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Activité neuronale oscillatoire dans les circuits des ganglions de la base pendant le mouvement normal et pathologique: Au-delà des gammes de fréquences (1/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Deux chirurgies crâniennes de trois à cinq heures chacune, des injections quotidiennes de neurotoxine pendant six mois au maximum, puis une séance d'enregistrement d'une heure par jour cinq jours sur sept pendant douze mois : 6 macaques à longue queue sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue. Le MPTP leur provoque un syndrome parkinsonien permanent, avec rigidité musculaire, tremblements au repos, posture anormale et, selon la sévérité, des difficultés à s'alimenter, une perte de poids et des escarres. Chaque animal est capturé au collier dans sa volière et habitué à rester assis dans une chaise de contention, son cerveau étant retiré du crâne après sa mort pour localiser les sites d'enregistrement. Le porteur précise que le choix entre macaque à longue queue et macaque rhésus dépendra des possibilités d'approvisionnement, dans un contexte qu'il décrit comme une pénurie de singes pour la recherche.
Objectifs
Dans la maladie de Parkinson, le ralentissement et l’absence de mouvements volontaires s’accompagnent d’activités oscillatoires anormales dans un réseau de structures localisées sous le cortex cérébral, aussi appelé les ganglions de la base. Néanmoins, le lien entre ces activités oscillatoires pathologiques et les troubles moteurs caractéristiques de la maladie de Parkinson reste flou malgré des décennies de recherche. D'une part, la concomitance entre la réduction/abolition de ces activités oscillatoires suite à des traitements pharmacologiques et/ou à des procédures chirurgicales et l'amélioration clinique des troubles moteurs suggère un lien de causalité entre ces oscillations neuronales et la planification, le contrôle et la coordination des mouvements. D'autre part, il a été démontré que le ralentissement et l’absence de mouvements volontaires peuvent apparaître avant l'émergence des activités oscillatoires dans les ganglions de la base. De plus, les caractéristiques de ces oscillations neuronales peuvent varier en fonction des différentes structures qui composent le réseau des ganglions de la base. Notre plan de recherche est structuré en trois objectifs complémentaires. Le projet vise à (i) caractériser comment ces activités oscillatoires se produisent et comment elles se propagent dans les différentes structures des ganglions de la base chez des singes parkinsoniens effectuant des mouvements de bras volontaires en direction d’une cible; (ii) identifier le lien entre les caractéristiques de ces oscillations neuronales dans différentes structures du réseau des ganglions de la base et les mouvements normaux/anormaux; (iii) développer de nouvelles approches thérapeutiques permettant une inversion rapide et robuste des changements neuronaux et comportementaux.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à développer des approches thérapeutiques innovantes pour la maladie de Parkinson qui diffèrent significativement des thérapies actuellement disponibles et qui ne peuvent être développées sans une profonde compréhension mécanistique et quantitative de la façon dont le cerveau remplit ses fonctions ainsi que des mécanismes qui sous-tendent ses dysfonctionnements. Ce projet permettra de comprendre les mécanismes de génération et de propagation des activités oscillatoires anormales observées dans les ganglions de la base chez des singes après induction d’un syndrome parkinsonien et révèlera le lien avec les symptômes moteurs parkinsoniens. Ce projet sera donc extrêmement intéressant pour les personnes souhaitant développer de protocoles thérapeutiques originaux visant à restaurer le fonctionnement normal du cerveau. A terme, ce projet aidera à soulager les troubles moteurs des patients souffrant de la maladie de Parkinson tout en minimisant l'apparition d'effets secondaires et donc participera à améliorer leur qualité de vie.
Procédures
Chaque animal subira une IRM pour obtenir une image morphologique 3D du cerveau (30min de transport jusqu'à l'IRM et 180min de procédure). Chacun des animaux sera également soumis à deux chirurgies d'une durée de 3à 5h chacune. La première chirurgie permettra l'injections de particules virales inactivées dans le cerveau visant à modifier les caractéristiques des neurones, et l'implantation d'électrodes d'enregistrements pour recueillir l'activité de ces neurones. La seconde chirurgie permettra l'implantation d'électrodes permettant de délivrer différentes intensités de courant électrique dans le cerveau pour restaurer son fonctionnement normal. Chaque animal subira également une injection intramusculaire quotidienne d'une substance chimique inerte et sans danger pour l'animal visant à manipuler l'activité des neurones dont les caractéristiques ont été modifiées préalablement (une injection par jour d'environ 20 à 30s, 5 jours par semaines durant 3 à 6 mois environ). L'induction du syndrome parkinsonien chez les animaux se fera grâce à des injections quotidiennes intramusculaires (une injection par jour d'environ 20 à 30s pendant n jours) d'une neurotoxine (appelé MPTP) qui provoque des symptômes permanents de la maladie de Parkinson. Le nombre de jours d'injection et le dosage de cette neurotoxine dépendra de la progression du syndrome (mais n'excédera pas plus de 6 mois). Enfin, chaque animal participera à une séance quotidienne d'enregistrements électrophysiologiques de l'activité neuronale (une séance d'environ 1h par jour, 5 jours par semaine durant 12 mois environ).
Impact sur les animaux
La phase précoce de conditionnement et de l'entrainement (c'est-à-dire la capture de l'animal dans la volière à l'aide d'un colier, l'entrainement de l'animal dans la tâche comportemental) peut stresser les animaux. Au cours de la procédure IRM, les nuisances sont essentiellement liées à l'anesthésie qui peut entrainer une baisse de la température corporelle, des troubles respiratoires et/ou cardiaques. Durant le transport à l'IRM, il faut également être très prudent afin que l'animal ne se blesse pas (par exemple plaies/coupures ) avec la cage de transport. De plus, des douleurs et infections peuvent survenir suite aux interventions chirurgicales . Enfin, l'induction du syndrome parkinsonien provoquera l'apparition de symptômes moteurs (c'est-à-dire des difficultés à effectuer des mouvements, une rigidité musculaire, une posture anormale et des tremblements au repos). Par ailleurs, selon la sévérité de ces symptômes parkinsoniens, les animaux pourront présenter des difficultés à s'alimenter et à bouger pouvant donc entrainer une perte de poids et l'apparition d'escarres.
Devenir
Une fois la procédure terminée, les animaux seront profondément anesthésiés et euthanasiés afin de pouvoir effectuer des analyses histochimiques post-mortem qui sont indispensables pour localiser les sites d'enregistrements de l'activité neuronale et l'aspect du cerveau après l’induction du syndrome parkinsonien. Après constatation de la mort de l’animal, le cerveau sera retiré du crâne, congelé pour procéder aux analyses histologiques.
Remplacement
Notre projet a pour but de caractériser les dysfonctionnements qui se produisent dans le cerveau après induction d'un syndrome parkinsonien et de déterminer les conséquences sur le comportement afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour les patients atteints de la maladie de Parkinson. Ce type de projet ne peut donc pas être effectué via des approches in silico, in vitro ou ex vivo et l'approche in vivo est indispensable. De plus, les singes ont un cerveau et des comportements semblables à l'homme ce qui permet de développer des tâches comportementales complexes et susceptibles de refléter les comportements humains. L'utilisation de rongeurs ou d’autres espèces de vertébrés n'est donc pas appropriée et nous sommes obligés d'utiliser des primates non-humains.
Réduction
Notre objectif est de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés pour la recherche. Nous y parvenons en planifiant soigneusement et en maximisant les données obtenues chez chaque animal. Ainsi, chaque animal sera son propre contrôle, ce qui diminuera par deux le nombre total d’animaux utilisé pour ce projet. Le nombre d'animaux a été choisi en fonction des pratiques standards qui combinent l'étude de l'activité neuronale et l'étude du comportement chez les primates non-humains. Enfin, notre stratégie de libre accès aux données sera essentielle non seulement pour les avancées scientifiques, mais aussi pour des raisons éthiques. En effet, il n'est pas nécessaire de réaliser davantage d'expériences sur les animaux si les données sont déjà disponibles quelque part dans le monde.
Raffinement
En début de protocole et durant 3 mois, l’expérimentateur habituera les animaux à sa présence (15-30min par jour, 5 jours par semaine). L’expérimentateur apprendra à l’animal à se laisser attraper par son collier à l’aide d’une canne et à rester calmement assis dans une chaise de travail (5 jours par semaine). Pendant la durée totale des expériences, les animaux seront maintenus en groupe et bénéficieront d'un environnement enrichi (jouets, musique). Le transport de l’animal vers la plateforme de bio imagerie située à 200m de l’animalerie se fera à l’aide d’une boîte de transport dédiée mise sur un chariot et protégée des regards extérieurs par une housse. L’animal anesthésié sera maintenu au chaud sous une couverture et bordé d’une bouillotte. Au total, la durée de l'examen sera de 30min de transport et 180min de procédure. Les chirurgies seront réalisées de façon stérile et sous anesthésie profonde. Une couverture antalgique en pré- et post-opératoire sera utilisée pour limiter la douleur de l’animal après l’intervention chirurgicale. Enfin, pour limiter la douleur que peuvent engendrer les incisions cutanées, nous administrons un anesthésique local avant incision. Pour le contrôle de la température, avant l’induction de l’anesthésie, une sonde sera insérée dans le rectum des animaux. De plus, durant la totalité de la chirurgie, les animaux seront placés sous une couverture (électrique) chauffante qui est régulée en fonction de la température corporelle. Suite aux chirurgies, les animaux seront quotidiennement observés durant 5 à 7 jours post-chirurgie par le personnel de l'animalerie sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition etc. Une attention toute particulière sera porté aux risques d'infections, d'abcès, d'œdèmes et d'inflammation. Durant l'induction du syndrome parkinsonien, les animaux seront également quotidiennement observés pour évaluer la sévérité de la maladie et induire un syndrome parkinsonien stable et modéré. Si les symptômes s'accentuent (difficultés à s'alimenter et à bouger, pouvant entrainer une perte de poids et l'apparition d'escarres), l'animal sera immédiatement sorti du protocole et séparé des autres animaux, de façon à sécuriser son hébergement et éviter qu’il se blesse. De plus, des précautions particulières seront prises telles que l'utilisation de matelas moelleux/alèses et de fréquents changements de position pour éviter les chocs et le développement d'escarres.
Choix des espèces
Contrairement à d'autres espèces de vertébrés (e.g., rongeurs), le macaque possède une organisation du cerveau semblable à celle de l'homme. De plus, le macaque possède un répertoire de comportements plus large et plus proche de celui de l'homme ce qui nous permet de développer des tâches comportementales complexes et susceptibles de refléter les comportements humains. L'utilisation du primate non-humain permettra donc de plus facilement transposer nos résultats à l’homme et reste donc indispensable dans le cadre de cette étude. De plus, les animaux utilisés pour ce projet seront âgés d’au moins 36-48 mois. A cet âge, on peut considérer que le développement du système nerveux central à atteint sa maturité. Ce paramètre est important à respecter puisqu’il nous permettra de comparer plus aisément les résultats obtenus chez ces animaux avec les caractéristiques observés chez l’homme à l’âge adulte. Notons que dans le contexte (européen et mondial) actuel de pénurie de singes pour la recherche scientifique, le choix du singe cynomolgus ou du singe rhésus dans ce projet dépendra des possibilités d'approvisionnement. Quoiqu'il en soit, nous n'attendons pas de différences majeures entre ces deux espèces.
Etude de la fonction des macrophages de la cavité péritonéale
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une unique injection dans l'abdomen d'une dizaine de secondes, susceptible de provoquer une inflammation au point d'injection, avant que le contenu de sa cavité péritonéale ne soit analysé après sa mort. Le projet vise à décrire une population de cellules immunitaires, les petits macrophages péritonéaux, dont la fonction reste inconnue, avec l'espoir lointain d'applications lors de dialyses péritonéales humaines. Aucun calcul ne vient étayer l'effectif de 1 040 animaux, le porteur indiquant seulement qu'il utilisera un nombre minimum mais nécessaire à des analyses statistiques pertinentes.
Objectifs
La cavité péritonéale est l’espace physique contenant les organes de l’abdomen comme le foie, l’estomac et les intestins. Cette cavité contient du fluide péritonéal, qui agit comme un lubrifiant facilitant les mouvements et réduisant la friction entre les organes. De nombreuses cellules immunitaires résident au sein de cette cavité. Chez la souris comme chez l’Homme, la majorité de ces cellules immunes sont des macrophages et des cellules dendritiques qui jouent un rôle clé au cours des réponses immunitaires. En particulier, une population de cellules appelée « petits macrophages péritonéaux » (PMP) a été identifiée chez la souris et chez l’Homme. La fonction des PMP reste totalement inconnue. Des études préliminaires chez l’Homme et chez la souris ont révélé une forte ressemblance entre les PMP et les macrophages (ce qui explique leur nom), mais aussi des points communs avec d’autres cellules immunitaires appelées cellules dendritiques. Leur profil « hybride » suggère que ces cellules puissent avoir la capacité d’activer la réponse immunitaire adaptative, menant notamment à la production d’anticorps. Les PMP circulent librement au sein du fluide péritonéal, mais ils peuvent également adhérer à la surface des organes péritonéaux et en particulier à l’omentum. L’omentum est un organe juxtaposé à l’estomac, qui contient des aggrégats de cellules immunitaires. Les PMP peuvent également être recrutés à l’omentum et nous émettons l’hypothèse que ces cellules peuvent y intéragir avec d’autres cellules immunitaires pour les activer. Les objectifs du projet sont : 1/ Caractériser précisémment les PMP au sein de la cavité péritonéale. 2/ Caractériser la capacité des PMP à intéragir avec les autres cellules immunes au sein de l’omentum activer la réponse immunitaire.
Bénéfices attendus
La cavité péritonéale contient de nombreuses cellules immunitaires ayant la capacité de phagocyter des pathogènes au cours de la réponse immunitaire innée, mais également de présenter des antigènes et activer le système immunitaire adaptatif. En particulier une partie de ces cellules appelées « PMP » sont parfaitement homologues chez la souris et chez l’Homme, cependant l’origine et la fonction de ces cellules restent indeterminées. Ce projet permettra d’étudier en détails la biologie des PMP afin de comprendre la fonction de ces cellules. Notre étude sur modèles murins est réalisées en parallèles d’une étude de PMP humains obtenus chez des patients nécessitant un recours à des dialyses péritonéales. A long terme, l’identification de facteurs régulant la génération, la survie et les fonctions des PMP permettrait de cibler ces cellules. Il est envisageable que nos approches d’édition génétique et transfert intrapéritonal soient applicables à l’Homme, au cours de dialyses péritonéales par exemple.
Procédures
La seule intervention réalisée au cours de nos protocoles est une injection intrapéritonéale, effectuée sur animaux vigiles. Chaque souris incluse dans notre protocole (1040 animaux) recevra une injection intrapéritonéale au cours de sa vie. La durée de cet acte (contention, injection et remise en cage) est d’environ 10 secondes.
Impact sur les animaux
Les effets négatifs attendus sont liés au stress subit par les souris lors de la contention et de l’injection péritonéale. Lors de ces injections, une inflammation peut se développer au niveau des sites d’injection.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure dans le but d’analyser le contenu cellulaire de la cavité péritonéale et répondre aux objectifs scientifiques définis.
Remplacement
Pour satisfaire au remplacement, des études in vitro seront réalisées sur des cellules primaires et lignées cellulaires. Cependant, pour comprendre en détails l’origine et les fonctions des PMP, il est indispensable de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents types cellulaires présents dans la cavité péritonéale et entre les différents organes. Notamment, les cellules stromales de la cavité péritonéale sont source de facteurs de croissance permettant la différenciation et le maintien des cellules immunitaires. Ces cellules diffèrent selon leur localisation au sein de la cavité et l’aspect spatial est donc essentiel dans notre étude.
Réduction
Pour satisfaire à la réduction, les souris seront maintenues au sein de notre élevage, 100% d'entre elles pourront être utilisées pour l’expérimentation. Si une cohorte numériquement plus importante est nécessaire, nous achèterons ces souris auprès d’un fournisseur agréé pour répondre à ce besoin ponctuel. Afin de réduire davantage le nombre de souris, nous utiliserons une approche d’édition génétique, ce qui permettra d’éviter la génération de nombreuses lignées murines. Chaque procédure sera réalisée sur un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes.
Raffinement
Pour satisfaire au raffinement, nous serons particulièrement attentifs à tout changement physique ou de comportement. Le suivi pondéral des souris sera également un bon indicateur de leur état général. Dans le cas d’une injection intrapéritonéale, nous surveillerons l’aspect du site d’injection. Le suivi sanitaire quotidien et nos visites régulières (dont la fréquence est adaptée à la procédure) permettront de déceler précocement tout signe de douleur, de souffrance ou d’angoisse et d'appliquer les points limites que nous avons définis. Des grilles d’observation ont été établies et des critères d’arrêt précis et précoces ont été définis pour chaque procédure. Un animal avec une blessure sans perte de substance sera isolé et la blessure sera traitée avec un antiseptique (une fois par jour s’il n’y a pas de suintement et 2 fois par jour s’il y a suintement). Nous éviterons l’utilisation de méthodes d’identification ou de biopsies pour ces animaux et confirmerons seulement leur genotype post mortem, ce qui permettra d'éviter un geste invasif sur ces souris.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris car la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. D’autre part, nous disposons des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriées à cette espèce. De plus, nous étudions des populations cellulaires présentes chez l’Homme comme chez la souris. Enfin, les données in vivo de la littérature sont obtenues essentiellement sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour faire des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Ces critères font de la souris l’espèce la plus adaptée pour répondre à nos questions scientifiques. Nous utiliserons des souris âgées d’au moins 6 semaines, correspondant à un stade auquel le développement est complet et la maturité sexuelle est atteinte.
Etude chez la souris de l’action protectrice d’un probiotique instillé en prophylaxie et en curatif sur les infections pulmonaires à Pseudomonas aeruginosa.
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Anesthésiées deux à trois fois pour recevoir dans la narine un probiotique puis une suspension de Pseudomonas aeruginosa, 845 souris développent une infection pulmonaire aiguë. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec pertes de poids, chute de température et immobilité progressive sur sept jours au maximum. Le porteur qualifie de faible l'intensité de chaque geste pris isolément, préhension, anesthésie, injection d'analgésique, tout en reconnaissant que l'évolution de l'infection va jusqu'à une intensité sévère. Toutes les souris infectées sont tuées, précisément parce qu'elles ont subi cette infection pulmonaire aiguë.
Objectifs
Pseudomonas aeruginosa est une bactérie responsable d’infection pulmonaire grave chez les patients atteints de mucoviscidose, de bronchopneumopathie chronique obstructive et chez les patients en réanimation. Cette bactérie devient résistante à tous les antibiotiques habituellement utilisés. Aussi, il est capital de rechercher des alternatives thérapeutiques aux antibiotiques comme les probiotiques. Les probiotiques sont des microorganismes qui, administrés en quantités adéquates, exercent des effets positifs sur la santé. Nous avons pu valider une preuve de concept, suite aux résultats prometteurs d’une bactérie à potentiel probiotique actuellement en développement au laboratoire, et ayant une action protectrice vis-à-vis de l’infection pulmonaire à Pseudomonas aeruginosa. L'objectif du projet est de tester l'efficacité du probiotique à des souris ayant une infection pulmonaire à Pseudomonas aeruginosa.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra de recueillir des données sur l’intérêt de l’utilisation de souches cliniques de Porphyromonas comme potentielles bactéries bénéfiques (probiotiques) à visée anti-Pseudomonas aeruginosa, pathogène clé de plusieurs pathologies respiratoires humaines étant à l’origine d’infections pulmonaires notamment dans la mucoviscidose ou la bronchopneumopathie chronique obstructive.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés deux à trois fois et recevront durant 1 minute du sérum physiologique ou un probiotique dans la narine puis la seconde fois une suspension bactérienne sur une durée de 1 minute. Si une troisième instillation est prévue, les souris recevront du sérum physiologique ou un probiotique durant 1 minute dans la narine.
Impact sur les animaux
Selon les procédures, les suivis quotidiens pourront durer de 3 à 7 jours. Ce projet peut induire un stress chez les animaux notamment lors de la préhension de l’animal, pour les suivis, les pesées et la prise de température (2 à 3 fois par jour maximum) : intensité faible, durée environ 1 min. Les animaux auront au maximum 3 anesthésies : Intensité faible, durée environ 2 min. Des pertes de poids et de température, une mobilité réduite voire, une inactivité après le début de l’infection pulmonaire peuvent être observées, elles sont d’intensité progressive avec l’évolution de l’infection pouvant aller jusqu’à une intensité sévère sur une durée de 7 jours maximum. Les analgésies par injection des animaux sont d’intensité faible et d’une durée d’environ 30 secondes.
Devenir
A l'issu du projet tous les animaux ayant été infectés, seront mis à mort. Et certains auront des prélèvements de tissus. Tous les animaux doivent être mis à mort, car ils ont subi une infection pulmonaire aigue.
Remplacement
Nous souhaitons observer dans cette demande un pourcentage de survie d’animaux à une infection pulmonaire causée par Pseudomonas aeruginosa mais également observer les effets aux niveaux tissulaires (poumons et autres) de l’instillation du probiotique sur l’infection à Pseudomonas aeruginosa. Les modèles cellulaires et/ou autres modèles in vitro ne permettent pas à ce jour de conclure sur la survie d’un animal ou des dommages tissulaires à une infection pulmonaire. Pour cette raison, nous faisons le choix de conserver le modèle animal. De plus, nous souhaitons étudier la sécurité du potentiel probiotique ce qui doit impérativement se faire sur un modèle animal.
Réduction
Lors des études de survies, l’analyse de la survie sera réalisée par des tests statistiques, le nombre de souris nécessaire par groupe est de 10 souris. Afin de réduire le nombre d’animaux, le nombre de souris dans notre groupe recevant uniquement notre probiotique est réduit au minimum car nous n’attendons aucune mortalité. Lors des procédures d’études de l’inhibition de Pseudomonas aeruginosa au niveau pulmonaire, le nombre de souris nécessaire afin de garantir une puissance statistique est de 6 souris minimum dans chaque groupe. Pour nos procédures de test du probiotique de manière curative 10 souris minimum sont nécessaires dans chaque groupe. Par ailleurs, dans nos procédures, nous nous limitons à une seule souche clinique de notre probiotique alors que plusieurs espèces sont décrites.
Raffinement
Avant toutes instillation intranasale, les animaux seront préalablement anesthésiés, une analgésie est mise en place en accord avec notre table se suivi de soin. De plus, un gel appétent contenant de l'analgésiant est déposé dans les cages 24h/24. Ce gel permet une analgésie continue pour les animaux tout au long de la journée. De plus, les points limites seront monitorés régulièrement (2 à 3 fois par jour) à l’aide d’une table de suivi de soins mise en place afin de réduire ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies, car leur sensibilité à Pseudomonas aeruginosa permet de provoquer une pneumonie tout en évitant une mortalité trop importante à 24h. Par ailleurs ce modèle a déjà été étudié au sein de notre équipe de recherche à plusieurs reprises. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 8 semaines, car c’est l’âge des souris du même modèle retrouvé dans la littérature. C’est également l’âge des souris utilisées dans de précédentes expérimentations réalisées dans notre équipe, ce qui nous permettra de conserver le même modèle d’étude pour l’interprétation de nos résultats.
Etude des changements d’efficacité de la communication entre les neurones dans un contexte d’addiction.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Cathéter veineux posé sous anesthésie, puis dix séances de six heures d'auto-administration de cocaïne ou vingt-cinq séances de trois heures pour la nicotine, six semaines d'abstinence, une chirurgie cérébrale de deux heures trente : 960 rats enchaînent ce protocole, isolés en cage individuelle pendant 57 ou 81 jours. Les 1 088 rats du projet finissent par trois heures d'enregistrement de l'activité de leurs neurones sous anesthésie générale, 128 d'entre eux n'étant pas réveillés, les 960 autres relevant d'un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués pour analyser leur cerveau. Le porteur annonce que ces travaux pourraient mettre en évidence une nouvelle approche thérapeutique pour les personnes dépendantes, quand l'isolement de 57 à 81 jours et la prise chronique de cocaïne figurent, eux, parmi les nuisances attendues.
Objectifs
Le cerveau est en permanence soumis à des phénomènes de plasticité, c’est-à dire à des changements de l’efficacité de la communication entre des neurones, permettant l’encodage de nouvelles informations. L’exposition chronique à des drogues d’abus est connue pour induire de tels phénomènes, ce qui pourrait constituer une mémoire de la drogue et faire partie du processus pathologique menant à l’addiction et aux épisodes de rechute. Ce projet vise à étudier le rôle du cholestérol cérébral dans ces processus de changement d’efficacité synaptique induits par les drogues d’abus telles que la cocaine et la nicotine chez le rat.
Bénéfices attendus
La conduite de ce projet devrait permettre d’identifier les mécanismes par lesquels la manipulation du métabolisme du cholestérol cérébral modifie la recherche de drogue et la rechute (nouvelle consommation) chez des rats addicts. Ces expériences pourraient mettre en évidence une nouvelle approche thérapeutique, en ciblant le cholestérol cérébral chez les patients addicts pour les aider dans leur désir d’abstinence.
Procédures
Tous les rats (1088) seront pesés 2 fois par semaine. 960 rats auront une injection d’un antalgique et immédiatement après suivront une chirurgie sous anesthésie générale (15 minutes) afin d’implanter un cathéter veineux Après leur chirurgie et jusqu'à la fin du projet, ces 960 rats seront hébergés seuls dans leur cage (57 jours pour les rats sous cocaïne et leurs contrôles (480 rats), 81 jours pour les rats sous nicotine et leurs contrôles (480 rats)). L'auto-administration de drogue se fera avec ces 960 rats pendant 10 sessions pour la cocaïne (480 rats) ou 25 sessions pour la nicotine (480 rats) à raison d’une session par jour (durée d'une session : 6 heures pour la cocaïne ou 3 heures pour la nicotine) en plaçant les animaux dans des cages spéciales dans lesquelles ils sont libres de leur mouvement. Ces rats (960) seront ensuite placés en abstinence dans leur cage d’hébergement (6 semaines). Parmi les 1088 rats, 640 rats auront une injection d’un antalgique et immédiatement après une chirurgie cérébrale permettant l’injection d’un produit modifiant le cholestérol dans une région précise du cerveau (2h30 sous anesthésie générale gazeuse). Tous les rats (1088) seront soumis à des enregistrements de l’activité des neurones (3 heures sous anesthésie générale gazeuse).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : -Chirurgies : douleurs soulagées par l'administration d'antalgiques pendant et après la chirurgie et inconfort transitoire au réveil. - Cathéter intraveineux : gène légère pendant la durée de l’expérience. -Auto-administration : La prise chronique de cocaine (bien que volontaire) peut causer un stress modéré et transitoire chez certains individus (poil hérissé, irritabilité) -La Période d’abstinence : peut causer un léger stress. -Isolement : stress modéré (57 jours pour les rats en auto-administration de cocaïne et leurs contrôles ; 81 jours pour les rats en auto-administration de nicotine et leurs contrôles)
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de procéder à des analyses sur le cerveau.
Remplacement
Ce type de recherche, qui vise à mesurer le changement d’efficacité synaptique cérébrale chez l’animal anesthésié suite à une exposition volontaire à la cocaïne ou à la nicotine, implique d’utiliser des modèles d’animaux vivants. L’étude des processus de changement d’efficacité synaptique cérébrale nécessite la présence de réseaux neuronaux intacts et fonctionnels uniquement accessibles dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants. Après vérification, il n’a pas été trouvé de test in vitro ou in silico permettant d’effectuer cette recherche et des méthodes de substitution à l’animal entier ne peuvent être utilisés.
Réduction
Pour étudier les changements d’efficacité synaptique cérébrale en réponse à la consommation volontaire de cocaïne ou de nicotine, nous progresserons pas à pas en utilisant un arbre décisionnel de type Go/noGo pour étudier plusieurs protocoles de stimulation permettant d’induire ces changements. Dans la procédure1, nous avons choisi de tester 4protocoles d'enregistrement/stimulation/enregistrement pour chacune des 4régions cérébrales ciblées, et d’utiliser 8animaux maximum par protocole. Chaque animal sera son propre contrôle et nous comparerons les changements d’efficacité synaptique avec les différents protocoles. L’ordre des protocoles testés dans chaque région cérébrale sera basé sur la littérature scientifique. Dès qu’un protocole entrainera un changement d’efficacité synaptique, il sera retenu pour la région cérébrale et les autres protocoles ne seront pas testés. Si aucun changement d’efficacité pour une région, alors elle ne sera pas étudiée dans les procédures suivantes et la région cérébrale suivante sera étudiée avec le même cheminement. Lorsqu’un protocole induira des changements d’efficacité synaptique, nous étudierons si la consommation de cocaïne ou nicotine impacte cette efficacité. Si aucun effet des drogues n’est observé, alors cette région ne sera pas étudiée dans l'étude de l'effet du cholésterol. Pour réduire le nombre d’animaux et faire des analyses statistiques, le nombre d’animaux requis par groupe expérimental a été calculé par une méthodedite de puissance qui tient compte de la variabilité des mesures.
Raffinement
Dès leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés à deux par cage en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger pour assouvir leur besoin naturel de ronger) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum. Toutes les phases du projet seront réalisées par des personnels expérimentés. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux et des pesées 2 fois par semaine. Selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide dans la décision d’intervention et d’arrêt. En effet, des points limites gradés précis et spécifiques sont définis de façon suffisamment précoce dans une grille de suivi (perte de poids, apparence, comportement de l’animal). Un animal, atteignant un point limite défini nécessitant une intervention, sera pris en charge sans délai par l’expérimentateur. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale et de l’administration d’antalgiques. Un maintien de la température grâce à un tapis chauffant et une hydratation régulière des tissus seront assurés pendant les chirurgies.
Choix des espèces
Le rat est l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux, car ses réponses neuronales sont proches des réponses neuronales observées chez l'Homme. Les rats ont des réponses aux drogues similaires à celles de l’Homme et ils s’auto-administrent toutes les drogues abusées par l’Homme de façon spontanée, ce qui n’est pas aussi évident avec d’autres espèces. Nous utiliserons des rats de la lignée « Sprague-Dawley ». Il s’agit de rats « outbred », c’est à dire avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus pour un meilleur reflet de ce que l’on trouve chez l’Homme. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet, ce qui limite le risque de variabilité qui pourrait être lié à l’utilisation de rat en phase d’adolescence (juvéniles).
Caractérisation de nouveaux modèles murins pour l’étude de la maladie de Huntington
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées à l'issue, dont 1 248 opérées sous anesthésie sans jamais reprendre conscience, 1 934 souris vont être utilisées pour caractériser quatre nouveaux modèles génétiques de la maladie de Huntington. Les 686 autres relèvent d'un niveau de souffrance léger. Certaines lignées sont maintenues jusqu'à onze mois pour que des symptômes neurologiques et moteurs apparaissent, symptômes que le porteur dit jamais handicapants, avant une série de tests comportementaux d'une semaine au maximum puis une chirurgie terminale. Ces tests, présentés comme très fins et seuls capables de révéler les symptômes en question, ne sont nommés nulle part dans le résumé.
Objectifs
La maladie de Huntington est une maladie neurodégénérative rare d’origine génétique pour laquelle il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. Afin de pouvoir répondre à des questions fondamentales sur les mécanismes de cette maladie, quatre nouveaux modèles murins génétiquement modifiés ont été développés. Cependant, avant de pouvoir les utiliser en recherche, une description complète de leur comportement est indispensable. De plus, il faut également analyser si les modifications génétiques ne perturbent pas le développement des animaux afin de valider la fiabilité de ces nouveaux modèles. Cette étape est primordiale pour s'assurer que de futurs projets de recherche dans lesquels ces modèles seront utilisés ne seront pas biaisés.
Bénéfices attendus
Les différents modèles murins déjà existants pour étudier la maladie de Huntington ne permettent pas d’étudier et de visualiser directement et à l'état normal les protéines défaillantes et responsables de la maladie. Pour cela, il faut utiliser des intermédiaires cellulaires permettant de tracer et marquer les protéines. Cependant, l'ajout de ces intermédiaires peut engendrer des modifications cellulaires indésirables et fausser certains des résultats. Ainsi, ces nouveaux modèles murins vont être de précieux outils pour atteindre les objectifs des projets qui visent à mieux comprendre les mécanismes de mise en place de la maladie de Huntington et à aboutir à des innovations thérapeutiques permettant de retarder la progression de la maladie et/ou d’empêcher l’apparition des symptômes. Ainsi, la caractérisation du développement, du comportement et des fonctions physiologiques de ces souris est essentielle.
Procédures
Parmi les animaux de ce projet, certains développent un phénotype dommageable avec l'âge. Tous les animaux effectueront une seule série de tests comportementaux pendant une durée maximale d'une semaine, puis une chirurgie terminale sera réalisée.
Impact sur les animaux
Certains des nouveaux modèles présentés ici peuvent développer avec l’âge des symptômes légers de la maladie de Huntington. Ces symptômes neurologiques et moteurs associés au modèle ne sont observés que lors de tests comportementaux très fins conçus à cet effet. Ces symptômes ne deviennent jamais handicapants pour l’animal et n’occasionnent pas de perte de poids excessive ni une perte d'autonomie. Il est possible d’identifier 3 nuisances légères potentielles : 1) un stress léger pendant leur transport d'une animalerie vers l'autre. 2) un stress léger lors de la manipulation par l'expérimentateur pendant la mise en place des croisements et pendant la réalisation des tests comportementaux. 3) un stress léger d'une femelle ayant mis bas lorsque les animaux seront prélevés.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin des procédures. Leurs tissus cérébraux ainsi que d'autres organes clés dans la maladie de Huntington seront prélevés et conservés afin de réaliser des expériences ultérieurement.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs des projets de recherche et reproduire la complexité d’un organisme vivant. De plus, les nouveaux modèles murins de la maladie de Huntington qui ont été développés vont permettre d'étudier le rôle de plusieurs protéines impliquées dans le développement de la maladie en conditions physiologiques et/ou pathologiques sans devoir utiliser des intermédiaires pouvant biaiser les résultats. Le modèle murin est indispensable pour comprendre le rôle de la protéine huntingtine et de ses interactions au niveau d’un organisme entier.
Réduction
Le nombre total d’animaux pour ce projet a été calculés en considérant que les expérimentations doivent être validées avec au minimum deux groupes de souris afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables. Dans une démarche de réduction, les souris utilisées vont permettrent de faire plusieurs études et de répondre à différentes questions fondamentales. De plus, à la fin de chaque étude, les tissus cérébraux ainsi que d’autres organes clés dans la maladie de Huntington seront prélevés. Ceci permettra d’obtenir du matériel biologique précieux sans devoir générer des animaux supplémentaires.
Raffinement
Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Comme expliqué plus haut, aucun effet indésirable majeur n’est attendu chez ces animaux. Les animaux seront hébergés dans des cages adaptées et équipées d’une litière stérile ainsi que de la paille permettant aux animaux de fabriquer leurs nids. De plus, différents matériaux pour divertir les rongeurs seront ajoutés dans la cage avec une rotation chaque semaine pour que les animaux aient chaque semaine un nouveau divertissement. Ces cages seront changées toutes les semaines. L’accès à l’eau et à la nourriture sera illimité. Les biberons d'eau et les croquettes seront également changés toutes les semaines. Le transport des animaux d’une animalerie à l’autre sera effectué en cages occultées avec au moins un matériau de divertissement et des croquettes mouillées à disposition. Les groupes sociaux initialement formés dans les cages seront conservés lors du passage d’une animalerie à l’autre. L’état de santé des animaux sera surveillé toutes les semaines ou tous les jours si besoin jusqu'à la fin de leur vie. Les animaux seront élevés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement.
Choix des espèces
Compte tenu de la similarité de son anatomie avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude de la maladie de Huntington. Certaines souris seront utilisées au stade de jeunes adultes, c'est-à-dire entre 8 et 12 semaines, d’autres devront atteindre l’âge de 11 mois afin qu'elles développent les symptômes légers de la maladie de Huntington et permettre que l’étude soit pertinente. Concernant les études développementales, les animaux seront utilisés à différents stades de développement cérébrale car cette période est fondamentale pour la mise en place des tissus cérébraux. En outre, de plus en plus d'études montrent que des dyfonctionnements cérébraux s’installent très tôt, bien avant l'apparition des symptômes de la maladie de Huntington.
Le rôle du système inhibiteur du système vestibluospinal dans le contrôle de la posture chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour cartographier les réseaux de neurones inhibiteurs entre la moelle épinière et le cerveau, 224 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. 64 subissent une chirurgie d'injection dans la moelle épinière, 60 en subissent deux, moelle épinière puis tronc cérébral, et 100 reçoivent une injection dans le tronc cérébral puis l'implantation d'une fibre optique. Ces dernières passent trois épreuves comportementales, un couloir, un plateau basculé à 45 degrés dix fois par jour pendant deux semaines et un tapis roulant, pendant que la lumière active ou inhibe leurs neurones. Les suites annoncées sont le saignement, la douleur postopératoire, l'infection des sutures, le déséquilibre et la perte de poids, quand le bénéfice tient en une phrase, des connaissances utiles à la compréhension du système postural.
Objectifs
Les interactions entre la moelle épinière et le cerveau sont responsables de nombreux comportements, plus particulièrement les comportements moteurs. Cependant les mécanismes d’interaction entre ces deux systèmes (moelle et cerveau) ne sont pas comlètement élucidés. La connaissance de l’anatomie et du fonctionnement de ces interactions reste essentielle à la compréhension des mécanismes locomoteurs. En effet, les réflexes permettant la position debout et la stabilité pendant les déplacements ainsi que les positions statiques sont contrôlés par ces interactions. Si le réseau de neurones excitateurs a bien été étudié et caractérisé, ce n’est pas le cas pour les interactions entre ce réseau dit « excitateur » et celui dit « inhibiteur ». Le but de cette étude est donc de comprendre comment sont anatomiquement organisés les réseaux de neurones inhibiteurs de la moelle épinière et du cerveau et de caractériser également leur fonctionnement. Dans ce but nous travaillerons sur le modèle murin, et plus particulièrement sur des souris génétiquement modifiées dont les neurones cibles ont été rendus facilement répèrables par des outils de génie génétique ce qui permettra leur ciblage pour les étudier. La souris possède un système locomoteur quadripède assez proche de l’homme, de par les structures cérébrales qu’il implique. Pour ce faire, nous allons utiliser des approches de marquage des projections neuronales entre la moelle épinière et le cerveau, ainsi que des approches fonctionnelles permettant d’activer ou d’inhiber les neurones cibles en utilisant la lumière.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra une meilleure compréhension du système postural impliqué dans le maintien corporel d’un être vivant. L’étude anatomique et fonctionnelle de ce système d’adaptation apportera des connaissances utiles piur la compréhension de son fonctionnement en situation pysiologique et pathologique.
Procédures
-64 animaux seront soumis à 1 chirurgie d’injection dans la moelle épinière, d’une durée de 30 à 45 min sous anesthésie générale. -60 animaux seront soumis à 2 chirurgies : 1 injection dans la moelle épinière d’une durée de 30 à 45 min, puis 3 à 4 semaines après, 1 injection dans le tronc cérébral, chirurgie d’une durée de 1h. -100 animaux seront soumis à 2 procédures de chirurgies et 3 tests comportementaux : 1 injection au niveau du tronc cérébral (30min). 3 semaines après, 60 animaux seront soumis à une implantation de fibre optique au même niveau que le lieu d’injection précédemment mentionné (30min). Les 60 autres animaux seront implantés dans la moëlle épinière (1h) La stimulation optogénétique : durée et fréquence 30 sec toutes les minutes pendant 10 minutes Les animaux utilisés en comportement recevront 3 comportements différents : couloir (3 jours, 5x1min par jour), bascule (2 semaines, 10 basculements de 45° par jour), tapis roulant (6 jours, 4x 3 min).
Impact sur les animaux
Il s’agit de risques généraux suite à la chirurgie tel que le saignement, la douleur post-chirurgicale, l'infection au niveau de la suture, la réduction de la mobilité à court terme, le déséquilibre, la perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérimentation pour l'étude histologique
Remplacement
En accord avec la Directive Européenne et le principe des 3Rs, nous avons réfléchi à nos expériences afin d'intégrer les approches alternatives. A notre connaissance, seuls les modèles mammaliens, et plus particulièrement la souris, répondent aux questions scientifiques posées par notre étude. Le recours donc au modèle animal « souris » est indispensable pour la réalisation de cette étude qui nécessite une évaluation comportementale et un ciblage de neurones spécifiques. Aucun modèle in vitro ne peut reproduire de telles conditions. Cependant, nous avons réalisé des études pilotes chez le xénope pour mettre au point les protocoles et s’assurer de leur fonctionnement avant de les adapter à la souris.
Réduction
Avant la mise en place de ce projet, nous avons réalisé des expériences pilotes pour la mise au point des injections spinales cervicales afin de diminuer au maximum le nombre d’animaux du projet. La réduction du nombre d’animaux a été prise en compte tout en conservant une signification scientifique statistique. Le nombre maximal, en prenant en compte les variations expérimentatles, ne dépasse pas ainsi 15 animaux par groupe pour l’étude fonctionnelle et 8 par groupe pour l’étude anatomique. De plus, nous utiliserons des souris mâles et femelles, ce qui permet d’inclure tous les animaux des portées.
Raffinement
Tous les protocoles sont réalisés par des experts dans le domaine et sont ainsi optimisés pour soulager le stress et la douleur des animaux. Les animaux sont hébergés en cage collective avec enrichissement du milieu (tunnel, maisonnette, cellulose pour le nid). L’utilisation d’anesthésique et d’analgésiques est prévue pour soulager les douleurs post-chirurgicales. De plus, de la nourriture enrichie est fournie pendant au moins 3 jours suivant la chirurgie. Les animaux seront surveillés quotidiennement par l'expérimentateur avec une surveillance renforcée après la chirurgie jusqu’à la fin de l’expérimentation avec la mise en place d’une réhydratation, un réchauffement, des traitements vétérinaires si besoin.Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter la souffrance des animaux, pour cela, les animaux seront suivis régulièrement pour détecter d’éventuels signes cliniques (perte de poids, apparence physique, comportements provoqués/non provoqués). En plus des points limites spécifiques sont déterminés suite à la chirurgie (poids, mobilité, respiration) et ce pendant 3 jours après la chirurgie. Les sutures seront particulièrement surveillées pendant la première semaine et seront reprises en cas d’ouverture.
Choix des espèces
Cette étude nécessite d’agir sur des neurones dont les modifications génétiques ne sont maitrisées n’existant que chez la souris, d’où le choix de cette espèce. Nous utiliserons des animaux adultes âgés de minimum 8 semaines et n’excédant pas 6 mois pour des raisons de conservation de mobilité optimale car nous nous interressons à l’organisation des réseaux locomoteurs matures et fonctionnels.
Profilage toxicologique de mélanges chimiques complexes associés aux particules de carbone suie: application aux hydrocarbures aromatiques polycycliques
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système respiratoire
Injectés trois jours de suite dans l'abdomen avec des hydrocarbures aromatiques polycycliques associés aux particules de suie, 112 rats passent ensuite par dix échocardiographies de vingt minutes, une IRM de trente à quarante-cinq minutes et un cathétérisme cardiaque terminal. 72 relèvent d'un niveau de souffrance modéré, 40 d'un niveau léger, et tous sont tués pour prélever poumons, aorte et cœur. Le porteur attend une atteinte cardiaque dès l'injection, avec accumulation de tissu non contractile et baisse de la contractilité, et suit les animaux jusqu'à 180 jours. Sa grille déclenche la mise à mort au-delà de 20 % de perte de poids ou d'un score cumulé supérieur à 4, qui additionne poil ébouriffé, posture anormale, immobilité et automutilation.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de développer une stratégie intégrée visant à identifier et étudier le potentiel bioactif de mélanges complexes de polluants environnementaux émis lors de procédés de combustion et susceptibles d’induire des effets respiratoires et cardiovasculaires. Ce projet se focalisera sur une famille de polluants environnementaux ubiquistes, les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) et leurs dérivés oxygénés (oxy-HAP) associés aux particules de carbone suie.
Bénéfices attendus
L’ensemble de cette étude in vivo permettra de mettre en évidence la prédictivité du biotest et d’apporter de nouvelles connaissances sur les effets chroniques d’expositions à faibles doses de mélanges de HAP.
Procédures
Les animaux subiront des injections IP lors des injection qui durée 10 secondes (avec la contention de l'animal vigile ) pendant 3 jours consecutif puis une échocgraphie cardique d'une durée de 10* 20 minutes, une irm d'une durée de 30-45 minutes et la fonction cardiaque sera également évaluée par cathétérisme cardiaque en phase terminal d'une durée de 20-30 minutes avec prlévement d'organe a la fin de la procédures .
Impact sur les animaux
Nous supposont une atteinte cardique sur l'animal du a la toxicité intrinseque de la molécule injecter des que l'animal a recut la molécule . L'atteinte cardiaque correspond à une accumulation de tissue non-contractile et une dysfunctionnement des mitochondries. Ces deux effets induiront (probablement) une diminution de la relaxation cardiaques. L'atteinte entraine une diminution de la contractibilité cardiaque .
Devenir
Le projet nécessite des prélévements d'organes vitaux pour chaque procédure.
Remplacement
Dans l’objectif de remplacer l’expérimentation animale, nous vérifions dans ce projet l’intérêt de mesurer la bioaccessibilité in vitro, pour estimer une biodisponibilité par inhalation in vivo. Le volet in vivo faisant l’objet de cette saisine permettra de fournir des indications sur la prédictivité de méthodes in vitro.
Réduction
Pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude, nous réaliserons un criblage cellulaire à l’aide de cultures pour choisir le mélange de molécules à tester (fraction bioaccessible) ce qui limite considérablement le nombre d’animaux à utiliser. Nous limitons les prélèvements tissulaires qui ne se feront qu’à un seul temps avec un suivi de la fonction cardiaque de façon non invasive pour nous guider dans la date de mise à mort, avec une durée maximale de suivi de 180 jours. Nos expériences dans le laboratoire ont démontré que des groupes de n=12 sont nécessaires pour des évaluations fonctionnelles telles que l’échocardiographie. L’analyse répétée en échocardiographie / IRM sur le même animal au cours d’une étude permet également de diminuer le nombre d’animaux par groupe nécessaire pour démontrer un effet significatif. Nous utiliserons un nombre limité d’animaux afin de mettre au point tous les marqueurs biologiques envisagés. Les organes d’intérêt sont les poumons, l’aorte et le cœur mais d’autres organes seront prélevés pour constituer une banque de tissus pouvant être analysés ultérieurement (foie ; intestins ; reins).. Les tests statistiques utilisés seront: Pour la fonction cardiaque par échographie . Pour l'hémodynamique invasive, Test paramétrique.
Raffinement
Tout au long de l’étude, les animaux seront nourris ad libitum et hébergés dans des portoirs conventionnés au nombre maximum de 4 animaux par cages avec de l’enrichissement (Tunel,Kraft Paper). Afin de limiter le stress occasionné par le transport, une période d’acclimatation de deux semaines après réception des rats sera maintenue avant tout début de protocole. Les conditions de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Ainsi, un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement durant toute la durée du protocole expérimental, ce qui permettra de déceler un éventuel signe de souffrance. Notre grille d’évaluation du bien-être animal se décompose en : A) changement du poids corporel 0. Normal 1. Perte de poids
Choix des espèces
Le rat Wistar adulte est par excellence l’espèce utilisée dans la plupart des études toxicologiques dont il existe au sein du consortium des données historiques. Rats Wistar adultes de 225-250 g âgés d’environ 50 jours en début de protocole. L'évaluation toxicologique des molécules à tester sera effectuée sur des rats adultes s'assurant ainsi d'une maturité des systèmes de défense mis en jeu.
Rôle d’un facteur de transcription dans la réponse à l’exercice physique et à un régime hyperglucidique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
Contraintes de courir sur un tapis roulant sous stimulations électriques, jusqu'à cinquante par séance, 90 souris subissent aussi un test de tolérance au glucose avec injection dans l'abdomen et scarification de la queue. 42 relèvent d'un niveau de souffrance modéré, 48 d'un niveau léger, et toutes sont tuées pour prélever six organes chacune. Le gène étudié n'est jamais nommé dans le résumé, désigné seulement comme un facteur de transcription induit par l'exercice et par le glucose. Le porteur qualifie la stimulation électrique de désagréable sans être douloureuse, et affirme que l'eau sucrée n'induit aucun stress, la stéatose hépatique qu'elle provoque étant selon lui asymptomatique.
Objectifs
La sédentarité est un facteur de risque pour de nombreuses pathologies, et l’activité physique s’impose de plus en plus comme un moyen de prévenir et/ou de contribuer à guérir des pathologies telles que les maladies métaboliques (diabète, stéatose hépatique non alcoolique ou ‘‘maladie du soda’’), et les cancers. Le muscle squelettique capte l'essentiel du glucose sanguin après un repas, c'est donc un organe clé dans le contrôle de l’homéostasie glucidique. Cette captation de glucose dépend du type de muscle (glycolytique ou oxydatif), elle est augmentée par l’exercice physique alors qu’elle est altérée dans le cas de maladies métaboliques comme diabète et l’obésité. Le projet de recherche a pour but de déterminer le rôle d’un gène induit par l’exercice physique et le glucose dans la performance physique, le métabolisme musculaire et l’homéostasie métabolique de l’organisme.
Bénéfices attendus
Ce projet est pleinement justifié d'un point de vue scientifique et respecte la règle des 3R. Il a pour but d'étudier le rôle d'un gène dont l'expression varie au cours de la journée, dont l'expression est augmentée par l'exercice physique et par le glucose, et qui joue un rôle dans le métabolisme glucidique et lipidique et dans la physiologie du muscle squelettique. Ce projet devrait permettre d’évaluer le rôle de ce gène musculaire dans la performance physique en fonction du temps de la journée, et d’identifier les gènes régulés par l’augmentation de l’expression de ce gène, soit lors de l’exercice physique, soit lors d'un régime sucré dans différents muscles glycolytiques et/ou oxydatifs. La physiologie musculaire jouant un rôle important dans l'homéostasie métabolique systémique, ce projet permettra également de déterminer le rôle de ce gène musculaire dans la régulation de la glycémie., Sur la base des résultats obtenus, nous pourrons étendre le projet à l’étude des voies de régulation et des processus métaboliques les plus affectés par la délétion de ce gène dans le muscle squelettique.
Procédures
Pour le test de performance physique, les souris reçoivent des stimulations électriques de l'intensité la plus faible. Pour le test de tolérance au glucose, durée 2h, chaque souris subit une injection intrapéritonéale de glucose au début du test et une seule scarification à la queue pour prélever une goutte de sang.
Impact sur les animaux
Il y a peu d’effets indésirables concernant le test de performance physique car il sera effectué pendant la phase active nocturne des souris. L'intensité de la stimulation électrique utilisée pour contraindre les souris à courir est la plus faible. Elle est désagréable mais n'induit pas de douleur. En ce qui concerne le challenge nutritionnel, l’ajout de glucose-fructose dans l’eau de boisson conduit à une prise de poids modérée ainsi qu’à une stéatose hépatique une résistance à l’insuline asymptomatiques et n'induit donc aucun stress ni aucune douleur.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure pour prélèvement d'organes
Remplacement
Nous avons utilisé un modèle cellulaire de myotubes (cellules C2C12) pour montrer que l’expression du facteur de transcription d'intérêt est induite rapidement et fortement par le glucose. De plus nous collaborons avec d'autres équipes afin d’analyser les fibres musculaires isolées et d’établir un modèle mathématique multi-échelles d’organisation et de fonctionnement des muscles.
Réduction
Nous prélevons 4 muscles (EDL, gastrocnemius, soleus, tibialis antérieur) ainsi que d’autres organes impliqués dans l’homéostasie métabolique (foie, tissu adipeux) chez chaque souris et à partir de ces différents organes nous allons réaliser une analyse transcriptomique, et une analyse des fibres musculaires. Comme nous prélevons 6 tissus/organes à partir de chaque souris, nous réduisons le nombre d'animaux par 6. Une collection d’échantillons d’ARN sera constituée et réutilisable dans le cadre du prolongement de ce projet ou pour d’autres projets. Les données brutes de transcriptomique seront déposées dans un entrepôt de données publiques (ENA, EBI). Les effectifs sont élaborés à partir d'expériences antérieures d'une autre équipe de recherche avec laquelle nous collaborons. Nous utiliserons ensuite des tests non paramétriques pour analyser les résultats.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans les conditions habituelles d’animalerie avec un environnement enrichi varié (dôme, briquette en bois, frizzoti pour nidification) , en groupes sociaux et en accord avec la réglementation en vigueur. Le suivi sanitaire effectué chaque jour ouvré par les animaliers permet de déceler tout signe de souffrance ou d’angoisse. En amont de chaque procédure, des dispositions (habituation) sont prises pour minimiser tout stress aux animaux. Pour limiter le stress lié à l'exercice physique sur tapis roulant, une habituation de 10 minutes au tapis roulant sera réalisée 3 fois par semaine la semaine précédant le début du protocole. La 1ère session d'habituation consiste en une habituation à l'environnement (les souris se déplacent librement sur la ligne du tapis roulant, mise en route du tapis à très faible vitesse (les souris se déplacent en marchant). Les souris incapables de courir ne seront pas incluses dans la procédure. Nous réaliserons les séances d'entrainement et d'habituation en pendant la phase d’activité nocturne des souris. . Points limites : Lors du test de performance physique, si la souris ne court pas spontanément, mais uniquement sous la contrainte de stimulations répétées,nous arrêterons ces stimulations lorsque le nombre de 50 sera atteint. Toutefois, si la souris refuse de courir malgré la stimulation, l'expérience sera immédiatement stoppée et la souris sera considérée comme étant dans le groupe contrôleL’ajout de glucose-fructose n’induit pas de stress car les souris ont une appétence naturelle pour le sucré. Aucune souffrance n’est attendue par cette procédure qui induit une stéatose hépatique connue pour être asymptomatique chez l’homme et l’animal. Avant le test de tolérance au glucose, les souris seront régulièrement manipulées pour éviter le stress au moment du test. La mesure de la glycémie aux temps 0, 15, 30 ,60 et 120 min, se fait par dépôt d’une 1 goutte de sang sur une électrode et analyse avec un glucomètre (Abbott). La goutte de sang est obtenue par scarification de l’extrémité de la queue. Pendant la durée du test, la cicatrisation est incomplète, il n’est donc pas nécessaire de répéter le geste à chaque mesure de glycémie. Point limite : si la souris perd du poids (>10%), si elle a un comportement anormal (prostrée), elle sera euthanasiée.
Choix des espèces
1- La souris est le seul modèle chez lequel des mutants du gène d'intérêt peuvent être générés. 2- Elle est très utilisée dans les études fondamentales sur le métabolisme et permet de faire des analyses physiologiques. Le gène étudié est conservé chez l’humain. Les échantillons permettent d’obtenir assez de matériel pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Des travaux antérieurs de notre équipe et les données in vivo de la littérature sont obtenus sur des souris et les modèles génétiques des mutants de ce gène, ce qui permet de faire des comparaisons indispensables et de ne pas répéter certaines expériences. 3-Nous utilisons la souris C57Bl6J car la régulation du métabolisme est similaire chez la souris et l'humain et la souche C57Bl6J est prédisposée au maladies métaboliques. les souris seront âgées de 2-4 mois au début du challenge exercice physique car c'est à cet âge que les résultats montrant une diminution de l'endurance ont été générés. les souris seront âgées de 6 à 10 semaines au début du challenge hyperglucidique car c'est à cet âge que nous avons montré que la délétion de ce facteur de transcription hépatique aggravait la stéatose hépatique.
Rôle du cholestérol cérébral dans l’addiction à la nicotine et dans le phénomène de rechute
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
648 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun hébergé seul en cage pendant 77 jours après la pose d'un cathéter intraveineux. Chaque rat enchaîne vingt-cinq séances quotidiennes d'auto-administration de nicotine de six heures, six semaines d'abstinence, une chirurgie cérébrale de deux heures pour injecter une enzyme qui dégrade le cholestérol, puis une séance de test de rechute. Chacun reçoit une trentaine d'injections intraveineuses en condition vigile. Les retombées annoncées, une meilleure prise en charge des personnes dépendantes et de futurs médicaments contre la rechute, sont formulées au conditionnel, quand l'isolement de 77 jours figure, lui, parmi les nuisances attendues.
Objectifs
L’addiction aux drogues est une maladie comportementale et psychiatrique chronique avec une prévalence croissante, au coût élevé sur le plan médical, social et économique . Le tabagisme fait plus de 8 millions de morts chaque année dans le monde. Sur ces 8 millions, 7 millions sont dus à la consommation directe de tabac, et environ 1,3 million de ces morts subviennent chez des non-fumeurs, qui sont involontairement exposés à la fumée du tabac (selon l’OMS). L’une des caractéristiques de l’addiction est le risque durable de nouvelles consommations même après une abstinence prolongée. Ce risque serait lié à des adaptations durables laissées par les drogues dans le cerveau. La découverte de stratégies pour aider les personnes addicts dans leur désir d’abstinence est une réelle nécessité. Plusieurs évidences suggèrent que le cholestérol cérébral pourrait représenter une nouvelle cible thérapeutique pour traiter l’addiction. En effet, la littérature scientifique indique que le cholestérol pourrait participer aux modifications neuronales persistantes, qui sous-tendent les risques durables de rechute vers une addiction. Ce projet a pour premier but d'identifier chez le rat, une structure cérébrale dans laquelle la manipulation du cholesterol cérébral réduit la recherche de nicotine chez des rats addicts. Quand une structure sera identifiée, nous chercherons à identifier les mécanismes neurobiologiques associés à ces effets comportementaux.
Bénéfices attendus
Ce projet innovant permettra d’apporter une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires expliquant la vulnérabilité à la rechute en particulier à l’addiction au tabac. Ces expériences pourraient conduire à une meilleure prise en charge des personnes addictes et au développement de thérapies médicamenteuses pour réduire voire empêcher la rechute (nouvelle consommation) de nicotine.
Procédures
Tous les rats (648) suivront une chirurgie sous anesthésie générale gazeuse (durée : 15minutes) afin d'implanter un cathéter intraveineux permettant les injections de nicotine pendant les sessions d’auto-administration. Après la chirurgie et jusqu’à la fin du projet, ces 648 rats seront hébergés seuls dans leur cage. L'auto-administration de nicotine concernera tous les rats pendant 25 sessions, 1 session par jour (durée d'une session : 6 heures) en plaçant les animaux dans des cages spéciales dans lesquelles les animaux sont libres de leur mouvement. Les sessions d'auto-administration sont suivies d'une période d'abstinence d'une durée de 6 semaines pour tous les rats. Pour modifier la quantité de cholestérol cérébral, tous les rats suivront une chirurgie cérébrale sous anesthésie générale gazeuse pour permettre l’injection d’une enzyme dégradant le cholestérol ou son contrôle dans une région cérébrale précise (environ 2 heures sous anesthésie générale). Après les 6 semaines d’abstinence, tous les rats sont replacés dans la cage d’auto-administration pour une session de test de rechute (1 session, 4 heures). Tous les rats auront 1 injection sous-cutanée avant et les 2 jours après les chirurgies (3 injections par rat) et une injection intraveineuse (par le cathéter), les 5 premiers jours après la chirurgie d’implantation de cathéter et tous les jours d’auto-administration (30 injections), en condition vigile.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues pour cette procédure sont : -Chirurgies : inconfort transitoire au réveil, douleur minimisée par le traitement antalgique pendant et après la chirurgie -Cathéter intraveineux : gène légère pendant la durée de l’expérience -Période d’abstinence : peut causer un léger stress avec certaines drogues mais non observé avec la nicotine. -Isolement : stress modéré (pendant 77 jours)
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience afin de procéder à des analyses sur le cerveau.
Remplacement
Ce type de recherche, visant à comprendre les bases du comportement de rechute, peut uniquement être menée sur un animal vivant. Après vérification, il n’a pas été trouvé de test in vitro ou in silico permettant d’effectuer cette recherche et il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux au maximum et pouvoir faire des analyses statistiques de type ANOVA, le nombre d’animaux requis a été calculé par un test dit de puissance qui tient compte de la variabilité des mesures. Ainsi, nous avons trouvé que 18 animaux par lots seront nécessaires avec 36 lots au total soit 648 animaux maximum. Le nombre d'animaux indiqué est un maximum. Le projet est conçue dans une démarche "pas à pas" où certaines expériences ne seront réalisées que si les résultats des expériences précédentes sont concluantes.
Raffinement
Toutes les phases du projet seront réalisées par des personnels expérimentés. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide dans le suivi des points limites et des critères d’intervention et d’arrêt. En effet, ses points limites gradés précis et spécifiques sont définis de façon suffisamment précoce dans une grille de suivi (perte de poids, apparence, comportement de l’animal). Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape avec une pesée 2 fois par semaine. Lors des procédures de chirurgie un recours à une anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques, ainsi que d’un maintien de la température par tapis chauffant et d’une hydratation régulière des tissus. Les expérimentateurs sont compétents en chirurgie. Dès leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés à deux par cage en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger pour assouvir leur besoin naturel de ronger) et accès à l’eau ad libitum. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum.
Choix des espèces
Le rat est l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux. Les rats ont des réponses aux drogues qui sont similaires à celles de l’Homme et ils s’auto-administrent toutes les drogues abusées par l’Homme de façon spontanée, ce qui n’est pas aussi évident avec la souris, pour lesquelles la réalisation de tâches opérantes modélisant l’addiction est plus difficile à obtenir. Nous utiliserons des rats de la lignée « Sprague-Dawley ». Il s’agit de rats « outbred », c’est-à-dire avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus pour un meilleur reflet de ce que l’on trouve chez l’Homme. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet, ce qui correspond au stade de développement utilisé dans l’ensemble de nos projets de recherche afin de limiter le risque de variabilité qui pourrait être lié à l’utilisation de rats en phase d’adolescence (juvéniles).
L’inflammasome en tant que cible thérapeutique des processus inflammatoires périphériques et cérébraux dans la maladie d’Alzheimer dans un modèle murin.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des ultrasons délivrés une minute par jour, jusqu'à cinq jours de suite, pour ouvrir la barrière qui protège le cerveau, après la pose d'un cathéter et l'injection de microbulles de gaz : 176 souris porteuses d'une modification génétique reproduisant la maladie d'Alzheimer subissent ce protocole, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent aussi, à l'état vigile, une injection quotidienne pendant deux jours d'une protéine bactérienne qui déclenche fièvre, poil hérissé et prostration pendant trois à six heures, puis un inhibiteur censé bloquer l'inflammation cérébrale. Toutes sont tuées et leur cerveau prélevé pour analyse. Le porteur annonce des tests comportementaux étalés sur quatorze jours, dix minutes par test sur animal vigile, sans préciser lesquels.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer (MA), constituent un problème de santé et sociétal majeur dans le monde, les causes et les nombreux facteurs contribuant à la MA sont encore mal compris, et les essais cliniques n’ont jusqu'à présent pas réussi à stopper la progression de la MA. Une meilleure compréhension des mécanismes de la MA est nécessaire pour explorer de nouvelles approches thérapeutiques. La contribution de l'inflammation périphérique et cérébrale aussi appelée « neuroinflammation », à la pathologie de la MA est établie mais reste encore mal comprise. L’inflammation peut être ciblée via l’un de ses composants critiques : l’inflammasome, et plus particulièrement par une protéine impliquée dans cette neuroinflammation. Ce projet vise: - à déterminer la contribution de l'inflammation systémique, induit par des stimuli pro-inflammatoires, à la pathologie de la MA - à établir si la protéine peut être ciblée à la fois de manière périphérique et centrale - à utiliser une approche innovante pour améliorer la délivrance cérébrale d'un inhibiteur sélectif de cette protéine en utilisant les ultrasons (US) pour ouvrir la barrière hémato-encéphalique(BHE).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont : • De valider une cible thérapeutique innovante associée à une technologie permettant d’améliorer l’efficacité potentielle de cette thérapie ; • D’apporter de nouvelles connaissances dans le domaine des neurosciences et plus particulièrement du rôle de l’inflammation et de la neuroinflammation dans la MA.
Procédures
Un groupe d'animaux recevra: une injection intra-péritonéale (IP) par jour d'une protéine bactérienne pendant 2 jours d'une durée de 20 secondes par injection. (Animal vigile) et recevra une autre injection intra-péritonéale (IP) d'une molécule inibitrice de la protéine concernée, 1 seule fois, d'une durée de 20 secondes par injection (Animal vigile). Les animaux ayant reçu les injections IP auront une séquence d'ultrasons d'une durée d'une minute: pose de cathéter en IV (1 min) puis injection de microbulles de gaz (1min) et séquence ultrasonore. (sous anesthésie gazeuse). Il auront 1 fois une injection en IP (vigile) pour une anesthésie chimique d'une durée de 20 secondes. Un autre groupe d'animaux recevra également une injection intra-péritonéale (IP) par jour d'une protéine bactérienne pendant 2 jours d'une durée de 20 secondes par injection. (Animal vigile) et recevra une autre injection intra-péritonéale (IP) d'une molécule inibitrice de la protéine concernée de J3 à J7 d'une durée de 20 secondes par injection (Animal vigile). Ces animaux recevront une fois par jour pendant 5 jours une séquence d'ultrasons d'une durée d'une minute: pose de cathéter en IV (1 min) puis injection de microbulles de gaz (1min) et séquence ultrasonore. (sous anesthésie gazeuse). Habituation de la pièce de comportement: 30 min avant les tests. Les souris auront différents tests comportementaux pendant 14 jours pour une durée de 10 min par test (animal vigile). Tous les animaux auront 1 fois une injection en IP (vigile) pour une anesthésie chimique d'une durée de 20 secondes.
Impact sur les animaux
Administration intrapéritonéale et intra veineuse: Les injections peuvent engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection et la manipulation/contention des souris peut engendrer un certain stress. La protéine bactérienne n’induit pas d’effets indésirables sévères chez les animaux, mais peut induire un état fiévreux : poil hérissé, prostration liée la fièvre (l’inflammation périphérique) induite par la protéine bactérienne pendant les 3-6h suivant l’administration. Ces symptômes disparaissent d’eux-mêmes dans les 6h suivant l’injection.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue du projet et leur cerveau sera prélevé pour des analyses immunohistochimiques.
Remplacement
Seules des études chez l’animal vivant peuvent reproduire la complexité de l’ensemble des processus physiopathologiques dans leur intégralité. De plus, il est important de noter que la méthode d’imagerie TEP (tomographie émission de positions) utilisée est intégralement transférable à la clinique et que l’étude chez l’animal nous informera de l’amplitude des différences entre groupes qui lors d’études similaires précédentes se sont révélées similaires de celles observées chez l’homme.
Réduction
L’utilisation de la méthode d’imagerie in vivo permet de réduire le nombre d’animaux utilisé (-25%) par le biais du suivi longitudinal. Le nombre total d’animaux est néanmoins dicté par les groupes expérimentaux requis pour l’obtention de résultats permettant de répondre à la question scientifique posée. Ces groupes seront composés de 50% de mâles et 50% de femelles. Bien que des différences mineures de pathologie de la MA aient été notées entre mâles et femelles dans le modèle transgénique, celles-ci ne devraient pas affecter significativement les paramètres mesurés dans cette étude. Nous prévoyons ainsi d’inclure un effectif de 10 animaux/groupe (afin d’assurer un minimum de 8 animaux à exploiter, par exemple en cas d’échec de l’injection du traceur ou de mort au cours de l’imagerie), nombre qui a été suffisant lors d’études précédentes dans ce modèle. Par souci de réduction, nous n’inclurons qu’un seul groupe non transgénique comme contrôle absolu pour tous les autres groupes, puisque d’un point de vue scientifique et translationnel des animaux/patients sains ne recevraient pas de traitement. D’après notre expérience, ce groupe est néanmoins nécessaire car il y une légère augmentation de la neuroinflammation avec l’âge (notamment mesurée par un radiotraceur fluoré) chez ces souris. Dans ce projet, nous utiliserons des tests statistiques appropriées pour analyser les différents paramètres mesurés au cours de ce projet: en imagerie, le comportement, des études in-vitro.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison ou tube en plastique). Les animaux seront observés une à deux fois par jour. Une récompense alimentaire sera donnée aux animaux après les injections pour diminuer leur stress. Toutes les stratégies d'analgésie, d'anesthésie et de soin seront mises en œuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être induit par les procédures. Pendant le protocole, si nous constatons des conflits dans les cages, nous procéderons à une séparation des individus. En cas de blessures, nous appliquerons un nettoyant et un désinfectant sur la plaie jusqu’à la cicatrisation complète. Pendant le projet, le point d’injection, les expressions faciales, la posture de l’animal, la réactivité de l’animal à des stimuli externes (bruit…) seront monitorés chaque jour. Une perte de poids de plus de 15%, une réactivité anormale à des stimuli externes (bruits), une posture et des expressions associées à une souffrance de l’animal impliqueront sa mise à mort. Le jour de l'imagerie l’induction et le maintien se fera sous anesthésie gazeuse. Une protection oculaire sera appliquée. L’animal sera maintenu durant toutes les expérimentations d’imagerie sur tapis chauffant, le rythme respiratoire et la température corporelle seront surveillés. Dès son réveil, l’animal sera remis dans sa cage d’hébergement.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix car la pathologie de la maladie d'Alzheimer (MA) est bien reproduite dans ce modèle d'animal transgénique et les processus inflammatoires lié à cette maladie dans ce modèle sont très similaire à ceux observé chez l'humain. La taille du cerveau de la souris est compatible avec la résolution spatiale de la caméra microTEP. Nous utiliserons des souris adultes car la MA ne concerne que les populations adultes/âgées.
Etude du rôle du long ARN non-codant LincPint sur la fonction endothéliale lymphatique.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
Après cinq jours d'injections quotidiennes dans le ventre, des souris reçoivent des cellules tumorales, subissent une chirurgie qui provoque un lymphœdème ou l'application d'une molécule inflammatoire, puis, pour certaines, une lymphographie par injection entre les coussinets d'une patte. 280 souris femelles de 5 semaines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour récolter leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'équipe étudie, chez des souris génétiquement modifiées qui ne l'expriment plus dans leurs vaisseaux lymphatiques, le rôle d'un ARN, LincPint, retrouvé en excès chez des patientes atteintes de lymphœdème après un cancer du sein. Le résumé ne nomme ni la substance injectée cinq jours de suite ni la molécule inflammatoire, et liste les signes surveillés, dos voûté, yeux mi-clos, poil hérissé, perte de poids, sans dire ce qui arrive à une souris qui les présente.
Objectifs
Le système lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener à la circulation sanguine au niveau de la veine sous-clavière. Il est impliqué dans le transport des graisses et des macromolécules et joue un rôle important dans l’immunité en transportant les cellules de l’inflammation. Le réseau lymphatique est également impliqué dans de nombreuses pathologies telles que le lymphoedème, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde et dans la dissémination métastasique. Le lymphoedème est le résultat d’une obstruction ou d’une perturbation du système lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedème est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient après la chirurgie du cancer, cependant aucune thérapie visant la régulation du dysfonctionnement de ce réseau lymphatique n’est proposée. Lors d’une étude chez les patientes ayant développé un lymphoedème après cancer du sein, nous avons mis en évidence qu’un Long Acide Ribo Nucléique (ARN) non traduit en protéine, LincPint, était fortement surexprimé dans vaisseaux lymphatiques au niveau les lésions. De plus, des données de la littérature ont montré que cette molécule jouait une rôle prédominant dans la croissance tumorale. Ce projet aura pour but de déterminer quel est le rôle de LincPint dans la fonction lymphatique.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre certains aspects de la physiopathologie du système vasculaire lymphatique non étudiés à ce jour. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Enfin, il permettra de mieux comprendre quels sont les mécanismes de régulation génique qui contrôlent l’apparition et le développement du lymphoedème.
Procédures
Les animaux seront soumis à jusqu'à 3 procédures au total. D'abord, une injection intraperitonéale par jour pendant 5 jours consécutifs est réalisée. Ensuite, ils seront soumis à une injection de cellules tumorales ou à une procédure chirurgicale ayant pour but d'induire le lymphoedème secondaire sous anesthésie générale (durée
Impact sur les animaux
Les chirurgies ainsi que le développement de tumeurs vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet.
Remplacement
Les effets des long Acides Ribo Nucléiques (ARN) font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques de ces molécules dans la fonction endothéliale lymphatique. De même, la croissance tumorale et le développement de lymphoedème secondaire font intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endothéliale lymphatique, inflammation..), il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe sera determiné à l'aide d'un logiciel dédié afin de déterminer le nombre minimal d'animaux à inclure par groupe pour avoir un effet statistiquement significatif et donc de ne pas utiliser plus d'animaux que necessaire.
Raffinement
Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. Cette surveillance permet d'appliquer des points limites précis. Les paramètres contrôlés sont le dos vouté/courbé, yeux plissés/mis-clos, poil herissé et absence de toiletage, diminution des mouvements d'activité, ainsi que la perte de poids. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car il n'existe que dans cette espèce des individus génétiquement modifiés afin d'avoir les caractéristiques nécessaires à notre étude. Cette modification génétique a conduit à l'invalidation de notre molécule d'intérêt dans les vaisseaux lymphatiques. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée chez des souris femelles à l'âge de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 à 12 semaines.
Analyse de mitochondries des souris déficientes en seipines
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Pour isoler et caractériser les mitochondries du tissu adipeux de souris privées de seipine, une protéine dont l'absence détruit la graisse corporelle, 384 souris vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Chacune reçoit cinq jours de suite une injection de tamoxifène dans le péritoine, qui déclenche la suppression du gène. Le porteur décrit le phénotype obtenu comme très léger, une perte de masse graisseuse sans effet sur le poids total. Toutes sont tuées quinze jours après l'injection, six d'entre elles étant tuées pour chaque préparation de mitochondries, à raison de huit préparations par groupe et pour chacun des quatre paramètres étudiés.
Objectifs
L’obésité est un facteur de risque majeur pour les maladies cardiométaboliques. De plus en plus d’évidences montrent que la dysfonction adipocytaire joue un rôle central dans le développement des complications métaboliques de l'obésité. Notre équipe s’intéresse à différents facteurs qui contrôlent l’homéostasie de l’adipocyte. Au cours de ces 10 dernières années, nous avons identifié plusieurs cibles moléculaires impliquées dans la bonne santé adipocytaire. Depuis plus de 15 ans, nous nous intéressons au rôle de la seipine, une protéine dont l'absence entraîne la perte du tissu adipeux. Récemment, nous avons montré que la seipine régulait la bonne santé du tissu adipeux via sa localisation dans les points de contact entre deux structures cellulaires, le réticulum endoplasmique (RE) et les mitochondries. Nous avons d'ores et déjà étudié un modèle murin de déficience inductible et adipospécifique qui de la seipine. Ces dernières années, grâce à des analyses in vitro, nous avons montré que la seipine contrôle l'activité des mitochondries, des organites cellulaires impliqués dans la production de l'énergie et la synthèse des lipides. Afin de confirmer la relevance de nos résultats chez l'animal, nous souhaitons isoler les mitochondries de souris déficientes en seipine et les caractériser. De plus en plus d'évidences montrent que les mitochondries jouent un rôle important dans l'homéostasie du tissu adipeux et que leur fonction est altérée dans le tissu adipeux des souris obèses et des patients atteints d'obésité. Notre travail pourrait permettre de mieux comprendre comment les mitochondries contrôlent les propriétés du tissu adipeux et comment la correction de leurs propriétés pourrait améliorer l'état du tissu adipeux des patients vivants avec une obésité.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux définir les déterminants de la bonne santé adipocytaire et dans le futur, de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Les souris recoivent une injection intrapéritonéale (durée 20 secondes) pendant 5 jours.
Impact sur les animaux
Les nuisances principales sont liées aux injections par voie intrapéritonéale de tamoxifène qui permettent l'induction de la délétion. Les souris sont mise à mort 15 jours après l'injection, à ce stade le phénotype est très léger et se traduise principalement par une perte de masse graisseuse sans effet sur le poids total et sans altération du métabolisme.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour permettre les analyses biologiques nécessaires pour le projet
Remplacement
Nous avons déjà validé in vitro que la seipine joue un rôle central dans le contrôle des propriétés des mitochondries. Les expériences proposées ici interviennent à un moment où le rationnel est solide. Cependant, une validation in vivo est indispensable car les propriétes du tissu adipeux restent différentes de celles des modèles celulaires disponibles.
Réduction
Le projet nécessite l’utilisation d’un nombre total de 384 animaux, ce qui dans un souci de réduction correspond au nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs, en accord avec nos données précédentes. Nous utilisons 6 animaux pour une préparation d'isolement de mitochondries, et pour avoir des données robustes nous avons besoin de 8 préparations par groupe, pour chacun des 4 paramètres étudiés. Nous utiliserons des tests non paramétriques pour tester la valeur statistique de nos données.
Raffinement
Nous utilisons systématiquement des cages avec litières et frisottis et soit un igloo soit un tube tunnel, les deux fabriqués en polycarbonate. Les souris sont hébergées 5 par cages. Nous utilisons des aiguilles micro-fines pour l'injection, qui réduisent la douleur. Nous avons détaillé dans la section concernant la procédure notre stratégie en termes de points limites gradés et adaptés aux nuisances observées. La surveillance quotidienne (week-end) comprise permet une application stricte et efficace de la stratégie élaborée.
Choix des espèces
Nous avons généré et étudié les souris iATSKO. Nous connaissons bien le modèle et nous savons d'ores et déjà que dans le tissu adipeux de ces souris agées de 8 semaines, les mitochondries ont des propriétés altérées. C'est pour cette raison que nous utiliseraons des souris adultes de 8 à 10 semaines, à un stade où la dysfonction mitochondriale est déjà présente.