nous interessons à différents polluants: - les fongicides, très largement utilisés pour le traitement de la vigne et pour préserver les fruits de la moisissure grise après récolte. Des études scientifiques ont d’ailleurs révélé que des résidus de fongicides font partie des pesticides les plus fréquemment détectés dans l’alimentation française. Récemment, ces résidus ont été retrouvés dans les petits pots destinés à l'alimentation des bébés, mais aussi dans l'air et dans l'eau. Nous avons montré précédemment que l'exposition à 3 fongicides à la dose reglementaire, autorisée dans l'eau potable, aggrave les marqueurs de la maladie d'Alzheimer dans un modèle de souris génétiquement modifié. Notre objectif est donc d'étudier l'impact de ces composés sur le neurodevelopppement, puis au cours du vieillissement chez la souris. Notre hypothèse est que ces composés pourraient induire des altérations moléculaires lors du développement du cerveau conduisant à des défauts de comportements, voire à un phénotype de type autistique, caractéristique des pathologies neurodéveloppementales. De la même manière, nous nous intéressons aussi à 3 types de résidus plastiques : -les PET (polyethylène téréphthalate), les PVC (polychlorure de vinyle) et les PS (polystyrène) présents dans les emballages alimentaires. Des résidus type "nanoplastiques" contaminent directement les aliments ou l'eau des bouteilles. Par ailleurs, les "microplastiques" issus de la dégradation de déchets plastiques de plus grande taille, envahissent les océans et les eaux de surface type lacs ou rivières, et sont une voie d'entrée dans la chaine alimentaire. Leurs impacts sur l'environnement et la santé sont préoccupants. Notre objectif est d'étudier leurs effets sur le neurodéveloppement et le vieillissement.

Bénéfices attendus

Le projet aura des bénéfices sur la santé humaine : - identification des polluants perturbant le neurodéveloppement et le vieillissement (au niveau moléculaire, cellulaire et phénotypique). - les expositions utilisées dans notre modèle correspondent aux doses réglementaires à ne pas dépasser dans l'eau potable ou à faibles doses, en fonction des résultats obtenus, une révision de la réglementation actuelle pourrait être envisagée - si les animaux développent des phénotypes spécifiques de certaines pathologies (autisme, Parkinson, Alzheimer,TDAH), ces données permettraient d'expliquer en partie l'étiologie de ces maladies et de proposer des méthodes préventives.

Procédures

Les nuisances subies par les animaux sont les suivantes : 1) Exposition des animaux, femelles gestantes et progénitures, aux polluants environnementaux dans l’eau de boisson. Les femelles sont exposées entre 1-2 mois avant la reproduction et pendant toute la durée de la gestation, lactation, jusqu’au sevrage des petits. La progéniture est exposée in utéro, pendant la lactation, et jusqu’à leur date d’euthanasie. Nombre total d’animaux exposés dans l’étude : 3036. 2) Analyse de la morphologie de la progéniture, et tests d'observation et de comportements chez des animaux jeunes. Ces tests comportementaux sur la progéniture seront effectués dès 3 jours post-natal jusqu'à 3 mois. La durée est variable selon le test: entre 1 min pour les tests d'observation du phénotype, et jusqu'à 3 séances consécutives de 10 min pour les tests d'interactions sociales. Ces tests sont non-invasifs. Nombre d'animaux = 752. 3) Tests de comportements chez des animaux âgés à 3, 6, 9 et 12 mois. Les animaux ont 1 séance de 10 min par jour pendant 3 à 5 jours selon le test. Ces tests sont non invasifs. Nombre d'animaux = 752 animaux. 4) Des résultats préliminaires ont montré que les animaux exposés à certains polluants développent un comportement type trouble déficitaire de l’attention et hyperactivité (TDAH). Il existe un traitement médicamenteux chez l’humain pour traiter le TDAH, et notre objectif est d’administrer ce médicament aux souris afin de les soigner. Cela permettra de confirmer que les animaux ont bien un phénotype TDAH. Dans ce but, les souris subiront deux injections, une injection par test de comportement, mesurant soit l’activité locomotrice, soit l’impulsivité. Ces tests sont non invasifs et durent entre 5 min et 1h30. Nombre d'animaux = 92 animaux.5) Chirurgie sur des femelles gestantes pour marquer les cerveaux des embryons avec de l’ADN. Cette intervention va induire la production de protéines fluorescentes pour visualiser les cellules du cerveau en développement. La nuisance va durer le temps de l’intervention chirugicale, entre 30-45 min selon le nombre d'embryons à électroporer par femelle, et la durée du rétablissement des femelles opérées (7 jours). Nombre d'animaux = 768 (dont 128 femelles opérées).

Impact sur les animaux

D'après nos études conduites chez des souris adultes génétiquement modifiées (modèle Alzheimer) traitées aux fongicides pendant 11 mois, aux doses réglementaires autorisées dans l'eau potable, nous n'avons pas observé de douleurs, souffrance, perte de poids, stress, consécutives au traitement. De même, chez les souriceaux préalablement exposés aux polluants pendant la gestation, aux doses réglementaires autorisées dans l'eau potable, et analysés à 3 jours post-natal, nous n'avons pas observé d'anomalies morphologiques, de douleur ou de souffrance induites par l'exposition aux fongicides. Les nuisances attendues pour le traitement par les composés aux doses indiquées sont légères. Pour les chirurgies, les nuisances attendues sont des nuisances post-opératoires de classe modérée : douleurs, saignement suspect, mobilité (prostration éventuelle), aspect du pelage (terne, hérissé), éventuelle inflammation abdominale, infection ou problème de délivrance.

Devenir

A l'issue des 5 interventions décrites ci-dessus en 5.6.1, tous les animaux (3036) seront euthanasiés et les tissus prélevés pour analyser les marqueurs de pathologies neurodéveloppementales ou neurodégénératives.

Remplacement

Nous avons déjà étudié les effets des fongicides sur des modèles cellulaires. Nos travaux ont montré que les fongicides ciblés dans ce projet sont toxiques pour les cultures de neurones à de faibles concentrations. Nous étudions également les effets des fongicides sur les cellules souches issues de patients Alzheimer. Pour les différents plastiques, nous avons montré dans des études in vitro, qu'ils favorisaient la formation d'aggrégats de protéines. Toutefois, étudier les effets de ces polluants sur la cognition et le comportement, en lien avec des pathologies de type autisme ou des maladies neurodégénératives, telles que Alzheimer, nécéssite d'avoir recours à un modèle plus complexe telle que la souris.

Réduction

Pour ce projet nous envisageons d'utiliser 3036 souris sur la durée du projet, réparties en 5 procédures. Nous procéderons par étapes, avec des études pilotes avec un faible nombre d'animaux avant de générer l'ensemble des expériences prévues. D'autre part, les études sur le PVC et PET seront réalisées ultérieurement après les études sur le PS. Le nombre d'animaux adéquat a été calculé grâce à un logiciel permettant d'avoir des analyses robustes. Nous avons également tenu compte de notre expertise de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés tout en en gardant un nombre suffisant d'animaux pour ne pas compromettre la validité statistique des expériences qui seront menées. Seules les expériences considérées comme absolument indispensables seront réalisées.

Raffinement

Les industriels ne sont pas tenus de faire des tests de toxicité avec les fongicides à la dose maximale autorisée dans l’eau potable par l’Union Européenne et dose utilisée dans l’étude, ni pour les résidus de plastiques, car à ces faibles doses, il n'est pas attendu de toxicité. D'après nos résultats obtenus sur les fongicides, et à ces doses, il n’est pas attendu de souffrance chez l’animal. Les animaux (5/cages) seront hébergés sous surveillance quotidienne, dans un milieu enrichi, avec un accès illimité à la nourriture et à l’eau de boisson, avec ou sans polluants. Si les points limites adaptés à nos expérimentations sont atteints lors de l’expérimentation les souris seront euthanasiées. Concernant les souris qui subissent une chirurgie: l’acte chirurgical est réalisé de préférence le matin pour suivre le réveil des animaux pendant la journée et s’assurer de l’absence de complications post-opératoires. Les femelles seront anesthésiées pendant la chirugie. En post-opératoire un analgésique sera administré pour éviter la douleur. Les souris sont surveillées régulièrement pendant la période post-opératoire. Concernant les points limites pour les femelles électroporées, une grille de suivi adaptée sera mise en place avec 5 critères notés de 0 (bon) à 5 (mauvais). Si le score se situe entre 0 et 9, l'animal est considéré bien portant, entre 10 et 12, une surveillance augmentée est mise en place, et au delà de 12, l'animal est euthanasié. Cette décision est prise par le personnel formé qui réalisera la procédure.

Choix des espèces

Dans les modèles d'expositions aux polluants environnementaux pendant la gestation, la souris représente un modèle de choix, pour les raisons suivantes: - ce sont des mammifères donc le mode de transmission des polluants via le placenta et le lait est similaire à l'humain; - la reproduction et la gestation sont relativement rapides ce qui permet de générer les groupes nécessaires à l'étude assez rapidement; - le nombre de petits par portée est élevé, ce qui permet d'avoir une robustesse dans nos études comportementales, de prendre en compte le sexe dans les groupes et d'avoir des échantillons en nombre suffisant pour les analyses biochimiques et histologiques; - des études précédentes sur l'exposition aux polluants ont permis de mettre en évidence des modèles d'autisme et de TDAH chez la souris. Les souris sont donc un bon modèle de pathologies neuro-développementales et de vieillissement, c'est pourquoi nous privilégions les souris sauvages dans ce projet. Les mères seront traitées avec les polluants avant l'accouplement (1 ou 2 mois selon le polluant), puis pendant l'accouplement et la gestation. Elles seront en permanence sous traitement à la concentration résiduelle, comme c'est le cas de la population humaine exposée chroniquement aux polluants tout au long de leur vie. Les petits issus de ces portées seront soumis aux polluants à faibles doses pendant le développement (stade foetal), pendant la lactation et jusqu'à la date d'euthanasie prévue des animaux.