Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
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Xénogreffe de cellules souches normales ou leucémiques humaines chez la souris immunodéficiente
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Immunodéficientes par construction, les souris de ce projet accueillent des cellules souches humaines saines ou leucémiques sans les rejeter. 19 959 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Chacune est transportée, irradiée jusqu'à quatre-vingt-deux secondes, injectée par voie intraveineuse, prélevée au sang une fois par semaine et ponctionnée dans la moelle osseuse du tibia sous anesthésie gazeuse. Toutes sont tuées, y compris les trios reproducteurs une fois passés leurs six mois de reproduction, et l'effectif de près de vingt mille souris tient en une phrase du porteur affirmant qu'il correspond au minimum déterminé par une approche statistique.
Objectifs
Décrire les différences génomiques (activation de gènes) entre les cellules souches humaines et les cellules issues de patients souffrant de leucémie afin d’établir des cibles thérapeutiques pour de nouveaux traitements. Découvrir de nouvelles caractéristiques au sein des cellules souches lors de leur développement durant l’hématopoïèse.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes contrôlant le développement normal et leucémogénique des cellules lymphoïdes humaines. Ce projet constitue un prérequis pour le développement de stratégies thérapeutiques innovantes des leucémies.
Procédures
Injection intraveineuse, 1 min par intervention. Prélèvements sanguins, 2 min par intervention une fois par semaine. Prélèvement de moelle osseuse au niveau du tibia sous anesthésie gazeuse, 5 min par intervention, transport (10min), irradiation (82 secondes maximum).
Impact sur les animaux
Le transport et l’irradiation sur site peuvent provoquer un stress transitoire durant les heures qui suivent. L’anesthésie gazeuse peut provoquer une baisse de la température corporelle et un assèchement des yeux. Les injections intraveineuse et intrapéritonéale peuvent provoquer un stress transitoire. Les prélèvements sanguins et de moelle osseuse peuvent provoquer une douleur.
Devenir
L’ensemble des animaux expérimentaux et trios d'accouplement seront mis à mort à la fin de la procédure. Les animaux expérimentaux sont injectés avec des cellules humaines et leur mise à mort est indispensable pour récupérer les cellules d'intérêts. Les trios d'accouplements seront mis à mort car ils auront passé les 6 mois de reproduction. Ces animaux sont à phénotype dommageable et ne peuvent être remis en liberté.
Remplacement
Les cellules humaines étudiées (saines et leucémiques) ne peuvent être maintenues en culture. L’utilisation d’un modèle murin immunodéficient permet de les maintenir fonctionnelles et de les expandre.
Réduction
Les expériences sont réalisées avec le nombre minimum d’animaux nécessaires à l’obtention d’un résultat significatif déterminé par une approche statistique.
Raffinement
Les animaux seront élevés au sein d’une animalerie dont le statut sanitaire apporte un niveau de stérilité important. Les souris seront hébergées à raison de 5 animaux par cage sur portoir ventilé avec un accès à la nourriture et à la boisson ad libitum. Chaque cage bénéficie d’un enrichissement matérialisé par un tunnel translucide rouge destiné à diminuer le stress et stimuler l’activité des souris, par des carrés de cellulose afin de favoriser la nidification. Le bien-être des animaux sera surveillé régulièrement et une grille de score d’évaluation sera mise en place. Lors des prélèvements au niveau du tibia, les animaux seront placés sur une plaque chauffante et sous anesthésie gazeuse et des soins analgésiques seront appliqués.
Choix des espèces
Les souris utilisées ont été décrites dans la littérature scientifique comme le modèle de référence pour greffer les cellules hématopoïétiques humaines, étudier le développement des leucémies humaines, et ainsi servir de modèles précliniques pour l’évaluation de nouvelles thérapies. Les animaux subiront une greffe de cellules humaines à l'âge adulte (6 à 8 semaines) car il s'agit de l'âge optimal pour obtenir les meilleures chances de succès de greffe
Etude de l’activation des cellules myéloïdes dans les maladies d’inflammation vasculaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Les souris dont la douleur ne cède pas au traitement analgésique sont tuées, l'atteinte d'un point limite entraînant l'arrêt du protocole. 1 680 souris vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour prélever leur sang et leurs organes. Les modèles de vascularite rénale et pulmonaire qui leur sont imposés peuvent provoquer une insuffisance rénale, une gêne respiratoire, un affaiblissement général et une perte de poids, et chaque souris subit selon le protocole des injections dans le péritoine à l'état vigile, trois injections derrière l'œil sous anesthésie, une instillation dans le nez et jusqu'à huit heures en cage métabolique. Les retombées annoncées tiennent à des molécules ciblant deux récepteurs, déjà en développement pour d'autres maladies, dont le porteur écrit qu'elles pourraient ouvrir des perspectives dans les vascularites.
Objectifs
Les vascularites, maladies inflammatoires des vaisseaux sanguins, représentent un groupe hétérogène de maladies systémiques avec des mécanismes physiopathologiques distincts et des stratégies thérapeutiques distinctes. Les vascularites sont classées selon la taille des vaisseaux affectés et peuvent conduire à l’altération d’autres organes tels que les poumons et les reins. Ces pathologies se caractérisent par la présence d’un infiltrat inflammatoire, composé particulièrement de cellules immunitaires, qui viennent envahir la paroi aortique, entraînant un remodelage de cette dernière pouvant aller jusqu’à l‘occlusion du vaisseau. Une meilleure compréhension des facteurs impliqués dans la régulation des cellules inflammatoires et aortiques est indispensable. Les objectifs du projet est d’étudier le rôle de deux récepteurs présents à la surface des cellules immunitaires, les monocytes/macrophages, et leur modulation au cours des maladies inflammatoires. Les modèles murins de maladies inflammatoires étudiés seront des modèles de vascularites rénales, pulmonaires et des gros vaisseaux, et un modèle de réponse inflammatoire systémique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre en évidence l’implication potentielle de deux récepteurs membranaires présents à la surface des monocytes/macrophages dans la physiopathologie de maladies inflammatoires, notamment les vascularites affectant les vaisseaux de gros et petit calibre, entraînant l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Des molécules venant cibler ces récepteurs sont en cours de développement dans d’autres pathologies, et les travaux réalisés pourraient ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans les vascularites.
Procédures
Prélèvement à la queue (1fois 30sec) sur souris vigile, une injection intra-péritonéale (10 secondes, nombre d'injections variant selon le protocole), une injection rétro-orbotaire sous anesthésie (15 secondes, 3fois), une instillation intranasale sous anesthésie (1fois), une injection intraveineuse (45sec, nombre d'injections variable selon le protocole), un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie (45 sec). Cages métaboliques : inférieur à 8h avec accès à l'eau.
Impact sur les animaux
Les différents modèles peuvent induire un affaiblissement général de l’animal, asthénie, perte de poids, insuffisance rénale (modèle de glomérulonéphrite et vascularite rénal), gène pulmonaire (modèle de vascularite pulmonaire). L’ensemble des modèles peut induire des douleurs de courtes durées et peu intenses liées aux injections. Enfin, un stress chez les animaux peut survenir subissant des contentions et manipulations répétées.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever le sang et les organes pour y réaliser des analyses cytologiques et histologiques.
Remplacement
Les vascularites et maladies systémiques impliquent des réponses immunitaires complexes au sein de divers organes. Actuellement, les modèles in vitro ne permettent pas de reproduire finement l’environnement physiopathologique dans lequel la réponse immunitaire est mise en jeu. L’expérimentation animale est indispensable afin de se rapprocher de la physiopathologie de ces maladies observées chez l’Homme. Les systèmes et protocoles d'imagerie ont été optimisés et caractérisés sur des objets physiques de forme, géométrie, composition connus permettant ainsi de comparer images obtenues et réalité, avant de passer chez l'animal.
Réduction
Les paramètres expérimentaux ont été définis selon des études déjà publiées (temps de traitment, doses et voies d’administration). Nous avons déterminé un nombre d’animaux restreint au maximum, de sorte à obtenir des résultats permettant d'obtenir la puissance statistique nécessaire pour y ttirer des conclusions biologiquement pertinentes. Pour chacune des expériences nous avons maximisé les prélèvements et analyses biologiques. Les méthodes d'imagerie étant non invasives et non douloureuses, les animaux pourront être suivis au cours temps et les paramètres étudiés seront mesurés à chaque passage pour chaque animal. Des analyses statistiques seront effectuées sur chacune des expériences.
Raffinement
Les injections intra-péritonéales seront réalisées sur animal vigile tandis que les injections rétro-orbitaires et pulmonaires seront réalisées sur animal anesthésié et posé sur un tapis chauffant pour le confort de l’animal. Pour les injections répétées nous alternerons les points d’injections afin de maintenir le confort de l’animal. Une évaluation générale de l’animal, basée sur son apparence physique et comportemental, sera faite grâce à l'établissement de points limites. Le poids corporel sera relevé tous les 3 jours pour les traitements inférieurs à 10 jours et 1 fois par semaine pour ceux supérieurs à 10 jours. Les animaux seront élevés dans des cages enrichies et regroupés en groupe sociaux pour éviter tout isolement. Le personnel qualifié assure un suivi quotidien et tout comportement anormal sera reporté au responsable du projet. L’atteinte d’un point limite établi entrainera une mise à mort anticipée de l’animal et l'arrêt du protocole. Nous aurons recours à de l’imagerie non invasive afin de monitorer les lésions inflammatoires dans le cas d’apparition de vascularites spontanées, et de pouvoir suivre l’évolution de ces modèles de la manière la moins invasive possible. Pour toutes les analyses d'imagerie, les animaux seront sous anesthésie générale. Les examens d'imagerie au centre du projet sont non invasifs et atraumatiques et impliquent au maximum l'injection d'un agent de contraste ou fluorescent. Les animaux seront surveillés tout au long de l’expérience afin d’observer leur comportement. En cas de signes de souffrance, des traitements analgésiques seront utilisés. En cas d'échec de réduction de la douleur, les manipulations seront arrêtées et les animaux mis à mort.
Choix des espèces
Le modèle animal nous permet de réaliser des expériences de physiopathologie d’inflammation vasculaire et systémique (induit ou spontané) de mammifère en prenant en compte l’ensemble des paramètres physiologiques existant in vivo. Les analyses in vitro ou in sillico ne sont pas relevantes en ce qui concerne l’inflammation vasculaire et systémique car trop de paramètres physiologiques entrent en jeu. Les pathologies induites décrites précédemment font l’objet de protocoles publiés.
Etude de la stéatose hépatique non alcoolique chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Des dommages hépatiques sévères provoqués par une molécule, un régime riche en graisses maintenu des semaines, jusqu'à huit injections, un gavage et trois prises de sang : 2 340 souris subissent ces procédures, déclarées d'un niveau de souffrance modéré à sévère. Le porteur décrit chacune de ces atteintes en une ligne et qualifie de légères la douleur des injections comme la contrainte du gavage, la seule mention de sévérité portant sur les dommages au foie qu'il induit délibérément. Il ajoute que les souris deviendront un peu moins actives en prenant du poids, et qu'une mise à jeun de six heures leur imposera une sensation de faim. Toutes sont tuées en fin de procédure pour récupérer des prélèvements qu'il juge "indispensables" à la compréhension de la stéatose hépatique.
Objectifs
La stéatose hépatique non-alcoolique est une maladie chronique caractérisée par une accumulation de graisses dans le foie associée à une inflammation. Elle est plus fréquente chez les personnes atteintes d’obésité et/ou du diabète de type 2. Dans notre projet, nous visons à utiliser des modèles de souris pour comprendre le développement et les facteurs contribuant à cette maladie et proposer des solutions thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche permettra une meilleure compréhension des mécanismes gouvernant l’inflammation du foie et pourrait permettre de définir de nouvelles approches thérapeutiques dans la stéatose hépatique non-alcoolique et ses complications.
Procédures
Injections sous anesthésie locale (maximum 8, durée 1 minute). Gavage (n=1, durée 1 minute). Prélèvements de sang (n=3, durée 2 minutes).
Impact sur les animaux
Régime riche en graisse (HFD) long-terme : les souris vont prendre du poids au fur et à mesure des semaines et devenir un peu moins actives. - Injection : douleur légère. - Mise à jeun de 6 heures: Les animaux n’auront plus accès à la nourriture, ils pourront subir une contrainte due à la sensation de faim. - Gavage : contrainte légère due à la contention et à la sonde de gavage. -Induction de dommages sévères au foie par une molécule.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de récupérer tous les prélèvements nécessaires pour mettre en oeuvre les trois grandes techniques qui nous sont indispensables à la compréhension des mécanismes que nous souhaitons explorer dans ce projet.
Remplacement
Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement cellulaire dans le foie dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux régimes et traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…). Pour réaliser les tests métaboliques et analyser la signalisation inter-organe, les modèles in vivo sont indispensables. Seul un animal vivant peut permettre d’étudier dans sa globalité le comportement des macrophages du foie soumis à différentes régimes.
Réduction
Le nombre de souris est réduit a son minimum. De nombreux tissus et cellules seront collectés apres la mise a mort, afin d'approfondir les études moléculaires, cellulaires et transcriptomiques. Chaque souris génèrera donc de nombreuses données. De plus nous avons determiné un nombre de souris par groupe, suivant les procédures, en fonction de données de la littérature ou grâce a l'utilisation d'un outil statistique (calcul de puissance) pour le calcul des effectifs. En détail, nous avons déterminé le nombre de souris par régime et par génotype grâce à l'utilisation d'un outil statistique pour le calcul des effectifs avec un test de puissance . Concernant les résultats, une analyse statistique sera réalisée en tenant compte de la variabilité intra-groupe ainsi que test d'analyse de variance sur mesures répétées par les valeurs d'enzymes hépatiques et les poids des souris.
Raffinement
Les souris seront sous surveillance quotidienne de la part de l’équipe de recherche pour évaluation clinique adaptée à chaque procédure, et mise en place d'actions correctives pertinentes. Des traitements antalgiques seront mis en place pour soulager les animaux en procédure. Des point limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Toutes les interventions seront faites sous anesthésie locale ou générale.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus pertinent dans notre étude car elle se rapproche physiologiquement des pathologies humaines. En effet, selon la littérature, les modèles murins sont utilisés dans les études de l’obésité alimentaire et l’insulinorésistance. De plus, notre modèle murin (souris invalidées pour le gène d'intérêt) a déjà été validé dans des travaux publiés précédents. Les souris utilisées pour les procédures expérimentales auront entre 8 et 10 semaines au début de la procédure, il s’agit de souris adultes car la pathologie humaine se développe chez le jeune adulte et chez l'adulte.
Étude de l’homéostasie et fonctionnement de cellules immunitaire et de leurs rôles dans la réponse immunitaire contre des tumeurs solides
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1 428 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur par voie intraveineuse, sous la peau ou directement dans la paroi intestinale lors d'une chirurgie de quinze minutes, d'autres sont infectées par une entérobactérie, et certaines sont maintenues endormies deux à quatre heures pour de l'imagerie après une opération de trente minutes. Le porteur estime que les souris rencontrent peu d'effets indésirables et que la localisation de la tumeur ne semble affecter ni leur mobilité ni leur comportement, tout en fixant comme points limites le poil ébouriffé, la prostration et la diarrhée. Aucune ne peut être réutilisée, replacée ou adoptée, ayant reçu des cellules tumorales ou subi une chirurgie viscérale qu'il décrit comme non opérable.
Objectifs
L’objectif du projet consiste à étudier le développement des cellules lymphoïdes (ILCs), ainsi que leurs fonctions dans l’homéostasie tissulaire et dans l’initiation et le maintien de la réponse immune contre des tumeurs et l’infection bactérienne. D’une part, nous analyserons les mécanismes de développement permettant la génération des différents types d’ILCs. Cette étude consistera à déterminer les signaux activateurs et inhibiteurs permettant la génération, le maintien et la régulation fonctionnelle de ces cellules. D’autre part, nous étudierons leurs rôles et leurs interactions au sein du système immunitaire lors de la réponse anti-tumorale et antibactérienne.
Bénéfices attendus
Nous proposons ici de caractériser au niveau moléculaire et cellulaire le mécanisme de surveillance immunitaire des cellules lymphoïdes innées dans un modèle tumoral et infectieux. Ainsi, nous obtiendrons une compréhension intégrée du système immunitaire dans des conditions normales et pathologiques. Ainsi, la compréhension du mécanisme qui régule les premières phases de l'immunité innée contre la progression tumorale et infectieuse pourrait conduire à de nouvelles approches thérapeutiques pour prévenir l’infection bactérienne ou améliorer l'espérance de vie après la tumorigenèse.
Procédures
Certains animaux recevront une greffe tumorale qui consistera à une intervention chirurgicale de 15 minutes. Les injections instantanées seront réalisées i.v, i.p, et/ou intra lamina propria intestinale. Certains animaux subiront une intervention chirurgicale de 30 minutes pour effectuer l’imagerie et seront maintenus endormis pendant 2 à 4h.
Impact sur les animaux
Notre projet propose, d’une part d’étudier les cellules lymphoïdes innées (ILCs) infiltrant une tumeur et nécessite la greffe intraveineuse, sous-cutanée ou intestinale de tumeur aux souris et d’autre part d’étudier l’infiltration des ILCs dans le tissu infecté par une entérobactérie. Notre connaissance suggère que les souris rencontrent peu d’effets indésirables causés par la pousse tumorale ou l’infection bactérienne. La localisation de la tumeur ne semble pas impacter leur mobilité, leur alimentation, leur pelage et leur comportement et l’infection aura des effets transitoires sur le poids de la souris. Nos précédentes expériences montrent que l’injection de molécules (anticorps) que nous proposons d’étudier dans ce projet n’aura pas d’effets indésirables dans la période expérimentale. Injection des tumeurs par voie i.v. : effets légers Injection des tumeurs par vous sous-cutanée : effets modères Injection des tumeurs intestinale : effets modères Infection des souris avec des entérobactéries : effets modères
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront reçu initialement des cellules tumorales ou une chirurgie viscérale non opérable.
Remplacement
Nous avons recours aux animaux afin de décortiquer le mécanisme d’action des ILCs car les modèles in vitro actuels ne permettent pas de récapituler la complexité des réponses immunitaires ayant lieues in vivo. Néanmoins, nous ne réaliserons que les tests in vivo les plus nécessaires (emplacement spatiale des ILCs dans les tumeurs/métastases et la croissance des tumeurs/métastases. Par contre, afin de caractériser la fonctionnalité de l'ILC, nous remplacerons les expériences in vivo par des tests in vitro afin de réduire le nombre des animaux dans les expériences.
Réduction
D'après notre expertise issue des projets précédents et notre collaboration avec le département de statistiques, nous avons déterminé́ le nombre d'animaux par groupe qui nous permettront d'utiliser les tests statistiques robustes. Le nombre de souris nécessaire à l’expérimentation a été déterminée en tenant compte d’une réduction maximale du nombre d’individus tout en garantissant une significativité statistique des résultats. Les animaux ne pourront pas être réutilisés car ils seront porteurs de tumeur(s) ou infectés par des bactéri es. L'utilisation cytométrie spectrale nous permet de réduire le nombre d'animaux utilisé car cette technologie permet d'acquérir plus de paramètres que la cytométrie classique à partir d’un un même animal. Dans la mesure du possible, les expériences de cytométrie, séquençage, et d’immunohistochimie seront effectuées sur les même animaux afin de limiter leur utilisation.
Raffinement
Modèles tumoraux : Pour épargner toute douleur, les animaux seront suivis fréquemment et des points limites (poil ébouriffé́, prostration, diarrhée) sont établis pour raffiner les procédures. Nous utilisons ces modèles de tumeurs depuis plusieurs années et nous connaissons leur tumorigenèse dans des souris contrôles et immunodéficientes (absence des cellules lymphoïde adaptatives et innées). D’après notre expérience et la littérature, nous estimons que le développement tumoral dans les souris mutantes comprises dans ce projet se situera entre ces deux extrêmes. Cependant, nous prévoyons les mesures suivantes et dans l’ordre dès apparition d’un signe clinique : l’ajout du gel hydrique dans la cage pour faciliter la réhydratation et prise de nourriture, réhydratation sous-cutanée, amélioration de la température (plaque chauffante ou chaufferette) de la cage et si pas amélioration mise à mort. Dans le cadre de la tumorigenèse pulmonaire et intestinale, la tumeur ne pourra pas être mesurée au cours de l’expérimentation mais le volume tumoral sera mesuré après la mise à mort. Le nombre de cellules tumorales injectées est établi depuis plusieurs années afin de contrôler la pousse tumorale et de pouvoir comparer des résultats de diffèrent projets. L’injection se faisant intraveineuse, sous-cutanée ou intra tissulaire (face intestinale externe), l’animal qui n’aura aucune difficulté à bouger ou à s’alimenter. Modèle infectieux : Pour épargner toute douleur, les animaux seront suivis fréquemment et des points limites (perte de poids, poil ébouriffé́, prostration, diarrhée) sont établis pour raffiner les procédures. Nous utilisons le modèle bactérien depuis plusieurs années et nous connaissons son développement dans des souris contrôles et immunodéficientes (absence des cellules lymphoïde adaptatives et innées). D’après notre expérience et la littérature, les souris utilisées dans la procédure auront une infection proche de celle observée dans les souris controles. Cependant, En cas de souffrance observé, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Le développement lymphocytaire et les réactions immunitaires sont des processus complexes. De façon générale, l’immunité nécessite plusieurs types de lymphocytes participants chacun dans une ou plusieurs interaction(s) directe(s) ou indirecte(s) avec un ordre spatio-temporel. De ce fait, les systèmes de culture in vitro actuels ne permettent pas de modéliser cet environnement complexe. De plus, il n’existe, pour le moment, aucune lignée cellulaire murine ou humaine de cellules lymphoïdes étudiées (NK/ILC1, ILC2, ILC3). Par conséquent, l’étude de ces processus nécessite pour l’instant l’utilisation d’animaux vivants. Cependant, la compréhension du mécanisme de développement cellulaire faite in vivo, nous permettra probablement d’établir de nouveaux modèles in vitro utilisant des lignées cellulaires afin de réduire la contribution animale. Par conséquent, le modèle murin est essentiel dans notre domaine de recherche. Le nombre de souris est calculé en tenant compte d’une réduction maximale du nombre d’animaux tout en garantissant l’obtention de résultats statistiquement significatifs dans les différentes conditions expérimentales. Cette évaluation est déterminée grâce à nos données préliminaires et/ou antérieurs et à la bibliographie scientifique. Elle tient également compte de la faisabilité de nos expériences. En effet l’analyse post-mortem nécessite un temps de préparation conséquent, ce qui nous contraint à analyser de petits groupes d’animaux et d’augmenter la répétition des expériences pour une analyse statistique satisfaisante. Cependant, nos résultats précédents ont permis d’estimer les variabilités biologiques et expérimentales et ainsi minimiser la répétition expérimentale.
Infection de la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) par Flavobacterium psychrophilum : identification des facteurs de virulence et bases génétiques de la résistance de l’hôte.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Pour identifier les facteurs de virulence de la bactérie de la flavobactériose et les bases génétiques de la résistance de l'hôte, 13 680 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger pour les témoins et sévère pour les poissons infectés, chez qui l'infection peut conduire à la mort. 8 040 alevins de un à dix grammes reçoivent une injection de la bactérie sous anesthésie, 180 subissent des prises de sang espacées de trois jours pendant un mois, et le protocole retenu pour la dose létale 50 mobilise six doses et dix poissons par condition. Le porteur note qu'aucun élément concret d'appréciation de la souffrance ressentie pendant la maladie ne figure dans la littérature, et annonce chercher des paramètres précoces utilisables à la place de la mortalité, les poissons atteignant le point limite étant sortis du protocole et tués.
Objectifs
L’étude porte sur la bactérie responsable de la flavobactériose d’eau froide qui provoque chez les salmonidés une infection pouvant conduire à des mortalités considérables dans les piscicultures. Cet agent pathogène est l'une des causes les plus courantes de maladie bactérienne en production aquacole de truite arc-en-ciel en eau douce. Aucun vaccin commercialisé n'est actuellement disponible et le traitement repose uniquement sur l’antibiothérapie. Les facteurs intervenant dans la survenue des épisodes infectieux sont encore peu compris. Le projet vise à comprendre les mécanismes de pathogénicité de ces bactéries, les caractères de résistance/sensibilité de la truite arc-en-ciel et les interactions hôte-bactérie, et à contribuer au développement de stratégies de contrôle de la maladie. Pour cela, nous utiliserons des modèles d’infection développés précédemment chez la truite arc en ciel et permettant d’étudier la pathogenèse et l’efficacité de méthodes de contrôle. Ces modèles ont été standardisés et peuvent être de ce fait employés avec des effectifs minimisés. Le projet comprend une analyse conjointe de l’impact des paramètres génétiques de l’hôte et de la bactérie sur le développement de la maladie. Les infections expérimentales permettront de caractériser les gènes impliqués dans le pouvoir pathogène des bactéries (facteurs de virulence) grâce à l’obtention de critères d’appréciation quantitative de la pathogenèse (signes cliniques, cinétique de colonisation et de survie de l’hôte) pour des souches bactériennes génétiquement différentes. Nous rechercherons des paramètres précoces pouvant être utilisés en alternative à la mortalité pour l’analyse de la pathogenèse et des paramètres prédictifs du caractère de résistance de l’hôte. Enfin, les infections expérimentales permettront d’évaluer rigoureusement l’effet de différents paramètres sur la résistance des animaux à l’infection, qu’ils soient génétiques ou environnementaux (régime alimentaire, vaccination, immunostimulants, conditions physico-chimiques d’élevage).
Bénéfices attendus
Le programme de recherche apportera des connaissances fondamentales sur la pathogenèse, permettra de caractériser les déterminants génétiques de la virulence et de la résistance de l’hôte ainsi que leurs interactions. Les résultats obtenus doivent contribuer au développement de méthodes alternatives de contrôle de la maladie (vaccins vivants atténués, marqueurs génétiques de sélection de la résistance) avec à terme une réduction des épisodes infectieux de flavobactériose dans les élevages de truite arc-en-ciel, une réduction de l’usage des antibiotiques et une amélioration du bien-être animal.
Procédures
Les infections expérimentales réalisées par injection sont réalisées sous anesthésie et une seule injection par poisson en moins de 15 secondes sur 8040 poissons. Les prélèvements sanguins se déroule au moins d'une minute sur un même individu sont espacés d’au moins 3 jours sur une période n’excédant pas 1 mois. Ces prélèvements seront réalisés sur 180 poissons.
Impact sur les animaux
Les manipulations (tri, pesée, transfert, injection, imagerie) ainsi que la mise à jeun 24 ou 48 heures avant l’infection engendrent un stress chez les animaux. Aucun élément d’appréciation très concret de la souffrance éprouvée lors de l’évolution de la maladie n’est disponible dans la littérature. Cependant, le niveau de douleur sera considéré comme nul chez les contrôles non infectés en bonne santé, et sévère chez les animaux infectés chez qui l’infection peut conduire à la mort. L’infection peut également conduire certains individus à une perte d’appétit, un excès d’excrétion de fèces, une nécrose au point d’injection et une nage erratique.
Devenir
Tous les animaux de ce projet entreront dans un protocole d'infectiologie et ne pourront être réutilisés pour d'autres finalités, ils seront donc mis à mort en fin d'expérience.
Remplacement
Il n’existe pas de modèles cellulaires permettant d’étudier les facteurs de virulence de l’agent pathogène responsable de la flavobactériose. La quantification de la virulence, la caractérisation de la résistance de l’hôte, la compréhension des interactions hôte-bactérie et l’évaluation de l’efficacité de stratégie de contrôle nécessitent de reproduire la maladie chez l’animal. Ainsi, le projet que nous menons chez la truite arc-en-ciel ne peut être réalisé avec des méthodes alternatives. D’autre part, seul un animal ayant un système immunitaire adaptatif permet d’évaluer l’efficacité d’un vaccin lors d’une épreuve d’infection expérimentale en quantifiant la protection apportée.
Réduction
La dose létale 50 (DL50), c’est-à-dire la dose conduisant à 50% de mortalité, est un protocole de référence en expérimentation animale nécessitant 6 doses avec 10 poissons par condition. Les infections par balnéation ou par injection permettent de comparer la cinétique de survie entre plusieurs conditions (différents génotypes de truite, différentes souches, vaccination ou non, etc). Une même dose infectieuse est utilisée pour tous les groupes testés. La mise en évidence de différences significatives de survie entre les conditions nécessite un effectif total de 90 poissons par condition (60 pour le suivi de mortalité et 30 pour les prélèvements d’échantillons biologiques après euthanasie ou l’imagerie). Afin de limiter le nombre d’individus, les conditions sont testées par 4 ce qui permet de mutualiser le groupe contrôle correspondant à des animaux non infectés.
Raffinement
Tout au long de leur vie, les poissons sont élevés dans les meilleures conditions possibles. Ils sont nourris 2 fois par jour. Ils sont toujours en présence de congénères et les biomasses maximales sont rigoureusement respectées. La qualité de l’eau est optimale et surveillée en permanence. Les animaux sont observés au moins deux fois par jour. Les individus atteignant le point limite défini dans le projet sont sortis du protocole et euthanasiés. Une anesthésie par bain est réalisée avant de procéder à l’injection, avant prélèvement de sang ou imagerie. Plusieurs paramètres alternatifs à la mortalité seront évalués dans le cadre du projet : la bactériémie, la charge bactérienne dans les organes cibles et le suivi par imagerie in vivo.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel est le modèle classique de la pisciculture continentale européenne : c’est la principale espèce d'élevage en France et c'est l'hôte naturel de la bactérie étudiée dans ce projet. Il est nécessaire de travailler sur des poissons vivants afin de pouvoir quantifier la virulence de l’agent pathogène et la résistance de l’hôte afin de permettre in fine une compréhension de la pathogenèse et une évaluation efficace des stratégies de contrôle de la maladie. Les animaux sont utilisés au stade alevin, soit à des stades relativement précoces (1 à 10 g) où la susceptibilité à l’infection est maximale. C’est à ce stade que les animaux sont le plus sensible dans les élevages à cette pathologie. Néanmoins, dans quelques cas particuliers (évaluation de la durée de protection conférée par la vaccination, quantités d’échantillons biologiques prélevables non suffisantes au stade alevin pour réaliser les analyses), les infections pourront être réalisées sur des individus adultes.
Prélèvement de tissus pour la caractérisation d’animaux génétiquement altérés utilisés pour l’étude de la déficience en OTC
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
Tuées quand leur génotype ne présente pas d'intérêt, gardées vivantes dans le cas contraire : sur les 3 113 souris de ce projet d'élevage, 2 823 sont conservées pour être utilisées dans d'autres projets. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger et consistent, pour une partie des animaux, en un prélèvement de trente secondes à l'oreille pour lire leur génotype. Le projet sert à purifier le fond génétique d'une lignée modifiée pour ne plus produire un acide aminé, lignée dont les souris perdent du poids et voient leur fonction cardiaque se dégrader sous régime pauvre en protéines. Le porteur affirme qu'un modèle in vivo est "indispensable" pour cette physiologie intégrée et que la souris est la seule espèce permettant de choisir le lieu et le moment exacts de la mutation.
Objectifs
Depuis plusieurs années, l’intérêt s’est porté sur les propriétés régulatrices des acides aminés. En effet, différents travaux ont montré qu’un acide aminé particulier avait des effets sur plusieurs fonctions de l’organisme, comme sur la fonction musculaire, la fonction cardiaque, le système immunitaire, le métabolisme glucidique,... Cependant, dans toutes les études réalisées jusqu’alors sur cet acide aminé, celui-ci était apporté par voie exogène. Les effets de cet acide aminé endogène, c’est-à-dire produit par l’organisme, et plus particulièrement dans un organe précis, n’ont quant-à-eux jamais été étudiés. Pour palier cela, nous avons développé une lignée de souris qui n’exprimait pas le gène de l’enzyme responsable de la production de cet acide aminé, et qui ne produisait donc pas cet acide aminé au niveau de l’organe voulu. A l’aide de ce modèle, nous avons mis en évidence que l’absence de cet acide aminé au niveau plasmatique (via l’absence de production), lors d’un régime standard, n’avait pas d’effet sur les animaux. En revanche, sous régime faible en protéines, l’absence de cet acide aminé au niveau plasmatique entrainait une importante perte de poids chez les animaux (masse maigre et masse grasse) ainsi qu’une forte altération de leur fonction cardiaque. Cependant, le rôle majeur de cet acide aminé en cas de régime hypoprotéique, et non sous régime standard, sur le métabolisme protéino-énergétique et sur le système cardiovasculaire n’est pas encore totalement compris. Lorsqu’on possède une lignée de souris transgéniques, il est nécessaire, pour éviter une dérive génétique, de purifier le fond génétique de ces souris en les croisant avec des souris sauvages ayant un fond génétique « pur ». Le but de ce projet-ci est donc de purifier puis de conserver notre lignée de souris génétiquement modifiées. Pour cela, nous devons effectuer un génotypage invasif afin de définir les animaux qui comportent la modification génétique et ceux qui ne la possèdent pas.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de purifier le fond génétique de notre lignée de souris transgénique, puis de conserver nos 2 lignées de souris de façon à poursuivre les investigations pour une meilleure compréhension du rôle de notre acide aminé d’intérêt dans les différentes fonctions de l’organisme.
Procédures
Une partie des animaux sera prélevée au niveau de l’oreille pour génotypage (durée : 30 secondes).
Impact sur les animaux
Les nuisances sur les animaux sont les suivantes : stress lié au prélèvement d’un morceau de l’oreille pour le génotypage.
Devenir
Certains animaux sans génotype d’intérêt sont mis à mort et les autres sont conservés pour une utilisation continue dans les projets (2823 souris).
Remplacement
Le modèle animal que nous souhaitons conserver est utilisé dans des projets qui étudient les conséquences d’une diminution de la concentration d’un acide aminé au niveau plasmatique (via la suppression de l’enzyme permettant sa production) sur différentes fonctions de l’organisme, et notamment le métabolisme protéino-énergétique. Le recours à des modèles alternatifs comme des cellules en culture n’est, dans l’état actuel des connaissances, pas possible parce que nous nous situons dans le domaine de la physiologie intégrée. L’objectif des projets qui utilisent ce modèle de souris transgéniques est de mieux comprendre comment cet acide aminé module différentes fonctions de l’organisme au niveau corps entier. Dans ce but, un modèle in vivo est indispensable. Le choix de la souris se justifie car c’est la seule espèce qui permet de créer des animaux transgéniques pour lesquels nous pouvons choisir le lieu exact de la mutation génétique, ainsi que le moment précis où nous voulons que celle-ci apparaisse.
Réduction
Comme un des gènes que nous ajoutons au génome des souris transgéniques doit absolument rester à l’état hétérozygote, nous devons obligatoirement conserver les 2 lignées distinctes. Cependant, tous les calculs ont été effectués de façon à ajuster au maximum les accouplements et les animaux à conserver pour la purification du fond génétique de la lignée dans laquelle notre gène d’intérêt est marqué et la conservation de ces 2 lignées.
Raffinement
Les animaux seront en collectivité, en cages ouvertes, permettant aux individus de sentir la présence de leurs congénères, avec un milieu enrichi par l'ajout d'objets dans les cages (tunnels, abris en carton...). De plus, nous utiliserons des points limites gradés précis et adaptés permettant de suivre objectivement l’état général des animaux, et d’agir rapidement en cas de problème. Enfin, les expérimentateurs/soigneurs ont été formés aux différentes techniques utilisées dans ce protocole, et ont développé les compétences permettant de respecter le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Le recours à l’utilisation de lignées cellulaires n’est, dans l’état actuel des connaissances, pas réalisable parce que nous évoluons dans le domaine de la physiologie intégrée et nous nous inscrivons dans une approche fonctionnelle du métabolisme. L’objectif des projets utilisant ces lignées de souris est de mieux comprendre le rôle d’un acide aminé endogène dans la régulation de l’équilibre protéino-énergétique au niveau corps entier. Dans ce but, un modèle in vivo est indispensable. Le choix de la souris se justifie car c’est la seule espèce qui permet de créer des animaux transgéniques pour lesquels nous pouvons choisir le lieu exact de la mutation génétique, ainsi que le moment précis où nous voulons que celle-ci apparaisse. Les animaux seront mis en accouplement à l’âge de leur maturité sexuelle, soit 8 semaines.
Photobiomodulation (PBM) : Évaluation à moyen terme de la sécurité et de l’efficacité d’un nouveau dispositif médical en vue de traiter par PBM l’ischémie/ reperfusion cardiaque aigüe sur un modèle porcin.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Le thorax ouvert ou une sonde poussée dans les artères du cœur, une coronaire bouchée pendant une heure pour provoquer un infarctus, sept heures d'anesthésie générale au total : 100 porcs adultes de 55 à 70 kilos subissent ces procédures, déclarées d'un niveau de souffrance modéré à sévère. Chacun est ensuite suivi trois mois, avec réveil, douze à dix-huit heures en cage de contention, alimentation par perfusion, IRM et prises de sang répétées. Le porteur indique que l'instabilité cardiaque du modèle conduit à des massages cardiaques et des défibrillations, et que dans 30 % des cas la réanimation échoue, la mort étant prononcée après cinquante minutes. Tous les porcs sont tués pour prélever leur cœur, et le porteur écrit qu'aucune approche statistique n'a été réalisée pour fixer l'effectif de 100 animaux.
Objectifs
L'infarctus du myocarde (IDM) se définit comme la nécrose d'une partie du muscle cardiaque, suite à un manque d’oxygène. Cette situation provoquée par une sténose (rétrécissement) partielle ou totale des artères du cœur est traitée par ouverture de la sténose. La réouverture appelée « reperfusion » est nécessaire mais entraine une instabilité du myocarde, qui engendre d’autres problèmes et provoque des phénomènes de mort tissulaire jusqu’à plusieurs jours après la reperfusion. Des approches thérapeutiques ont été développées sans succès. La prise en charge de l'infarctus reste donc un problème de santé publique. La thérapie par Photobiomodulation (PBM) se définit comme une irradiation lumineuse athermique et non ionisante aux longueurs d’ondes visible et proche infrarouge. Les photons émis agissent sur la mitochondrie et améliorent les échanges gazeux intracellulaires en optimisant la consommation d’oxygène en phase d’hypoxie. Ils modulent ainsi la réponse cellulaire et tissulaire afin d’améliorer la cicatrisation des tissus et réduire l’inflammation. Nous développons un dispositif médical innovant utilisant les principes de la PBM. Nos travaux préliminaires en phase aiguë ont montré des résultats pertinents en termes d’efficacité de notre protocole thérapeutique. L’objectif de cette étude est d’évaluer la sécurité et l’efficacité à moyen terme (3 mois de suivi) de notre dispositif médical pour le traitement par PBM des lésions de reperfusion induites dans un modèle pathologique porcin d’IDM. Pour cette étude, 100 porcs seront nécessaires pour fournir les informations suffisantes pour envisager une étude clinique humaine. Deux modèles pathologiques seront étudiés : - Ischémie/Reperfusion (I/R) cardiaque à thorax ouvert, 50 porcs : modèle chirurgical utilisé dans notre étude préliminaire en phase aigüe - I/R cardiaque à thorax fermé, 50 porcs : modèle mini-invasif (sans intervention chirurgicale et donc moins traumatique) que nous maitrisons et qui répond à une stratégie plus adaptée pour la phase chronique : L’étude comporte plusieurs phases préparatoires du modèle ischémique, pour un suivi du traitement de la pathologie sur 3 mois. Pour la période de réveil et de soins intensifs, notre expérience antérieure nous permet d’assurer le suivi des animaux dans des conditions appropriées au confort des animaux, dans le respect de l’éthique et du bien-être animal.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra : - de valider les effets de la PBM sur l’amélioration et la restauration du muscle cardiaque ischémié en regard de porcs non traités. L’adjonction du lot témoin renforce l’étude préclinique qui présente un modèle pathologique en regard du lot traité. Nous apporterons un regard tout particulier aux animaux pour limiter les souffrances physiques. - de déterminer le taux de survie des animaux de chaque lot. - de vérifier que le dispositif médical n’a pas provoqué d’effets secondaires (bénéfice/risque). Ces résultats seront décisionnels pour passer à une étude clinique chez l’homme, objectif fondamental en regard des critères définis par l’article L1123-7 du code de santé Publique (CSP) et en conformité des comités de Protection des Personnes (CPP)
Procédures
L’étude comprend : - une procédure invasive (50 porcs) et mini-invasive (50 porcs) pour la phase d’ischémie /reperfusion cardiaque avec ou sans traitement PBM. Ces procédures sont réalisées 1 seule fois (à J0) sous anesthésie générale (AG). Les animaux seront prémédiqués (environ 15 minutes), intubés (environ 5 minutes) et anesthésiés durant toute l’intervention (IRM basale 1h, abords vasculaires 30 minutes, chirurgie 1h, ischémie 1h, traitement PBM et suivi post-reperfusion 1h30, fermeture des sous-plans musculaires 30 minutes, IRM post-reperfusion 1h30, soit au total 7 h sous AG). - Une procédure d’acquisition d’images par IRM pour l’analyse de la fonctionnalité cardiaque. Elle sera réalisée sous AG à J0 et à 3 mois de suivi longitudinal (environ 1h30 à 2h sous AG par session) . - Les prélèvements sanguins seront réalisés 3 fois sous AG à J0, puis 1 fois en vigile (via le cathéter veineux central mis en place à J0) à J1, J2, J3, J21 et à 3 mois de suivi (3 minutes par prélèvement sanguin) - Les prélèvements tissus et organe seront prélevées sous AG au moment du sacrifice (durée des prélèvements tissulaires de 45 minutes à 1h environ).
Impact sur les animaux
Des douleurs physiques aigues sont possibles au cours des 48h post-opératoires. Dans tous les cas les antalgiques sont maintenus durant les 4 jours post intervention. Les douleurs seront prises en compte et notifiées dans une fiche d’évaluation de la douleur avec un score qui fera l’objet de discussions et d’une prise de décision par les porteurs du projet pour apporter une solution éthique appropriée. Bloc opératoire : les animaux sont sous anesthésie générale (AG). Tout événement inhérent au modèle pathologique d’infarctus du myocarde, caractérisée par une instabilité hémodynamique, arythmies, fibrillations auriculo-ventriculaires, nous amène à pratiquer des réanimations : massages cardiaques, défibrillations, médications appropriées. Les décès seront prononcés après 50 minutes de réanimation non efficace (30% des cas selon notre expérience). Aucun réveil ne sera effectué si l’animal n’est pas en capacité de survivre (fonctions biologiques instables, organes défaillants…). La phase de réveil est une étape clé pour la survie et le suivi des animaux dans cette étude longitudinale. Le réveil de l’animal n’est décidé qu’au moment où sa respiration et ses fonctions hémodynamiques sont totalement restaurées (débit et fréquence cardiaque, pression artérielle…). Dès que l’animal cherche à se lever, il est mis en cage de contention pour une durée d’environ 12 à 18 heures. La cage de contention est suffisamment grande pour que l’animal puisse être libre de ses mouvements. Une surveillance continue est assurée pour prévenir et intervenir sur les conséquences ischémiques. Durant cette période, l’animal est nourri par voie parentérale. Avant le réveil, l’innervation intercostale est protégée par une injection de Naropeine. Les antalgiques sont maintenus durant les 4 jours post intervention. Avant le départ vers l’animalerie, des prélèvements sanguins et traitements (antalgiques, antiinflammatoires, antibiotiques…) sont pratiqués. A la phase du suivi sur 3 mois : période 1 des 3 premières semaines de suivi en loge individuelle et période 2 de suivi jusqu’à 3 mois en loge collective. Pour la période 1 seront pris en compte i) suivi de l’état général de l’animal, soins post opératoires ii) médications pour réduire la souffrance et éviter l’infection et les conséquences ischémiques. Pour la période 2, les animaux retournent en loge collective. Après 3 mois de suivi longitudinal, retour au site d’expérimentation pour IRM sous AG. L’animal sera ensuite euthanasié
Devenir
Tous les animaux seront placés sous AG pour être euthanasiés afin de prélever le cœur qui sera observé macroscopiquement lors de l’explantation. Si un animal doit être euthanasié durant la période de suivi longitudinale il sera au préalable anesthésié avant l’euthanasie. Des échantillons seront ultérieurement étudiés par analyse histologique et biologique afin de nous permettre d’observer d’éventuelles lésions tissulaires, de quantifier la zone à risque et d’évaluer ainsi la sécurité de notre dispositif médical implanté in vivo.
Remplacement
Cette étude sur l’efficacité d’un traitement par PBM des lésions de reperfusions induites par un infarctus du myocarde est un long cheminement qui a débuté, avant de passer à l’utilisation de modèles animaux, par une validation in vitro sur des cellules cardiaques en cultures et in utéro sur des embryons de poulet. Il s’est poursuivi par des études in vitro de respiration mitochondriale (dans un oxygraphe à haute résolution de type Oroboros) de cardiomyocytes porcs et humains soumis à la PBM. Cet ensemble de résultats justifient nos études animales pour passer de l’animal à l’homme mais sans nul doute de passer aussi de l’homme à l’animal. En effet la pratique vétérinaire qui s’enrichit des techniques qui sont pratiqué chez l’homme en particulier pour les animaux de compagnie peut avoir un réel intérêt. D’autant plus que la pratique vétérinaire s’est beaucoup enrichi ces dernières années de la luminothérapie dans la pratique clinique.
Réduction
Pour cette étude notre cheminement a tenu compte et cherché à maitriser une technologie innovante et prometteuse, en utilisant des animaux qu’à des étapes clés de l’évolution de notre projet de recherche. Les animaux ont été utilisés pour nous permettre de disposer d'éléments suffisants pour montrer la sécurité, l’efficacité du traitement PBM et la performance de notre DM, étapes indispensables pour déposer un dossier pertinent pour remédier à un vrai problème de santé publique. A cette étape, aucune approche statistique n’a été réalisée. L’expérimentation a été menée en collaboration avec des partenaires académiques pour partager certains de nos travaux et expériences dans une structure expérimentale commune. Nous partageons ainsi notre expérience pour la mise au point du modèle pathologique avec une autre équipe afin de réduire le nombre d’animaux ; certains prélèvements pourront éventuellement servir pour les besoins d’autres études non liées à ce protocole et ainsi éviter d’utiliser des animaux supplémentaires. Nous portons un intérêt à publier nos résultats pour apporter les preuves de concept et enrichir la communauté scientifique pour utiliser nos travaux.
Raffinement
Pour réduire le mal être et la souffrance de l’animal lors de nos interventions : - L’entrée des porcs dans la structure expérimentale est programmée de façon à fournir aux animaux un environnement optimum (mise en loge d’expérimentation au minimum 7 jours avant l’intervention, avec un enrichissement du milieu). - Les porcs sont hébergés dans les conditions adaptées à leur espèce, logés sur copeaux, en groupes sociaux, avec jeux à leur disposition. Un suivi quotidien leur est apporté. Un vétérinaire assure le suivi sanitaire - Pour le transport vers le site d’expérimentation, l’animal déjà isolé dans un box de l’animalerie, à proximité de ses congénères la veille de son départ (pour la mise à jeun inférieure à 12 heures), est tranquillisé par un sédatif - Les animaux sont placés sous anesthésie générale pendant toute la procédure chirurgicale et d’imagerie ; pendant ces procédures, la douleur induite par l’ischémie est assurée par des perfusions continues et lentes d’antalgique. - Durant la procédure sous anesthésie générale, la température corporelle des animaux sera maintenue grâce à une couverture chauffante ou des bouillottes d’eau chaude (dont l’eau chaude sera régulièrement renouvelée). - Lors de la période de réveil, un protocole utilisé et validé chez l’homme et parfaitement maitrisé par notre équipe de chirurgiens cardiaques permet d’éviter la souffrance post chirurgicale. - Lors de la période post-opératoire, toute situation pouvant être invalidante et douloureuse sera prise en compte et notifiée dans une fiche d’évaluation de la douleur avec un scoring qui pourra faire l’objet de discussions et d’une prise de décision par les porteurs du projet pour apporter une solution éthique et appropriée. Le personnel animalier de l’EU sera formé au suivi comportemental de l’animal et au remplissage de cette fiche d’évaluation. - Pour la mise à mort, l’animal est toujours placé sous anesthésie générale avant induction d’une surcharge de barbiturique.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie pour notre étude est le porc adulte de taille réduite âgés de >24 mois, 55-70kg). Ce stade physiologique et cette taille "adulte" est nécessaire pour tester notre dispositif médical et être au plus près des conditions humaines. L'anatomie vasculaire est à ce stade plus proche de l’homme, ce qui en fait un modèle parfaitement adapté pour nos essais précliniques. Cette lignée nous permet de faire notre étude sur des porcs adultes représentatifs de l’âge où surviennent les accidents vasculaires cardiaques. Selon notre expérience, le porc charcutier (de type Large White) est moins intéressant, car pris à un âge très jeune (de 3 à 4 mois et pesant de ce fait 40/60 kg) pour avoir un poids manipulable, il présente une anatomie vasculaire plus éloignée et moins prédictive de ce qui se passe chez l’homme adulte. Nous utiliserons des porcs adultes de taille réduite, d’âge supérieur à 2 ans, de sexe mâle (castré) ou femelle, ayant un poids compris entre 55 et 70 kg. L’éleveur est le fournisseur exclusif de cette souche de porcs. Nous avons des données expérimentales importantes sur la lignée elle-même et sur ce type d’expérimentation nous permettant de limiter le nombre d’animaux à utiliser dans de nouveaux protocoles. Les résultats obtenus sur les animaux de cet âge sont convaincants et suffisants dans nos études. Ce modèle animal nous permet : - De travailler sur des animaux représentatifs de l’âge où surviennent les pathologies chez l’homme. - D’utiliser un dispositif médical qui sera l’exacte copie du DM utilisé en clinique humaine - De transposer les connaissances acquises vers une utilisation en clinique humaine.
Effets combinés de contaminants biologique et chimique sur l’anguille européenne
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Pêchées à l'entrée des estuaires puis élevées quinze à dix-huit mois en aquarium, avec un taux de survie estimé à 30 %, 3 000 civelles sont collectées pour que 720 anguilles européennes entrent dans les procédures, déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Chacune est exposée à l'une de quatre doses de bisphénol S et reçoit, sous anesthésie, une intubation gastrique qui l'infeste d'un ver parasite se nourrissant de son sang. Elles sont tuées par groupes vingt, quarante et soixante jours après le début de l'exposition, les surnuméraires étant relâchées dans leur milieu d'origine. L'anguille européenne est classée en danger critique d'extinction depuis 2008, et le porteur en tire argument pour écrire qu'il n'est pas possible de recourir à des méthodes de remplacement de cette espèce.
Objectifs
Dans leurs environnements naturels, les animaux aquatiques sont exposés à une variété de contaminants biologiques et chimiques. Parmi les contaminants biologiques, les parasites affectent par définition la physiologie de leurs hôtes, les obligeant à réallouer leur énergie pour mieux résister. Parmi les contaminants chimiques, les agents plastifiants, tels que les dérivés du bisphénol, sont des polluants émergents potentiels, présents dans les débris plastiques et les eaux usées industrielles, qui contaminent l'environnement aquatique et induisent de multiples problèmes de santé qui nuisent à la survie des animaux exposés. Bien que de nombreuses études aient rapporté les effets de l'un ou l'autre, les mécanismes immédiats qui sous-tendent les effets néfastes induits par les parasites et les polluants organiques, agissant en combinaison, sur les organismes aquatiques n'ont pas encore été tous examinés. Dans ce projet, nous nous concentrerons sur 1) un ver parasite connu pour être pathogène de l’anguille européenne, espèce sentinelle des milieux aquatiques, menacée d’extinction (depuis 2008, UICN) mais non protégée et, 2) un agent plastifiant, le bisphénol S (BPS), polluant émergent particulièrement préoccupant à l’heure actuelle car de plus en plus utilisé dans l'industrie comme alternative au bisphénol A interdit en France dans tous les contenants alimentaires depuis 2015. L'objectif premier du projet est d'étudier les effets du BPS et/ou du ver parasite sur la physiologie de l’anguille européenne afin de répondre aux questions suivantes : 1. L'exposition à des doses croissantes de BPS rend t’elle l'anguille européenne plus vulnérable au parasite supposé impliqué dans son déclin ? 2. L'infestation par le parasite diminue t’elle la capacité de l'anguille à faire face à l'effet du BPS ? Enfin, au delà de l’apport de connaissance scientifique relatif à l’étude de l’impact combiné de ces deux contaminants, notre deuxième objectif est d’étudier le potentiel du mucus cutané de l’anguille (le mucus est la 1ère barrière des organismes aquatiques face à l'environnement extérieur) pour appréhender de manière non létale l'état de santé/stress de ce poisson.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de répondre aux exigences et recommandations prévues dans les plans de gestion de l’anguille européenne à savoir : 1) améliorer les connaissances sur les mécanismes induits par une double contamination chimique et biologique des anguilles et identifier la réponse de ce poisson vis-à-vis des 2 contaminants ciblés (BPS et le ver parasite individuellement ou en combinaison), 2) développer des biomarqueurs à partir du mucus cutané de l'anguille afin d'évaluer son état de santé/stress à l'aide de méthodes qui ne nécessitent pas de tuer les animaux et, 3) évaluer la potentielle menace, actuelle ou future, induite par le BPS sur l’anguille afin de proposer des recommandations pour sa conservation (niveau seuil de BPS dans l’environnement).
Procédures
Exposition à 4 doses différentes de Bisphénol S et à une infestation unique par un ver parasite (intubation gastrique), cette dernière étant effectuée sous anesthésie. Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures expérimentales à 3 pas de temps après le début des procédures soit 20, 40 et 60 jours après le début de l’exposition et/ou infestation.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables auxquels on peut s’attendre seront à priori assez réduits dans la mesure où les doses de contaminants chimique (BPS) et biologique (parasite) utilisées dans les procédures sont des doses relativement faibles et environnementales et que la durée de la procédure est assez courte (60 jours). Cependant, on peut toutefois s’attendre à une légère anémie des poissons infestés par le ver parasite qui se nourrit du sang de l’anguille ainsi qu'à de potentielles modification de comportement, réduction de vivacité ou diminution de l'embonpoint à la plus forte dose du contaminant chimique.
Devenir
Les animaux soumis aux procédures expérimentales seront successivement euthanasiés 20, 40 et 60 jours après le début de l’exposition et/ou contamination.
Remplacement
Ce projet visant à évaluer l’impact de 2 contaminants (chimique émergeant, le BPS, et biologique pathogène, le ver parasite Anguillicola crassus) sur la physiologie de l’anguille européenne (espèce classée en danger critique d’extinction depuis 2008 par l’UICN), il n’est pas possible d’utiliser des méthodes de remplacement de cette espèce.
Réduction
Le taux de survie des juvéniles d'anguille, après collecte et au début de leur mise en élevage en aquarium, estimé à 30%, ainsi que les potentiels échecs des infestations expérimentales par le parasite et/ou des contaminations chimiques nous contraignent à collecter et élever 3000 juvéniles d'anguille pour la bonne réalisation de l’ensemble du projet (720 juvéniles d'anguille feront l'objet des procédures expérimentales). En effet, la nécessité du maintien des civelles en élevage pendant 15 à 18 mois avant la mise en œuvre des procédures expérimentales sont des contraintes fortes qui imposent cette démarche. A la fin du projet, les anguillettes surnuméraires n’ayant pas fait l’objet des procédures expérimentales seront relâchées dans leur milieu d’origine.
Raffinement
Dans le cadre de notre projet, plusieurs mesures seront prises pour limiter inconfort, stress et souffrance des individus depuis leur collecte jusqu’à la fin des procédures expérimentales. La manipulation des juvéniles d’anguille sera effectuée à l’aide d’une épuisette à maille fine afin de ne pas les blesser, en pratiquant des gestes lents et délicats afin de ne pas les stresser tout en permettant une collecte rapide et non traumatisante. Par ailleurs, les juvéniles d’anguille étant grégaires et fuyant la lumière, des tuyaux en PVC alimentaire seront placés dans les aquariums pour que ces jeunes stades puissent s’y regrouper et s’y cacher. De même, un éclairage indirect sera privilégié pendant les temps d’éclairement afin de réduire au maximum tout stress induit par une intensité lumineuse trop forte sur les aquariums et de simuler au sein de ceux-ci des zones moins éclairées, refuges naturels pour ces animaux qui se cachent durant la journée. L’alimentation des juvéniles d’anguille sera également adaptée afin de les habituer progressivement à passer à une nourriture artificielle inerte. De plus, toutes les mesures (poids et taille) ainsi que les infestations expérimentales par le ver parasite s’effectueront sous anesthésie, optimisée pour ces jeunes stades de vie.
Choix des espèces
L'anguille européenne joue un rôle écologique majeur et revêt une valeur économique importante. Suite à la diminution drastique de sa population, elle est classée comme espèce en danger critique d’extinction par l’IUCN (2008) mais non protégée. Parmi les facteurs potentiellement responsables de l'effondrement de sa population figurent les contaminants chimiques (dont le BPS) et biologiques (parasite Anguillicola crassus, pathogène de l’anguille). Dans ce contexte de fort déclin et volonté de contribuer à sa préservation (R(CE) 1100/2007), il convient en 1er lieu de combler le manque de connaissances lié à l’impact de ces contaminants agissant en combinaison (conséquences physiologiques du stress induit). Il devient également urgent de tenter de développer un outil non létal de l'état de santé/stress de ce poisson pour en assurer le suivi en conditions naturelles (développement de protocoles non létaux inscrit dans le Plan de Gestion pour les Poissons Migrateurs 2022-2027, volet anguille). Les individus qui feront l’objet des procédures expérimentales sont des juvéniles d’anguille qui auront été maintenus en élevage pendant 15 à 18 mois après leur collecte dans le milieu naturel. En effet, nous devons collecter des individus d’une même cohorte (même âge) à leur entrée dans les eaux de transition (estuaires, lagunes…) afin qu’elles soient exemptes du parasite, dont nous voulons étudier l’impact, avant le début de l’expérience (dans les conditions naturelles, elles s’infestent dans les eaux de transition). En outre, la période d'élevage de 15 à 18 mois avant le début de l’expérimentation est nécessaire pour permettre aux anguillettes d'atteindre une taille suffisante pour être infestées expérimentalement par le parasite (intubation gastrique).
Évaluation de l’effet thérapeutique du transfert adoptif de lymphocytes T humains optimisés dans le traitement de tumeurs solides humaines dans un modèle de souris immunodéficientes
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
400 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré, chacune recevant une greffe de cellules cancéreuses humaines dans le flanc puis, pendant trois semaines, une injection intraveineuse hebdomadaire de lymphocytes T modifiés. Une tumeur pousse dans leur flanc. Toutes sont tuées par dislocation cervicale après anesthésie, dès qu'un signe clinique sévère ou trois signes notables apparaissent, pour des analyses effectuées sur des prélèvements post mortem. Le porteur cherche des preuves de concept susceptibles de justifier ces immunothérapies chez l'humain, alors que les essais cliniques déjà menés avec ces cellules ont montré une efficacité anticancéreuse qu'il qualifie lui-même de trop limitée.
Objectifs
L’immunothérapie, devenue une thérapie de référence pour certains cancers, consiste à améliorer les mécanismes de défenses spécifiques du patient pour éliminer le cancer. Parmi les différentes stratégies, l'immunothérapie par transfert adoptif de cellules immunitaires repose sur l’administration à un patient de ses propres cellules immunitaires reconnaissant et éliminant spécifiquement les cellules cancéreuses, appelées « lymphocytes T cytotoxiques ». Des essais cliniques d’injections de ces cellules immunitaires ont déjà été réalisés chez l’humain et, s’ils ont montré une bonne tolérance, leur efficacité anti-cancéreuse est encore trop limitée. Ce programme de recherche préclinique vise à évaluer la faisabilité et l’efficacité thérapeutique, dans le traitement du cancer de la peau et du cancer colo-rectal, d’immunothérapie par transfert adoptif de lymphocytes T cytotoxiques optimisés. Afin que cette étude soit la plus représentative possible de la pathologie humaine, des souris immunodéficientes (n’ayant plus de système immunitaire) recevront dans un premier temps une greffe de cellules cancéreuses humaines puis dans un second temps des injections de ces lymphocytes T humains optimisés. Cette optimisation passe par des modifications génétiques qui ont pour but de potentialiser les fonctions anti-cancéreuses de ces lymphocytes T.
Bénéfices attendus
L’objectif principal de ce programme est d’obtenir, à l’aide de ces modèles "in vivo", des preuves de concept précliniques pouvant justifier la mise en place d’immunothérapies par transfert adoptif de lymphocytes T cytotoxiques optimisés, dans le traitement de cancers. En fonction des données de faisabilité et d’efficacité obtenues, ces travaux pourront aussi permettre de prioriser le ciblage de certaines molécules exprimées par ces lymphocytes T.
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection en sous-cutanée de tampon salin (avec ou sans cellules cancéreuses) dans le flanc au premier jour de l’étude dans chaque procédure. La procédure d’injection des cellules cancéreuses dans le flanc sera réalisée sous anesthésie. Dans les procédures 2, 3 et 4, les animaux seront également soumis à des injections hebdomadaires (à partir du 7ème jour de l’étude) en intraveineuse d’un tampon salin (avec ou sans cellules immunitaires optimisées) pendant 3 semaines. Ces injections en elles-mêmes sont de l’ordre de la minute.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis aux nuisances ou effets indésirables suivants : - une douleur intrinsèque à l’injection (piqûre) dans le flanc ou en intraveineuse, de cellules dans un volume donné de tampon salin. - un refroidissement des souris lors de l’anesthésie. - le développement d’une grosseur tumorale dans le flanc.
Devenir
Tous les animaux inclus dans le protocole seront mis à mort, car des études ex-vivo seront effectuées à partir de prélèvements post-mortem effectués sur les animaux.
Remplacement
Remplacement : Les paramètres observés dans cette étude ne peuvent pas à ce jour être remplacés par des procédures "in vitro". L'évaluation chez l'humain du bénéfice thérapeutique de l’administration de cellules immunitaires, dans le cadre de traitements anti-cancéreux, nécessite le développement d'études précliniques permettant de vérifier la faisabilité de ces thérapies et de détecter la survenue de premiers effets secondaires délétères. Concernant ces immunothérapies anti-cancéreuses, il est établi que les cellules cancéreuses se comportent différemment "in vitro" et "in vivo", en terme de croissance, de résistance à la mort cellulaire et de capacité à instaurer un environnement délétère pour le système immunitaire. Notre étude permet d'évaluer l'efficacité du traitement proposé en conditions physiologiques (notamment en termes de migration des cellules immunitaires injectées au niveau des cellules cancéreuses), et de définir les modalités optimales d’administration de ces cellules immunitaires. Compte-tenu de la difficulté de mise en place d’essais cliniques et de recrutement de patients éligibles, il paraît clair que les informations obtenues suite à ces travaux précliniques, couplées aux données obtenues "in vitro", auront une importance capitale lors du transfert en clinique.
Réduction
Réduction : Le nombre d'animaux a été réduit à des lots de 5 souris (procédure 1) et de 10 souris (procédures 2, 3 et 4). D'un point de vue éthique, le nombre d'animaux utilisé ici est réduit au minimum tout en permettant d’obtenir des différences statistiquement significatives. En effet, plusieurs études publiées dans notre domaine de recherche, et nos propres études antérieures avec des modèles animaux similaires décrivent l'utilisation de 5 animaux par lot pour le développement de greffes de cellules cancéreuses humaines, et 10 animaux par lot pour l’évaluation du bénéfice thérapeutique de l’administration de différents types de lymphocytes T.
Raffinement
Raffinement : Pour leur confort, les animaux seront hébergés dans des cages adaptées (groupe de 5 souris par cage maximum), avec un enrichissement par frisottis et/ou dôme et un accès libre à l’eau et à la nourriture. De façon à diminuer le stress, les différentes procédures seront réalisées sous anesthésie. Le bien-être des souris sera surveillé tout au long de l'étude avec une évaluation des signaux généraux (visite 3 fois par semaine en présence d’un signe clinique notable et visite quotidienne en présence de deux signes cliniques notables. De plus, en présence de trois signes notables ou un signe sévère : les animaux seront mis à mort après une anesthésie, par dislocation cervicale. Les signes cliniques sont basés sur le comportement/mouvement, l’aspect physique extérieur, la manipulation, la consommation de nourriture, l’excrétion, l’évolution du poids, l’évolution de la tumeur, l’aspect de la tumeur).
Choix des espèces
Les souris sont des modèles d'étude pertinents, notamment en immunothérapie pour le traitement des cancers, de par leur facilité d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. L'utilisation préalable de ces animaux par des équipes scientifiques internationales permet à d’autres travaux de recherche de débuter avec une base solide (connaissances théoriques, modèles, équipement, ...). Le développement de greffes de tumeurs humaines chez la souris nécessite l’utilisation de sujets immunodéficients pour éviter le rejet de greffe, tels que les souris NSG. Ces souris permettent la croissance de nombreuses lignées tumorales humaines et l'utilisation thérapeutique de cellules immunitaires d'origine humaine. Les souris seront utilisées à partir de 9 semaines (période où le poids se stabilise), pour des raisons de maturité du développement squelettique, facilitant non seulement le geste lié aux greffes de cellules cancéreuses et de lymphocytes T, mais renforçant aussi la pertinence des effets thérapeutiques.
Etude de l’effet de la phéromone apaisante du lapin (Rabbit Appeasing Pheromone, RAP) sur le développement du microbiote intestinal du lapereau et implications fonctionnelles sur la physiologie des systèmes digestifs et immunitaires
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Réduire les troubles digestifs du sevrage et l'usage d'antibiotiques dans les élevages de lapins : c'est à cette fin qu'une phéromone de synthèse est testée sur 6 lapines et 48 lapereaux, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Chaque lapereau est immobilisé et piqué à la veine d'une patte arrière à l'état éveillé, jusqu'à six fois à raison d'une par semaine, et trente-deux d'entre eux vivent seuls en cage grillagée pendant trente-cinq jours, vingt-trois heures par jour en semaine et vingt-quatre le week-end. Le porteur reconnaît que cet hébergement individuel peut provoquer des comportements anormaux et une baisse d'activité, et que la collecte hebdomadaire de leurs fèces molles les prive d'un aliment qu'ils consomment normalement. Les 48 lapereaux sont tués au trente-cinquième ou au soixante-dixième jour pour prélever leur intestin, les 6 mères étant gardées vivantes, jeunes et en bonne santé, pour de futures procédures.
Objectifs
Le bien-être des lapins domestiques est une préoccupation croissante en Europe. Qu'ils soient des animaux de compagnie ou d'élevage, ils sont souvent soumis à des situations stressantes comme la manipulation, les changements d'environnement, les rencontres avec d'autres lapins, les déplacements ou les visites chez le vétérinaire. Il est crucial d'améliorer l'élevage des lapins pour les rendre plus résistants et mieux adaptés à leur environnement. Aujourd'hui, l'élevage vise à assurer leur bien-être, à optimiser leur alimentation, à renforcer leur système immunitaire et à réduire l'usage des antibiotiques. Le microbiote (l’ensemble des virus, bactéries, champignons) intestinal des lapins joue un rôle vital dans ces objectifs. Il influence la digestion, le métabolisme, la santé intestinale, l'immunité et même le fonctionnement cérébral. Les premières semaines de vie sont essentielles pour le développement du microbiote car c'est à ce moment-là que l'intestin des lapins est colonisé par des micro-organismes. Ce projet de recherche examine si l'utilisation de phéromones apaisantes maternelles durant les premières semaines de vie des lapereaux, notamment lors de moments tels que la séparation de la mère, le sevrage et le mélange d'animaux, peut réduire le stress et influencer la composition du microbiote intestinal. Des études antérieures suggèrent que les phéromones pourraient influencer le microbiote. Cette recherche vise à approfondir ces connaissances en examinant l'effet des phéromones sur différentes espèces d'élevage, y compris les lapins, qui sont particulièrement sujets à des problèmes intestinaux. Réduire l'usage d'antibiotiques dans l'élevage des lapins nécessite de nouvelles approches pour maintenir leur santé, en particulier pour prévenir les troubles digestifs après le sevrage, liés à des déséquilibres dans le microbiote intestinal et/ou à une immaturité de l'intestin et/ou du système immunitaire. Cette étude vise à déterminer si l'exposition des lapereaux aux phéromones pendant leurs premières semaines de vie peut favoriser le développement d'un microbiote intestinal sain, ainsi que la maturation et le bon fonctionnement de leur système digestif et immunitaire. Pour ce faire, différents aspects seront étudiés, comme la composition du microbiote intestinal, la fonction immunitaire, la structure de l'intestin, la capacité de l'intestin à agir comme barrière protectrice, les capacités digestives, ainsi que le comportement des animaux.
Bénéfices attendus
Le bien-être des lapins de compagnie et d'élevage est de plus en plus important en Europe. Par exemple, dans les élevages de lapins, les maladies intestinales restent une grande menace. Le stress peut affaiblir le système immunitaire, entraînant des réponses immunitaires moins efficaces. Cela peut causer des problèmes digestifs après le sevrage, une période de grands changements pour les lapins. Leur système immunitaire n'est pas encore complètement développé à ce stade. Le microbiote intestinal joue un rôle crucial dans le développement du système immunitaire et digestif. Une idée intéressante pour améliorer la santé des lapins, et prévenir les maladies intestinales, est de favoriser un bon microbiote. Utiliser une phéromone apaisante maternelle de lapin pourrait aider à réduire le stress et à améliorer leur bien-être. Ce projet vise à montrer comment cette phéromone peut aider à développer un microbiote intestinal sain et diversifié, renforçant ainsi les défenses immunitaires et digestives et réduisant les effets du stress. À long terme, cela pourrait réduire l'utilisation d'antibiotiques chez les animaux domestiques, contribuant ainsi à lutter contre l'antibiorésistance et à améliorer les pratiques d'élevage, conformément au concept "Une seule santé".
Procédures
Tous les lapereaux (48 au maximum) subiront au moins une fois une immobilisation et un prélèvement sanguin réalisé sur animaux éveillés. Cette intervention (immobilisation et prise de sang) devrait être d'une durée inférieure à 10 minutes/lapin. Pour deux tiers des lapereaux (32 au maximum), cette intervention (immobilisation et prise de sang) sera répétée encore 5 fois, à raison d'une fois/semaine, jusqu'à la fin de la procédure au 70ème jour. Deux tiers des lapereaux (32 lapereaux au maximum) seront hébergés individuellement, toutefois sans isolement visuel, olfactif et auditif d'avec les autres lapins, et dans des cages métalliques grillagées spacieuces fournies avec du matériel d'enrichissement, pendant 35 jours, à raison de 23h maximum par jour les jours de semaine, et 24h par jour le week-end. En effet, les lapereaux issus d’une même portée (pour assurer la compatibilité avec les autres lapins) seront sortis de leurs cages et regroupés dans un « parc d’activités » (enclos sur 2 niveaux, avec paille, matériel à ronger, jouets, tunnel, rampe, cabane) pour leur permettre exercice physique et socialisation avec les autres lapins et les habituer à la manipulation, à raison d’1h/jour minimum, tous les jours de semaine.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les nuisances attendues pour les animaux sont représentées par : (i) les conditions d’hébergement puisque dans la phase 2 de l’étude, les animaux seront hébergés individuellement (sans isolement visuel, auditif et olfactif) au-delà de 24h. Cela peut conduire à l’apparition de comportements anormaux chez les animaux, une baisse de leur activité physique et à une altération de leur bien-être ; (ii) par la privation d’une partie de leurs fèces molles lors des prélèvements hebdomadaires de ceux-ci, empêchant leur consommation si celle-ci se met en place avant la fin de l’étude, pouvant possiblement altérer les apports nutritionnels au lapin ; (iii) par la manipulation et la contention des lapereaux lors des pesées et prises de sang dans la phase 2, possiblement sources de stress psychologique; (iv) par l’introduction d’une aiguille dans la veine de la patte arrière sur animal éveillé lors des prises de sang dans la phase 2, qui peut être source de douleur et possiblement créer un hématome sur le site du prélèvement; (v) par la piqûre pour l'anesthésie préalable à l’injection d’euthanasiant lors de la mise à mort des animaux (au 35e et 70e jour) qui peut être source de douleur.
Devenir
Les 6 lapines gestantes puis mères n'auront subi qu'une procédure légère (exposition au traitement pendant 45 jours, et seulement pour la moitié d'entre elles de surcroit, le groupe placebo n'étant pas exposé à la phéromone apaisante), elles seront encore jeunes, attendues en bonne santé, et donc pourront être réutilisées dans de futures procédures. Tous les laperaux (48 individus au maximum) seront mis à mort au cours de la procédure (soit au 35ème jour pour 1/3 d'entre eux, soit au 70ème jour pour 2/3 d'entre eux) car l'étude implique des prélèvements léthaux, qui seront réalisés post-mortem: tissus intestinaux (section et muqueuse de l'iléon) et contenu intestinaux (digesta du caecum et de l'iléon). Ces prélèvements seront utilisés dans des analyses biologiques visant notamment à déterminer la composition du microbiote (proportion et identité des différentes bactéries), la présence de certaines espèces bactériennes favorables, la structure/architecture de la muqueuse intestinale, à mesurer l'expression de certains gènes modulant le système immunitaire et la fonction barrière intestinale.
Remplacement
Il s’agit d’une étude de recherche fondamentale investiguant les effets de la phéromone apaisante de lapin sur le comportement, les paramètres d'élevage, la physiologie des systèmes digestifs et immunitaires, et le microbiote (communauté des micro-organismes) du lapin, le tout formant des systèmes biologiques interdépendants et s’influençant mutuellement. En tant qu'étude de physiologie, elle doit nécessairement porter sur des êtres vivants, qui représentent des systèmes biologiques intégrés, où de multiples organes/tissus fonctionnent de façon associée et coordonnée. En effet, l’utilisation de traitement phéromonal est une stimulation sensorielle par exposition à des phéromones qui nécessite l’utilisation d’organisme entier pouvant détecter et réagir aux composés testés. La détection de ces composés peut engendrer une cascade de réactions physiologiques pouvant mener à une modification du comportement ou de la physiologie de l’animal. Cela ne peut être obtenu et observé que sur animaux entiers pouvant pleinement exprimer leurs comportements et physiologies naturels. Il n'existe pas actuellement de méthodes de remplacement pouvant simuler ces changements suite à une stimulation sensorielle. Cela nécessite donc l’implication d’êtres vivants, dans ce cas des lapins.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés dans l'étude est déterminé par des calculs statistiques pour détecter un effet significatif du traitement, basés sur des études précédentes. En fonction des données et des tests, 3 à 12 unités par traitement sont nécessaires pour observer une différence significative entre les groupes (placebo vs. phéromone). Dans la phase 1, les lapereaux sont logés ensemble, donc l'unité est la cage/portée en raison de la collecte des fèces qui ne peut être individualisée. Chaque groupe comprendra au moins 3 lapines gestantes pour garantir une variété génétique et une représentativité des résultats et permettre l’analyse statistique. Cela signifie que 18 à 24 lapereaux naîtront ensuite dans chaque groupe (selon le taux de naissance et de mortalité des lapereaux). A la fin de la phase 1 et avant la phase 2, un tiers des lapereaux sera mis à mort, laissant 12 à 16 lapereaux pour être logés individuellement et collecter leurs fèces de manière individuelle. Tous les paramètres mesurés seront alors rapportés à chaque lapereau qui est ici l’unité. Les analyses statistiques compareront les traitements sur les paramètres biologiques. Des modèles statistiques seront utilisés, avec des analyses multivariées dans la phase 2. Des précautions seront prises pour éviter les biais (randomisation, aveuglement des traitements, etc.).
Raffinement
Les cages, métalliques à barreaux, sont fournies d’une litière, une plateforme/abri, du matériel à ronger (buchettes en bois, boules en osiers, balles de foin, balle en plastique). Dans la phase 1, une boite à nid à rebords hauts avec litière est fournie aux lapines gestantes. Dans chaque salle sont réglés les paramètres nécessaires à l’espèce en termes de température, luminosité, ventilation et humidité. Pour compenser l’hébergement individuel dans la phase 2, les cages seront les unes à côté des autres pour permettre le contact visuel, olfactif et auditif entre les lapins. De plus, lors de cette phase, les lapereaux issus d’une même portée seront sortis de leurs cages et regroupés dans un « parc d’activités » (enclos sur 2 niveaux, avec paille, matériel à ronger, jouets, tunnel, rampe, cabane) pour leur permettre exercice physique et socialisation et les habituer à la manipulation, à raison d’1h/jour minimum, tous les jours de semaine. Afin de limiter la réaction de peur des lapins, l’opérateur frappe 3 fois à la porte pour avertir de son entrée. Aussi, des séances de socialisation (caresser les lapins dans leur cage) seront prévues pour limiter la peur des lapins durant la sortie de la cage et des manipulations. Les prélèvements sanguins respectent les recommandations en termes de volumes et fréquences, et sont effectués par un vétérinaire et/ou un opérateur expérimenté, toujours en binôme avec un autre operateur formé à la contention. Les prises de sang se déroulent dans une salle différente à l’élevage, loin des autres lapins, dans une ambiance calme. Pour éviter la réaction de douleur du lapin à la perforation de la peau, un gel anesthésique local est appliqué avant la ponction sanguine. Une serviette pourra être utilisée pour mieux contenir le lapin et diminuer sa peur. La pesée des lapins provoque peu de stress car les animaux sont introduits dans une boite qui est posée sur la balance, évitant ainsi la contention des animaux. La pesée servira aussi à suivre la croissance des animaux et détecter d’éventuels problèmes de santé. De même, lors du recueil des féces molles au crépuscule des lapins, l’opérateur notera si des comportements anormaux (par exemple, rongement des barreaux) se manifestent à ce moment particulier d’activité plus élevée des lapins.
Choix des espèces
La phéromone apaisante testée est une version artificielle de la phéromone que les mères lapines produisent pour calmer leurs petits après la naissance. Nous avons choisi d'étudier les lapins car ce sont des mammifères herbivores à un seul estomac, souvent utilisés en laboratoire et pour lesquels nous disposons de nombreuses méthodes d'analyse validées. Les résultats de cette recherche pourraient également être appliqués et bénéficier aux lapins de compagnie et d'élevage en améliorant leur santé intestinale et leur bien-être. Nous utilisons des lapines gestantes adultes car elles sont sexuellement matures, et des lapereaux juvéniles, depuis la naissance jusqu'à 10 semaines, avant qu'ils ne soient sexuellement matures. Cette période d'âge jeune est cruciale pour le développement de leur microbiote intestinal, influencé par la génétique, l'alimentation, l'hygiène, l'environnement et le stress. Le sevrage, qui marque le début de l'alimentation solide, peut être stressant pour les lapereaux, perturbant leur flore intestinale et leur santé digestive et immunitaire. Nous couvrons donc tous les moments importants pour comprendre comment le microbiote intestinal se forme et influence le développement des systèmes digestif et immunitaire.
Etude des capacités de cellules humaines à former des vaisseaux sanguins dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Les souris de ce projet sont immunodéprimées, ce qui les expose à un gonflement, du pus ou un hématome là où la matrice qu'elles reçoivent est implantée. 624 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Chacune reçoit sous la peau du dos deux implants contenant des cellules prélevées sur des valves aortiques humaines, retirés quatorze jours plus tard sous anesthésie, pour repérer quelles cellules de la valve forment des vaisseaux sanguins. Toutes sont tuées au retrait, le porteur indiquant que la recherche des implants exige deux grandes cicatrices dorsales et que leur extraction abîme la chair de l'animal, ce qu'il qualifie lui-même de nuisance très importante.
Objectifs
La sclérose valvulaire aortique est le rétrécissement de l'ouverture de la valve aortique due à une atteinte structurelle de la valve cardiaque. C’est un enjeu majeur de santé publique qui touche 2 à 6 % des personnes âgées de plus de 65 ans. Sa prévalence est susceptible de doubler au cours des 50 prochaines années en raison du vieillissement croissant de la population. La sclérose valvulaire aortique est maintenant principalement considérée comme un processus incluant une formation de vaisseaux sanguins pathologiques à l’intérieur de la valve aortique. Ainsi notre projet consiste à comprendre quelles cellules de la valve permettent de former des vaisseaux sanguins, notamment en fonction de leur localisation dans la valve aortique. Le but du projet est d’étudier la capacité des cellules, issues de différentes parties de la valve aortique humaine, à former des vaisseaux sanguins dans un modèle murin. Nous comparerons l’aptitude à former des vaisseaux sanguins les cellules isolées de différentes parties de la valve aortique à des cellules endothéliales de sang de cordon ou de sang adulte connues pour former des vaisseaux sanguins. L’objectif est de mettre en évidence le type cellulaire capable de former de manière la plus importante des vaisseaux sanguins et de rechercher des voies de blocage afin d’envisager des nouveaux traitements de la sclérose valvulaire aortique.
Bénéfices attendus
Mieux comprendre les caractéristiques de fonctionnement des cellules de la valve devrait conduire à une meilleure compréhension des dégénérescences valvulaires et éventuellement proposer des stratégies de modulation des fonctions de ces cellules dans un objectif thérapeutique afin à terme de traiter et/ou de prévenir la sclérose valvulaire aortique.
Procédures
Les souris seront anésthésiées 5 minutes maximum pour les deux injections en sous-cutanée des deux implants 1 fois, chaque injection dure au maximum 20 secondes. Les souris seront anésthésiées 5 minutes maximum pour le retrait des implants au bout de 14 jours.
Impact sur les animaux
Les souris peuvent avoir un inconfort lié à la préhension des animaux et une potentielle douleur au point d’injection de la matrice extracellulaire. Les souris immunodéprimées peuvent avoir au niveau de la zone d’injection de la matrice extracellulaire un gonflement, du pus ou un hématome.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort après la récupération des implants. Malgré le repérage des implants par palpation la recherche des implants nécessite deux grandes cicatrices au niveau dorsal. De plus le retrait des implants abime la chair de l’animal. Ces deux points constituent une nuisance très importante pour l’animal tant au niveau de la cicatrice que de la chair.
Remplacement
Malgré l’existence de nombreux modèles in vitro évaluant les différents processus impliqués dans la capacité des cellules à former des vaisseaux, l’utilisation de modèles in vivo reste indispensable en raison des nombreuses interactions entre les cellules et leurs environnements qui permettent la génération de vaisseaux fonctionnels
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux : -Nous effectuerons en amont des études in vitro afin d’étudier la capacité des cellules à former des tubes. Deux implants seront injectés par animal pour limiter le nombre d’animaux. Le nombre d’animaux devra être de 5 par condition (soit 10 implants) afin d’avoir des résultats significatifs. Ce nombre a été calculé selon l'expérience acquise dans notre équipe en tenant compte de la variabilité observée lors d'expériences similaires et les données de la littérature. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Afin de réduire au maximum la douleur et le stress, les animaux disposent d’un accès sans restriction à la nourriture et à la boisson et d’un environnement enrichi (coton). De plus, l’injection sous-cutanée et le retrait des implants seront effectuées sous anesthésie générale. Les animaux seront surveillés de façon hebdomadaire avec mise en place de points limites qui permettront une prise en charge précoce en cas de douleur ou de souffrance. Si les animaux présentent une douleur ou une souffrance, un traitement analgésique sera administré et la fréquence de surveillance sera augmentée (au minimum 2 fois par semaine).
Choix des espèces
Le système vasculaire murin est proche du système vasculaire humain (vertébré) et la souris est un des modèles les plus utilisés dans la littérature pour l’étude de l’angiogenèse chez un animal adulte (modèle d’angiogenèse tumorale, modèle d’ischémie du membre inférieur). Souris adultes de 6-8 semaines pour que les animaux aient une taille suffisante pour permettre l'injection de deux implants sur le dos.
Evaluation des mécanismes de devenir des oligodendrocytes dans un modèle d’atrophie multisystématisée
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une heure trente de chirurgie intracérébrale pour injecter un virus qui fera exprimer une protéine toxique dans les cellules de soutien du cerveau, puis quatre à cinq prises de sang à la queue : 320 rats Sprague-Dawley subissent ce protocole dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever leur cerveau. L'induction de la maladie ralentit leur activité locomotrice et dégrade leur motricité fine. L'objectif déclaré est de comprendre les mécanismes de l'atrophie multisystématisée, maladie neurodégénérative sans traitement, et d'identifier des marqueurs sanguins qui seront ensuite vérifiés chez des patients. Le porteur annonce deux tests comportementaux répétés quatre à six fois sur des rats vigiles, l'un de trois minutes sur trois jours, l'autre d'une heure, sans indiquer à aucun moment lesquels.
Objectifs
L'atrophie multisystématisée est une maladie neurodégénérative fatale avec un handicap moteur sévère. Il n'existe actuellement aucun traitement disponible pour atténuer la gravité des symptômes ou la progression clinique de cette maladie orpheline. Elle se caractérise au niveau cellulaire par l'accumulation et l'agrégation d’une protéine dans les oligodendrocytes (cellule de soutien essentielle à la fonction et à la survie des cellules nerveuses) entrainant une neurodégénérescence. Dans ce projet, des rats recevront une injection de virus permettant l’expression de cette protéine spécifiquement dans les oligodendrocytes. Le but de ce projet est d’identifier les mécanismes moléculaires responsable du dysfonctionnement des oligodendrocytes et aboutissent à leur perte de fonction dans le cerveau en utilisant des approches comportementales (évaluation motrice), histologiques et cellulaires. De plus les prélèvements de sang réalisés chez les animaux à différentes étapes du développement de la maladie permettront d’identifier des cibles thérapeutiques potentielles pour lesquelles des stratégies pourraient être développées afin de prévenir ou de corriger les altérations qui touchent les oligodendrocytes, dans le but de restaurer leur fonctionnement normal. Les marqueurs d'oligodendrocytes qui pourront être identifiés dans le modèles précliniques seront ensuite validés chez des patients atteint d’atrophie multisystématisée.
Bénéfices attendus
Le projet actuel propose d’identifier les mécanismes moléculaires responsables du dysfonctionnement des oligodendrocytes et la mise en évidence de biomarqueurs au niveau sanguin. Ces résultats de recherche amélioreraient considérablement la compréhension de la physiopathologie de l’atrophie multisystématisée d’une part et auraient des implications considérables pour les soins aux patients et le développement thérapeutique et de biomarqueur dans l’atrophie multisystématisée d’autre part.
Procédures
- Pour 320 animaux : test comportemental 1 d’une durée de 3 minutes sur 3 jours et test comportemental 2 d’une durée d’1h sur une journée. Ces tests comportementaux sont réalisés à plusieurs reprises au cours du projet (4 à 6 fois maximum en fonction des lots de rats) sur animaux vigiles. - Pour 320 animaux : prélèvement sanguin au niveau de la queue sur animaux anesthésiés d’une durée de 3 minutes (4 à 5 fois maximum en fonction des lots de rats) - Pour 320 animaux : chirurgie intracérébrale réalisée sur animaux anesthésiés et sous couverture antalgique périphérique et locale, d'une durée d'1 heure 30. - Pour 160 animaux : perfusion intracardiaque réalisées sur animaux anesthésiés par une double dose d'un mélange d'anesthésique et antalgique permettant également une couverture antalgique périphérique.
Impact sur les animaux
- La chirurgie stéréotaxique peut induire une légère perte de poids et un stress notamment au réveil, la douleur occasionnée est soulagée par des antalgiques pendant et après la chirurgie. - L’induction de l’AMS va induire un ralentissement global de l’activité locomotrice et des difficultés de motricité fine. - Prélèvements de sang peuvent ponctuellement induire un hématome au niveau de la veine caudale. - Petit inconfort de la contention ou léger stress lors de la pesée hebdomadaire.
Devenir
Tous les animaux de la procédure seront mis à mort en fin afin de récuperer les ceveaux et de réaliser des analyses histologiques, cytologique et transcriptionnel.
Remplacement
Malgré des recherches sur des modèles cellulaires dans l’atrophie multisystématisée, dans le cadre de ce projet basé sur la compréhension du développement de la maladie et de ces effets comportementaux ainsi que l’analyse de biomarqueurs sanguins le modèle animal entier ne peut pas être substitué car nécessite l’intégrité des réseaux neuronaux et ne peut donc pas être réalisée in vitro, ni in silico.
Réduction
Le nombre d’animaux dans chaque groupe expérimental a été obtenu grâce à des calculs de puissance. Ces critères impliquent d’utiliser pour des groupes expérimentaux de 20 animaux par condition expérimentale par suivi longitudinal et par sexe soit 320 rats afin d'obtenir des résultats statistiques interprétables.
Raffinement
Les expérimentations sont réfléchies de façon à minimiser au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse des animaux au cours des différentes procédures de ce projet (actes réalisés par du personnel expérimenté, médicamentation définie avec le vétérinaire référent et les tests comportementaux basés sur le comportement spontané des animaux). Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale (gazeuse, facilement modulable et permettant un réveil rapide et plus confortable) avec surveillance de la température corporelle, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgique. Le traitement antalgique sera poursuivi au lendemain de la chirurgie voire 48h post- opératoire si l'état de l'animal le nécessite. Des points limites gradés, précis et adaptés ont été définis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations faites et aboutir à une gestion optimale de ceux-ci. Des critères d'arrêt de souffrances, appelés points limites terminaux sont définis. Les animaux sont hébergés deux par cage autant que possible (isolement de maximum 7 jours après la chirurgie restant une démarche de soin exceptionnelle), avec eau et nourriture ad libitum. L’hébergement en animalerie est réalisé en portoir ventilé, dans des pièces à température et hygrométrie régulées et contrôlées selon les normes en vigueur. Un enrichissement (bâtons à ronger et baguette de papier compressé) est disposé dans les cages d'hébergement. Un tunnel sera également rajouté si les animaux nécessitent un isolement. Les animaux sont manipulés au minimum de façon hebdomadaire tout au long du projet permettant une habituation à un binôme d’expérimentateurs, qui reste le même tout au long de l’étude. Les expérimentateurs sont compétents en chirurgie.
Choix des espèces
L’espèce animale utilisée est le rat (Rattus norvegicus) de souche Sprague-Dawley. Il s’agit de l’espèce la plus pertinente pour l’étude de l’atrophie multisystématisée. La lignée Sprague-Dawley a été choisie en raison des données déjà disponibles dans la modélisation de la maladie et de la similitude avec la pathologie humaine. Les animaux utilisés seront des animaux adultes (8 semaines au début des tests comportementaux réalisés avant la chirurgie) de façon à se rapprocher du stade de développement de l’atrophie multisystématisée.