Recherche fondamentale

Mis à jeun douze heures, gavés une fois par voie orale, saignés à l'extrémité de la queue deux minutes plus tard : 640 souris et 320 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sans anesthésie jusqu'à la mise à mort. Le protocole vérifie si des peptides vecteurs franchissent la paroi intestinale pour passer dans le sang, une technologie que la société veut étendre du cerveau à l'intestin. Le porteur reconnaît un risque de fausse route et de complication respiratoire si le gavage est mal exécuté, et présente le recours aux animaux non-humains comme le "principal désavantage" de sa demande. Tous reçoivent une dose létale d'anesthésique, puis leurs tissus sont prélevés.

Objectifs

Ces dix dernières années, notre société et ses partenaires académiques ont réussi à identifier et développer une stratégie de vectorisation innovante, afin de proposer de l’adressage spécifique de médicaments au niveau du système nerveux central après administration parentérale. Ce transport est réalisé à l’aide de protéines ou peptides cargos qui ciblent spécifiquement les récepteurs membranaires situés aux niveaux des barrières cellulaires de l’organisme, dans notre cas, la barrière Hématoencéphalique (BHE) du cerveau. Le succès de ces travaux et les dernières collaborations internationales ont démontré tout le potentiel de notre technologie sur le développement de nouveaux traitements contre certaines neuropathies. Cet engouement a permis de développer de nouveaux axes de recherches, notamment sur certaines maladies chroniques liées à l’hygiène de vie (Cancers, Diabètes, obésités), devenues le fléau de ces 20 dernières années. C’est dans ce contexte que nous souhaitons relever de nouveaux défis et utiliser notre technologie pour franchir de nouvelles barrières cellulaires de l’organisme, cette fois-ci au niveau intestinal, en améliorant l’adressage de médicaments administrés par voie orale. Il s’agira dans cette demande de démontrer qu’après administration orale chez le rongeur, nos protéines et peptides vecteurs seront capables de résister aux contraintes et attaques du tube digestif (Enzymes, pH), puis de valider leur passage spécifique à travers la barrière épithéliale, de l’intestin vers le sang.

Bénéfices attendus

Nous souhaitons tester le potentiel d’action de nos vecteurs sur de la délivrance systémique par voir orale. Notre objectif sera donc de relever ce nouveau challenge et de transposer notre savoir-faire et technologique sur de l’application « Drug-Delivery » par voie orale. Ainsi, nous pourrions proposer de nouveaux concepts et alternatives thérapeutiques facilitant le quotidien des soignants et des patients par un meilleure accessibilité (traitements devenus trop coûteux ou trop contraignants), conservation et praticité. L’application de notre stratégie de vectorisation pourrait également servir de levier dans bon nombre de pathologies à enjeux de santé publique.

Procédures

Au cours de cette procédure, nous n'aurons pas d'anesthésie, ni d'étape chirurgicale. Les animaux seront uniquement manipulés éveillés et de manière délicate. L'absence de stress est ici un garant du succès et bon déroulement de la procédure. En point final, les animaux seront d'abord mis à mort avant le prélèvement tissulaire final. -Constitution des cohortes d'animaux : Manipulation douce et unique pour la pesée et l'annotation codale des animaux, pour une durée de 2 minutes. -Administration par voie orale : Gestes et manipulations ultra-précis pour réaliser correctement cette étape. Administration simple et unique sans intervention parentérale, pour une durée de 1 minutes. -Prélèvements sanguins intermédiaires : A l'extrêmité de la queue afin d'y collecter quelques gouttes de sang. Geste contentionné expert et précis qui réduit considérablement le stress. Durée Approximative 2 minutes. -Mise à mort pour prélèvements (sédatoin à dose létale + contastation du décès) : Contention manuelle rapide et précise pour réaliser l'injection intrapéritonéale du mélange d'anesthésique à dose létale.

Impact sur les animaux

Les possibles effets ou effets indésirables sont ici listés pour chacunes des manipulations/expérimentations. -Transport et adaptation : Le transport est une source de stress non négligeable dont il faudra tenir compte avant d'envisager les tests. -La stabulation peut engendrer un temps d'adaptation, du stress, ayant un impact sur l’alimentation et le comportement, donc la prise de poids. -Mise à jeun des animaux : Nécessaire à la bonne réalisation de l'étude, les animaux seront mis à jeun 12h avant le début des administrations. Cette phase relativement courte, induira un léger stress transitoire, mais n’aura pas de réel impact sur la santé des animaux. En effet, les données de la littérature démontrent une absence d’effets significatifs sur le poids et l’activité métabolique en cas de mise à jeun inférieure à 18h. -Administration per os (Gavage par voie orale) : Réalisée sur animal éveillé et contentionné manuellement, il est ainsi immobilisé, ce qui génère un certain stress. L'acte de gavage est une gêne évidente mais très brève. Si le geste n’est pas bien réalisé, il y a cependant un risque notable de fausse route et de complication respiratoire. -La manipulation pour la réalisation des prélèvements sanguins intermédiaires : De même que pour le gavage, cette étape sera réalisée sur animal éveillé, après immobilisation en contention spécialisée. L'animal n'aimant pas être coincé, c'est une source de stress (≤2 min). -La manipulation pour l’administration d’une dose létale d’un mélange d’anesthésique : Source de stress au moment de l'injection intrapéritonéale, le geste rapide sera totalement maîtrisé par le manipulateur.

Devenir

L'issue de l'étude étant le prélèvement de tissus, tous les animaux seront mis à mort en point final, par administration d'un anesthésique à dose létale.

Remplacement

Afin de mener à bien notre projet, nous n’utiliserons que nos vecteurs préalablement investigués sur des études in vitro (cellules) ainsi qu’in vivo sur des récents suivis pharmacocinétiques et de biodistributions. Ces premières séries de tests amonts ont notamment permis de vérifier le maintien des interactions avec les récepteurs cellulaires cibles (cultures cellulaires, mesure d'affinité pour le réceptuer cible), mais restaient insuffisantes pour prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques (mécanistiques, immunitaires, métaboliques et d'éliminations). Afin de transposer notre modèle de pharmacologie pour de la voie orale nous devrons absolument envisager de réaliser notre administration orale sur le petit animal de laboratoire, ici le rongeur (rat et souris). En effet, la physiologie complexe du tube digestif nous impose l’utilisation de modèle vivo. Des modèles prédictifs ex vivo existent mais nécessitent également le sacrifice d’animaux, sans pour autant intégrer l’ensemble des mécanismes physiologiques périphériques précédemment cités. Afin d’éviter une utilisation encore plus importante d’animaux, notre procédure simple, sur de courtes cinétiques, avec des prélèvements optimisés (intermédiaires et finaux), restera la plus avantageuse en termes de résultats scientifiques pour un nombre d’individus utilisé. Le choix du modèle rongeur se justifie comme étant pour l’heure le 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques, sans trop de contraintes d’hébergement, ni de manipulations. Son utilisation sous forme de faibles cohortes permet d’exploiter au maximum les résultats par l’obtention de données statistiques significatives. Malheureusement, il n’existe pour le moment aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes ces réponses ou suffisamment complexe et informel tel que les organoïdes ou sphéroïdes. Dans notre cas, le principal désavantage de cette demande reste donc le recours indispensable à l’utilisation d’animaux. Il s’agit maintenant de définir à minima et au plus juste le nombre d’individus à utiliser.

Réduction

Le nombre total d’animaux sera réparti sur de petits groupes de n=4 (2 mâles/2 femelles), à raison de maximum 5 groupes par test et 8 études par an, ce qui représente 160 individus/an (80 mâles + 80 femelles) pour chacun des fonds et espèces utilisées. Tel que largement décrit dans la littérature pour un modèle « oral delivery », nous utiliserons dans un premier temps le modèle souris sur fond albinos, à raison de 160 individus par an. En parallèle nous voudrons vérifier nos données obtenues sur un autre modèle souris, de fond consanguin, pour un nombre équivalent d’animaux (maximum 160/an). En effet ce modèle utilisé dans nos précédentes études Pharmacologiques sera précieux pour de futurs essais sur récepteurs humanisés en vue d’une transposition à l’homme. Enfin, le modèle souris présentant certaines divergences fonctionnelles et un modèle plus développé, sera indispensable dans nos investigations. Nous travaillerons à la suite des deux précédents, sur rats de fond albinos standard, pour un gros maximum de 160 individus/an. Il est important de noter que pour chaque espèce, ce nombre total d’animaux sera mixte à 50/50 entre mâles et femelles (cages séparées). Pour une analyse statistique, le faible « n » (4 individus), sera suffisant et nous orientera vers des modèles non-paramétriques. Sur de l’expérimentation in vivo, tous les paramètres ne sont pas maîtrisés, et sont basés sur des populations aléatoires de souris ou chaque animal présente des variables individuelles. En fin de procédure, une liste ciblée de tissus à prélever nous évitera une utilisation abusive et inutile d’animaux et permettra d’optimiser la procédure sur plusieurs types de post-expérimentations. La réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires (Maximum 1 prélèvement caudal/individu ≤50 μl) en cours de cinétique, permet d'obtenir des données précieuses sur le passage systémique de nos candidats, en plus du prélèvement en point final, ce qui va également dans le sens d'une optimisation et réduction du nombre d’animaux.

Raffinement

La formation initiale et l’expérience du personnel sont nécessaires pour appréhender les moindres signes et/ou comportements caractéristiques d’une douleur ou gène chez l’animal (Annexe 2 : grille scores et points limites). Nous porterons une attention particulière à la préparation amont de l’expérimentation. Elle regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux, laquelle sera au minimum de 14 jours dès réception. 7 jours avant les administrations, les animaux seront sortis de l’hébergement conventionnel pour aller dans une pièce cyclée spécifique rats ou souris (cyclée12h/12h), insonorisée, en armoire ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Ils sont maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), dans la même cage (taille standard pour portoir ventilé + couvercle à filtre), un maximum de 2 individus par cage (car groupes n=4 mixtes de 2 mâles + 2 femelles), litières (copeaux de bois) et double raffinement (maison en plastique + cartons déchirés). Les animaux y seront visités régulièrement afin d’être sensibiliser à l’expérimentateur. A J0, les manipulations et administrations se feront sur animaux éveillés, il n’y aura pas d’anesthésie en cours d’étude jusqu’à la mise à mort en point final. En cours d’étude, les pesées, administrations et prélèvements intermédiaires de sang seront précis et rapides (≤ 2min). Des points limites seront malgré tout établis, afin de pouvoir répondre à une situation d’urgence. En point final, une injection létale d’anesthésiques en intrapéritonéale permettra une mise à mort rapide des animaux sans stress ni douleur. Nous n’utiliserons ici que des animaux couramment utilisés en recherche pour des études de pharmacocinétiques, sur fonds albinos ou consanguins et non génétiquement modifiés.

Choix des espèces

Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, pratique pour les études de pharmacologies et comportementales, elle est donc idéale pour la mise en place de premières études de pharmacocinétiques (groupes de 4 individus). A l’heure actuelle, faute d’alternatives de remplacement, le modèle rongeur (souris et rat), reste le seul modèle accessible de « petit mammifère » dont la physiologie est bien connue et relativement proche de l’homme. Par sa petite taille, Il devient également très intéressant pour la balance pharmacologie/toxicologie (bénéfices/risques) et une diminution des posologies. Les animaux seront utilisés pour réaliser des cinétiques pharmacologiques périphériques et des échantillonnages de sang et tissus. Pour notre procédure et les trois lignées d’animaux (rat x1 et souris x2) nous utiliserons des animaux dits « jeunes adultes », ayant une moyenne de 8 à 10 semaines pour les souris et 6 à 8 semaines pour les rats. A cet âge, nous limitons les variations inter individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Cet âge présente un poids moyen de 25-27g environ chez la souris et 120-140g chez le rat, ce qui s’avère plus économique et mois risqué en termes de posologies par rapport à des animaux plus âgés (réduction des doses).

Certains poissons subissent une montée de la température de l'eau jusqu'à perdre l'équilibre, pendant deux heures au maximum, pour déterminer leur température critique. 2 000 chevaines et spirlins pêchés dans le Rhône vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 1 800 tués pour l'analyse de leurs cellules et 200 relâchés sur leur lieu de capture. Chaque individu est anesthésié pour être marqué, puis à chaque transfert entre bassins, et reste isolé jusqu'à vingt-quatre heures dans un tunnel de nage. Le porteur inscrit ce travail dans un objectif de conservation des espèces du Rhône, et mentionne 800 poissons supplémentaires tués sans expérimentation préalable, qu'il choisit de ne pas comptabiliser dans le tableau récapitulatif.

Objectifs

Une augmentation de la température environnementale peut entraîner des conséquences dramatiques sur les organismes, notamment chez les animaux ectothermes, dont la température corporelle dépend directement de la température ambiante. Ce projet vise à comprendre comment les poissons d’eau douce vont réagir face au réchauffement global. En effet, une augmentation de la température de l’eau entraine une augmentation des dépenses énergétiques des organismes, ayant pour conséquences directes une diminution de la croissance et de la reproduction. Depuis plusieurs années, le réchauffement de la planète est un phénomène qui s’accélère et donc les organismes doivent mettre en place des mécanismes adaptifs plus rapidement s’ils veulent survivre. Pour ce qui est des réponses à la contrainte thermique, 2 principales hypothèses se dégagent : (1) les individus vivant dans des milieux relativement chauds pourraient être plus résistants et mieux adaptés au réchauffement et aux périodes de stress thermique par rapport aux individus vivant dans des milieux plus frais ou (2) le fait de vivre dans des conditions thermiques suboptimales pourrait rendre les organismes ectothermes plus sensibles aux stress subséquents. Cette étude a pour but de définir des températures de tolérance pour les espèces du Rhône et de mettre en lumière les mécanismes d’adaptation à long terme et/ou d’acclimatation plus rapide face à une augmentation des températures. Afin de pouvoir étudier ces réponses physiologiques, deux espèces de poissons seront utilisées comme modèles expérimentaux : le Chevaine, espèce eurytherme présente partout dans le Rhône et le Spirlin, espèce plus abondante en aval des centrales nucléaires productrices d’énergie (CNPE), là où l’eau est plus chaude. Cette zone plus chaude pourrait être considérée comme une condition future étant donné le réchauffement actuel. Donc, étudier les différences d'adaptation entre les populations en amont et en aval s’avère pertinent. Le projet se fera le long du Rhône selon un gradient nord sud et donc les échantillonnages se feront sur 5 sites ; Brégnier-Cordon (nord), en amont et en aval de la CNPE du Bugey, et en amont et en aval de la CNPE du Tricastin (sud) afin de pouvoir comparer les capacités d’acclimatation et les préférences thermiques des différentes populations selon leur lieu d’origine.

Bénéfices attendus

L’étude des conséquences du réchauffement climatique sur la physiologie des poissons d’eau douce est au centre des préoccupations du grand public, des instances gouvernementales et des chercheurs. Ce projet s’inscrit directement dans cet axe d’intérêt, et les résultats obtenus permettront notamment de donner des réponses concrètes sur les effets d’une augmentation de température de l’eau afin de réfléchir à des directives de conservations des écosystèmes basées sur des données physiologiques. Cette étude va définir des températures de tolérance pour les espèces du Rhône et potentiellement permettre de mettre en lumière les mécanismes d’adaptation et d’acclimatation face à une augmentation des températures. De plus, comme nous travaillons sur une espèce eurytherme (chevaine) et une que l’on retrouve de plus en plus en aval des centrales thermiques (spirlin), si ces poissons ont du mal à s’adapter au réchauffement des températures alors nous pouvons supposer que cet échauffement entraînera des conséquences d’autant plus délétères pour des poissons qui supportent moins bien le réchauffement et les variations de température. Donc, ce projet a non seulement un but de caractérisation des adaptations à la température, mais aussi un but de conservation d’espèces plutôt endémiques du Rhône. Le protocole de CTmax permet de définir la température maximale de tolérance thermique, qui n’a jamais été documentée pour les deux espèces étudiées ici. Les protocoles de mesures croisées (répétition de 3 performances de nage à 3 différentes températures) sont indispensables pour élucider les mécanismes d’acclimatation et les réponses aigues aux différentes températures, et le métabolisme énergétique pourra être ainsi abordé selon une double approche in vitro et in vivo. En conclusion, cette étude permettra de caractériser les mécanismes adaptatifs mis en place chez différentes populations de poissons distribuées selon le gradient naturel « haut-Rhône » froid et « bas-Rhône » plus chaud d’une part et selon l’amont ou l’aval des deux CNPE d’autre part, mettant en exergue des variations environnementales provenant directement d’activités anthropiques. Ainsi, ce projet a pour but de participer aux efforts de conservation de la biodiversité et via une connaissance accrue des capacités d’adaptation de ces espèces, permettant de mieux appréhender comment ils pourraient réagir face au changement climatique.

Procédures

Suite à leur prélèvement en milieu naturel, tous les poissons seront acclimatés à l’animalerie et stabulés dans des conditions adaptées à leur espèce. Les poissons seront soumis à une anesthésie / analgésie afin de les implanter avec des marques pour les individualiser. Cette intervention dure au maximum 15 minutes par poisson. Les poissons seront ensuite soumis à une période de pré-conditionnement thermique (2 jours à 6 semaines selon la procédure). A chaque manipulation (lors des transferts entre les aquariums de stabulation et les enceintes expérimentales), les poissons seront légèrement anesthésiés afin de limiter le stress du déplacement. Cette anesthésie ne fera pas effet pendant plus d’une minute sur le poisson. Certains poissons subiront une augmentation de la température de l’eau jusqu’à perte d’équilibre (3h). Certains poissons seront mis à mort après une stabulation courte à l’animalerie. Certains poissons subiront des tests de préférence thermique (12h) puis 3 tests de performance de nage (

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables de ces protocoles pourrait être un niveau de stress accru faisant suite à la pêche, à la stabulation dans un nouveau milieu, et/ou aux expérimentations. Cette augmentation du stress peut s’exprimer via l’apparition d’infections chez les poissons. En effet, les risques d’infections sont plus hauts que la normale car comme les poissons viennent de milieux naturels, on ne connaît pas leur histoire et ce qu’ils auraient pu rencontrer dans leur habitat. Un autre point de surveillance sera lié à la période d’isolement des poissons (entre 2h et

Devenir

200 individus seront replacés en liberté sur leur lieu de capture. 800 poissons seront euthanasiés sans expérimentation préalable et seront utilisés post-mortem pour la caractérisation des mécanismes cellulaires in vitro. 1800 individus seront euthanasiés pour la caractérisation des mécanismes cellulaires in vitro.

Remplacement

A ce jour, seule l’expérimentation sur animaux permet de réaliser une étude intégrative qui prend en compte l’ensemble de l’organisme et ses réponses physiologiques, surtout lorsqu’il s’agit d’animaux sauvages. Cela permet notamment de caractériser les interactions complexes entre les tissus et leurs fonctions cellulaires. Cette vision globale est indispensable pour étudier de façon complète, les réponses métaboliques de l’animal face à son environnement.

Réduction

Le nombre de poissons a été réduit au minimum et défini au seuil de la pertinence scientifique et statistique, compte tenu de l’étendue de la variabilité interindividuelle des processus étudiés dans cette étude. En effet, une forte variabilité interindividuelle est attendue du fait du brassage génétique et de l’impact des différents facteurs environnementaux du milieu naturel. La taille des échantillons a été ainsi définie pour permettre une analyse statistique fiable. Pour ce qui est de la procédure expérimentale pour obtenir la température critique maximale (CTmax), minimum 20 poissons par endroit d’échantillonnage sont nécessaires car comme expliqué ci-dessus, une forte variabilité interindividuelle peut entrer en jeu. Donc 5 endroits x 2 espèces x 20 individus = 200 poissons pour la CTmax au total. Pour les mesures de bioénergétique sur populations naturelles, il y a 5 endroits x 4 saisons x 2 pêches /an x 1 espèce (uniquement les spirlins) x 20 individus = 800 individus. Mais au vu de la courte durée de stabulation au sein de l’EU, ces individus utilisés uniquement post-mortem ne seront pas comptabilisés dans le tableau récapitulatif. Pour ce qui est de la procédure d’acclimatation à la température, 1800 poissons seront utilisés, soit 1200 spirlins (5 endroits x 2 pêches/an x 2 ans x 20 individus x 3 groupes) et 600 chevaines (5 endroits x 1 pêche/an x 2ans x 20 individus x 3 groupes) ; 200 poissons supplémentaires sont prévus afin de palier d’éventuelles morts spontanées.

Raffinement

Lors des protocoles non invasifs in vivo (mesure de la consommation d’oxygène associée aux performances de nage et tests comportementaux), un des principaux objectifs est de limiter au maximum le stress et la douleur des animaux. Chaque geste contraignant (mesure et placement des poissons dans les tunnels de nage) sera réalisé sous anesthésie légère, suivi par un temps d’acclimatation de 12h dans le tunnel de nage, avant le protocole de nage (Ucrit) ou de 2h dans les arènes de choix. Après chaque expérience, les poissons seront replacés dans leur aquarium de stabulation et toutes les précautions seront prises pour leur éviter toutes nuisances visuelles et sonores. Les poissons sont maintenus dans des aquariums de 60L ou 90L en densité adaptée à leur espèce. Les spirlins et les chevaines juvéniles sont des poissons vivant en banc. Ils seront donc maintenus à plusieurs dans les aquariums (environ 30 par bac) afin d’optimiser les conditions de stabulation. Des cachettes adaptées (tubes de gros diamètres leur permettant de se cacher en banc), des plantes artificielles et du gravier sont disposés dans chaque aquarium. Un système de pompe filtrante assurera également une circulation d’eau bullée continue dans les aquariums. Les poissons seront nourris une fois par jour, avec des cubes de moules hachées avec du mix (différentes larves de moustiques, daphnies et de la verdure (épinards, spiruline)) et lors du nourrissage, leur comportement est observé. En effet, si un poisson ne se nourrit pas, des mesures seront prises à son égard. Une observation biquotidienne sera réalisée par le personnel animalier et les expérimentateurs afin de veiller au bien-être des animaux depuis leur arrivée à l’animalerie jusqu’à l’euthanasie. Les états de santé et de bien-être des animaux seront ainsi évalués en prenant en compte les signes cliniques et comportementaux selon des grilles d’évaluation afin de définir des points limites adaptés. Dès l’apparition de signes cliniques de mal-être, les animaux seront sortis du protocole et remis en conditions standard d’élevage. Dans le cas où des signes de douleur ou de mal-être devaient persister au-delà de 24 heures après la mise en stabulation, les animaux seront euthanasiés selon la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

Le chevaine est une espèce plutôt ubiquiste du Rhône, généraliste et eurytherme avec un panel de tolérance thermique large. Le spirlin est une espèce que l’on retrouve de plus en plus en aval des centrales thermiques ce qui laisse supposer une bonne adaptation à des variations de températures. L’étude de cette espèce dans des environnements thermiques élevés permettra d’évaluer précisément ses capacités d’acclimatation et d’anticiper l’impact délétère du réchauffement sur des espèces moins adaptatives. De plus, ces espèces sont en statut préoccupation mineure, sur la liste rouge UICN (Union internationale pour la conservation de la nature), donc les pêcher n’aura pas de grand effet sur les populations naturelles. Enfin, les organismes avec qui nous allons pêcher font des suivis de populations et sont donc au courant des statuts des différentes espèces dans le Rhône. Aucun prélèvement n’aura d’impact négatif sur les populations naturelles. Les spirlins utilisés sont des spirlins adultes. Leur petite taille (30 cm) étant incompatible pour une telle étude, seuls des chevaines juvéniles seront employés.

Greffées sous la peau avec des fragments de tumeurs prélevées sur des patients, 2 420 souris âgées de quatre à cinq semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux qui développent une tumeur sont tués, ceux qui n'en développent pas sont gardés un an au maximum puis tués aussi, faute de pouvoir survivre hors d'un environnement dépourvu de pathogènes. Le porteur classe l'ensemble en souffrance modérée tout en listant parmi les signes surveillés la nécrose tumorale cutanée, le prolapsus anal, le dos courbé et le "masque de la douleur". Le projet alimente une banque de 162 modèles tumoraux caractérisés, que l'établissement entend élargir aux tumeurs rares et mettre à disposition d'autres équipes.

Objectifs

Nous avons une collection de 162 tumeurs humaines issues de patients. Cette collection regroupe 5 types de tumeurs : sein, ovaire, pancréas, côlon et sarcomes. Une partie seulement de ces modèles a été caractérisée de façon complète. Ces modèles sont très utiles pour les études de nouvelles molécules anticancéreuses car ils conservent bien les caractéristiques de la tumeur du patient dont ils sont issus. Dans le cadre de ce projet, notre objectif est à la fois d’optimiser la collection existante et de la caractériser. De plus nous souhaitons développer de nouveaux modèles tumoraux, certains très rares, que nous ne possédons pas actuellement dans la banque. A termes, nous souhaitons pouvoir mettre à disposition de chercheurs l’ensemble des modèles pour des projets de recherche en oncologie.

Bénéfices attendus

Les modèles tumoraux développés sont précieux pour tester les réponses à différentes molécules anti-cancéreuses. Ils reproduisent fidèlement les caractéristiques d’une tumeur humaine, les résultats obtenus sur souris peuvent être considérés comme des transpositions fiables de la réponse chez les patients. Notre collection vise à disposer de modèles représentatifs de cancers agressifs et difficiles à soigner. Cette collection de modèles parfaitement caractérisés représentera un outil de recherche pré-clinique puissant.

Procédures

Chaque animal subira une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et sous anti-douleur. La durée de l’intervention est en moyenne de 5 minutes anesthésie, chirurgie et réveil compris. En cas de signe clinique pouvant évoquer une toxicité, un prélèvement sanguin (durée < 20 secondes / prélèvement) sera réalisé pour des analyses.

Impact sur les animaux

La chirurgie de greffe de fragments tumoraux peut engendrer chez les animaux : - Douleurs - Faibles pertes de poids - Déshydratations - Risque d’infection au site d’incision Tous les animaux seront surveillés quotidiennement avec une attention particulière quant à l’apparition de signes cliniques pouvant être liés au développement tumoral : - Nécrose tumorale cutanée - Diarrhées - Déshydratations - Dos courbé - Prolapsus anal - Masque de la douleur - Perte de poids

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux ayant développé une tumeur seront euthanasiés. Les animaux n’ayant pas développé de tumeur seront conservés et suivis pendant un an maximum, délai au delà duquel ils seront également euthanasiés car ne pouvant survivre que dans un environnement dépourvu de pathogènes.

Remplacement

Il n'existe pas de possibilité de remplacement. Dans la cadre de ce projet, l'utilisation d'animaux à des fins expérimentales est indispensable. Il n'existe en effet pas d'alternative permettant de reproduire aussi fidèlement les caractéristiques des tumeurs de patients.

Réduction

Le nombre d'animaux sera réduit au minimum mais il doit cependant être suffisant afin que les tumeurs générées reproduisent fidèlement les tumeurs de patients.

Raffinement

Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état des souris utilisées sera assurée en prenant en compte tous les points limites établis dans le cadre de ce projet. Les greffes sont réalisées sous anesthésie gazeuse et sous anti-douleur, afin de réduire tout stress et la souffrance de l’animal. Les antidouleurs pourront être utilisés si nécessaire. L’espace de vie de l’animal est diversifié et enrichi afin d’assurer son confort de vie.

Choix des espèces

La souris est un mammifère suffisamment proche de l’espèce humaine. C’est un bon modèle pour l’évaluation de la croissance des tumeurs d’origine humaine. Sur la base de notre expérience dans le domaine, pour favoriser la prise de greffe, les animaux utilisés seront âgés entre 4 et 5 semaines, car la prise de greffe est optimisée à cet âge.

Pour voir si un anti-inflammatoire ajouté à l'immunothérapie retarde le cancer du foie, 104 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à des semaines différentes selon leur groupe. Deux jours après leur naissance, elles sont séparées de leur mère le temps d'une injection de streptozotocine, puis nourries au régime gras dès le sevrage jusqu'à développer une cirrhose puis un carcinome hépatocellulaire à partir de la seizième semaine. Suivent de quatre à quarante injections dans le ventre sur animal éveillé selon les groupes, trois anesthésies gazeuses, deux scanners du foie et deux allers-retours de cinq cents mètres entre l'animalerie et le service d'imagerie, le porteur qualifiant d'"indolore" cette évolution vers le cancer. La seule limite décrite pendant l'examen tient au monitoring respiratoire, l'animal en détresse étant retiré de l'appareil, soigné et surveillé jusqu'à son réveil.

Objectifs

Le cancer du foie est le 6° cancer le plus fréquent et la 3° cause de décès par cancer dans le monde. Il survient sur un foie avec une inflammation et en situation de cirrhose. Le traitement de référence est une immunothérapie mais elle ne fonctionne que chez un patient sur 3. Aussi, nous souhaitons voir si un traitement de l’inflammation, déjà efficace dans d’autres pathologies inflammatoires, combiné à l’immunothérapie, permettra de retarder ou éviter l’évolution vers le cancer dans un modèle de souris mâles développant tous les stades d’évolution depuis la cirrhose jusqu’au cancer du foie. Des imageries par scanner seront réalisées pour évaluer l’effet préventif, ou curatif, ou complémentaire de l’immunothérapie. Ce projet sera réalisé au sein de deux établissements utilisateurs, un établissement pour l'hébergement et un établissement spécialisé dans les imageries.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de comprendre et étudier les mécanismes bénéfiques d’un médicament régulant l’inflammation sur le cancer du foie avancé développé sur un foie gras et inflammé, et d’évaluer sa complémentarité avec l’efficacité antitumorale de l’immunothérapie.

Procédures

Les interventions suivantes seront réalisées au sein de l'établissement utilisateur EU1 : - La maladie du foie gras sera provoquée chez les souris en leur injectant un antibiotique, appelé streptozotocine, juste après leur naissance, et cela prendra seulement 5 secondes par souris. Ensuite, après avoir été sevrées, elles recevront une alimentation riche en graisse. - Le traitement par le médicament régulant l’inflammation du foie se fera par injections dans le ventre 4 jours par semaine en suivant un plan spécifique pour chaque groupe de souris. Chaque injection prendra environ 3 secondes par animal. - Le traitement par immunothérapie se fera par des injections dans le ventre 1 jour par semaine avec des injections à partir de la semaine 18 pour les groupes d’étude concernés. Les interventions suivantes seront réalisées au sein de l'établissement utilisateur EU2 : - Une imagerie du foie sera réalisée en utilisant un scanner, pendant que les souris seront sous anesthésie générale. Cette procédure sera effectuée par du personnel qualifié et avec le matériel approprié pour les souris, incluant une plaque chauffante et un suivi des signes vitaux. Cela prendra entre 2 minutes par souris. L'agent de contraste pour l’imagerie sera administré qu’une seule fois pour toute la durée de l’étude.

Impact sur les animaux

- Injection à J+2 de vie + séparation du souriceau de la mère de quelques minutes classée légère. - Au sevrage, régime riche en graisse provoquant l’évolution de la maladie jusqu’au carcinome hépatocellulaire à partir de la semaine 16 classé légère. - 4, 16, 20, 40 injections intra-péritonéales sur souris vigiles selon les groupes d’étude classée modérée. - 3 anesthésies gazeuses par individus de 5 minutes chacune (1 pour réaliser une injection de produit de contraste en veine caudale + 2 pour réaliser les imageries) classée légère- 2 aller-retours entre l’animalerie centrale et animalerie d’imagerie, distante de 500 mètres classée légère.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort à différentes semaines selon les groupes d’étude et les procédures.

Remplacement

A nos jours, il n’existe aucune approche in vitro pour étudier l’apparition et l’évolution de la stéato-hépatite métabolique vers la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire. Une étude chez l’animal est indispensable pour mettre en évidence l’effet de l’inhibition d'un récepteur de l'immunité associé ou non à l’immunothérapie sur l’ensemble des paramètres contribuant au développement de cancer du foie.

Réduction

Nos résultats préliminaires de la mise en place de ce modèle nous ont permis de calculer et de fixer le nombre de 104 souris mâles de façon optimale, en nous appuyant sur une méthode statistique adéquate. L'utilisation de l'imagerie permet donc de limiter le nombre d’animaux utilisés, car non invasive.

Raffinement

Dès leur réception, les souris parents auront une période d’acclimatation d’une semaine pour s’adapter à leur nouvel environnement avant de réaliser les accouplements. Ils seront hébergés dans une animalerie dotée de tous les paramètres nécessaires (température, hygrométrie, filtration de l’air, enrichissement) à leur bien-être. Une observation quotidienne du bien-être animal avec une grille d’évaluation de l’état des animaux et une pesée tous les 3 jours seront réalisés pour tous les animaux tout au long du projet. Les injections chez les souriceaux mâles puis au long de l’étude seront réalisées par un zootechnicien expert sur animal vigile. Le régime riche en graisse administré à partir de la 4ème semaine de vie (dès le sevrage), conduit à l’évolution de la maladie jusqu’au cancer du foie de manière indolore. Après la phase de sevrage, les souris seront hébergées en petit groupe cage avec des divers types d’enrichissements, tels que : des cylindres de coton et/ou des nids de papier, afin de permettre aux souris de construire des nids confortables, ainsi que des Mini Dômes comme refuge. Des petits bouts de bois non toxiques seront fournies afin de permettre aux souris d'assouvir leur besoin de ronger. Des tunnels ou des abris afin de permettre aux souris de se cacher et d'explorer leur environnement. Les stades d’évolution de la maladie seront évalués de manière non invasive par scanners, sous anesthésie générale sans douleur, avec une seule injection du produit de contraste pour toute la durée du suivi sur plusieurs semaines. Durant l’examen, les animaux seront surveillés par un monitoring respiratoire. Si l’animal présente une détresse respiratoire, il sera immédiatement retiré de l’appareil, soigné et surveillé jusqu’au réveil.

Choix des espèces

Les principaux modèles des maladies chroniques du foie ont été validés internationalement sur des souris ou des rats. Nous avons une bonne connaissance des modèles murins et de plus, le choix de l’espèce « souris » se justifie par l’existence du modèle invalidé génétiquement pour le récepteur d’intérêt permettant d’étudier le(s) rôle(s) spécifique(s) de l’inflammation dans la maladie du foie gras non alcoolique et du cancer du foie. Les souriceaux débuteront le protocole à J+2 de vie et seront issus de souris gestantes et le termineront à la semaine 20 ou 22 selon les groupes d’étude.

Une injection de cellules cancéreuses sous la peau sous anesthésie, cinq injections dans le ventre sur animal éveillé, une injection dans une veine, une injection directement dans la tumeur, neuf séances d'imagerie : 1 600 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La tumeur qui pousse peut provoquer des douleurs, une gêne, une nécrose et une perte de poids, et les anesthésies répétées de l'imagerie ajoutent fatigue et stress. Le porteur présente le suivi par fluorescence comme non invasif et fait valoir que chaque animal est son propre témoin, argument de réduction avancé pour un projet qui en utilise 1 600. Sur la raison de la mise à mort, il écrit que les souris seront tuées parce qu'elles auront une tumeur sous la peau.

Objectifs

Le développement de nouvelles sondes d’imagerie en cancérologie, que ce soit pour la détection de tumeur ou pour la thérapie (ou les 2 combinés), est en plein essor. Afin d’étudier leur potentiel thérapeutique et leur devenir dans l’organisme une fois injectées, une étude préclinique est nécessaire.

Bénéfices attendus

Evaluer le potentiel diagnostic et/ou thérapeutique de nouvelles sondes d’imagerie en préclinique dans le but de développer de nouvelles thérapies dirigées contre le cancer ou de nouvelles sondes améliorant le diagnostic.

Procédures

Injection sous la peau sur animal anesthésié : injection de cellules cancéreuses, durée 1 minute, geste réalisé 1 fois. Injection dans le ventre sur souris vigile : durée 10 secondes, geste réalisé 5 fois. Injection dans la veine sur animal anesthésié : durée inférieur à 1 minute, geste réalisé 1 fois. Injection dans la tumeur sur animal anesthésié : durée 30 secondes, geste réalisé 1 fois. Imagerie : 1 min, 9 fois.

Impact sur les animaux

Les nuisances peuvent provenir de : 1. L’injection des cellules cancéreuses sous la peau : infection au niveau du site d’injection. 2. La présence d’une tumeur : douleur, gêne occasionnée, nécrose. Perte de poids liée à la croissance tumorale. 3. Suivi en imagerie : fatigue et stress liés aux anesthésies répétées, stress lié à la contention. Mauvaise réaction suite à l’injection des sondes d’imagerie.

Devenir

Les souris seront euthanasiées car elles auront une tumeur sous la peau.

Remplacement

Nous souhaitons développer de nouvelles sonde d’imagerie qui permettraient d’améliorer le diagnostic et/ou la thérapie dans le cadre du cancer. Même si le potentiel thérapeutique, la validité de la sonde et l’absence de toxicité seront testés en amont sur des modèles de cultures cellulaires ou d'organoides quand cela est possible, la finalité est le test sur des modèles animaux avant d’envisager un passage chez l'homme.

Réduction

Les sondes seront préalablement testées et validées in vitro avant d’être injectées à l’animal. Seules les sondes validées seront utilisées. Le suivi se fait par imagerie de fluorescence qui est une technique d’imagerie non invasive permettant de faire un suivi du début à la fin sur un même animal. Chaque animal est son propre contrôle.

Raffinement

Les souris seront acclimatées pendant 7 jours après leur arrivée dans l’animalerie pour leur permettre de s'habituer à leur nouvel environnement. Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (tunnel, maison, paille), dans une environnement contrôlé en température et en hygrométrie. Les étapes du projet sont réalisées sur animal anesthésié et lors de l’anesthésie l’animal est maintenu sur un tapis chauffant. Les animaux sont surveillés par le personnel de l’animalerie et par l’expérimentateur. Des points limites ont été mis en place afin de limiter les possibles douleurs chez l'animal.

Choix des espèces

L'imagerie optique est plus sensible et facilement réalisable sur le petit animal tel que la souris. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, entre 8 et 12 semaines. A cet âge les souris ont un poids et une taille raisonnable permettant leur manipulation.

Le flanc rasé sous anesthésie gazeuse, 176 souris reçoivent une injection de cellules tumorales de pancréas sous la peau, puis deux ou trois injections d'anticorps dans l'abdomen. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à l'issue, tumeurs, rates et ganglions prélevés. Il s'agit de tester l'inhibition de trois composants d'une voie moléculaire soupçonnée de faire progresser le cancer du pancréas et de le rendre résistant aux immunothérapies. Ni la voie, ni les protéines, ni les anticorps ne sont nommés, et le nombre de souris par groupe est dit défini "à minima" sans qu'aucun chiffre ni calcul n'apparaisse.

Objectifs

Le cancer du pancréas touche près de 500.000 personnes chaque année, et est la 4e cause de décès par cancer dans le monde. Malgré la révolution apportée par les immunothérapies dans certains types de tumeurs, les cancers de ces patients sont généralement résistants à ces traitements. Afin de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques, il apparaît indispensable de comprendre les mécanismes moléculaires supportant la progression de ces cancers. Nos données préliminaires, ainsi que les connaissances dans d’autres types de cancers, suggèrent qu’une voie particulière pourrait jouer un rôle crucial dans la progression du cancer du pancréas et la résistance aux immunothérapies. Nous souhaitons donc investiguer l’effet de l’inhibition de trois composants de cette voie dans la progression de ces cancers, dans un modèle de souris.

Bénéfices attendus

Ces travaux pourraient permettre d’identifier un nouveau mécanisme moléculaire permettant la progression du cancer du pancréas, et l’échappement au système immunitaire, constituant de fait une cible thérapeutique potentielle.

Procédures

- Rasage du flanc des souris sous anesthésie gazeuse (1x 2 minutes/souris) - Injection sous-cutanée dans le flanc, sous anesthésie gazeuse, de cellules tumorales (1x 2 minute/souris) – injections intrapéritonéales d’anticorps (2 ou 3x 5 secondes/souris).

Impact sur les animaux

Les volumes tumoraux et le poids sont évalués trois fois par semaine et nécessitent une contention de quelques secondes, pouvant engendrer un stress léger. Les injections peuvent entraîner des douleurs courtes au site d'injection au niveau de l'abdomen pour l'administration des traitements, et sur le flanc pour l'injection des cellules tumorales. Possible douleur légère ou gène autour de la tumeur. L’administration d’un des médicaments, peut induire une perte temporaire de poids légère, qui est restaurée rapidement après l’arrêt du traitement.

Devenir

Afin d’effectuer des analyses sur les tumeurs, rates et ganglions lymphatiques, les souris seront mises à mort et ces tissus seront prélevés pour analyse. Ceci permettra de documenter la fonction de la voie d’intérêt non seulement dans la croissance tumorale mais aussi dans la composition et distribution du microenvironnement immunitaire.

Remplacement

Nous avons tout d’abord effectué un certain nombre d'expériences in vitro qui suggèrent que la voie d’intérêt est impliquée dans la prolifération des cellules de cancer du pancréas, mais aussi dans leur expression de certaines molécules impactant la réponse immunitaire. Cependant, la pertinence préclinique de nos résultats nécessitera une série d'expériences in vivo pour valider la fonction de ces protéines. À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, les interactions entre les différentes cellules immunitaires et leur microenvironnement, ne peut actuellement pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Notre analyse statistique a priori se base sur des données bien établies de la littérature.

Raffinement

Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs (3 fois par semaine), et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, tunnel en carton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage. En cas d’altération du bien être ou de perte de poids limitée, de la nourriture liquide et de l’eau gélifiée pourront être utilisés. En cas de douleur détectable, un analgésique sera administré.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation chez la souris est justifié par l’utilisation d’un modèle de cancer du pancréas, le plus utilisé dans la littérature car reflétant la pathologie humaine de façon fidèle, notamment concernant le rôle des cellules immunitaires. Les méthodes de scoring et les points limites sont également très bien établis. Les souris seront âgées de 7 à 12 semaines, ce qui correspond à un état de maturité du système immunitaire. L’âge sera homogène dans chaque procédure.

240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever tumeurs, rates et ganglions lymphatiques. Sous anesthésie gazeuse, elles reçoivent des cellules de mélanome sous la peau du flanc puis des lymphocytes en intraveineuse, et sont transportées pour une irradiation de dix minutes qui peut leur faire perdre du poids et affaiblir un temps leurs défenses immunitaires. La tumeur est mesurée trois fois par semaine, l'objectif étant de voir si des lymphocytes modifiés pour surexprimer un facteur cellulaire deviennent efficaces contre les tumeurs solides, là où les thérapies par transfert de lymphocytes échouent aujourd'hui. Le porteur écrit que les interactions entre cellules immunitaires et microenvironnement "ne peuvent actuellement pas être remplacées par des systèmes in vitro fiables", après avoir mené in vitro les expériences qui ont suggéré l'intérêt de ce facteur.

Objectifs

Les traitements d’immunothérapie ont révolutionné la prise en charge de certains cancers. Néanmoins, les thérapies par transfert de lymphocytes, qui sont très efficaces dans les cancers du sang, ne permettent aujourd’hui pas d’obtenir un bénéfice clinique chez les patients atteints de tumeurs solides telles que le mélanome. Un nouveau facteur cellulaire a été décrite comme importante pour la fonction des lymphocytes dans le mélanome. Nous souhaitons donc évaluer l’effet d’une augmentation génétique de l’expression du facteur d’intérêt dans deux types de thérapies par transfert de lymphocytes, dans le cadre du mélanome chez la souris.

Bénéfices attendus

A ce jour, les thérapies cellulaires par transfert de lymphocytes ne sont que très peu efficaces chez les patients atteints de tumeurs solides. Nos travaux pourraient permettre soutenir le développement d’une nouvelle génération d’immunothérapies par transfert de lymphocytes sur-exprimant le facteur d’intérêt.

Procédures

Injection sous-cutanée dans le flanc, sous anesthésie gazeuse, de cellules tumorales (1x 2 minute/souris) – Injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse, de lymphocytes (1x 2 minutes/souris) – Transport sur le même site et irradiation à faible dose (10 minutes/souris).

Impact sur les animaux

Les volumes tumoraux et le poids sont évalués trois fois par semaine et nécessitent une contention de quelques secondes, pouvant engendrer un stress léger. Les injections peuvent entraîner des douleurs courtes au site d'injection. Possible douleur légère ou gène autour de la tumeur. L’irradiation peut entraîner une perte de poids temporaire et une immunodéficience partielle temporaire.

Devenir

Afin d’effectuer des analyses sur les tumeurs, rates et ganglions lymphatiques, les souris seront mises à mort et ces tissus seront prélevés pour analyse. Ceci permettra de documenter la fonction de la molécule d’intérêt non seulement dans la croissance tumorale mais aussi dans la composition et distribution du microenvironnement immunitaire.

Remplacement

Nous avons tout d’abord effectué un certain nombre d'expériences in vitro qui suggèrent que l’augmentation de l’expression du facteur d’intérêt dans les lymphocytes, améliore leur potentiel thérapeutique. Cependant, le développement pré-clinique de cette thérapie de nouvelle génération nécessitera une série d'expériences in vivo pour confirmer son effet bénéfique. À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, les interactions entre les différentes cellules immunitaires et leur microenvironnement, ne peuvent actuellement pas être remplacées par des systèmes in vitro fiables.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Notre analyse statistique a priori se base sur des données bien établies de la littérature.

Raffinement

Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs (3 fois par semaine), et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris, via notamment l’anesthésie gazeuse et un anesthésique local. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, tunnel en carton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage. En cas d’altération du bien être ou de perte de poids limitée, de la nourriture liquide et de l’eau gélifiée pourront être utilisés. En cas de douleur détectable, un analgésique sera administré.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation sur la souris est justifié par l’existence de différents modèles de mélanomes , de souris transgéniques, et de protocoles bien établis dans la littérature, nous permettant de mesurer le rôle de la molécule d’intérêt dans l’efficacité des immunothérapies.. Les méthodes de scoring et les points limites sont également très bien établis. Les souris seront âgées de 7 à 12 semaines, ce qui correspond à un état de maturité du système immunitaire. L’âge sera homogène dans chaque procédure.