Recherche fondamentale
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Évaluation in vivo de l’efficacité anticancéreuse des traitements locaux du glioblastome
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les rats qui n'ont atteint aucun point d'arrêt cent vingt jours après la greffe sont considérés comme guéris, puis tués comme les autres. 204 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacun subit deux chirurgies cérébrales, une greffe de tumeur puis une résection accompagnée de la pose d'un gel ou d'une pâte chargée en chimiothérapie, avec pour certains un gavage, le porteur mentionnant des hémorragies locales possibles, une perte de poids liée à la progression tumorale et de rares troubles neurologiques. Soixante-douze d'entre eux sont tués à quatre temps prédéfinis pour mesurer la diffusion du médicament dans le cerveau, le rat étant retenu plutôt que la souris parce que sa taille permet d'administrer des volumes plus importants.
Objectifs
Le glioblastome (une forme grave de cancer du cerveau) présente un pronostic difficile, avec une survie moyenne de 15 mois malgré des traitements tels que la chirurgie, la chimiothérapie et la radiothérapie. Deux défis majeurs compliquent l'efficacité des médicaments anticancéreux pour traiter le glioblastome : d'une part, la barrière hémato-encéphalique (couche protectrice qui régule l'accès des substances sanguines au cerveau) limite l'accès des traitements à la tumeur, et d'autre part, la présence de cellules tumorales résistantes à la chimiothérapie qui se propagent dans le cerveau. Après la chirurgie et les traitements, tous les patients font face à des rechutes très agressives, souvent à proximité du site de la chirurgie. Les réponses du cerveau après la chirurgie peuvent créer un environnement favorable à la formation de ces rechutes. Il est crucial de prévenir ces rechutes pour améliorer l'efficacité des traitements pour les personnes atteintes de glioblastome. Deux approches prometteuses ont été développées pour contrer les effets dévastateurs du glioblastome : la libération ciblée de médicaments anticancéreux à l'aide d'implants, de gels ou de pâtes administrés directement dans le cerveau, et l'utilisation de nanomédicaments. La première méthode permet de délivrer les médicaments directement à la tumeur, en contournant les obstacles de la barrière hémato-encéphalique, tandis que la deuxième utilise de toutes petites particules pour cibler spécifiquement les cellules cancéreuses, surmonter la résistance et réduire les effets secondaires. Ce projet vise à évaluer l'efficacité de trois traitements locaux (deux gels et une pâte médicamenteuse) et à comprendre comment les substances actives se répandent dans le tissu cérébral. L'objectif final est d'améliorer le traitement des personnes atteintes de glioblastome.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de vérifier l’efficacité anticancéreuse de trois nouveaux traitements locaux véhiculant des agents chimio-thérapeutiques pour le glioblastome. Les retombées de ce projet pourraient permettre de répondre à un besoin médical non pourvu dans le traitement du glioblastome qui n’a pas bénéficié d’innovation thérapeutique depuis 2005.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux chirurgies: 1) greffe tumorale ; 2) résection tumorale et administration locale d'un traitement. Une administration de médicament par voie orale est aussi prévue pour certains animaux.
Impact sur les animaux
Les nuisances anticipées dans ce projet concernent la greffe intracérébrale, la résection chirurgicale et le gavage par voie orale. Les sources de stress potentielles avant/pendant ces actes sont la manipulation, contention des animaux, les injections d'anesthésiques, l’incision de la peau. La résection peut induire des hémorragies locales. La perte de poids reflétant la progression tumorale des tumeurs intracrâniennes de glioblastome est aussi un effet indésirable attendu dans ce projet. Il est également possible, quoique rare, que les animaux développent des troubles neurologiques lors de stades avancés de la pathologie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale. Les animaux de l’étude de survie seront mis à mort lorsque l'un des points d'arrêts est atteint. Si les animaux n'ont pas atteint ces points au jour 120 post-greffe tumorale, ils seront considérés comme guéris et seront mise à mort. Les animaux de l'étude de pénétration tissulaire de médicaments seront mis à mort a des temps prédéfinis pour effectuer des analyses post-mortem.
Remplacement
L’objectif de ce projet est de vérifier l’efficacité anticancéreuse des traitements locaux véhiculant des agents chimio thérapeutiques pour le glioblastome. Les équipes impliquées dans le projet ont établi les différentes étapes expérimentales sur la base des résultats obtenus préalablement. L'étape de validation de l'efficacité du traitement in vivo est indispensable avant toute évaluation clinique chez le patient. Il n’existe à l’heure actuelle, aucune autre méthode qui pourrait se substituer à l’expérimentation animale dans ce domaine.
Réduction
Le nombre totale d'animaux requis pour ce projet est de 204 animaux. Le nombre d’animaux utilisés pour évaluer l'efficacité des traitements a été déterminé selon des protocoles précédemment décrits: nous avons utilisé une méthode statistique pour réaliser le calcul d'effectif permettant d’obtenir une différence statistiquement significative entre les groupes étudiés (n=11 x 4 groupes expérimentaux = 44 animaux pour chaque traitement local --> totale = 132 animaux). Cette étude de survie va durer environ 22 jours pour les animaux contrôles et jusqu’à maximum 120 jours pour les animaux traités. Les jours de décès après la greffe des différents animaux seront analyses avec un logiciel statistique afin de comparer la survie des animaux. Un deuxième étude va nous permettre d'évaluer la pénétration de médicaments dans le cerveau, et pour ceci 72 animaux supplémentaires seront nécessaires: 3 animaux contrôle et 3 animaux du groupe traitement local seront mise à mort à quatre temps différents post-traitement pour des analyses post-mortem (n= 6 animaux x 4 temps = 24 animaux pour chaque traitement local --> totale = 72 animaux).
Raffinement
Les rats seront hébergés à raison de 2 animaux par cage et leur bien-être sera assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose, de dômes autoclavables et de morceaux de bois à ronger, dans toutes les cages. Les animaux seront soumis à une observation quotidienne, et si possible, familiarisés avec des comportements susceptibles de provoquer du stress afin de minimiser les nuisances. Une échelle d'évaluation de la souffrance sera utilisé pour quantifier la souffrance en fonction des changements de poids corporel, des changements dans leur apparence physique, comportement, de réponses aux stimuli ou de l’apparition de signes cliniques de souffrance. En fonction du score total obtenu grâce à cette échelle des mesures visant à soulager la détresse (ex. eau gélifiée, nourriture dans la cage, ajout d’enrichissement, remise d’un animal isolé en hébergement de groupe) et la douleur (ex. analgésie) seront mises en place.
Choix des espèces
Le modèle rat (avec le modèle souris) représente le modèle le plus étudié dans le traitement des tumeurs cérébrales. Nous avons choisi un modèle de rat pour tester nos traitements locaux et non pas un modèle souris car il représente un modèle plus grand et qui permettra donc d'obtenir une meilleure localisation in vivo de la tumeur, de la distribution du traitement dans le tissu cérébral et d'administrer des volumes plus importants de traitement, ce qui nous rapproche davantage de la clinique. Les différents travaux scientifiques dans ce domaine ont utilisé très majoritairement des rats Fischer 344 de 5 à 8 semaines : afin de pouvoir confronter nos résultats avec la littérature et avec nos travaux précédents nous avons choisi d’utiliser des rats de 7 semaines.
Essais in vivo d’injection de nanoparticules lipidiques contenant de l’ARNm luciferase.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection intramusculaire d'une formulation de nanoparticules lipidiques et trois injections dans le péritoine, puis des séances répétées d'imagerie sous anesthésie, le porteur citant comme nuisances une infection possible au point d'injection, de la douleur, une inflammation et la fatigue liée aux anesthésies répétées. L'ARN messager injecté ne code aucun principe actif mais une protéine luminescente, servant seulement à visualiser où les nanoparticules se rendent. Le bénéfice avancé se limite à "évaluer le potentiel" de nouvelles formulations dans l'optique d'améliorer les vaccins à ARN, quand les atteintes décrites sont, elles, immédiates.
Objectifs
L’objectif est de tester différentes formulations de nanoparticules lipidiques qui pourraient être utilisées pour la fabrication de vaccin. Afin de visualiser l’efficacité des nanoparticules, un ARN messager permettant l’expression d’un rapporteur d’imagerie sera utilisé dans les formulations.
Bénéfices attendus
Evaluer le potentiel de nouvelles formulations de nanoparticules lipidiques dans l’optique d’améliorer les vaccins ARN.
Procédures
Injection dans le muscle des formulations : 30 secondes, 1 fois. Injection dans le péritoine : 10 secondes, 3 fois.
Impact sur les animaux
Les nuisances peuvent provenir de : 1. L’injection intramusculaire : infection au niveau du site d’injection, douleur, inflammation. 2. Suivi en imagerie : fatigue et stress liés aux anesthésies répétées, stress lié à la contention.
Devenir
Nous envisageons de prélever des organes après l'euthanasie afin de faire des tests complémentaires.
Remplacement
L’objectif est de développer de nouvelles formulations de nanoparticules lipidiques qui pourraient être utilisées pour la fabrication de vaccin . Même si les formulations seront validées en amont sur des cultures cellulaires, la finalité est le test sur des modèles in vivo avant d’envisager un passage en clinique.
Réduction
Les formulations seront préalablement testées et validées in vitro avant d’être injectées à l’animal. Seules les formulations validées seront utilisées. Le suivi se fait par imagerie de bioluminescence qui est une technique d’imagerie non invasive permettant de faire un suivi du début à la fin sur un même animal ce qui permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Chaque animal est son propre témoin. Le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique.
Raffinement
Les souris seront acclimatées pendant 7 jours après leur arrivée dans l’animalerie. Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (tunnel, maison, paille) sur un portoir filtrant. Les étapes du projet sont réalisées sur animal anesthésié et lors de l’anesthésie l’animal est maintenu sur un tapis chauffant. Les animaux sont surveillés par le personnel de l’animalerie et par l’expérimentateur. En cas de léger mal être un antidouleur sera administré à l'animal.
Choix des espèces
L'imagerie optique est plus sensible et facilement réalisable sur le petit animal tel que la souris. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte entre 8 et 12 semaines. A cet âge les souris ont un poids et une taille raisonnable permettant leur manipulation.
Analyse des interactions entre cellules cancéreuses et les neurones dans un modèle d’épilepsie tumorale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Des femelles gestantes subissent une chirurgie de quarante-cinq minutes pour que leurs embryons, à 14,5 jours de développement, reçoivent une injection puis une électroporation destinées à faire naître une tumeur cérébrale. 144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 128 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 16 un niveau modéré. Les souriceaux sont tués à cinq ou vingt jours de vie pour analyser les propriétés électriques de leurs tumeurs et comprendre comment les connexions entre neurones et cellules cancéreuses provoquent l'épilepsie. Le porteur affirme qu'aucun symptôme n'est attendu, les signes cliniques apparaissant après la date prévue de prélèvement, et ne justifie pas l'effectif, se bornant à indiquer que "les effectifs seront déterminés" avec des tests statistiques adaptés.
Objectifs
Le cerveau est composé de differents types de cellules et la mise en place de connexions entre elles au cours du développement embryonaire est indispensable à son bon fonctionnement. L’altération de ces connexions est à l’origine de l‘épilepsie dans des pathologies cancéreuses. L’objectif de se projet est de comprendre comment les tumeurs se dévellopent et comment les connexions entre neurones et cellules cancéreuses induisent de l’epilepsie.
Bénéfices attendus
Le but de cette étude est d’identifier de nouvelles options thérapeutiques pour les patients atteints de certaines tumeurs cérébrales et souffrant d'épilepsie. Ce type d’épilepsie est souvent reistant aux traitements existants. Donc, la découverte de nouveaux mécanismes dans ces tumeurs peut fournir de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Chirugie avec analgésie et anesthésie – 45 min, une fois. Injection sous-cutanées, 30 sec, cinq fois. Inj intra-cerebrale, 5 sec, une fois.
Impact sur les animaux
La chirurgie peut être source de douleur et de stress. Dans le modèle de tumeur cérébrale, les symptômes apparaissent après le délai fixé pour le prélèvement des tissus, de sorte qu'aucun symptôme n'est attendu.
Devenir
Tous les animaux seront utilisés pour le prélèvement d'organes et l'analyse phénotypique.
Remplacement
Cette étude nécessite l'utilisation de différents types de cellules au cours d'une période embryonnaire spécifique, ce qui ne peut être fait qu'avec des animaux.
Réduction
Les effectifs seront déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés
Raffinement
Nous veillerons en continu au bien-être des animaux par l’utilisation d’analgésiques et d’anesthésiques lors de la procédure opératoire et par un enrichissement de leur environnement dans les cages d’hébergement.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le fonctionnement des circuits neuronaux, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cortex cérébral entre les rongeurs et l’Homme. Des femelles adultes gestantes âgées de 8 à 12 semaines seront utilisées pour l'électroporation d'embryons. Les embryons sont électroporés à E14.5 et seront utilisés pour le prélèvement de tissus à l'âge postnatal 5 ou 20 afin d'étudier les caractéristiques électrophysiologiques des néoplasmes à deux stades du développement tumoral.
Etude du rôle d’EZH2 sur un modèle expérimentale de polyarthrite rhumatoïde murin
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Deux injections d'une émulsion de collagène à la base de la queue, à vingt et un jours d'intervalle, déclenchent l'arthrite, ce qui peut provoquer des grattages et des plaies. Les articulations des pattes gonflent, avec des difficultés possibles à se déplacer, à saisir et donc à se nourrir, tandis que chaque souris est contenue cinq à dix minutes par jour et soumise jusqu'à une heure trente de tests de réponse à la douleur, deux à trois fois par semaine pendant six semaines. Le porteur conclut que la mesure de la réponse aux stimulations thermiques et mécaniques est une méthode "irremplaçable" pour estimer la douleur et que la procédure présente un "caractère de stricte nécessité".
Objectifs
La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie inflammatoire chronique, caractérisée par une atteinte articulaire, souvent bilatérale et symétrique, évoluant par poussées vers la déformation et la destruction des articulations atteintes. Il s’agit du plus fréquent rhumatisme inflammatoire chronique, touchant entre 0,5 et 1% de la population mondiale, et touchant 4 fois plus les femmes que les hommes. Les premiers symptômes se traduisent par des douleurs articulaires, des rougeurs et des gonflements des articulations, en particulier des mains et des pieds. A l’heure actuelle, il n’existe pas de traitement de la PR, seulement des moyens de soulager la douleur ou réduire l’intensité des symptômes. Il est donc nécessaire de développer des médicaments à la fois efficaces contre la progression de la maladie mais aussi ses symptômes et notamment la douleur. Différentes études suggèrent que la modulation d’EZH2, une histone méthyltransférase, pourrait être une cible thérapeutique intéressante pour le traitement de la PR. En effet, des études in vitro et in vivo ont démontré que l’inhibition d’EZH2 permet de réduire l’inflammation dans de nombreux contextes physiopathologiques. Plus particulièrement, le laboratoire a démontré que dans des modèles murins d’arthrose, une autre pathologie articulaire inflammatoire, l’inhibition d’EZH2 par l’EPZ-6438 permet de réduire la progression de la maladie (destruction de l’articulation), et la douleur associée. Dans la mesure où, comme dans l’arthrose, l’expression d’EZH2 est augmentée dans l’articulation des patients arthritiques, il a été proposé que l’inhibition d’EZH2 pourrait réduire la progression de la PR. Dans ce contexte, le but de cette étude est d’évaluer l’effet de l’inhibition d’EZH2 dans un modèle expérimental d'arthrite afin de mieux comprendre les mécanismes de la maladie et d’envisager de nouvelles pistes de traitements. Contrairement à la plupart des études pré-cliniques qui visent à évaluer uniquement la capacité de nouveaux traitements à inhiber l’inflammation et la destruction des articulations, nous évaluerons ici à la fois ces paramètres (inflammation, destruction et/ou gonflement de l’articulation) mais aussi la capacité de l’inhibiteur d’EZH2 à réduire la douleur. En effet, c’est l’intérêt clinique majeur pour les patients.
Bénéfices attendus
Plusieurs laboratoires dont le nôtre ont démontré que l’inhibition d’EZH2 par l’EPZ-6438 ralentit la progression de l’arthrose en réduisant la dégradation du cartilage et l’inflammation articulaire, et améliore les fonctions motrices des souris ainsi que la douleur, ce qui suggère qu’EZH2 serait une cible thérapeutique intéressante dans le traitement de cette pathologie articulaire. Pour cette étude, nous nous attendons à des effets comparables voire plus prononcés dans la mesure où l’arthrite est une maladie articulaire à forte composante inflammatoire. Les bénéfices attendus sont donc l’identification d’une nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de la PR, capable d’induire une réduction des signes cliniques (réduction du gonflement et de l’inflammation sur les pattes des animaux, réduction de la douleur/sensibilité tactile). L’EPZ-6438 étant un traitement déjà utilisé en médecine humaine pour le traitement de certains cancers, une stratégie de repositionnement du médicament dans cette nouvelle indication pourrait être envisagée.
Procédures
Les animaux recevront deux injections à 21 jours d’intervalle pour induire l'arthrite ainsi que deux injections par semaine pendant 3 semaines pour le traitement. Une contention régulière afin d’observer les animaux et les signes cliniques de la maladie seront nécessaires quotidiennement (5-10 min par jour et par animal). Des tests de comportement permettant de mesurer la réponse à la douleur seront effectués 2 à 3 fois par semaine (1h30 par jour par animal maximum) pendant 6 semaines. Un prélèvement sanguin sera effectué sous anesthésie générale avant la mise à mort.
Impact sur les animaux
L’induction de l’arthrite se traduit généralement par le gonflement des articulations des pattes ainsi que par l’apparition de rougeurs. Ces gonflements, s’ils atteignent un stade élevé, peuvent induire des difficultés à se déplacer et à la préhension et donc des difficultés à se nourrir et à une réduction de la mobilité. Une perte de poids peut donc être attendue. L'injection de l'émulsion de collagène à la base de la queue peut générer une irritation conduisant la souris à se gratter au point d'injection et à former des plaies. Aucun effet secondaire ou mortalité n’ont été mis en évidence sur les souris après administration répétées d’EPZ-6438 dans la littérature.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l’issue de la procédure afin de procéder à des analyses des tissus.
Remplacement
Au sein de notre projet scientifique, nous étudierons l’impact d’un traitement contre la PR, une maladie inflammatoire chronique qui touchent plusieurs articulations. La physiopathologie est complexe avec l’implication de nombreuses cellules immunitaires (lymphocytes, macrophages, etc) et articulaires (chondrocytes, synoviocytes), ne permettant pas de récapituler l’ensemble des processus in vitro. Ainsi, l’impact du traitement par l’EPZ-6438 sur l’évolution de la maladie (notamment gonflement des pattes et rougeurs) ne peut pas être évalué sur un modèle ex vivo ou in vitro. De même, l’analyse comportementale et notamment l’évaluation de la réponse à des stimulations thermiques et mécaniques est une méthode irremplaçable pour estimer la douleur, que nous ne pouvons pas substituer par des méthodes alternatives. Ainsi, la procédure expérimentale décrite dans ce projet a un caractère de stricte nécessité et ne peut pas être remplacée par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Notre projet scientifique applique le principe de la réduction puisque pour déterminer le nombre d’animaux prévu pour cette étude, des tests statistiques notamment le test de puissance a été réalisé. Le nombre d’animaux requis pour l’étude a été déterminé après avoir effectué un test statistique de puissance. En se basant sur les données de la littérature correspondant à notre étude (score clinique de l’arthrite et évaluation de la douleur), l’effectif par groupe a été déterminé à 15 animaux par groupe soit un total de 180 animaux. Cependant, les données cliniques de l’arthrite indiquent que le sexe a une influence significative sur le développement de la pathologie et notamment la mise en place de la réponse du système immunitaire, nous souhaitons donc étudier l'effet du sexe. Nous prévoyons donc des groupes composés de 15 souris mâles et 15 souris femelles. Un total de 90 animaux par modèle d’arthrite est donc nécessaire. Les deux modèles d’arthrite (modèle de poussée à fort caractère inflammatoire et modèle précoce) seront étudiés. Ce projet nécessite donc un total de 180 animaux.
Raffinement
Les animaux seront contrôlés quotidiennement pour évaluer et réduire au maximum tout risque de douleur. Des points limites ont été definis pour chaque procédure. Les gestes susceptibles d’entraîner une douleur ou un stress seront réalisés sous anesthésie et l'administration d'un analgésique est prévu pour limiter la douleur. Les conditions de vie seront améliorées au maximum (5 souris maximum par cage, ajout de matériel de nidication et igloo en carton).
Choix des espèces
Deux souches de souris seront utilisées dans ce projet. L'injection de collagène de type II chez la souris DBA/1J entraine le développement d’arthrites sévères par réaction auto-immune, ce qui représente un bon modèle des phases de poussées de la maladie. La deuxième souche de souris mime les phases précoces de la maladie chez l’homme, avec l’apparition d’une arthrite moins sévère. Les souris utilisées sont âgées de 7 semaines, elles sont alors adultes et ont fini leur croissance.
Etude de la réversibilité de la réponse induite par des perturbateurs endocriniens à l’aide de poissons zèbres génétiquement modifiés
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Une lignée de poissons zèbres génétiquement modifiés, dont la fluorescence suit l'activité d'un gène du métabolisme intestinal, est mise au point pour évaluer les perturbateurs endocriniens au niveau réglementaire, dans le cadre d'un projet européen. 700 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue pour le prélèvement de leurs intestins, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Exposés à des substances entre 72 et 120 heures après la fécondation, ils passent cinq séances d'imagerie au microscope sans anesthésie, à 5, 7, 10, 15 et 20 jours, et sont suivis jusqu'à trois mois. Le porteur qualifie cette expérience d'"essentielle" à la caractérisation de la lignée et invoque l'"organisme entier" pour écarter les cellules en culture.
Objectifs
Dans le cadre de l’étude des perturbateurs endocriniens en lien avec les pathologies métaboliques telles que l’obésité, le diabète ou la stéatose, nous développons une lignée transgénique de poisson zèbre apte à rendre compte d’effets de substances au niveau du métabolisme intestinal, y comprit chez l’Homme. La quantification de la fluorescence dans cette lignée transgénique permet de suivre l'expression de notre gène d'intérêt et est réalisée après exposition d’embryons issus de cette lignée à des substances pendant 48h, de 72 heures post-fécondation (hpf) à 120hpf. Afin d’étudier la réversibilité de la réponse de ce modèle nous souhaitons poursuivre les mesures de fluorescence au microscope au-delà de 120hpf, jusqu’à 3 mois. Les animaux ne seront donc pas exposés aux substances passé 120hpf. L’utilisation de la lignée transgénique apportera des informations complémentaires sur les mécanismes d’action des substances sans augmenter le nombre de poissons nécessaires à la réalisation des essais pour l’identification des perturbateurs endocriniens. A terme, le modèle que nous développons permettra d’évaluer l’impact de perturbateurs endocriniens en ayant recours à des embryons âgés de moins de 120hpf et les données générées au cours de ce projet permettront le développement/l’amélioration de voies de toxicité impactant le métabolisme qui pourront être utilisées pour une meilleure évaluation des dangers et des risques des perturbateurs endocriniens au niveau réglementaire.
Bénéfices attendus
L’étude la réversibilité de la réponse après exposition des embryons de poissons zèbres aux substances de 72hpf à 120hpf permettra d’approfondir notre connaissance des mécanismes régulant cette réponse. Nous pourrons ainsi analyser si l’expression de la fluorescence, induite ou inhibée à la suite de l’exposition aux substances, persiste ou au contraire revient à la normale alors que les poissons n’y sont plus exposés. Ainsi, la fluorescence étant relative à l’expression de notre gène d'intérêt, acteur clé du métabolisme intestinal chez le poisson zèbre, cette expérimentation permettra d’étudier les effets au long terme (jusqu’à 3 mois) sur ce métabolisme à la suite d’une exposition courte (48h) aux substances inductrices ou inhibitrices de de ce gène. Dans le cadre du développement d’un modèle de poisson zèbre apte à rendre compte des impacts des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme intestinal, y comprit chez l’Homme, l’étude de la réversibilité de la réponse aux substances a toute son importance. Ces données participeront à la caractérisation du modèle et de fait à l’élaboration d’un outil d’évaluation de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme chez l’Homme, au cœur des objectifs du projet européen dans lequel s’inscrivent ces travaux.
Procédures
Les poissons zèbres seront soumis à des prises d'image en microscopie à fluorescence. Les animaux (5, 7, 10, 15 et 20 jours post fécondation) ne seront pas anesthésiés mais resteront dans de l'eau tout le temps de l'imagerie qui ne durera que 10 secondes environ. Chaque animal sera soumis à 5 imageries au cours de l'expérimentation.
Impact sur les animaux
L’exposition aux substances réalisée en début d’expérimentation (de 72hpf à 120hpf) aura un effet sur l'expression de notre gène d'intérêt (et probablement d'autres qui ne seront pas mesurés) sur le court terme et peut être le long-terme mais aucun effet toxique ou développemental n'est attendu aux concentrations sélectionnées. Les manipulations répétées tout au long de l’expérimentation (la prise d'image au microscope à fluorescence) pourraient entrainer un stress chez les animaux.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort à la fin de l'expérimentation afin de prélever les intestins pour réaliser des mesures d'expression du gène d'intérêt à l'aide de techniques de biologie moléculaire.
Remplacement
L’étude de la réversibilité de la réponse dans le modèle poisson zèbre que nous développons ne peut s’affranchir de l’utilisation d’animaux vivants. En effet, cette expérimentation est essentielle à la caractérisation de ce modèle biologique, permettant de renseigner de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme à l’échelle de l’organisme entier, une problématique encore peu investiguée. Les modèles cellulaires ne permettent pas cette approche. Quant aux modèles mathématiques, s’agissant d’une problématique émergente, la modélisation de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme est encore balbutiante. A terme, l’expérimentation menée ici permettra d’établir un modèle de poisson zèbre pertinent pour l’évaluation de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme.
Réduction
L'utilisation d'animaux transgéniques pour le suivi des effets dans le temps des substances permet de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés en réutilisant les mêmes individus à chaque temps d'étude. Les effectifs ont été calculé en tenant compte de la variabilité de l'expression de notre gène d'intérêt et de la mortalité normale au cours du développement afin de pouvoir mettre en évidence des effets des substances de plus de 50% (test statistique).
Raffinement
Les animaux sont conservés dans un environnement controlé connus pour engendrer un minimum de stress (aquariums teintés en bleu si possible avec un fond en décors graviers, paramètres physico-chimiques de l'eau et photopériode contrôlés). Ils sont hébergés en groupe afin de respecter leur comportement grégaire et limiter l’anxiété que pourrait entrainer l’isolement, en gardant des populations faibles afin d’éviter les comportements agressifs. Les poissons sont également nourris en partie avec des artémies vivantes, leur permettant ainsi d’enrichir l’éventail de leurs comportements sociaux, notamment celui de la chasse. Tout au long des expérimentations, les animaux seront suivi avec une grille de bien-être adaptée à chaque stade de développement. L'ensemble de ces procédures est réalisé par des personnes formées et sensibilisées à l'évaluation de la souffrance animale.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est une des espèces recommandées pour la réalisation de tests réglementaires sur les perturbations endocriniennes. Sa petite taille permet des expositions dans de faibles volumes d’eau d’où une faible consommation de substances toxiques et une quantité de déchets générés moindre. Ces dernières années un nombre croissant de lignées de poissons zèbres génétiquement modifiés ont été développées et se sont avérées être des outils pertinents pour la détection des perturbateurs endocriniens tout en réduisant le nombre d'animaux.
Evaluation de l’effet des antidépresseurs sur l’épilepsie des souris modèles de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Quinze jours seules en cage, des électrodes implantées dans le cerveau et reliées à un câble pour un enregistrement continu : 96 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Opérées sous anesthésie pendant 90 minutes au plus, elles reçoivent ensuite pendant dix jours, mêlé à leur eau de boisson, l'un des quatre traitements comparés, dont trois antidépresseurs. L'équipe soupçonne certains de ces médicaments d'aggraver l'épilepsie liée à la maladie d'Alzheimer, au risque, écrit-elle, de crises sévères et d'une mort précoce des souris. Le porteur qualifie cette lignée, qui développe des plaques amyloïdes et une activité épileptique, de "modèle idéal" pour cette étude.
Objectifs
Dans ce projet, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées qui développent la maladie d’Alzeihmer et des activités épileptiques. Nous étudierons les effets de 3 antidépresseurs sur les activités épileptiques présentes chez nos souris. Pour cela, nous utiliserons des techniques d’enregistrement continu de l’activité cérébrale par électroencéphalographie intracrâniale. Compte tenu des connaissances actuelles sur les mécanismes d’action des antidépresseurs et de nos travaux antérieurs, nous suspectons un effet aggravateur de certains anti-dépresseurs et un effet protecteur pour d’autres sur l’activité épileptique dans le cadre de la MA. Notre projet pourrait, à long terme, permettre de limiter la survenue de l’épilepsie chez les patients atteints de la MA en remplaçant les traitements antidépresseurs aggravateurs par d’autres traitements ayant des bénéfices au moins similaires mais non responsables de l’accélération du déclin cognitif
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de déterminer si certains antidépresseurs exacerbent les activités épileptiques présentes chez les souris modèles de la maladie d’Alzheimer et si d'autres antidépresseurs ont un rôle protecteur vis-à-vis de ces mêmes activités. Ainsi, si notre hypothèse se vérifie, ce projet justifiera la mise en place d’études cliniques permettant de tester cette hypothèse chez les patients. A long terme, ce projet pourrait donc permettre de mieux adapter les traitements et ainsi apporter un bénéfice considérable aux patients atteints de la maladie d’Alzheimer (MA) en évitant de majorer leur épilepsie.
Procédures
Les animaux anesthésiés et analgésiés auront une chirurgie implantatoire (d'une durée maximale de 90 minutes) pour la pose d’électrodes afin de réaliser des électro-encéphalogrammes. Les encéphalogrammes des animaux seront réalisés en continu pendant 15 jours. Les anti-dépresseurs seront administrés par voie orale en les mélangeant à l’eau de boisson durant 10 jours.
Impact sur les animaux
La chirurgie implantatoire est susceptible d’induire une douleur modérée au stade post opératoire durant 24-48 heures. L’isolement des animaux au cours des enregistrements électrophysiologiques durera 15 jours : ceci peut induire un stress modéré. Cet isolement est indispensable à la conduite des enregistrements. Habituellement, les évènements épileptiques des souris modèles de la MA sont essentiellement des pointes isolées qui surviennent pendant le sommeil et ne sont pas associées à une modification comportementale. Mais l’administration chronique de certains antidépresseurs pourraient exacerber ces activités épileptiques et provoquer des crises d'épilepsie sévères et ainsi provoquer une mortalité précoce des souris. Les pesées peuvent entrainer un stress léger de quelques dizaines de secondes. Le génotypage des animaux pourra entrainer une douleur légère de courte durée.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour récuperer leurs cerveaux en vue d'analyses histologiques.
Remplacement
Le projet a pour objectif d’évaluer les effets des antidépresseurs couramment utilisés en clinique sur l’épilepsie dans la maladie d’Alzheimer (MA). L'épilepsie comme la dépression dépendent d'interactions qui se font entre différentes régions cérébrales au sein de larges réseaux, qui ne peuvent pas, à l'heure actuelle, être mimées dans de simples cultures cellulaires. Une approche par modélisation informatique des interactions entre maladie d'Alzheimer, épilepsie et antidépresseur ne pourra se faire que sur la base de données expérimentales qui ne sont que parcellaires pour le moment. Ainsi, nous sommes dans l’obligation d’utiliser un modèle murin de la MA qui ne peut donc être remplacé par aucun autre modèle.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe (n=12) a été déterminé sur la base de nos études antérieures de l’activité épileptique des souris modèles de la MA, de sorte à avoir une puissance statistique suffisante pour les analyses nécessaires aux comparaisons intergroupes (4 différents traitements) et intragroupes (comparaisons entre chacun des 10 jours de traitement à la baseline).
Raffinement
Les souris sont hébergées à 4 dans des cages contenant du matériel de nidification ainsi qu'une buchette pour l'enrichissement. Les animaux sont habitués à l'expérimentateur lors de 3 séances de manipulation de 10 minutes par souris (handling) avant le début des enregistrements. Les animaux seront suivis quotidiennement par des personnels formés au soin. Si une altération de l’état est observée, une grille de scoring sera utilisée pour déterminer la conduite à tenir. Les critères évalués sont : l’aspect général de l’animal (pelage, peau, yeux, bouche), les fonctions corporelles (respiration altérée), le comportement (posture, locomotion, isolement, réaction à la manipulation), le poids (pesée une fois par semaine puis quotidienne en cas de perte de poids). Pour ce dernier, le poids en fin de chirurgie sert de référence pour calculer le pourcentage de perte (pour prendre en compte le poids du connecteur). Nous avons identifié deux situations pour lesquelles une attention particulière sera portée aux souris : d’une part, la chirurgie (implantation intracérébrale des électrodes d’éléctroencéphalographie (EEG) et période post opératoire) qui pourrait provoquer de la douleur ou de la souffrance ou l'angoisse et, d’autre part, l’isolement lors des enregistrements EEG, qui pourrait affecter le bien-être des animaux. Pour les chirurgies (acte avec réveil), les animaux seront d’abord anesthésiés par inhalation d’isoflurane puis analgésiés 15 minutes avant le début de la chirurgie. Une injection d'anti-inflammatoires sera réalisée en fin de chirurgie et le lendemain pour éviter d’éventuelles douleurs post opératoires. Pendant les deux semaines qui suivront la chirurgie, les animaux seront inspectés tous les jours. Les animaux doivent rester isolés les uns des autres lors des enregistrements électrophysiologiques pour éviter qu’ils ne rongent les câbles les uns des autres et pour éviter qu’ils ne perturbent le sommeil de leurs congénères. Or, il a été montré qu’un isolement peut provoquer une souffrance de l’animal et des modifications neurologiques si l’isolement dure plusieurs semaines (les isolements durent 5 semaines dans la plupart des études sur le sujet). Une attention particulière a donc été portée à la réduction du nombre de jours d’isolement (15 jours). La procédure s’achèvera ainsi par la mise à mort les animaux dès que les enregistrements seront terminés.
Choix des espèces
Dans ce projet, nous utiliserons des souris transgéniques modèles de la maladie d’Alzheimer. Cette lignée reproduit de nombreuses caractéristiques de la pathologie observées chez l’humain : plaques amyloïdes, déclin cognitif progressif et activités épileptiques, entre autres. Cette lignée constitue donc un modèle idéal pour l’étude des effets des antidépresseurs sur l’épilepsie dans la MA. Les animaux seront inclus dans le protocole à l’âge adulte, entre 3 et 5 mois. A cet âge, les souris modèles de la MA sont à un stade précoce de la maladie d’Alzheimer mais présentent déjà des activités épileptiques qui ne progressent pas avec l’âge.
Rôle protecteur de la progestérone contre la rechute à la cocaïne : dissection du rôle du cortex insulaire et du système mésolimbique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Un rat dont l'état se dégrade ou ne s'améliore pas après 72 heures de soins est tué sur-le-champ, par décapitation ou exsanguination s'il a déjà passé des tests comportementaux qui exigent le prélèvement de son cerveau. 1 920 rats mâles et femelles vont être utilisés, tous tués à l'issue pour l'analyse de leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Opérés pour recevoir un cathéter dans la veine jugulaire et, quand l'équipe enregistre leurs neurones, des injections dans le cerveau avec pose d'une fibre optique, ils prennent de la cocaïne, et les femelles subissent sept jours de prélèvements vaginaux quotidiens. L'équipe teste si les hormones sexuelles, dont la progestérone, les protègent de la rechute, sans décrire les tests comportementaux employés. Le porteur décrit une perte de poids et une hyperactivité liées à la cocaïne, tout en affirmant que la littérature "ne montre pas de stress lié à la prise de cocaïne".
Objectifs
Les objectifs de ce protocole sont triples : - Premièrement, tester l’effet des hormones sexuelles sur la rechute à la cocaïne - Deuxièmement, étudier comment l’activité des neurones d'une partie du cerveau, appelée insula, est modulée par les hormones sexuelles lors de la rechute à la cocaïne - Troisièmement, étudier si la manipulation de l’activité des neurones de cette partie du cerveau influence la rechute à la cocaïne.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’étudier le rôle des neurones d'une partie du cerveaux (insula) dans l’effet protecteur des hormones sexuelles sur la rechute à la cocaïne chez les rats mâles et femelles. A long terme, ce projet a le potentiel d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques applicables à l’humain (homme et femme) pour prévenir la rechute à la cocaïne grâce à un traitement basé sur les hormones sexuelles qui sont déjà des molécules pharmacologiques approuvées par l’ANSM (Agence Nationale de la Santé et du Médicament).
Procédures
Les animaux subiront deux types d’intervention chirurgicales, la pose d’un cathéter dans la veine jugulaire qui durera 30 minutes et des injections intracérébrales ainsi qu’une implantation de fibre optique (durée 1h30) quand nécessaire pour enregistrer d’activité des neurones. Enfin, chez les femelles, le cycle hormonal sera suivi pendant 7 jours par un prélèvement vaginal (durée 10 secondes) quotidien. Les males seront manipulés de la même façon sans prélèvement pour éviter tous biais expérimentaux.
Impact sur les animaux
La chirurgie peut engendrer des douleurs post-opératoires au niveau des sites d’incision, l’injection, ou d’implantation de matériel (crâne, cou, abdomen). La prise de cocaïne peut engendrer une perte de poids lors des premières sessions, mais cette perte n’excède pas 3 ou 4 jours à l’issus desquels les animaux retrouvent un poids initial. La cocaïne peut également engendrer une hyperactivité des animaux qui disparaît 1 heure après la fin de la prise de drogue. La littérature ne montre pas de stress lié à la prise de cocaïne et il n’y a pas de syndrome de sevrage (tremblement, perte de poids) dans les modèles animaux de prise de cocaïne.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de procéder à des analyses sur les tissus cérébraux.
Remplacement
Le projet porte sur une analyse de la connexion des neurones et de leurs propriétés de transmission d’informations au cours du comportement. Par conséquent cette procédure doit être effectuée chez des animaux vivants. L’étude de ces phénomènes n’est donc pas possible sur des cellules isolées, car elles ne permettent pas la quantification des connections neuronales ou la mesure de l’activité en réponse à une stimulation sensorielle.
Réduction
Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux afin d’obtenir une analyse fiable (le nombre d’animaux estimé permet d’effectuer des tests statistiques) et complète de la connectivité et de l’activité de la région cérébrale d’étude. Nous avons utilisé un logiciel statistique pour calculer le nombre d’animaux nécessaires pour chaque procédure en prenant en compte la quantité de conditions expérimentales pour chacune d’elle. Nous utiliserons ainsi 1920 animaux sur cinq ans.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cages collectives, pour limiter le stress de l’isolement. Nous avons réduit au strict minimum les animaux hébergés individuellement pour des raisons expérimentales. Les cages seront enrichies en nids en coton et bois. Avant la chirurgie et après anesthésie, un antalgique sera administré en sous-cutané afin d’éviter la souffrance opératoire. Un anesthésiant local en crème sera appliqué (en plus de l’anesthésie) 10 minutes avant l’incision. La chirurgie sera effectuée en conditions stériles. Si infection, le vétérinaire référent mettra en place un traitement antibiotique approprié. Après chirurgie, l’expérimentateur suivra quotidiennement l’animal (prise alimentaire, qualité du poil, locomotion) et le pèsera pendant 4 jours jusqu’à stabilisation du poids. Du baume cicatrisant sera appliqué sur les sites d’incision si mauvaise cicatrisation. Si douleur post-opératoire, nous procèderons ainsi : Points limites et les critères d’arrêt : Stade 1 : Normal (pas d’action). Si perte de poids jusqu’à 10% du poids initial une injection sous-cutanée (s.c.) de saline sera réalisée et de la nourriture humidifiée sera au sol. Stade 2 : Perte de poids qui persiste 24h post chirurgie avec des signes de douleurs (prostration, mauvaise qualité de poil, hypoactivité). Une injection s.c. d’antalgique et de saline seront réalisées et de la nourriture humidifiée sera au sol. Stade 3 : Perte de poids qui persiste 48h avec des signes de douleurs (prostration, mauvaise qualité de poil, hypoactivité). Une injection s.c. de d’antalgique, de saline, et de glucose en intrapéritonéale (i.p.) seront réalisées et de la nourriture humidifiée sera au sol. Une seconde injection de d’antalgique et de saline pourra être réalisée à 72h si pas d’amélioration. L’animal sera euthanasié si son état est prolongé au-delà de 72h sans amélioration. Stade 4 : Etat de l’animal ne pouvant être pris en charge par médication et engendrant de la souffrance, ou état qui ne s’améliore pas voire se dégrade au-delà de 72h même avec une prise en charge. Conduit à une euthanasie immédiate par décapitation ou exsanguination si animal a déjà réalisé des tests comportementaux nécessitant le prélèvement du cerveau pour analyses histologiques. Dans les deux, une injection s.c. d’antalgique puis i.p. d’euthanasiant seront réalisées avant le sacrifice.
Choix des espèces
Les rats sont un modèle largement utilisé pour l’étude des neurones impliquées dans les troubles de la consommation de drogues. L’administration de cocaïne est utilisée depuis de nombreuses années et largement décrit dans la littérature, et l’injection d’hormones sexuelles est une manipulation facile à conduire. De plus, les régions cérébrales d’intérêt de notre étude possèdent la même structure chez le rat que chez l’humain. Les animaux seront utilisés au stade adulte, afin de travailler sur des neurones des aires cérébrales ciblées matures. Les procédures chirurgicales seront réalisées chez des animaux âgés de 10 semaines.
Etude de l’impact de mutations Nr2f1 sur le développement du cerveau et des yeux chez des modèles de souris du syndrome d’atrophie optique
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Les femelles gestantes porteuses d'embryons mutés sur leurs deux copies du gène Nr2f1 sont tuées avant la mise bas, faute de savoir, pour deux des trois lignées, si les souriceaux survivraient. 2 214 souris vont être utilisées, 600 opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, 1 554 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 60 un niveau léger. Il s'agit de comprendre comment des mutations du gène NR2F1 perturbent le développement du cerveau et des yeux dans le syndrome d'atrophie optique de Bosch-Boonstra-Schaaf, en injectant des traceurs fluorescents dans le cerveau ou dans l'œil des animaux, puis en les tuant dix jours après pour analyser leurs tissus. 60 souris sont transférées vers d'autres procédures, les autres tuées pour prélever cerveau, œil et gonades.
Objectifs
Le syndrome d’atrophie optique de Bosch-Boonstra-Schaaf (BBSOAS) est une maladie génétique qui touche le développement du cerveau et des yeux. Les personnes atteintes de ce syndrome rencontrent des problèmes de vue ainsi que des difficultés d'apprentissage, parfois associées à un retard cognitif. Cette maladie est causée par des variations dans un gène spécifique appelé NR2F1. Ces variations, appelées mutations, perturbent le fonctionnement normal du gène et peuvent entraîner des anomalies dans le développement du système nerveux central. Pour mieux comprendre comment ces mutations génétiques conduisent à la maladie, nous utilisons des modèles de souris génétiquement modifiées. Ces souris possèdent des mutations similaires à celles observées chez les patients atteints de BBSOAS. En étudiant ces modèles animaux, nous pourrons observer les effets des mutations sur le développement du cerveau et des yeux. Les objectifs principaux de ce projet sont de : 1. Identifier comment chaque mutation du gène NR2F1 contribue aux défauts observés dans le développement du système nerveux central. Certaines mutations pourraient affecter certaines parties du cerveau plus que d'autres, ce qui pourrait expliquer les variations de symptômes observées chez les patients. 2. Déterminer quelles cellules du système nerveux central sont impactées par les différentes mutations. Comprendre quelles régions du cerveau sont affectées et quelles cellules sont impliquées peut aider à mieux cibler les recherches sur de nouveaux traitements. 3. Comprendre comment ces mutations altèrent les mécanismes du développement du système nerveux central. Comprendre ces mécanismes peut fournir des informations cruciales sur les processus biologiques perturbés dans la maladie et aider à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. En comprenant mieux les mécanismes sous-jacents à la maladie et en identifiant les cellules et les processus biologiques impliqués, nous espérons ouvrir la voie à de nouveaux traitements et thérapies pour améliorer la prise en charge des personnes atteintes de BBSOAS.
Bénéfices attendus
De précédentes études ont déjà révélées des similitudes entre un modèle de souris et les jeunes patients atteints du BBSOAS, notamment une atrophie du nerf optique, des problèmes de myélinisation (l'enveloppe protectrice des nerfs) et des défauts dans la prolifération et la différenciation de certains types de cellules du cerveau. Pour approfondir notre compréhension de cette maladie, nous utilisons plusieurs modèles de souris ayant différentes mutations du gène NR2F1, similaires à celles observées chez les patients. Ces mutations ont été choisies pour représenter la diversité des altérations génétiques observées chez les patients. En étudiant ces modèles, nous pourrons examiner les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans les symptômes spécifiques liés à chaque mutation. À moyen terme, cette approche devrait nous permettre de mieux anticiper les symptômes chez les jeunes patients en fonction de leur mutation génétique, ce qui pourrait améliorer leur prise en charge précoce. À long terme, nous espérons identifier des cibles thérapeutiques pour contrer les effets néfastes des mutations sur le développement du cerveau et des yeux, afin d'améliorer les soins et le bien-être des jeunes patients.
Procédures
Afin de suivre le comportement des cellules dans le cerveau et les yeux à différents stades de développement post natal, nous injecterons des traceurs fluorescent dans le cerveau ou les yeux des animaux. Ces interventions ne dépasseront pas 15 minutes et seront réalisées sous anesthésie générale. Après la chirurgie, les animaux recevront une injection sous cutanée d’antalgique et d’antibiotique répétée toutes les 24h sur 3 jours. Chaque animal ne subira qu’une seule injection et sera sacrifié 10 jours après pour analyser ses tissus. Pour suivre la prolifération cellulaire nous injecterons des nucléotides modifiés à différents stades de développement. L’injection unique, réalisée sur animal vigile sous contention, durera moins d’une minute. Si aucun signe de douleur ou d’inconfort n’est constaté dans les 15 minutes post injection, les animaux seront euthanasiés entre 2 et 24h après l’injection pour analyser leurs tissus.
Impact sur les animaux
Pour ce projet, nous utiliserons 3 lignées de souris transgéniques portant des mutations du gène Nr2f1, similaires à celles trouvées chez les patients atteints du syndrome d’atrophie optique. Pour la première lignée, dont la mutation entraîne la perte d’expression de Nr2f1, l'absence de phénotype dommageable chez les souris porteuses de cette mutation sur une seule des deux copies du gène (souris hétérozygotes) a été montré par de précédentes études. Pour les deux autres lignées étudiées, l'absence de phénotype dommageable chez les souris hétérozygotes est attestée par ceux ayant généré ces lignées. Nous savons, pour la première lignée, que l’absence totale de Nr2f1 (mutation présente sur les deux copies du gène) entraîne la mort des souris dans les 7 premiers jours de vie, mais aucune information n'est disponible pour les deux autres mutations étudiées. Par mesure de précaution, nous ne ferons naitre aucune souris portant des mutations sur les 2 copies du gène Nr2f1 et les femelles gestantes susceptibles d’avoir de tels embryons seront prélevées avant la mise bas. Ces trois lignées pourront être croisées avec une lignée rapportrice, dont l'expression du marqueur GFP n'affecte pas le phénotype des animaux. Les animaux pourront être impliqués dans diverses procédures nécessitant des injections ou interventions chirurgicales. Pour les animaux subissant une stéréotaxie, une douleur ou un inconfort au niveau de l’incision de la peau du crane peut persister après la chirurgie jusqu'à la cicatrisation complète. Dans le cas de l'injection intravitréale, l'utilisation d'une aiguille fine et de volumes de liquide très faibles minimise le risque de lésions ou de pression intraoculaire gênantes. De plus, les traceurs injectés ne devraient pas la physiologie de l'œil ou du cerveau. L'injection intrapéritonéale peut provoquer une douleur aiguë transitoire due à la piqûre, mais cette sensation disparaît rapidement. Pour les femelles gestantes, une attention particulière sera accordée à la surveillance post-injection, car leur état peut entraîner une douleur accrue, des saignements ou des contractions. Par mesure de sécurité, aucune injection ne sera administrée à des femelles ayant dépassé 16 jours de gestation.
Devenir
A la fin des procédures procédures tous les animaux seront euthanasiés pour pouvoir récupérer leur tissus (cerveau, oeil, gonades) et les analyser pour notre étude.
Remplacement
Afin de limiter autant que possible les expériences sur animaux vivants, nous utilisons, en parallèles des lignées de souris, des cultures cellulaires in vitro. Cependant, la détermination du programme de chaque cellule ne dépend pas seulement des facteurs génétiques. Les cellules communiquent entre elles et s’adaptent à leur environnement. Par conséquent, les facteurs spatiaux et temporels jouent un rôle crucial dans le bon développement du système nerveux central et sont impossibles à reproduire de manière identique in vitro. C’est pourquoi le recours à un modèle animal reste indispensable pour comprendre les mécanismes physiopathologiques qui mènent aux symptômes observés chez les patients. Les modèles animaux nous permettent de prendre pleinement en compte la complexité des interactions cellulaires et des influences environnementales dans le développement et la progression des maladies neurologiques, ce qui est essentiel pour notre compréhension globale de ces troubles et pour le développement de traitements efficaces.
Réduction
Nous utilisons une stratégie de croisement qui permet d'utiliser tous les animaux générés, indépendamment de leur sexe, réduisant ainsi le nombre total d'animaux produits. Pour optimiser au mieux l’utilisation de chaque animal, nous prélèverons systématiquement plusieurs organes (cerveau, yeux, gonades), et nous effectuerons une analyse complète des échantillons. Les protocoles utilisés ont été soigneusement choisis afin de réduire au maximum le nombre et l’ampleur des interventions pratiquées sur les animaux sans en compromettre l’efficacité.
Raffinement
Toutes nos interventions seront réalisées par des utilisateurs compétents et formés, réduisant ainsi le temps de manipulation et le stress pour les animaux. Les chirurgies seront effectuées sous anesthésie générale administrée par injection intrapéritonéale d'un mélange permettant à la fois une anesthésie générale, un bon relâchement musculaire et une couverture analgésique générale jusqu'à 24h après l'injection grâce à une combinaison d’un analgésique et d’un anti-inflammatoire. Pour les animaux maintenus en vie pendant et après la chirurgie, un protocole supplémentaire de prise en charge de la douleur sera mis en place. Ainsi, une anesthésie locale au niveau du site de la chirurgie sera administrée par une injection sous-cutanée pour les chirurgies crâniennes ou par l'application de collyre pour les injections dans les yeux. De plus, pour prévenir les infections post-opératoires, les animaux recevront un traitement antibiotique juste après la chirurgie. Ce traitement sera adapté à la nature spécifique de la chirurgie effectuée. Pour ce faire, une injection sous-cutanée de gentamicine ou l'application de crème ophtalmique antibiotique seront utilisées. Ces médicaments ont été choisis pour leur efficacité dans la prévention des infections et leur compatibilité avec les procédures chirurgicales réalisées. Enfin, un suivi quotidien des animaux en procédure sera assuré pour détecter tout signe de douleur avec une mise en place de points limites impliquant un arrêt immédiat de la procédure si la douleur ou l'inconfort détecté ne peut être soulagé dans les 24h.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris en raison de sa grande similarité génétique avec l'homme, ce qui en fait un modèle précieux pour étudier les gènes impliqués dans le développement du système nerveux central. De plus, les mécanismes neurodéveloppementaux que nous souhaitons étudier sont identiques chez la souris et l’homme et il existe déjà des lignées de souris transgéniques portant des mutations du gène Nr2f1 retrouvées chez les patients atteints du syndrome d’atrophie optique qui sont d’excellents modèles pour étudier cette maladie génétique. Dans ce projet, nous cherchons à comprendre comment différentes mutations du gène Nr2f1 affectent le développement du cerveau et des yeux. Ces mutations peuvent entraîner des dysfonctionnements dans le développement de ces organes, conduisant aux symptômes observés chez les patients. Dans ce but, nous analyserons différents stades de développement embryonnaires et postnataux chez des modèles de souris de cette maladie. Nous commencerons notre étude à 10,5 jours embryonnaires où, chez la souris, les bases du cortex cérébral et des yeux sont établies. Puis nous progressons à travers plusieurs autres stades embryonnaires (12.5 ; 14.5 ; 16.5 et 18 jours embryonnaire) où les structures cérébrales et oculaires continuent à se former et à se différencier. Chez les souris, tout comme chez les humains, le système nerveux central continue à se développer et à mûrir après la naissance, notamment par la myélinisation des fibres nerveuses. Pour cette raison, nous étudierons également plusieurs stades postnataux, jusqu'à ce que le processus de myélinisation soit complet. L’expression de Nr2f1 étant maintenue à l’âge adulte, nous analyserons aussi des souris adultes pour voir l’impact des mutations étudiées sur un système nerveux central pleinement mature.
Immunisation chez la souris en vue de la génération d’hybridomes pour produire des anticorps.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Tuées pour qu'on récupère leur sang et leur rate, 100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit cinq injections sous-cutanées d'un peptide mélangé à de l'adjuvant de Freund incomplet, dont le porteur indique qu'il provoque des douleurs articulaires, en plus d'une rougeur, d'une inflammation et d'une élévation de température pendant les 72 heures suivant chaque inoculation. Cinq prélèvements sanguins suivent, puis une thoracotomie et une ponction cardiaque de quinze à vingt minutes. Le porteur qualifie d'"indispensable" le recours à la souris faute de méthode in vitro fiable pour produire des anticorps spécifiques, tout en décrivant l'étape suivante du projet, l'immortalisation des cellules de rate prélevées, comme permettant une production infinie d'anticorps sans utiliser d'autres animaux.
Objectifs
Ce projet vise à développer des anticorps polyclonaux anti peptide et d’en dériver des lignées d’hybridomes monoclonaux sécrétant de façon infinie les anticorps ciblant ces peptides. 25 peptides d’intérêt majeur dans la lutte contre les infections bactériennes ont été identifiés et caractérisés par le laboratoire. La production d’anticorps dirigés contre ces peptides permettra dans un premier temps d’obtenir des outils utiles pour développer nos travaux de recherche et dans un second temps d’envisager leur utilisation dans des tests diagnostiques et dans des biothérapies. Le but final est de diminuer ou remplacer les antibiotiques dans le traitement de maladies infectieuses à germes multirésistants.
Bénéfices attendus
Dans un premier temps, il s'agit d’obtenir des outils pour développer nos travaux de recherches et définir plus précisément le rôle de chaque peptide dans la virulence et la pathogénicité de différents germes tel que Staphylococcus aureus ou Pseudomonas aeruginosa. Dans un second temps nous envisageons leur utilisation dans des tests diagnostiques et dans des biothérapies visant à remplacer les antibiotiques dans le traitement de maladies infectieuses à germes multi résistants.
Procédures
5 injections sous-cutanée à but vaccinal d'une durée de 5 à 10 minutes maximun suivant le temps d'endormissement, 5 prélèvements sanguins de 30 secondes pour un suivi sérologique de la réponse immune. Une thoracotomie et un prélèvement cardiaque d'une durée de 15 à 20 minutes. Toutes ces procédures seront effectuées sous anesthésie générale profonde
Impact sur les animaux
Comme dans la plupart des procédures vaccinales, on s’attend à une rougeur, une inflammation et une douleur au site d’injection pendant les 72h qui suivent l’inoculation ainsi qu’une élévation de la température corporelle. L’utilisation d’adjuvant de Freund incomplet induit aussi des douleurs articulaires.
Devenir
Le but final de ce projet est la production d'anticorps polyclonaux et monoclonaux dirigés contre des peptides d'intérêt à visée thérapeutique anti-infectieux. Les animaux après vaccination suivront la procédure 2 et seront mis à mort pour récupérer leur sang contenant les anticorps polyclonaux et leur rate contenant les cellules productrices d'anticorps.l'immortalisation de ces cellules spléniques a pour but la génération d'hybridomes sécrétant de façon infinie des anticorps monoclonaux.
Remplacement
Concernant la première étape de ce projet il est indispensable d’avoir recourt à l’animal car il n’existe pas de méthode fiable in-vitro pour la production d’anticorps spécifiques de molécules. Cependant, afin de remplacer les animaux dans la production massive d’anticorps, nous allons procéder à l’immortalisation des cellules productrices de nos anticorps (générées durant la première étape au sein de la rate) pour obtenir des lignées cellulaires stables permettant une production infinie de nos anticorps sans avoir recourt à d'autres animaux.
Réduction
Dans le cadre de la réduction du nombre d’animaux nous utiliserons 4 souris maximum par peptide. Par expérience la quantité d’anticorps polyclonaux obtenue sera suffisante pour nos premiers travaux de recherche. La génération des lignées d’hybridome (sécrétant les anticorps monoclonaux) aura deux impacts sur la réduction des animaux utilisés. Le premier et le plus direct concerne la production en masse des anticorps en culture cellulaire animale et le deuxième est la mise en place après séquençage des régions variables de nos anticorps d’une production d’anticorps recombinant dans un système d’algue éliminant ainsi l’utilisation de sérum de veau fœtal très consommateur d’animaux.
Raffinement
Afin de répondre au principe de raffinement les prélèvements de sang permettant d’effectuer le suivi sérologique de l’apparition des anticorps seront effectués en sub-mandibulaire sous anesthésie générale à l’isoflurane. Les volumes seront limités à 50µl soit environ 2 gouttes. Durant les 72h suivant chaque injection d’immunogène les animaux recevront du paracétamol dans l’eau de boisson. Une surveillance particulière sera effectuée après le premier rappel et jusqu’à la fin de la procédure par la mesure d’un score clinique quotidien basé sur le mouse grimace scale. Pour un score allant de 2 à 3 les animaux seront maintenus sous paracétamol au-delà de 3 les animaux concernés seront mis à mort pour suivre la procédure de prélèvement final. L’ensemble des règles d’hébergement en accord avec l’agrément de notre établissement utilisateur sera évidemment respecté à savoir enrichissement, température, taille des cages, cycle jour/nuit et visite quotidienne.
Choix des espèces
La souris est l’espèce la plus utilisée pour l’obtention d’anticorps. Elle permet d’obtenir une réponse immune avec très peu d’immunogène (facteur souvent limitant par le cout de production et de purification des immunogènes ici des peptides). De plus le myélome permettant l’immortalisation des cellules productrices d’anticorps est murin et facilite donc la création d’hybridomes sécréteur d’anticorps d’intérêt. Les souris auront un âge compris entre 6 et 10 semaines période où le système immunitaire est parfaitement fonctionnel.
Etude des récupérations sensorimotrices chez le rat après lésion de la moelle épinière et implantation d’une matrice contenant des cellules souches issues du tissu adipeux.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Soumis à une contusion de la moelle épinière au niveau thoracique, 125 rats mâles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, cinq autres étant anesthésiés et tués sans réveil pour prélever la graisse dont sont tirées les cellules souches implantées. Tous sont tués à l'issue. Après l'opération, chaque rat est testé quinze minutes par semaine pendant trois mois sur sa récupération sensorimotrice, puis soumis à un enregistrement électrophysiologique d'une heure. Le porteur décrit des troubles de la miction imposant des massages manuels de la vessie, des douleurs pouvant persister trois semaines et, rarement, de l'automutilation. L'effectif reste ouvert entre 25 et 130 animaux selon les premières vagues, le porteur prévoyant d'abandonner l'étude s'il ne parvient pas à dégager de différence entre les groupes.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier l’efficacité de cellules souches issues du tissu adipeux et mises en culture sur un support 3D. Il s’agira d’étudier chez le rat mâle Sprague Dawley, une nouvelle stratégie thérapeutique consistant, après une contusion spinale thoracique, à réparer ou préserver la moelle épinière à l’aide d’un hydrogel contenant des cellules souches. L’objectif principal étant de réduire les déficits post-traumatiques et d’entraîner une récupération sensori-motrice la plus complète possible. A terme, ces résultats pourraient être transférés aux bénéfices des patients ayant subi des dommages de la moelle épinière. L’évaluation qui portera sur la récupération sensorimotrice et l’activité électrophysiologique (réflexe H : réflexe spinal monosynaptique entre les fibres afférentes proprioceptives Ia et les fibres motrices efférentes issues des motoneurones-α, activité des fibres nerveuses, ajustements ventilatoires) sera complétée par des analyses histologiques et biochimiques.
Bénéfices attendus
Dans le domaine de la réparation de la moelle épinière, malgré une recherche intensive depuis les cinquante dernières années, à ce jour aucune stratégie thérapeutique n’a été proposer afin de limiter la progression des déficits fonctionnels post-lésionnels et d’entraîner des récupérations sensori-motrices suffisantes permettant une récupération de l’autonomie des patients. Des études récentes très prometteuses ont montré que les cellules souches issues du tissu graisseux semblent entraîner une récupération fonctionnelle, une neurogenèse et une neuroprotection après lésion de la moelle épinière. Les cellules souches apparaissent comme une alternative prometteuse pour préserver et réparer la moelle épinière endommagée. Toutefois, ces études n’ont pas permis d’obtenir des résultats suffisamment marqués pour envisager une application chez des patients blessés médullaires car les cellules prélevées étaient mises en culture sur un support matriciel 2D ne permettant pas d’exprimer toutes leurs potentialités. Notre étude pré-clinique vise à tester l’efficacité thérapeutique de cellules souches mises en culture sur un support 3D en vue de proposer une thérapie transférable à l’Homme. Elle représente donc une étape très importante avant un transfert vers la clinique humaine.
Procédures
Chirurgie lésionnelle : n=1, durée : 1h ; Test sensorimoteurs : 1 fois par semaine pendant 3 mois, durée : 15 min ; Enregistrements électrophysiologiques : n=1, durée : 1h
Impact sur les animaux
La contusion spinale thoracique entraîne des déficits sensorimoteurs sous-lésionnels, ainsi que des troubles végétatifs, notamment en ce qui concerne la miction. Des douleurs peuvent également être présentes, ainsi qu’une perte de poids, une déshydratation ou une dénutrition. La littérature scientifique et notre expérience indiquent que les troubles végétatifs et les douleurs liées à la chirurgie peuvent persister jusqu’à 3 semaines selon le type et l’importance de la lésion spinale, ce qui nécessite une évaluation quotidienne des animaux. Toutefois, il faut noter que les lésions nerveuses centrales peuvent rarement conduire à de l’autophagie. Les autres nuisances éventuelles pouvant être rencontrées chez les animaux sont les infections liées à la chirurgie, les effets secondaires post-anesthésie, les douleurs liées aux injections intrapéritonéales, le stress liés à leur manipulation (pour anesthésie, mesure périodique du poids…) ou lors des tests comportementaux.
Devenir
A l'issu des procédures expérimentales, les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Le rat est un mammifère dont les mécanismes neurobiologiques mis en œuvre après une lésion de la moelle épinière sont proches de ceux de l’humain. Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation de mammifères pour réaliser notre étude pré-clinique. Les études in vivo n’utilisant pas des mammifères ou celles in vitro réalisées à partir de cellules issues de mammifères livrent une quantité́ infime d’informations au regard de ce qu’il pourrait se passer chez l’Homme. Notre projet vise donc à proposer une nouvelle stratégie de préservation et/ou réparation de la moelle épinière directement transférable vers la clinique humaine. Pour cette raison, l’utilisation de mammifères est absolument indispensable et nécessaire. Il n’existe pas d’alternative au modèle animal in vivo. Pour cela, nous avons choisi d’utiliser des rats plutôt que des primates non humains, des bovidés, des porcidés, des canidés, des félidés… ou des murinés du genre Mus dont nous n’avons aucune expertise en termes de récupération après une lésion de la moelle épinière.
Réduction
Un à cinq animaux seront nécessaires pour prélever de la graisse à partir de laquelle les cellules souches seront isolées pour être mises en culture. Afin de mener à bien notre projet, nous devrons constituer 5 groupes expérimentaux. Ces groupes seront constitués de rats males Sprague Dawley d’environ 250 g (environ 2 mois d’âge) lors de la chirurgie initiale. Des males seront choisis en raison de l’absence d’importants cycles hormonaux mensuels pouvant introduire une grande variabilité dans les résultats attendus. Dans un souci de réduction du nombre d’animaux, chaque animal opéré sera engagé dans les 3 étapes expérimentales successives décrites dans la chronologie du protocole. Dans la mesure où la comparaison des résultats entre les groupes sera réalisée avec des tests statistiques paramétriques (analyse de la variance), nous prévoyons, au regard de nos expériences passées, d’inclure initialement dans chaque groupe au maximum 25 (+ 5 pour l’extraction des cellules souches) animaux, soit un total de 125 (+ 5 pour l’extraction des cellules souches) animaux. Toutefois, afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, nous enrôlerons, dans un premier temps, 5 (+ 1 pour l’extraction des cellules souches) animaux par groupe, soit un total de 25 (+ 1 pour l’extraction des cellules souches) animaux. A l’issue de cette première vague expérimentale, nous calculerons, au regard des résultats obtenus et de la variabilité intergroupe, d’une puissance de 80% et d’un seuil de significativité de 5%, avec un test statistique approprié, les effectifs nécessaires pour pouvoir montrer une différence entre le groupe traité et ceux non-traités. Si le calcul indique que les effectifs nécessaires sont supérieurs à ceux envisagés initialement ou qu’aucune différence intergroupe ne peut être dégagée pour un nombre d’animaux par groupe inférieur ou égal à celui initialement prévu, nous abandonnerons l’étude et conclurons à l’inefficacité du traitement thérapeutique.
Raffinement
Du gel ophtalmique sera utilisé au cours de la chirurgie afin d’éviter l’assèchement de la cornée. Une injection d’antalgique sera réalisée avant les chirurgies et une injection de sérum physiologique glucosée permettra de réhydrater les animaux en fin de chirurgie. Une couverture antibiotique (dans l’eau de boisson renouvelée toutes les 12h), ainsi qu’un traitement antalgique seront administrés au cours de la semaine suivant la chirurgie afin de réduire les éventuelles infections et douleurs post-chirurgicales. L’observation détaillée quotidienne (7j/7) de l’état de santé des animaux (à l’aide de la grille d’évaluation jointe en Annexe) et l’évaluation de l’expression faciale permettront de prendre l’ensemble des mesures destinées à réduire la douleur et le stress. En cas de trouble de la miction, des massages seront réalisés afin de vidanger la vessie jusqu’à reprise d’une miction naturelle. Les animaux atteignant le point limite seront euthanasiés selon la procédure réservée aux animaux éveillés. Au cours des 7 jours suivant la chirurgie, les animaux seront placés seuls dans une cage le temps que les plaies cicatrisent afin d’éviter les blessures et réouverture des plaies que pourraient occasionner les congénères. Toutefois, même si les animaux sont placés seuls dans leur cage enrichie avec des objets (tubes en polycarbonate rouge, morceaux de carton, papier, petites pièces de bois en peuplier…), ils ne seront pas à l’isolement. Leurs cages seront placées sur des portoir de cages à côté des cages des autres animaux. De l’eau et de la nourriture seront données ad libitum. A l’issue de cette période critique, ils seront replacés avec leurs congénères dans des cages enrichies avec des objets (tubes en polycarbonate rouge, morceaux de carton, papier, petites pièces de bois en peuplier…) et de l’eau et de la nourriture données ad libitum. L’hébergement des animaux sera réalisé dans l’animalerie du laboratoire. Nous nous efforcerons à chaque instant d’affiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins et des gestes adaptés.
Choix des espèces
Les mécanismes neurobiologiques mis en œuvre chez les mammifères après une lésion de la moelle épinière sont proches de ceux de l’humain. Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation de mammifères pour réaliser notre étude pré-clinique. Par ailleurs, nous avons choisi d’utiliser des rats plutôt que des primates non humains, des bovidés, des porcidés, des canidés, des félidés… ou des murinés du genre Mus dont nous n’avons aucune expertise en termes de récupération après une lésion de la moelle épinière et dont la littérature scientifique est très pauvre en ce qui concerne l’utilisation de ces genres. De plus, nous disposons de plateformes d’analyse du mouvement et des dispositifs d’enregistrement électrophysiologiques uniquement destinés aux genres Mus et Rattus. Les animaux seront des jeunes adultes de 250 g, c’est-à-dire de 2 mois d’âge environ. Afin d'étudier les processus régénératifs et la plasticité nerveuse, il est impératif d'utiliser des jeunes adultes.
Traitements visant à réduire les symptômes lors d’une coïnfection entre nématodes intestinaux et malaria
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par gavage avec un nématode intestinal, puis par injection dans l'abdomen d'un parasite du paludisme, subissent sept prélèvements de sang en vingt et un jours par incision de la queue puis retrait de la croûte de cicatrisation, et reçoivent jusqu'à six injections de traitement. La coïnfection provoque une anémie plus marquée et plus longue qu'une infection isolée, le porteur qualifiant par ailleurs l'infestation par le ver d'asymptomatique. Il conclut que les interactions entre l'hôte, le ver et le parasite ne peuvent pas être reproduites in vitro, et que les souris ne peuvent pas être réutilisées, leur système immunitaire n'étant plus naïf.
Objectifs
L’objectif du projet est d’identifier des traitements possibles en vue d’améliorer les symptômes de la coïnfection entre nématodes intestinaux et malaria. Les infections par des nématodes intestinaux sont toujours très prévalentes dans les pays en voie de développement et on estime que 3 milliards d’êtres humains souffrent d’au moins une infection par des helminthes au cours de leur vie. La carte de prévalence des infections par des helminthes coïncide en grande partie avec celle d’endémicité du paludisme, et on constate que souvent ces populations sont coïnfectées par les deux parasites. La coïnfection entraine des dynamiques différentes par rapport à celles observées quand les helminthes ou les Plasmodiums infectent seuls leurs hôtes et cela a des conséquences sur l’état de santé des individus coïnfectés. En particulier, lorsque Plasmodium infecte un hôte préalablement infecté par le nématode, on constate une aggravation des symptômes par rapport aux cas où les hôtes sont uniquement infectés par Plasmodium. Dans ce projet, nous souhaitons évaluer l’efficacité de certains traitements pouvant contribuer à améliorer les symptômes en cas de coïnfection.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à identifier les mécanismes pouvant jouer un rôle dans l’aggravation des symptômes produits par Plasmodium lors de coïnfections avec un nématode intestinal. Ces parasites infectent des millions de personnes chaque année dans les pays du Sud en voie de développement. On estime que 600.000 personnes décèdent chaque année des suites d’une infection par une des espèces de Plasmodium, essentiellement en Afrique subsaharienne. Ces mêmes personnes souffrent souvent d’infections chroniques par différentes espèces d’helminthes. Dans le cas de coïnfection, on constate souvent une aggravation des symptômes induits par Plasmodium. Notre projet vise donc à identifier des pistes thérapeutiques pouvant améliorer les symptômes observés dans les cas de coïnfection.
Procédures
Les animaux sont soumis aux interventions suivantes (tous les animaux ne sont soumis à toutes ces interventions, cela dépendant des groupes expérimentaux): gavage à l’aide d’une sonde souris, une seule fois, durée
Impact sur les animaux
Le nématode produit des infections asymptomatiques (aucun changement comportemental ou dans l’apparence de l’animal n’est constaté). Très rarement (< 1% des cas), l’émergence des vers peut provoquer une augmentation de la perméabilité intestinale. Etant donné que les animaux sont surveillés quotidiennement et deux fois par jours pendant la période d’émergence des vers, si on constate une détérioration de l’état de santé des souris elles sont immédiatement retirées de l’expérience et euthanasiées par dislocation cervicale sous anesthésie à l’isoflurane. Plasmodium yoelii 17X NL est une souche non létale. L’infection produit une lyse des globules rouges entrainant une anémie transitoire (culminant entre les jours 14 et 16 post-infection). A partir de jour 24 post-infection les valeurs de concentration de globules rouges par microlitre de sang reviennent à la normale. Cependant, en cas de coïnfection on constate des niveaux plus importants d’anémie et un temps de récupération plus long. L’infection avec le nématode est effectuée par gavage (intervention réalisée en quelques secondes), à l’aide d’une sonde souris (rigide). Chaque individu n’est gavé qu’une seule fois avec un petit volume d’eau. L’infection avec Plasmodium est effectuée par injection intrapéritonéale (intervention réalisée en quelques secondes). Les traitements avec l’érythropoïétine et l’hémopexine nécessitent trois et six injections intrapéritonéales respectivement. Ces injections seront au minimum espacées d’un jour. Les prélèvements de sang sont réalisés en pratiquant une petite incision à la pointe de la queue pour le premier et en ôtant la croute de cicatrisation pour les prélèvements successifs. Deux prélèvements maximum par semaine sont réalisés. Ces différentes interventions ne concernent pas toutes les souris. Un chronogramme fourni en annexe indique les interventions pour chaque groupe expérimental.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort car ils ne peuvent pas être réutilisés dans d’autres expériences, n’ayant plus une réponse immunitaire naïve par rapport aux parasites utilisés.
Remplacement
L’objectif de notre étude est d’explorer des mécanismes pouvant conduire à l’aggravation des symptômes induits par Plasmodium chez les hôtes coïnfectés et de tester des traitements visant à améliorer ces symptômes. Ceci met en jeu des interactions complexes entre les trois acteurs (l’hôte, le nématode et le Plasmodium) qui ne peuvent pas être reproduites in vitro.
Réduction
L’effectif de souris utilisé dans ce projet a été calculé afin d’en minimiser le nombre tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour obtenir des résultats fiables. Il s’agit en effet de 10 souris par groupe expérimental.
Raffinement
Plusieurs mesures sont prises pour réduire au minimum l’inconfort et le stress des animaux utilisés dans ce projet. D’abord, tous les animaux sont hébergés en groupe (5 individus par cage) afin de permettre l’expression des comportements sociaux. Toutes les cages sont enrichies et ont du matériel pour la construction de nids. Toutes les manipulations sont effectuées par du personnel expérimenté, dans un environnement calme qui minimise le stress des animaux. Dans la mesure du possible, les animaux sont transférés d’une cage à l’autre grâce à la technique du tunnel (au lieu de la préhension par la queue) ce qui a été démontré réduire le stress des animaux. Enfin, tous les animaux sont surveillés au moins une fois par jour pour évaluer leur état général. Si une dégradation de l’état de santé est constatée, nous utiliserons une grille quantitative de notation qui permet de définir des points limites suffisamment prédictifs
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour ce type d’expérience. Les parasites sont des parasites spécifiques de souris qui reproduisent assez fidèlement les coïnfections observées chez l’homme entre nématodes intestinaux et malaria. Nous utiliserons des animaux entre 8 et 10 semaines. Il s’agit d’individus adultes avec une système immunitaire complétement développé.
Rôle de la signalisation ocytocinergique dans la modulation des comportements douloureux lors d’une interaction sociale
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Opérés deux heures sous anesthésie puis injectés d'une substance inflammatoire dont la douleur n'est pas soulagée, parce qu'elle est l'objet même de l'étude, 1 760 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélèvement. Les chirurgies peuvent provoquer inflammation, infection des points de suture, hypothermie et perte de poids. Le projet cherche à savoir si la présence d'un congénère atténue la douleur, et par quels circuits neuronaux l'ocytocine y participe. Les tests comportementaux, deux par animal et vingt minutes chacun, ne sont désignés que par ce terme, sans qu'aucun ne soit nommé.
Objectifs
Notre but sera de mieux comprendre les interactions entre les relations sociales et l'atténuation de la douleur. Pour ce faire, notre stratégie de recherche s'articule autour de deux objectifs successifs et complémentaires : Dans un premier temps, nous analyserons l’activité des réseaux neuronaux impliqué dans ces interactions puis, nous étirons la relation entre les interactions entre les relations sociale et la douleur grâce à différents tests comportementaux.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à décrypter les mécanismes et les circuits neuronaux qui relient la modulation émotionnelle de la douleur par l'intermédiaire des interactions sociales, en mettant l'accent sur un modulateur endogène : l'ocytocine. La douleur chronique touche près de 8 % de la population mondiale, ce qui en fait un fardeau majeur dans notre société moderne. Il a été prouvé que l'ocytocine est au cœur des dysfonctionnements sociaux, ce qui a un impact sur les patients souffrant de douleur chronique et vice versa. Cependant, les circuits neuronaux médiant la régulation émotionnelle du comportement douloureux vis-à-vis des interactions sociales sont largement inconnus. Le bénéfice scientifique de ce projet est de fournir une compréhension détaillée des circuits neuronaux et des mécanismes permettant cette régulation émotionnelle de la douleur et des comportements sociaux..
Procédures
Les animaux seront soumis à principales intervention : 1. Une chirurgie de 2 heures sous anesthésie générale et analgésie générale et locale. 2. Une injection de subtance inflammatoire sur un animal anesthésié et analgésié d’une durée de 5 minutes. 3. Des tests comportementaux de 20 minutes (au maximum de 2 par animal) avec un intervalle de 1 jour entre chaque tests.
Impact sur les animaux
Le modèle inflammatoire ne peut être soulagé étant l’objet de l’étude. L’objectif de la recherche est d’évaluer si l’interaction sociale peut atténuer la douleur. Les chirurgies induisent des douleurs modérées et transitoires. Elles peuvent induire des inflammations, des infections notamment au niveau des points de suture mais aussi une perte de masse de l’animal. Une hypothermie des animaux est également attendue lors des chirurgies. La manipulation des animaux peut induire un léger stress, normalement atténué par la période d’habituation systématiquement appliquée, tant à l’expérimentateur qu’au geste technique effectué
Devenir
Les animaux seront systématiquement mis à mort pour prélèvement post-mortem afin de réaliser des analyses.
Remplacement
Pour étudier l'aspect complexe, sensoriel et émotionnel de la douleur, sa relation avec les interactions sociales et les mécanismes des circuits cérébraux sous-jacents, l'utilisation d'animaux dotés d'un cortex développé est indispensable. Il n'est donc pas possible d'utiliser des modèles in vitro tels que la culture cellulaire ou un modèle mathématique complet. À cette fin, les rongeurs sont les modèles animaux les plus appropriés en raison des conditions d'élevage et de la possibilité de comparer et de confronter les résultats obtenus avec la littérature et les données cliniques.
Réduction
Le nombre d'animaux sera limité au minimum selon les règles statistiques de façon à garantir des enregistrement fiables exploitables statistiquement. Les résultats seront comparés avec des tests statistiques appropriés permettant d’émettre en évidence le rôle de l’ocytocine dans le comportement douloureux en lien avec les interactions sociales
Raffinement
Pour répondre aux besoins comportementaux des animaux, ils seront hébergés en cages collectives (groupes sociaux) enrichies (bâtons, frisure, tunnel en carton) permettant ainsi aux animaux d’exprimer leur comportement naturel. Les animaux seront préalablement acclimatés à leur environnement (2 semaines avant l’expérimentation) et habitué à la présence de l’expérimentateur, aux différents tests le cas échéant, et à la contention. Les approches invasives seront réalisées sou anesthésie analgésie. La température corporelle de l’animal sera garantie par des tapis chauffant thermostaté et le dessèchement de la cornée sera prévenu par application d’un gel oculaire hydratant. Pour faciliter la récupération post-opératoire de l’animal un traitement analgésique sera mis en place et de la nourriture gélifiée appétante sera ajoutée sur le sol de la cage. L’état de santé des animaux sera évalué à l’aide d’une grille de score et des points limites précoces permettant d’interrompre les procédures et de mettre fin à la souffrance animal ont été définis.
Choix des espèces
Le recours à l’animal est nécessaire dans l’étude des phénomènes complexes d’interactions douleur et interactions sociales ; à ce jour aucune approche alternative n’est existante. Le modèle expérimental chez le rat est un standard pour ce type d’expériences et comporte une série de symptôme superposable avec la pathologie humaine (syndrome de Pradder-Willy, anxiété chronique, douleurs inflammatoires …). De nombreuses études sont réalisées concernant les réseaux neuronaux ocytocinergiques chez les rats : les outils sont donc bien validés sur cette espèce, ce qui concourt à assurer la fiabilité des résultats obtenus, leur interprétation ainsi que leur comparaison avec la littérature. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, ce qui correspond à environ 8 semaines. lorsque l’encéphale et donc les circuits neuronaux sont parfaitement mâtures.