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Les vésicules extracellulaires fécales comme traitement des symptômes de l’autisme dans un modèle animal
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Sur les 207 souris utilisées, 192 seront tuées pour prélever leur intestin et leur cerveau, les 15 souris dites naïves employées dans les tests d'interaction sociale étant mises à disposition d'autres utilisateurs. Ces souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré, une hypothyroïdie provoquée chez les mères par un antithyroïdien dans l'eau de boisson, puis chez la descendance un gavage trois fois par semaine pendant deux semaines, des prélèvements de sang à la queue et une bille introduite par voie anale pour mesurer le transit colique. Les tests comportementaux sont détaillés, exploration, interaction sociale de 35 minutes, mesure des stéréotypies et test d'anxiété de 15 minutes chacun. Le porteur affirme qu'évaluer un traitement des symptômes digestifs et comportementaux de l'autisme ne peut, à ce jour, être réalisé que sur des animaux non-humains.
Objectifs
6. Les troubles du spectre de l’autisme sont caractérisés par des déficits dans les interactions sociales, des stéréotypies et des centres d’intérêts restreints. En plus des symptômes comportementaux, une grande majorité de personnes avec TSA souffrent de symptômes gastro-intestinaux. Aucun médicament spécifique des troubles du spectre de l’autisme n’existe à ce jour. Il s’avère que le microbiote intestinal présente une composition altérée chez les patients avec autismes par rapport à des sujets témoins. Appuyant le microbiote intestinal comme possible cible thérapeutique dans l’autisme, des études cliniques pilotes de thérapie par transfert de microbiote fécal ou de probiotiques (micro-organismes vivants tels que bactéries, levures exerçant un effet bénéfique sur l'organisme) chez des enfants avec autisme ont permis d’améliorer certains symptômes comportementaux et digestifs, suggérant que des éléments produits par le microbiote intestinal possèdent un potentiel thérapeutique. Nous proposons de tester l’un de ces éléments : les vésicules extracellulaires produites par le microbiote intestinal qui sont présentes dans les selles. Parmi les facteurs de risques de l’autisme, la santé de la mère pendant la grossesse semble jouer un rôle crucial. En particulier, l'hypothyroxinémie maternelle est associée à un risque quatre fois plus élevé de développer des troubles du spectre de l’autisme chez la descendance. L’hypothyroxinémie est une forme d’hypothyroïdie dans laquelle la concentration sanguine de T3 (l’hormone thyroïdienne active) est normale alors que celle de T4 (précurseur de T3) est diminuée. Un modèle animal chez la souris permettant de modéliser l’hypothyroxinémie maternelle montre en effet l’apparition de troubles comportementaux et digestifs pertinents des TSA chez la descendance. L’objectif de ce projet est d’étudier une nouvelle approche thérapeutique dans un modèle animal d’hypothyroxinémie maternelle. Cette approche est basée sur l’utilisation vésicules extracellulaires fécales (contenant les vésicules extracellulaires du microbiote intestinal) ou des vésicules extracellulaires issues de probiotiques (micro-organismes vivants tels que bactéries, levures). L’objectif est d’étudier si un traitement d’un modèle animal avec des vésicules extracellulaires provenant d'un microbiote fécal sain ou de probiotiques réduira les symptômes comportementaux et gastro-intestinaux de type autistique chez la descendance de mères avec hypothyroxinémie.
Bénéfices attendus
Les troubles du spectre de l’autisme touchent environ 1% de la population mondiale et restent en constante augmentation sans médication proposée à ce jour. Plusieurs études indiquent que des éléments produits par le microbiote intestinal ou par des probiotiques (micro-organismes vivants tels que bactéries, levures) possèdent un potentiel thérapeutique pour les troubles du spectre de l’autisme. En ciblant les vésicules extracellulaires, notre projet pourrait apporter un nouvel outil thérapeutique dans l’autisme. Dans des modèles animaux de colites, l’emploi des vésicules extracellulaires fécale ou dérivées de probiotiques, a montré leur efficacité dans la diminution des symptômes gastro-intestinaux. Ce projet pourrait donc apporter de nouvelles perspectives pour un traitement thérapeutique de l’autisme basé sur l’utilisation de vésicules extracellulaires comme postbiotiques (composés produits par les probiotiques).
Procédures
Pour la procédure n°1 visant à induire une hypothyroxinémie chez les souris gestantes, nous réaliserons un seul prélèvement d’un échantillon de sang à la base de la queue (environ 200μl) de 5min. Pour la procédure n°2 visant à étudier le comportement et les fonctions digestives, nous réaliserons : - un gavage 3 fois par semaine (un jour sur deux) durant 2 semaines à l’aide d’une canule de gavage pour rongeurs avec 100 µl d’une solution de VE (2min). - des tests comportementaux sur 3 jours seront effectués sur les souris : 1) test d’exploration, 2) test d’interaction sociale de 35min 3) mesure des stéréotypies de 15min et 4) test d’anxiété de 15min. - un seul prélèvement d’un échantillon de sang à la base de la queue (environ 30μl) de 5min. - un prélèvement de selles tous les ¼ d’heure sur 2 heures.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendues sur les souris sont faibles. Cependant, du stress et de la douleur peuvent être générés par les différentes procédures expérimentales (gavage, prélèvements de sang ou tests comportementaux). Les signes de souffrance éventuelle seront observés quotidiennement au cours de l’étude.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux, à l’exception des souris naïves dites inconnues utilisées pour les tests comportementaux d’interaction sociale, seront mis à mort. Les souris naïves seront mises à disposition pour d’autres utilisateurs. L’intestin et le cerveau seront prélevés et des mesures ex vivo de motricité colique et de perméabilité colique seront effectuées ainsi que des analyses supplémentaires d’expression de protéines clés des fonctions digestives et cérébrales.
Remplacement
Une étude visant à évaluer le bénéfice thérapeutique d’un traitement sur les symptômes digestifs et comportement dans le cadre des troubles du spectre de l’autisme ne peut, à ce jour, être réalisée que sur des animaux.
Réduction
Des études antérieures publiées sur des modèles in vivo de colites et des approches in vitro conduites dans notre laboratoire sur des modèles de cultures de neurones entériques ont montré la bioactivité des VE fécales ou dérivées de probiotiques à induire des modifications fonctionnelles des neurones entériques et ainsi à déterminer la dose efficace de VE à administrer chez l’animal. Ces données et expériences préliminaires in vitro ont permis de réduire significativement le nombre d’animaux qu’il aurait fallu pour révéler ces effets in vivo. Parallèlement, des expérimentations similaires menés chez des modèles animaux au cours de projets antérieurs nous ont permis de faire des calculs de puissance statistique et ainsi de sélectionner le nombre minimum d’animaux par groupe pour avoir une significativité avec une erreur de 0,05 et une puissance de 80%.
Raffinement
Le bien-être animal sera pris en compte tout au long de l’expérimentation. Nous recevrons les souris gestantes au stade gestationnel embryonnaire de 6 jours, soit 5 jours avant le début du traitement avec le 2-mercapto-1-methylimidazole dans l’eau de boisson pour induire une hypothyroxinémie gestationnelle. Les souris gestantes seront hébergées collectivement dans un environnement enrichi avec frisottis et tunnels, puis seront transférées 3 jours avant la mise-bas dans des cages individuelles enrichies avec igloo pour leur permettent de construire leur nid. Pour la descendance, les souris seront hébergées collectivement dans des cages enrichies avec frosottis et tunnel. Concernant les tests comportementaux, une habituation d’1h est réalisée dans la pièce dédiée au comportement avant le début des tests. Pour le test du temps de transit colique distal par l’introduction d’une bille par voie anale dans le rectum, de la vaseline sera utilisée pour l’introduction de la bille. L’ensemble des procédures sera réalisé par du personnel qualifié. L’évaluation des animaux sera effectuée selon des critères définis de poids, d’apparence physique (pelage, posture), d’activité, de comportement et de fréquence respiratoire. Le poids et l’état d’hydratation seront surveillés régulièrement pour les femelles gestantes et au stade P10, P30 et P55 pour la descendance. Pour l’ensemble des procédures, des points limites sont mis en place. Si l’animal présente 2 ou 3 signes cliniques notables ou 1 signe clinique sévère, il sera retiré de l’étude et sacrifié. En cas de doute, nous ferons appel aux responsables de la SBEA de l’établissement. Si un seul signe clinique est notable, il sera alors demandé une consultation par le vétérinaire référent ou un responsable SBEA. Si un protocole d’analgésie s’avère nécessaire, les souris ayant eu une analgésie seront retirées de l’étude en raison du biais expérimental apporté par l’analgésie.
Choix des espèces
Des études antérieures conduites par nos collaborateurs ont montré la pertinence chez la souris du modèle d’hypothyroxinémie maternelle comme modèle d’autisme intégrant un facteur de risque maternel. De plus, nos études conduites dans le laboratoire montrant l’impact du microbiote fécal dans les troubles gastro-intestinaux et comportementaux ont été réalisées chez la souris. Les souris gestantes au stade gestationnel E4 seront réceptionnées à l’animalerie. Pour induire l’hypothyroxinémie, les souris au stade gestationnel E10 recevront 0,02% de 2-mercapto-1-methylimidazole (MMI) dissout dans l’eau de boisson jusqu’au stade E14 selon le protocole bien établi. Sur la descendance, les souris recevront le traitement avec les VE au stade 40 jours après la naissance, correspondant à un stade adolescent, encore en phase développementale de maturation cérébrale et intestinale. A cet âge, les symptômes gastro-intestinaux et comportementaux sont apparents. De plus cet âge est pertinent avec l’autisme, s’inscrivant dans une trajectoire développementale. Après 2 semaines de traitement, les souris seront étudiées au stade 54 jours après la naissance jusqu’à 58 jours.
Evolution de nos protocoles de transfert d’embryons et d’insémination de sperme par voie chirurgicale afin de raffiner la prise en charge de la douleur
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Rats : 28
Pour valider un protocole antidouleur que le service pourra ensuite appliquer en routine à ses chirurgies de transfert d'embryons, 20 souris et 28 rats vont être utilisés, 20 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 28 un niveau léger. Les rates reçoivent quatre injections, une pour synchroniser leur cycle, une d'analgésique, une d'anesthésique et une dernière pendant leur sommeil. La moitié des femelles subit en plus une chirurgie de transfert d'embryons de cinq minutes, l'autre moitié seulement l'anesthésie, puis toutes mettent bas et leurs petits sont comptés avant que mères et portées ne soient tuées, faute de pouvoir être réutilisées dans les activités de service de l'établissement. Le porteur écrit aussi que toute femelle chez qui une douleur ou un inconfort serait détecté sera mise à mort, dans un projet dont l'objet déclaré est la prise en charge de la douleur.
Objectifs
L'objectif du projet est de valider une nouvelle prise en charge de la douleur (administration de médicaments anti-douleur et anti-inflammatoire) lors de nos chirurgies de transfert d'embryons et d'insémination de sperme afin de raffiner nos procédures actuelles. L'utilisation de ces molécules et dans cette chronologie définie autour de la chirurgie doit être validée comme n'ayant aucun effet nocif sur la gestation et la mise bas afin de la passer en routine chez nous.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus pour ce projet sont d'améliorer la prise en charge de la douleur liée à la chirurgie de transfert d'embryons ou d'insémination de sperme sur nos rongeurs (rats et souris) et donc raffiner nos techniques. Le bien-être animal est une préoccupation majeure au sein de nos activités. Un animal qui ne souffre pas à des rendements plus fiables et plus reproductifs, ce qui impacterai également le R de Réduction. Donc sur ce projet on envisage d'impacter favorablement les R de raffiner et réduire.
Procédures
Les rates recevront une injection, sous simple contention rapide de 5 secondes, afin de synchroniser leur cycle pour devenir mères ou mères porteuses. 4 jours plus tard, les animaux recevrons une injection d'antidouleur sous simple contention rapide de 5 secondes, puis 40 minutes plus tard, ils seront anesthésiés par une autre injection, là encore sous simple contention rapide de 5 secondes. Une fois endormis, la moitié des animaux prévus vont passer en petite chirugie de transfert d'embryons sous anesthésie, alors que l'autre groupe, sera simplement anesthésié, sans aucune procédure invasive supplémentaire. La chirurgie dure environ 5 minutes. Juste après la chirugie, pendant que les animaux dorment encore, afin de limiter le stress, elles recevront un réhydratant et un anti-infammatoire en injectable. Ainsi, une rate recevra un total de 3 injections en contention rapide et une dernière lorsqu'elle sera endormie. Donc 3 injections au cours de la journée d'anesthésie/chirurgie et 4 injections au total. Pour la souris, elle recevra 2 injections en contention rapide et une dernière lorsqu'elle sera endormie. Donc 3 injections au cours de la journée d'anesthésie/chirurgie au total.
Impact sur les animaux
Le geste technique d'injection sous contention est un acte qui peu être un peu stressant pour l'animal, mais il ne dure que quelques secondes (environ 5 secondes) et est peu douloureux. Les animaux restent sous surveillance après leurs diverses injections, afin d’observer aucune apparence physique externe de souffrance. Les points de surveillance sont les suivants : rougeur, gonflement, traces de griffures si l’animal se gratte au niveau du site d'injection. Les animaux opérés (acte chirurgical) restent en observation jusqu’à leur complet réveil en bonne forme, dans leur cage placée sur une platine chauffante. Les points de surveillance post-opératoire sont : l’apparence de l’animal, son comportement (prostré….), l’aspect du site de chirurgie (rongeur, gonflement, écoulement, automutilation….)
Devenir
Les femelles gestantes doivent mettre bas et nous devons comptabiliser le nombre de petits pour l'analyse de notre projet. Elles seront ensuite mises à mort, puisque nous ne pouvons pas réutiliser ces femelles dans le cadre de nos activités de service. Il en est de même pour les portées.
Remplacement
Pas d’autre possibilité que le recours à l’animal vivant pour l'analyse de l'effet des molécules antalgiques et anti-inflammatoires sur le bon déroulement de la gestation in vivo et la mise bas afin de raffiner nos protocoles chirurgicaux de transfert d'embryons et d'insémination de sperme.
Réduction
Notre activité est connue et il existe bon nombre de données témoins, ainsi, nous avons juste besoin de faire des groupes expérimentaux. Un bonne analyse bibliographique a été faite pour ajuster au mieux le protocole antalgique choisi avec le vétérinaire. Le projet se fera en 2 parties. La première partie (groupe 1) consiste uniquement à valider le fait que les molécules et doses choisies n'altèrent pas le bon déroulement des gestations et mises bas, sur les femelles gestantes mais qui n'ont pas subies de chirurgie. Seulement si cette étape est validée, nous passerons à la phase 2 (groupe 2, avec chirugie de transfert d'embryons). Nous avons choisi un effectif de 10 femelles pour chaque groupe et pour chaque espèce afin d'obtenir des résultats de comparaison fiables.
Raffinement
Du gel oculaire est placé systématiquement sur les yeux des animaux anesthésiés afin de prévenir tout dommage de la cornée de l’animal. De plus, les animaux anesthésiés sont placés sur une plaque chauffante pour pallier à toute déperdition de chaleur liée à l’anesthésie. Les animaux opérés restent en observation jusqu’à leur complet réveil en bonne forme, dans leur cage placée sur une platine chauffante à 37°C. Les animaux sont hébergés en cages ventilées dans des conditions adéquates pour l'espèce. Des enrichissements (nids et quelques croquettes dans le fond de la cage pour les souris et nids + bois et balles à ronger + croquettes dans le fond de la cage pour les rats) sont mis à disposition dans la cage des futures mères lors de leur convalescence et gestation. Comme il s'agit ici d'un test, si une douleur ou un inconfort est détéctée, la femelle sera mise à mort pour lui éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Les rongeurs sont de petits mammifères à reproduction rapide qui sont très largement utilisés par la communauté scientifique. Ils sont de très bons modèles expérimentaux puisque 99% de leurs gènes présentent un gène homologue chez l'Homme. Nous voulons des mère porteuses, il nous faut donc des femelles en âge de procréer donc entre 10 semaines et 6 mois (pour les 2 espèces).
Analyse de la régénération musculaire après une lésion induite par un exercice d’intensité variable EU2/2
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Pour comparer la réparation des muscles chez les mâles et les femelles, 1 189 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie générale, chacune subit une électrostimulation qui blesse les muscles de son mollet droit, à la manière d'un claquage, puis jusqu'à sept mesures de force. Les femelles subissent aussi jusqu'à trois lavages vaginaux pour suivre leur cycle, et une partie des souris reçoit des injections et une séance d'imagerie sous anesthésie pouvant durer trois heures. Le porteur écrit n'avoir constaté "aucun signe de souffrance visible" lors de ces actes, tout en déclarant des effets "modérés" dus à leur cumul. Il justifie l'effectif de 1 189 souris par des "analyses statistiques effectués précédemment", sans en donner le détail.
Objectifs
Le projet se déroule dans 2 EU. Il vise i) à mettre en évidence l’influence du sexe sur les différentes étapes de la réparation musculaire en nous appuyant sur un modèle préclinique standardisé de lésions musculaires physiologiques induites par un exercice d’intensité variable (i.e., de légère à élevée) ; ii) à identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de i) à mettre en évidence l’influence du sexe sur les différentes étapes de la réparation musculaire en nous appuyant sur un modèle préclinique standardisé de lésions musculaires physiologiques induites par un exercice d’intensité variable (i.e., de légère à élevée) ; ii) à identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Ce projet pourrait permettre d’améliorer la prise en charge des atteintes musculaires associées à plusieurs situations physiopathologiques (vieillissement, cancer...)
Procédures
Les souris sont soumises à des lavages vaginaux (3 maximum, EU1/2), un protocole d’exercice par électrostimulation (sous anesthésie générale, durée 15 minutes maximum, EU1/2), à une mesure de force (sous anesthésie générale, durée 5 minutes maximum, 7 mesures maximum, EU1/2). Une partie des animaux est également soumis à des injections ip (4 maximum, EU1/2) (moins d’une minute), une injection sous-cutanée et à une analyse par imagerie (sous anesthésie générale, durée 3 heures maximum, EU2/2)
Impact sur les animaux
Des nuisances et effets indésirables "modérés" sont attendus du fait d’un cumul d’actes (contention, injections, lavages vaginaux, électrostimulation, anesthésies). Les souris femelles sont soumises à des lavages vaginaux (3 maximum) afin de contrôler leur cycle ovarien. L’ensemble des animaux est soumis à un protocole d’exercice qui induit une blessure des muscles du mollet droit mimant ainsi un « claquage » chez l’homme. Des mesures de force sont réalisées sous anesthésie générale pour déterminer la cinétique de réparation de la fonction musculaire. Notre expérience depuis le début du projet montre qu'il n'y a aucun signe de souffrance visible chez les animaux lors des lavages vaginaux et au décours de l'induction du dommage musculaire et des mesures de force. Toutefois, le cumul de ces actes peut générer du stress pour les animaux. Enfin, le traitement antalgique préalable à la session d’imagerie peut générer du stress lors de la contention.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour réaliser des analyses tissulaires et cellulaires
Remplacement
Le laboratoire a une longue expérience des essais in vitro par la culture cellulaire. Aussi, bien que l'analyse de la régénération musculaire puisse être en partie étudiée in vitro, ce processus repose notamment sur l’interaction entre différentes cellules qui ne peut être étudiée qu'in vivo, justifiant le recours à l'expérimentation animale
Réduction
L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectués précédemment pour ces procédures. Nous utilisons un dispositif expérimental totalement non-invasif qui permet de réaliser des protocoles d’exercice et de mesurer la force musculaire de manière concomitante sur les mêmes animaux rendant les préparations chirurgicales totalement obsolètes et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés
Raffinement
Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. La procédure expérimentale utilisée inclut un recours systématique à l'anesthésie générale adaptée lors de l’électrostimulation et de la mesure de la force musculaire. Notre expérience sur ce modèle de dommage musculaire et de lavages vaginaux montre que l'ensemble (100%) des animaux est inclus pour réaliser des analyses fonctionnelles et biologiques. Un lavage vaginal est effectué ce qui permet d’éviter la réalisation d’un prélèvement intravaginal (frottis). Un traitement antalgique est réalisé 30 minutes avant la session d’imagerie.
Choix des espèces
Des travaux précédents ont montré que les processus mis en œuvre au cours de la régénération musculaire chez la souris sont proches de ceux observés chez l'homme. Les animaux utilisés sont à l'âge adulte (8-12 semaines).
Manipulation pharmacologique d’agents anti-agrégats chez un modèle murin du syndrome d’Ondine
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système respiratoire
Des souriceaux nouveau-nés et juvéniles sont anesthésiés quelques minutes puis tués pour en extraire une partie du système nerveux, tandis que d'autres souris reçoivent deux solutions, par le nez sous anesthésie gazeuse ou par injection dans le ventre, avant des mesures de leur respiration en enceinte fermée. 1 182 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré ou menées sous anesthésie sans réveil, et chacune subit une biopsie de la queue pour le génotypage, que le porteur décrit comme "une source de douleur et de stress". Une partie porte la mutation du syndrome d'Ondine, où la respiration ne réagit plus à l'excès de CO2, et ces souris mutantes risquent des troubles respiratoires mortels lors des administrations par le nez sous anesthésie. L'équipe veut savoir si des agents qui empêchent la formation d'agrégats de protéines améliorent leur respiration. Le résumé ne nomme ni les deux solutions ni ces agents, et ne dit pas si la biopsie des nouveau-nés se fait sous anesthésie.
Objectifs
Les syndromes d’hypoventilation alvéolaire centrale (SHAC) sont des pathologies associées à une dérégulation du fonctionnement du système nerveux autonome. Ces SHAC sont associées à une altération de la respiration et surviennent dès la naissance. Ces pathologies s’accompagnent d’une réduction voire d’une absence de réponse respiratoire à l’hypercapnie (trop de CO2 dans l’air inspiré) Cette réponse est vitale et nécessaire pour éliminer le CO2 de l’organisme. Elle est produite par les neurones du cerveau qui composent la commande respiratoire. L’endormissement et le sommeil s’accompagnent d’irrégularités respiratoires pouvant conduire à une situation d’hypercapnie. Ainsi, les personnes atteintes de ce syndrome doivent tout au long de leur vie supporter une aide ventilatoire dès qu’elles s’endorment. Le bon fonctionnement des cellules de la commande respiratoire, sensibles aux variations de CO2, dépend de l’expression d’un gène codant pour une protéine spécifique. Si le gène est muté, la protéine a une mauvaise structure et forme des assemblages protéiques anormaux (les agrégats) non fonctionnels. Les expérimentations seront réalisées chez des souris mutantes modèle d’un SHAC. Des approches utilisées chez des souris nouveau-nées et juvéniles permettront d’étudier la commande centrale respiratoire, d’identifier l’agent anti-agrégats le plus efficace et d’enregistrer l’activité des neurones respiratoires avec ou sans agents anti-agrégats, qui participent à la détection du CO2 dans l’organisme et à la mise en place de la réponse respiratoire à l’hypercapnie. Chez des mêmes souris juvéniles puis adultes, l’approche utilisée est non invasive. Elle permettra de déterminer l’effet bénéfique d’agents anti-agrégats sur la respiration. In fine, les données obtenues devraient donc permettre de mieux comprendre comment les agrégats impactent la respiration. Ainsi, les éléments observés chez l’animal (dans des conditions non réalisables chez l’Homme) permettront le développement de nouvelles pistes thérapeutiques dans le cadre des SHAC.
Bénéfices attendus
Les souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine que nous utilisons dans ce projet sont porteuses d’une mutation sur un gène dont la protéine est exprimée dans une population de neurones indispensables à la réponse respiratoire à l’hypercapnie. A la naissance, ces souris ne présentent pas de réponse respiratoire à l’hypercapnie. Cette dernière est partiellement restaurée chez les souris adultes. L’inhibition de la formation d’agrégats protéiques pourrait potentiellement : 1/améliorer la respiration des souris nouveau-nées, juvéniles ou adultes. 2/restaurer une réponse respiratoire à l’hypercapnie chez les souris nouveau-nées ou juvéniles. 3/restaurer ou potentialiser la réponse respiratoire à l’hypercapnie des souris adultes. De plus, nous souhaitons 1/identifier les cibles cellulaires et moléculaires des agents anti-agrégats au niveau de la commande respiratoire et 2/déterminer si ces cibles évoluent selon l’âge des souris mutantes dont certaines récupèrent naturellement une faible réponse respiratoire à l’hypercapnie. In fine, les données obtenues devraient permettre de mieux comprendre comment les agrégats impactent la commande respiratoire. Ainsi, les éléments observés chez l’animal (dans des conditions non réalisables chez l’Homme) devraient permettre d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques chez les patients.
Procédures
Les souris mutantes et contrôles, nouveau-nées et juvéniles sont anesthésiées (quelques minutes) puis euthanasiées afin d’isoler rapidement une partie du système nerveux central. D’autres souris juvéniles puis adultes seront anesthésiées grâce à un gaz anesthésiant (pendant 10 minutes maximum) puis recevront une administration par voie nasale de deux solutions (faible volume par narine ; en 10 minutes par souris). 48 heures séparent les 2 administrations. D’autres souris juvéniles puis adultes recevront par administration intrapéritonéale les deux solutions. 48h sépareront les deux administrations. La mesure des variables ventilatoires chez les souris juvéniles et adultes sera réalisée de façon non invasive pendant 60 min (1 fois par jour pendant 2 jours) dans une enceinte hermétiquement fermée et alimentée par un flux d’air en continu. Une biopsie caudale (au niveau de la queue, inférieure à 2 mm) est réalisée chez les souris nouveau-nées, juvéniles et adultes pour génotypage.
Impact sur les animaux
Le prélèvement caudal réalisé une unique fois chez l’animal pour la détermination de son génotype apparaît comme une source de douleur et de stress. Les données de la littérature mettent en évidence une sensibilité exacerbée à l’anesthésie chez ces souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine ce qui conduit à un risque accru de défaillance respiratoire. L’administration intranasale des deux solutions peut entraîner une altération de la ventilation par obstruction des voies aériennes supérieures, sous anesthésie générale. L’administration intrapéritonéale (au niveau de l’abdomen) des deux solutions apparaît comme une source de douleur/un stress de courte durée.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin des actes en vue des prélèvements et analyses nécessaires.
Remplacement
L’utilisation de neurones isolés en culture ne permet pas d’appréhender les relations entre les structures neuronales et de mettre en évidence le développement de réseaux substitutifs nécessaires à la correction de la pathologie. La fonction respiratoire nécessite l’utilisation de modèles murins ex vivo et in vivo. Le projet nécessite d’avoir accès à la commande centrale respiratoire et aux neurones qui élaborent cette commande, dans des conditions qui ne peuvent être obtenues autrement que par un travail réalisé à partir de souris vivantes. L’étude de l’influence d’agents anti-agrégats sur la commande centrale respiratoire nécessite de conserver ex vivo un réseau vivant et fonctionnel de neurones et donc l’utilisation de souriceaux. L’étude des corrections des variables respiratoires par le(s) agent(s) anti-agrégats ne peut être réalisée que sur des souris vigiles, non contraintes et non anesthésiées.
Réduction
Nous utilisons aussi bien les souris mâles que les femelles (1182 animaux au total) dans nos travaux afin de limiter le nombre d’animaux mutants et sauvages (contrôles). La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et permet de mettre en évidence des différences biologiquement significatives dans les variables respiratoires. Des tests statistiques seront réalisés a posteriori pour procéder à une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes. L'isolement est évité au maximum. Le milieu des animaux est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. Cependant il est possible que certains animaux se retrouvent isolés pour des contraintes zootechniques (agression entre congénères, etc...). Dans ce cas, la structure chargée du bien-être animal sera toujours sollicitée pour trouver la solution la plus adaptée et la moins contraignante pour les animaux (enrichissement supplémentaire si l’isolement est validé, possibilité de rassemblement, etc.). L’habituation aux enceintes de pléthysmographie (technique permettant de mesurer de manière non invasive la ventilation de la souris in vivo) se traduit par la disparition des épisodes d’augmentation anormale de la fréquence respiratoire et de toilettages des souris lorsqu’elles sont dans un nouvel environnement. Après 5 jours d’habituation, les souris sont calmes et leur respiration est régulière dès le placement dans l’enceinte. Les souris mutantes présentent une sensibilité exacerbée à l’anesthésie ce qui conduit à un risque accru de troubles respiratoires mortels lors des administrations intranasales sous anesthésie. De ce fait, lors de ces administrations sous anesthésie, une surveillance accrue en continue du rythme cardiorespiratoire est assurée par l’expérimentateur jusqu’au réveil complet de la souris. En cas de défaillance cardiorespiratoire, l’anesthésie est stoppée, la souris est réanimée si nécessaire.
Choix des espèces
Les rongeurs (rats et souris) sont depuis de nombreuses années les espèces animales de choix pour l’étude des mécanismes associés à la genèse et à la régulation de la respiration par la commande centrale respiratoire. Le modèle animal de la pathologie sur laquelle nous travaillons, n’existe, de nos jours, que sur modèle de souris mutées pour un gène, présent sur des neurones impliqués dans la sensibilité au dioxyde de carbone (hypercapnie). Ces souris mutantes ont été validées par des études antérieures. Le projet nécessite d’avoir accès à la commande centrale respiratoire dans des conditions qui ne peuvent être obtenues que par un travail sur les souris mutantes et leur contrôle, des souris sauvages ; étude de l’influence des agents anti-agrégats sur la commande centrale respiratoire ex vivo ; étude de la ventilation chez l’animal juvénile et adulte vigil et de l’effet sur la respiration des agents anti-agrégats appliqués par administration intranasale et par injection intrapéritonéale.
Étude de la biologie du parasite responsable du paludisme et développement de vaccins anti-paludéens à l’aide de modèles murins
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
6 312 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, et chacune peut subir un prélèvement d'une goutte de sang au bout de la queue jusqu'à une fois par jour pendant 20 jours consécutifs. Toutes sont infectées par des parasites du paludisme, injectés dans la patte, une veine ou l'oreille, ou transmis par des piqûres de moustiques, et une partie reçoit des candidats vaccins par injections répétées. Certaines sont opérées : ouverture de l'abdomen pour filmer le foie sous une anesthésie maintenue jusqu'à la mise à mort, ou, avec réveil, pose d'un anneau en titane dans l'abdomen, ablation de la rate ou greffe de peau humaine. L'équipe espère en tirer, à terme, un vaccin contre la première phase de l'infection. Les souris infectées sont tuées avant l'apparition de la prostration, du poil altéré ou de la perte de poids, signes que le parasite se multiplie sans contrôle dans leur sang.
Objectifs
Notre but majeur est la compréhension fonctionnelle des interactions parasite-hôte qui surviennent lors de cette phase initiale de l’infection palustre dans le but ultime de développer un vaccin anti-paludique pré-érythrocytaire. A cet effet, nous utilisons une combinaison d’outils de génétique moléculaire, de biologie cellulaire et d’imagerie intra-vitale afin de comprendre comment l’animal est infecté et comment il monte une réponse immunitaire protectrice contre le parasite. Tous ces sujets doivent être abordés in vivo, en utilisant l'expérimentation animale, car la complexité de l'infection et de l'immunité ne peut être reproduite in vitro. Par conséquent, en utilisant principalement P.berghei et P.yoelii dans un modèle murin de paludisme, notre travail se décline selon trois axes majeurs : 1. Imagerie fonctionnelle de la phase pré-érythrocytaire de l’infection. 2. Compréhension de la mise en place de la protection contre la phase pré-érythrocytaire 3. Développement préclinique d'un vaccin pré-érythrocytaire contre le paludisme.
Bénéfices attendus
Dans ce projet nous espérons (i) mieux comprendre les premières étapes de l’infection en utilisant des approches de biologie cellulaire et moléculaire ainsi que la microscopie intra-vitale pour identifier les composants essentiels du parasite susceptibles de constituer des cibles pour de nouveaux médicaments et vaccins, (ii) mieux comprendre comment une immunité protectrice contre le parasite peut se développer et identifier de nouvelles cibles vaccinales, et (iii) développer pré-cliniquement un vaccin plus efficace contre le paludisme.
Procédures
Afin d’identifier et d’évaluer l’activité protectrice de nouvelles cibles vaccinales ou de nouvelles approches vaccinales et d’élucider leur mécanisme d’action, les souris impliquées dans cette procédure expérimentale pourront être soumises à des injections sous-cutanées (15 sec), intrapéritonéales (15 sec), intramusculaires (15 sec) ou intraveineuses (30 sec) ainsi qu’à des prélèvements sanguins et un ou plusieurs challenges infectieux par des parasites de Plasmodium. Bien que susceptibles d’être répétées, ces manipulations sont toutes considérées de sévérité légère et seront, de plus, suffisamment espacées dans le temps pour limiter le stress infligé aux animaux. Pour infecter les souris vigiles, le parasite sera micro-injecté dans le coussinet plantaire (15 sec) ou par la voie intraveineuse (30 sec). Les souris anesthésiées seront infectées par micro-injection dans la peau du pavillon auriculaire (15 sec) ou par des piqûres de moustiques infectés. Après infection, la parasitémie des animaux est contrôlée par frottis sanguins ou cytométrie en flux, à partir d’une goutte de sang prélevée à l’extrémité de la queue (30 sec). Pendant la phase de croissance exponentielle du parasite, qui se produit normalement entre le 3ème et le 6ème jour post-infection. Alternativement, l’infection hépatique sera mesurée de manière non invasive dans le foie disséqué. Des souris anesthésiées seront soumises à un acte chirurgical sans réveil (20 min) pour réaliser l’imagerie à court terme dans le foie ou la rate. Des souris anesthésiées et analgésiées seront soumises à un acte chirurgical avec réveil pour l’implantation abdominale d’un anneau en titane (imagerie longitudinale – foie, rate) (45 min), pour une splenectomie (45 min), ou pour la greffe de la peau humaine (30 min) (imagerie longitudinale de Plasmodium falciparum – peau).
Impact sur les animaux
Le rongeur vigile pourra souffrir de l'inconfort causé par des injections (intrapéritonéale, sous-cutané, intramusculaire, intraveineuse), par la micro-injection dans la peau, ainsi que par le prélèvement d'échantillons de sang à la queue, au menton ou à la joue. Bien que susceptibles d’être répétés, les prélèvements seront suffisamment espacés dans le temps pour limiter le stress infligé aux animaux : les prélèvements de sang au niveau d’un même site (joue, menton, veine caudale) seront espacés au minimum d’une semaine et les prélèvements d’une goutte de sang à l’extrémité de la queue pourront être répétés au plus quotidiennement pendant 20 jours consécutifs mais en aucun cas le volume prélevé n’excèdera le maximum par période glissante de 7 jours. Les animaux infectés par le parasite seront mis à mort avant l'apparition des symptômes du paludisme expérimental. Le rongeur anesthésié pourra être exposé à des injections intrapéritonéale, sous-cutané, intramusculaire, ou intraveineuse, ainsi que à de micro-injection dans la peau et à de piqûre des moustiques. Toutes ces procédures sont classifiées comme étant de sévérité légère. Pour l’imagerie intravitale du foie à court terme sans réveil, la souris anesthésiée sera soumise à une laparotomie avant la séance d’imagerie. Pendant la séance d'imagerie la souris sera maintenue constamment anesthésiée jusqu'à sa mise à mort à la fin de l'expérience. Pour l’imagerie intravitale à long terme du foie, de la rate, ou de la peau humaine greffée, l'intervention chirurgicale pour l'implantation d'un anneau d'imagerie ou de la greffe sera réalisée sur des souris anesthésiées. Des analgésiques seront utilisés pendant l’opération et les soins post-opératoires. Pendant la séance d'imagerie les souris seront maintenues constamment anesthésiées. Les procédures impliquant un acte chirurgical avec réveil sont classifiées comme étant de sévérité modérée.
Devenir
Toutes les souris utilisées dans les procédures expérimentales seront infectées par des parasites type Plasmodium. Il ne sera donc pas possible de les maintenir en vie ou les reutiliser. Les souris seront mises à mort avant la phase symptomatique du paludisme. Seulement méthodes de mis à mort validées par le comité etique seront utilisées.
Remplacement
Les processus conduisant à l'infection de l'hôte par les différents stades parasitaires ou à la protection de l'hôte contre ces stades par le biais de la vaccination sont extrêmement complexes. Dans la phase initiale de l’infection, ils impliquent des interactions multiples et dynamiques entre le parasite et plusieurs types cellulaires dans la peau, les ganglions, les vaisseaux, le sang, la rate et le foie, qu'il est impossible de répliquer dans leur ensemble dans un système in vitro. L’étude approfondie de cette phase nécessite donc l’utilisation de modèles animaux pour appréhender cette incroyable complexité. Depuis les années 1950, les espèces de Plasmodium qui infectent les rongeurs, P. berghei et P. yoelii, sont devenues les espèces de choix pour étudier cette phase, et ont notamment permis la découverte des candidats vaccins les plus importants contre le paludisme. Pour évaluer les activités cellulaires des sporozoïtes (motilité, traversée cellulaire, infection cellulaire), et les effets neutralisants des effecteurs immunitaires ou antipaludiques, les expériences seront effectuées in vitro. Malheureusement, certains effets observés in vitro ne correspondent pas à ce qui est observé in vivo, nous obligeant à valider les résultats obtenus in vitro dans des modèles expérimentaux animaux.
Réduction
Nous utilisons le nombre minimum possible d’animaux pour nos expériences calculé à l'aide du logiciel SHADE qui compare deux moyennes de groupes non jumelés à l'aide d'un test bilatéral paramétrique, en tenant compte des données expérimentales. Pour l’analyse statistique de nos expériences, nous appliquerons un test ajusté pour comparaison multiple. Nous normaliserons les tests statistiques sur un effet "répétition/cage" grâce à l'utilisation de modèles mixtes. Également, nous rechercherons toujours à réduire ce nombre en améliorant les procédures, par exemple, en développant des méthodes d'imagerie intravitale non invasive pour diminuer le nombre de souris utilisées dans les études longitudinales.
Raffinement
Nos points limites sont établis de manière à éviter la phase symptomatique du paludisme chez les animaux infectés. Les souris auxquelles sont inoculées les espèces de Plasmodium adaptées aux rongeurs de laboratoire sont suivies quotidiennement durant la phase sanguine de l’infection afin de déterminer leur niveau de parasitémie. Les animaux sont mis à mort avant que n’émergent des symptômes signant des dommages systémiques – prostration, aspect du pelage, perte de poids - et témoignant du développement asexué non contrôlé du parasite dans le sang. Il est important de souligner que la phase de l’infection que nous analysons est asymptomatique, et que lorsque les procédures expérimentales nécessitent d’atteindre la phase érythrocytaire de l’infection, les animaux sont sacrifiés avant la survenue de symptômes ou complications létales- neuropaludisme, anémie prolongée. Enfin, les interventions potentiellement douloureuses sont gérées par l'utilisation d’anesthésiques et antalgiques.
Choix des espèces
Les hôtes naturels des parasites P. berghei et P. yoelii sont des espèces de rongeurs sauvages (Grammomys, Thamnomys) d’Afrique Centrale. Des isolats de ces parasites ont été transmis et adaptés aux souris et rats de laboratoire depuis de nombreuses années par plusieurs équipes. Il est reconnu dans la communauté scientifique que l’infection des rongeurs avec ces parasites est un modèle biologiquement pertinent pour étudier plusieurs aspects du paludisme chez l’Homme. La preuve de l’intérêt d’une recherche rigoureuse chez le rongeur pour éclairer ou informer la recherche chez l’Homme n’est plus à faire. Nous privilégions l’utilisation de souris dans nos études car la plupart des concepts issus des modèles souris, en particulier dans le domaine de la vaccinologie anti-palustre, se sont révélés exacts chez l’Homme. De plus, la disponibilité de diverses souris transgéniques rend cette espèce adaptée aux études fonctionnelles des voies impliquées dans l'infection et la protection de l'hôte. Les inoculations de parasites aux souris seront réalisées sur de jeunes adultes de 4 semaines car ils ne sont pas immunocompétents, ce qui favorise l’infection par le parasite. Les expériences d’imagerie in vivo seront réalisées sur des souris de 4-12 semaines. Les expériences sur les réponses immunitaires seront réalisées sur des souris adultes immunocompétentes âgées de plus de 6 semaines.
Validation de l’efficacité des molécules candidates pour prévenir la fibrose myocardique dans un modèle murin d’insuffisance cardiaque.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
660 souris vont être utilisées, 640 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 20 un niveau modéré, toutes tuées à l'issue pour peser leur cœur, leur foie et leurs poumons. Une partie subit un rétrécissement chirurgical de l'aorte destiné à provoquer une insuffisance cardiaque, les témoins ayant la cage thoracique ouverte sous anesthésie sans autre geste. Suivent deux échographies d'une demi-heure, trois prélèvements de sang à la queue et une injection intrapéritonéale quotidienne pendant 21 jours. Le porteur écrit que le remodelage cardiaque et l'insuffisance cardiaque ne provoquent pas de douleur chez ces souris, alors que 640 d'entre elles sont déclarées en souffrance sévère.
Objectifs
L'insuffisance cardiaque (IC) se développe suite à l’accumulation de multiples altérations dénommées remodelage, induites par un stress pathologique. Les avancées thérapeutiques permettent de ralentir cette progression vers l’IC et parfois de lever le stress cardiaque initial. Cependant de nombreux patients voient leur fonction cardiaque décliner inexorablement ou secondairement. Des études récentes conduites chez l'Homme et chez l’animal ont montré que suite à une pathologie cardiaque transitoire, certaines lésions accumulées initialement s’estompaient constituant un processus de remodelage inverse. L’analyse au niveau moléculaire de ce processus indique que cette inversion correspond à un nouvel état plutôt qu’à un retour à la normale. Ces données sont cohérentes avec la description clinique d’altérations tardives après une prise en charge efficace dans un premier temps. Ce retentissement à long terme sera probablement de plus en plus fréquent avec le vieillissement de la population. Le projet vise à identifier, in vivo dans un modèle murin, des acteurs moléculaires susceptibles de favoriser une récupération plus complète et durable lors de la prise en charge de la dysfonction cardiaque. A ce jour, les recherches précliniques se sont concentrées sur la caractérisation du remodelage inverse précoce ou sur des aspects restreints du remodelage inverse tardif, uniquement chez les mâles. Le projet permettra de compléter ces études, d'avoir des données en fonction du sexe et de proposer des stratégies thérapeutiques complémentaires et de tester les plus prometteuses. Sur la base d'un modèle murin bien caractérisé de pathologie cardiaque, plusieurs études seront conduites : 1) une caractérisation moléculaire approfondie de coeurs en phase de récupération comparés à des coeurs sains et malades. Cette approche sans à priori, par séquençage des gènes exprimés dans ces différentes conditions permettra de décrire les évènements moléculaires et de générer de nouvelles hypothèses d'intervention. 2) L'établissement d'un modèle cellulaire permettrait de réduire les animaux utilisés pour cibler des traitements potentiels. 3) la modification de la trajectoire du vieillissement, après une chirurgie de construction de l'aorte transverse (TAC), sera évaluée par un suivi régulier des groupes d’animaux. 4) essais précliniques d’interventions médicamenteuses favorisant la limitation voir la regression de la fibrose sur la base des résultats préliminaires au sein du laboratoire.
Bénéfices attendus
Le projet s'inscrit dans les recherches expérimentales pour l'amélioration future de la prise en charge et du traitement de pathologies humaines et le maintien en bonne santé. Il s'intéresse à une cause majeure de morbimortalité dans les pays dits développés, les maladies cardiovasculaires. Il se penche sur un aspect nouveau de l'atteinte cardiaque, les altérations persistantes malgré les progrès de la prise en charge. A long terme chez l'Homme, la description de cette atteinte et la compréhension de ses mécanismes pourraient permettre de favoriser un vieillissement en meilleure santé et aussi de cibler des mécanismes pathologiques nouveaux lors dutraitement. Le projet déploit les dernières avancées technologiques pour une meilleure description moléculaire des altérations, une évaluation fonctionnelle approfondie et des essais précliniques de test d'interventions thérapeutiques. A plus court terme, la faisabilité d'une mise en place d'un modèle in vitro de fibroblastes activés sera testée. Ce type cellulaire participe de manière importante à l'altération du muscle cardiaque en synthétisant en son sein une matrice rigide responsable de défauts mécaniques et électriques cardiaques. Cette altération de la matrice est en partie irréversible et peu soumise au remodelage inverse. Il est donc important de rechercher des moyens d'intervention sur cet aspect. Un résultat positif sur ce point permettra de diminuer le nombre d'animaux nécessaires.
Procédures
Les animaux subiront à 2 reprises une échographie de 0.5 heure par souris (état basal avant chirurgie, puis aprés 4 semaines de TAC - La chirurgie de TAC est réalisée à une seul moment soit à 3 mois pour le groupe jeune soit à 22 mois pour le groupe âgé. Les groupes contrôles ne subiront pas de chirurgie cardiaque mais une ouverture de la cage thoracique et une anesthésie également- les prélèvements sanguins de peptides natriurétiques de type B ou bien de son précurseur seront réalisés sur prélèvement sanguin de la queue tous les 15 jours aprés la chirurgie et ce jusqu'à l'euthanasie, soit 3 prélèvements (J0, J15 et J28). Les administrations intrapéritonéales des médicaments ou du véhicule (PBS stérile pour éviter la quantité de DMSO) seront réalisées tous les jours vers 10 h du matin +/- 1 h pendant 21 jours à partir du 5 eme jour aprés la chirurgie. 4 semaines aprés la chirurgie (1 semaine de récupération de chirugie puis 3 semaines d'administration en IP) les animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Les échographies cardiaques sont réalisées sous anesthésie gazeuse (1,5% isoflurane) pour diminuer le stress (nuisance légèrer), un tapis chauffant, et un monitoring global de l'animal pour sa surveillance tout au long de l'examen seront mis en place. L'anesthésie lors de l'échographie et de la chirurgie peut comporter des risques de detresse respiratoire (nuisance sévères) et de trouble du rythme cardiaque (nuisance sévère) mais le monitoring permettra de diminuer ces risques et de réagir en diminuant les débits de gaz. Nuisance du modèle TAC: Les chirurgies comportent toujours un risque. Elles constituent les sources potentielles de douleur (nuisance modéré) et toutes les mesures d'anesthésie et d’analgésie décrites dans les procédures permettent de prévenir et d'éviter la douleur. Les lésions accidentelles associées à la chirurgie sont des lésions des gros vaisseaux induisant des pertes de sang importantes (nuisance sévères). Dans ce cas, la récupération étant compromise, le chirurgien procède à l’euthanasie de l’animal. Dans ce modèle, le remodelage cardiaque et l'insuffisance cardiaque ne provoquent pas de douleur mais un essoufflement des animaux et une diminution de leur capacité de se mouvoir (nuisances légères), une surveillance est cependant mise en oeuvre quotidienne pour vérifier qu'il n'y a pas de prostration des animaux. L'âge n'est pas connu pour être associé à une nuisance chez les souris en cage sans stress particulier. L'administration des candidats médicaments seuls ont déjà été administrés chez les animaux de laboratoire et ont montré une bonne tolérance, de la même manière que l'administration chez l’Homme . L'administration par voie intrapéritonéale sera réalisée quotidiennement à l'aide d'une aiguille de 29 gauges (nuisance modérée). Les nuisances de l'administration en IP peut être une inflammation au point d'injection, une rougeur, et une induration mais ces effets sont rares. Le DMSO est un véhicule irritant (douleur et nécrose cutanée) mais sera dilué avec du PBS stérile et sa concentration sera diminué conformément aux recommandations : pas plus de 50% de la dose administrée sera du DMSO. Les animaux seront injectés au côté droit conformément aux recommandations actuelles. Une administration de lidocaïne en IP à 1mg/kg sera réalisée si un animal présente des signes de prostration immédiate apres l'IP des candidats médicaments.
Devenir
A l'issu des temps prévu d'étude (4 mois et 22 mois), les animaux seront euthanasiés pour analyse histologique, le poids du coeur,le poid du foie, poid des poumons et le contrôle des autres organes.
Remplacement
Le mécanisme du remodelage cardiaque aboutissant à l'insuffisance cardiaque (IC) en réponse à un stress implique tous les types cellulaires constitutifs du tissu mais aussi le recrutement de cellules, en particulier inflammatoires et l’interaction avec d’autres organes (rein, système nerveux, …). L’IC est donc une pathologie touchant tout l’organisme rendant indispensable une approche in vivo. De manière analogue, le remodelage inverse nécessite la même approche. De plus, le meilleure critère d'évaluation de la fonction cardiaque est la capacité physique à l'image de ce qui est réalisé chez l'Homme (périmètre de marche, épreuve d'effort). Ce type d'exploration intégrée n'est possible que chez l'animal.
Réduction
Concernant la mise en place des modèles, les techniques utilisées correspondent au dernier développement publié pour permettre une diminution de la variabilité du remodelage ce qui entraîne une diminution du nombre d’animaux comparativement à la technique historique. Cette approche in vivo est complémentaire d’études in vitro qui seront conduites en parallèle et en complément. La culture de fibroblastes permettra d’établir un modèle ex vivo pour tester des cibles potentielles avec moins d’animaux que les tests in vivo. Enfin, les interventions thérapeutiques candidates pour améliorer la prise en charge seront testées chez les animaux. Le mode de calcul des animaux est basé sur la population la plus faible pour montrer un effet. Notre baisse attendue du niveau de fibrose est de 10%, le risque de première espèce alpha est fixé à 0.05, le risque beta de deuxième espèce est fixé à 0.1, la puissance du test (1-beta) est donc à 0.9 . La variabilité de notre mesure de fibrose est de 2%. Selon le logiciel R en ligne (BiostatTGV) le calcul du nombre d'animaux total à inclure est de 600. Le nombre de groupes se base sur l'effet des 2 molécules seules et de leur synergie possible et attendue (résultats préliminaires du laboratoire sur des cultures in vitro). De plus, le sexe des animaux semble jouer un rôle dans la physiopathologie de l'insuffisance cardiaque donc nous avons prévu de mener les expérimentations sur les 2 sexes, ceci augmente le nombre d'animaux mais nous semble nécessaire. Deux séries d'experimentation sont prévues. Les tests choisis seront des t test pour des variables continues à distribution normale et des test de Mann et Whitney pour des tests non paramétriques.
Raffinement
Les interventions susceptibles d’induire la douleur sont bien identifiées : l’approche chirurgicale d’induction de la sténose est réalisée sous anesthésie générale. Lors de ces interventions, l’analgésie locale en complément d’une analgésie générale (morphinique) permet de prévenir la douleur. De plus, les chirurgies seront réalisées par un chercheur rompu à la technique permettant des opérations rapides et des ouvertures minimales diminuant les risques opératoires et participant à une meilleure récupération. Les derniers développements de la technique chirurgicale qui rapportent un meilleur taux de succès seront mis en oeuvre. Le suivi est renforcé dans la période post-opératoire (48 h), l'analgésie est poursuivie et les animaux disposent d'aliments spécifiques, dédiés à la récupération. Il n’y a pas de source de douleur aprés la phase aigue post chirurgie. Le remodelage induit est silencieux mais malgrés cela, les animaux sont suivis quotidiennement. Les stress potentiels associés aux procédures sont de faible intensité, de courte durée (anesthésie/reveil) et espacés dans le temps. Cependant, si la surveillance quotidienne des animaux met en évidence, un arrêt du toilettage, une prostration et ou une perte de poids de plus de 10%, les animaux peuvent être euthanasiés plus tôt, car leur état sera jugé douloureux et non acceptable. Aprés la réalisation de l'administration intra péritonéale un massage est infectué au site d'injection pour diminuer la douleur. Si besoin, et devant des signes de douleurs visibles comme la prostration, un accident à type d'embol veineux ou arteriel sera supposé et une administration IP de lidocaïne sera réalisée pour diminuer la douleur à 1mg/kg. Ces animaux seront surveillés jusqu'à résolution du signe clinique. Les animaux sont par ailleurs hébergés dans un environnement enrichi (nidification) et les groupes sociaux sont conservés tout au long de l’étude. Un suivi quotidien est réalisé par le zootechnicien qui permettra d'intervenir le plus rapidement possible sur l'intervention de blessure ou autre problèmes post opératoire.
Choix des espèces
Le modèle souris est en grande majorité utilisé pour les études précliniques. Les connaissances acquises par la communauté scientifique sur cette espèce, toutes nécessaires à tirer le plus d'information à partir du présent projet, permettent l'analyse fine de l'expression génique et l'exploration de la physiologie cardiovasculaire. De plus, il s’agit de l’espèce pour laquelle les modifications génétiques sont les plus aisées actuellement, permettant de tester plus aisément les hypothèses scientifiques. Elle combine donc les avantages d’être de la même classe que l’Homme. Les animaux seront utilisés majoritairement à l’âge de jeune adulte (à partir de 3 mois) car les pathologies étudiées sont, le plus souvent, des pathologies acquises. L’utilisation d’animaux jeunes est en revanche éloignée de la situation clinique mais permet une bonne récupération des procédures expérimentales chirurgicales et donc une bonne qualité de vie.
Evaluation des effets neurotoxiques d’une exposition périnatale aux Pyréthrnoïdes sur le cerveau
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des souris femelles gestantes respirent un insecticide pyréthrinoïde huit heures par jour, du douzième jour de gestation jusqu'à la naissance de leur portée, et jusqu'à sept jours au-delà. 258 souris, mères et petits, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leur cerveau. Le porteur attend chez les mères des troubles digestifs, une hyperventilation, des déficits moteurs et des symptômes de type parkinsonien ou épileptique, et chez la descendance une mortalité accrue à la naissance ou un syndrome de type autistique, qui constitue précisément l'hypothèse testée. Les petits passent ensuite l'open field, la croix surélevée et le test d'interaction sociale à trois chambres, et le porteur affirme que reproduire une exposition par inhalation impose l'"organisme entier".
Objectifs
La prévalence de l'autisme ne cesse d'augmenter à l'échelle mondiale, devenant un problème de santé publique non négligeable. Les composantes environnementales ont un plus fort impact que les facteurs génétiques dans l'apparition de troubles du spectre autistique (TSA). Parmi elles, on retrouve les pesticides, néfastes pour les nuisibles mais également pour l'Homme dans le stades précoces du développement. En effet, diverses études épidémiologiques (Etats-Unis, France, Royaume-Uni...)) montrent une utilisation durant la dernière décennie de pesticides mais plus précisément d'insecticides à usage domestique dans 70 à 95% des cas. Ces produits sont retrouvés majoritairement sous forme de pulvérisateurs avec pour la plupart, comme substance active : les Pyréthrinoïdes (insecticides). Ainsi, une exposition aux pyréthrinoïdes pendant la période périnatale augmente le risque d'apparition de TSA, au travers d'un contact entre le pesticide et le foetus par l'intermédiaire de la mère qui l'inhale. Les agences environnementales alertent également sur leur utilisation intensive en air intérieur, notamment par les femmes enceintes car dans la société actuelle, la majorité de la population passe plus de 80% de son temps dans un environnement clos, taux augmentant à 95% pour les femmes enceintes. Nous avons précédemment montré que les concentrations de pyréthrinoïdes domestiques dans l'atmosphère intérieure sont 1000 fois plus élevées qu'à l'extérieur et que l'application aiguë de pyréthrinoïdes modifie l'activité électrophysiologique (activité électrique) des neurones des mammifères. Nous supposons qu’une exposition prénatale aux pyréthrinoïdes perturbe la séquence de développement des réseaux neuronaux et la synaptogenèse (connexions nerveuses), entraînant une altération durable des comportements sociaux et cognitifs. Nous sommes un consortium de neurobiologistes et de chimistes de l'atmosphère qui modéliseront l'exposition environnementale aux pyréthroïdes humains chez la souris. Nous focaliserons notre étude sur la deltaméthrine, un pyréthrinoïde de type II car il est le plus fortement détecté dans l'air ambiant ; l'Agence Française ANSES le classe parmi les 32 substances prioritaires ; enfin, il cible les récepteurs GABA et l'altération de la neurotransmission GABAergique est un mécanisme physiopathologique des TSA.
Bénéfices attendus
Face à l'orientation pandémique actuelle des TSA, la recherche doit aller au-delà des facteurs génétiques, sachant que les produits chimiques industriels largement disséminés dans l'environnement sont des contributeurs importants à cette pandémie. La nature innovante du projet est de démontrer le lien neurobiologique avec les preuves émergentes d'une association entre l'exposition prénatale à la pollution par les pyréthrinoïdes et l'apparition des TSA. Dans ce contexte, l'utilisation croissante d'insecticides ménagers commerciaux dans les atmosphères intérieures soulève des questions en raison des propriétés potentiellement dangereuses des substances actives pour la progéniture, étant donné que le niveau et la durée d'exposition à ces produits chimiques sont susceptibles d'être significatifs. La modélisation de cette exposition subaigue sur un modèle animal apportera donc des avancées importantes quant à la neurotoxicité des pyréthrinoïdes sur le cerveau en développement.
Procédures
Aucune intervention invasive ou chirugicale ne sera conduite sur les animaux. Les femelles gestantes seront exposées 8h/ jour à minima 7 jours (du stade embryonnaire jour 12 (E12) de gestation à la naissance de la portée) et jusqu'à 14 jours (du stade E12 de gestation à la naissance de la portée + 7 jours de vie). Cette procédure sera conduite à deux doses; l'une représente une dose mesurée en air intérieur (1µg/m^3) et l'autre une dose mesurée en air extérieure (10 ng/m^3). Des tests comportementaux seront effectués, à savoir : Les milestones entre les âge 3 et 15 jours afin de percevoir la présence de déficits sensori-moteurs caractéristiques des troubles autistiques pour une durée de 30 minutes par jour et par portée. Les enregistrements de vocalisations seront réalisées pendant 5 minutes sur des animaux âgés de 8-10 jours. Les tests comportementaux suivants seront réalisés sur des animaux âgés de 21 à 48 jours : le test de l'Open Field (10 minutes); la croix surélevée (5 minutes) et enfin le test d'interaction sociale à trois chambres (40 minutes).
Impact sur les animaux
Des effets indésirables sur les mères gestantes pourront être observés suite à l'inhalation de pyréthrinoides de type 2 : troubles digestif, hyperventilation, déficits cognitifs et moteurs avec symptomes de type parkinson ou de C-S syndrome (épilepsies). Les effets indésirables liés à l'exposition subaigue de l'insecticide sur la descendance sont une augmentation de la mortalité à la naissance ou un syndrome de type autistique ce qui est l'hypothèse de notre étude. Les tests comportementaux seront une source de stress engendrée par la séparation maternelle et les manipulations que nous prendrons en compte.
Devenir
L'ensemble des animaux seront sacrifiés dans la dernière étape de la procédure pour récuperer leur cerveau et permettre les analyses electrophysiologiques ou biochimiques.
Remplacement
L'objectif du projet étant de mimer l'exposition humaine par inhalation des insecticides sur un modèle animal afin de mesurer la neurotoxicité sur le comportement ainsi que sur l'activité nerveuse, ce projet ne peut pas être envisagée hors du contexte intégré retrouvé au sein de l’organisme entier. En ce sens, ces connaissances de l'impact de l'environnement sur le développement cérébral ne peuvant pas être transposées sur des modèles ex-vivo ou organoïdes, le remplacement n’est donc pas possible.
Réduction
Un plan d’expérience sera systématiquement rédigé avant les expérimentations dans un souci permanent d’optimisation du nombre d’animaux. Aucune étude antérieure n’a été menée sur ce projet auparavant. Nous envisageons l'utilisation de tests statistiques non paramétriques (Wilcoxon-Mann-Whitney, ANOVA 1 facteur - Kruskal Wallis, ANOVA 2 facteurs ) afin de limiter le nombre d’animaux utilisés dans cette étude.
Raffinement
Les expériences seront conduites sur un seul modèle animal et une seule souche : souris de type sauvage. Le bien-être des animaux, qu'il s'agisse des souris gestantes comme de leur progéniture exposée à l'insecticide, sera évalué régulièrement (croissance staturo-pondérale, aspect général, comportement). Les mères et leur nouveau-nés seront hébergés sous environnement contrôlé, dans une cage d'exposition aux insecticides avec un environnement enrichi d'igloos cartonnés et de mini-rouleaux de papier foisonnant permettant aux femelles de faire des nids, et avec la possibilité de boire et manger ad libitum. Afin de réduire la souffrance des expositions, celles-ci seront appliquées par inhalation et à des doses contrôlées par des mesures permanentes du taux d'insecticide (1µg/m^3 et 10ng/m^3). Les expériences de comportement sur la progéniture seront conduites uniquement en situations aigües et non chroniques. Afin de limiter leur stress, la salle de comportement est équipée d'un tapis chauffant, d'une lumière tamisée, d'un contrôle de la température. La pièce est silencieuse et ventilée. Le manipulateur frottera ses gants dans la sciure pour ne pas perturber les animaux par ses odeurs. Nous mettrons en place les points limites suivants: pour les femelles gestantes nous observerons la détérioration de l'apparence de l'animal, des difficultés respiratoires sévères et prolongées, la léthargie de l'animal (immobile, ne répondant pas aux stimuli), la perte de poids excessive (supérieure à 20% de son poids initial), diarrhée et température (suivi par caméra thermique). En fonction du score de l'animal (Annexe 3), les interventions seront : à surveiller (score de 3 à 5), demander un second avis et considérer l'euthanasie (score de 5 à 7) et souffrance sévère, prévoir l'euthanasie (score de 7 à 9). En ce qui concerne les descendants, les points limites seront l'apparition de troubles respiratoires (la cyanose), l'hypotonie néonatale, la perte de poids, et la prise de lait (visualisée au niveau de l'estomac).
Choix des espèces
Nous avons sélectionné la Souris pour plusieurs raisons: - L'objectif étant de reproduire l'exposition perinatale et par inhalation des femmes à un insecticide répandu, nous devons rester sur un modèle mammifère - Afin de pouvoir contrôler au mieux les concentrations d'expositions tout en considérant le bien être animal nous avons réalisé une chambre d'exposition dont le volume (30l) est approprié pour les rongeurs. - L'équipement que nous possédons sur notre plateforme comportementale afin de rechercher un phénotype autistique est adapté à la souris jeune et adulte et pas complètement au rat. - La période d'exposition (stade embryonnaire 12 à 7 jours post-natal) a été choisie car c'est une période critique pour le développement du système nerveux. Les expériences d'électrophysiologie sont réalisées au 7ème et 20ème jour post-natal afin d'observer la séquence développementale de l'activité excitatrice versus inhibitrice du GABA.
Etude du rôle de l’acide rétinoïque dans la différenciation des cellules germinales chez le foetus
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Gavées deux fois par voie orale sous contention de moins de trente secondes, des souris femelles gestantes sont ensuite tuées pour que leurs fœtus soient prélevés, puis tués à leur tour. 440 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur conclut que la mise à mort des femelles gestantes et de leurs fœtus fait qu'ils ne souffrent pas. Il ajoute qu'aucun ne peut être gardé en vie, réutilisé, adopté ni replacé, les testicules des fœtus mâles étant l'objet même de l'étude, consacrée au rôle de la vitamine A dans leur formation.
Objectifs
La vitamine A est essentielle au développement embryonnaire de tous les mammifères mais son rôle reste à définir dans les différents tissus. Pour agir pendant le développement embryonnaire, la vitamine A est transformée par des enzymes en un métabolite actif qui se fixe ensuite sur des récepteurs nucléaires qui relayent son effet biologique. Les cellules dans lesquelles la vitamine A ne doit pas agir fabriquent d’autres enzymes qui dégradent ce même métabolite. Afin d’étudier et de comprendre le rôle de la vitamine A dans la différenciation des cellules constitutives du testicule chez la souris, nous proposons de comparer des fœtus normaux à des fœtus porteurs de mutations dans les gènes codant les enzymes qui transforment et qui dégradent la vitamine A, ainsi que dans les gènes codant les récepteurs nucléaires, aux étapes clés de la formation du testicule (entre les jours 14.5 et 18.5 post-fécondation).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont de comprendre l’action de la vitamine A et de ses récepteurs nucléaires dans les différentes étapes de différenciation des cellules constitutives de testicule. En découvrant comment la vitamine A agit sur ces évènements chez la souris, nous obtiendrons des pistes pour mieux diagnostiquer (et éventuellement traiter) des pathologies du testicule ou des cas d'infertilité chez l’Homme, qui sont en augmentation constante dans le monde. Comprendre le rôle de la vitamine A dans le testicule au cours du développement peut également fournir des pistes pour développer de nouveaux contraceptifs masculins non chirurgicaux, à condition de bien caractériser et comprendre au préalable tous les mécanismes mis en jeu dans un modèle expérimental comme la souris.
Procédures
Les souris femelles gestantes sont traitées par gavage oral pour permettre la mutation (recombinaison). Il s’agit de deux contentions simples qui durent moins de 30 secondes chacune. Les souris sont ensuite euthanasiées. Après prélèvement (quelques secondes), les fœtus sont euthanasiés.
Impact sur les animaux
La nuisance subie par les femelles gestantes est limitée à la contention et l’administration de substance par gavage. Le gavage oral est utilisé en routine au laboratoire et nous possédons l’expertise requise pour cette expérimentation. Les doses de solution de gavage sont déterminées pour n’induire aucun effet indésirable lié directement à l’ingestion. Immédiatement après le gavage, tout signe de fausse route (par exemple suffocation) sera suivi de la mise à mort immédiate de l'animal. A ce jour, nous n'avons jamais rencontré ce problème. Dans le cadre de ce projet, les femelles gestantes et les foetus sont euthanasiées, de sorte que les femelles gestantes et les foetus ne souffrent pas.
Devenir
Tous les animaux décrits dans ce projet (femelles gestantes et fœtus) sont euthanasiés. Les femelles gestantes sont euthanasiées pour permettre le prélèvement des fœtus. Elles ne peuvent pas être gardées en vie, réutilisées, adoptées ou replacées. Les fœtus sont euthanasiés pour les analyses moléculaires ou sur coupes histologiques. Ils ne peuvent pas être gardés en vie, réutilisés, adoptés ou replacés.
Remplacement
Le testicule est formé de diverses cellules qui ont toutes un rôle essentiel pour la différenciation des cellules germinales. A l’heure actuelle, nous ne sommes pas capables de reproduire in vitro les conditions nécessaires à la formation d’un testicule. En effet, les techniques de culture cellulaire ou d’organoïdes ne permettent pas d'appréhender le développement dynamique du testicule, qui nécessite vascularisation, contexte tridimensionnel et interactions endocrines/paracrines. Par conséquent, l'emploi d’un modèle animal comme la souris récapitulant toutes les étapes complexes de ce processus de développement, est indispensable. Le remplacement par un système in vitro (1er R de la règle des 3R) est impossible.
Réduction
La stratégie des accouplements fait en sorte que parmi des fœtus obtenus, une moitié possède le génotype contrôle pour les allèles conditionnels et l’autre moitié possède le génotype mutant pour les allèles conditionnels. Relever les jours d’accouplement permet d’anticiper la date de mise à mort des femelles gestantes et de prévoir les dissections des fœtus. Utiliser à la fois les fœtus mâles et les fœtus femelles est impossible, puisque nous étudions le testicule. Les nombres de fœtus requis sont calculés au plus juste pour satisfaire aux exigences en matière de qualité des résultats obtenus et à la robustesse de leur validité statistique.
Raffinement
Les étapes expérimentales mises en œuvre engendrent une douleur minime aux femelles gestantes. La qualité de la contention permet d’assurer un gavage efficace et rapide, limitant le stress et la douleur imposés à l’animal par la procédure. Le personnel est formé à cet effet. Les solutions sont amenées à la température ambiante pour limiter l’inconfort de la femelle. Le bien-être des animaux est surveillé tous les jours et toute altération du comportement (souffrance, angoisse) est immédiatement discutée avec les responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) pour prendre les mesures correctives nécessaires (soins, analgésie, euthanasie, le cas échéant). Les animaux seront hébergés par quatre dans des cages comportant différents types d’enrichissement tels qu’un tunnel de transfert et suffisamment de fibres pour la construction de nids afin de leur permettre d'exercer les activités spécifiques à leur espèce.
Choix des espèces
De par sa petite taille, ses nombreuses ressemblances génétiques et physiologiques avec l'Homme, et les facilités de modification de son génome, la souris est un excellent modèle pour appréhender la physiopathologie des maladies humaines. Par ailleurs, le développement embryonnaire normal du testicule est décrit très en détail ce qui en fait un modèle de choix. Nous utilisons une approche de génomique fonctionnelle pour laquelle la souris est particulièrement bien adaptée. Tous les modèles génétiquement modifiés permettant d’étudier la fonction des gènes d'intérêt dans le testicule fœtal des souris sont déjà à notre disposition. Les femelles gestantes sont euthanasiées à différents moments du dernier tiers de la gestation, de sorte que la période de développement du testicule fœtal qui nous intéresse soit couverte.
Etude d’une molécule modulant la réactivité astrocytaire dans un modèle d’allodynie mécanique chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour tester si une molécule empêche la douleur du visage déclenchée par une inflammation, 130 rats Sprague-Dawley vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués ensuite pour le prélèvement de tissus nerveux. Chacun reçoit une injection intrapéritonéale par jour pendant cinq à huit jours sous anesthésie gazeuse, plus une injection sous-cutanée, puis passe chaque jour un test d'allodynie où un filament est appliqué sur sa face. Le porteur qualifie ces mesures de peu douloureuses au motif que l'animal peut se soustraire au filament, et attend de l'expérience qu'elle produise l'hypersensibilité douloureuse recherchée. Les rats qui perdent plus de 15 % de leur poids sont mis à mort.
Objectifs
Lorsque la douleur est chronique ou persistante, elle devient alors pathologique car elle n’offre plus aucun avantage mais provoque au contraire une extrême souffrance. C’est notamment le cas de douleurs inflammatoires qui apparaissent suite à une inflammation du système nerveux périphérique ou central. Parmi les symptômes douloureux, nous nous intéressons à l’allodynie qui correspond à une douleur provoquée par une stimulation normalement non douloureuse, qui peut être déclenchée suite à l’inflammation. Ce phénomène provoque l’activation de plusieurs populations neuronales, mais fait également intervenir les astrocytes, un sous-type de cellules gliales. Cependant, les mécanismes astrocytaires impliqués dans la génèse de l’allodynie en condition inflammatoire au niveau de la face sont peu connus.Nos résultats obtenus jusqu’à présent ont permis notamment de mettre en évidence que l’inflammation induisait une réactivité astrocytaire ainsi qu’une diminution d'un type de canaux astrocytaires. Cependant, la question de comment l’inflammation est capable d’entrainer cette dérégulation du canal astrocytaire, ainsi que la réactivité astrocytaire reste toujours en suspend. Le projet étudiera s’il est possible de prévenir les inflammations sur les canaux astrocytaires et par conséquent la douleur, à l’aide d'une molécule capable de moduler l’expression du gène correspondant à la protéine du canal astrocytaire. Il combinera des approches moléculaires et comportementales, et sera réalisé sur des rats adultes mâles, âgés entre 4 et 8 semaines.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes centraux induisant la dérégulation du canal astrocytaire, impliquée dans les phénomènes d’hypersensibilité douloureuse. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux douleurs chroniques, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont au nombre de 2 : • Injections intra-péritonéales (
Impact sur les animaux
Utilisant un modèle de douleur infammatoire, nous nous attendons au développement d’une hypersensibilité douloureuse lors d'une stimulation tactile. Les résultats obtenus ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux mise à part le développement d'une allodynie faciale suite à une stimulation tactile. La douleur occasionnée à l’animal est estimée comme étant « modérée » (retrait de la face). Ces mesures sont peu douloureuses puisqu’elles consistent en la mesure d’un seuil avec possibilité d’échappement et n'entrainent pas de réactions visibles autres que le retrait moteur de la zone stimulée. Afin de diminuer le stress lié aux tests de comportement et aux injections, les animaux ont une prériode d’adaptation suite à la livraision suivie d'une période d’habituation.
Devenir
A la fin des procédures, les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort pour prélever les tissus nerveux d'intérêts afin de réaliser une analyse protéique.
Remplacement
L’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique. D’après nos connaissances il n’existe à ce jour aucune méthode de remplacement capable d’intégrer tout ces éléments. C’est pourquoi il est nécessaire de réaliser notre étude sur animal entier.
Réduction
Le nombre de rats par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents en tenant compte des divers problèmes que nous pourrons rencontrer au cours des différentes phases expérimentales (problème au moment de la dissection, mauvaise apprentissage lors de l’habituation aux tests comportementaux…). Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif . Cependant, plusieurs étapes sont limitantes donc par il est préférable de prévoir un maximum de 10 animaux par groupe: habituation, injections systémiques,comportement, prélèvements. Pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. Si lors des procédures, 6 animaux sont suffisants, nous n'utiliserons pas plus d'animaux. Des tests statistiques seront utilisés pour déterminer le nombre d'animaux suffisant et nécessaire. Afin de limiter le nombre d'animaux, les études comportementales et moléculaires seront réalisées avec les mêmes groupes.
Raffinement
Les animaux seront stabulés dans des pièces ventilées, thermorégulées (22±1 °C) avec hygrométrie contrôlée. Le cycle de lumière est inversé (lumière de 19h à 7h). L’accès à la nourriture et à l’eau se fait ad libitum et le changement de la litière se fait 2 fois par semaine. Les rats sont placés 3 par cage de 800 cm2 (enrichissement social). Les animaux seront utilisés avant d'atteindre un poids supérieurs à 300g. Des rouleaux de cartons sont ajoutés pour pouvoir se cacher et grignoter. La surveillance des animaux se fera quotidiennement par les personnes compétentes du laboratoire conformément à la législation en vigueur. L’expérimentation sera réalisée à parti de 7 jours après réception (période d’adaptation) et après 5 jours d’habituation pour les expériences encomportement. Plusieurs critères seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures, et des points limites ont été établis par une grille de scores. Les animaux seront notamment surveillés quoditiennement lors des différentes procédures. Le poids est mesuré quotidiennement. Si la perte de poids excède 15% du poids initial, les animaux seront mis à mort. Nous regarderons également l’apparence et le comportement (poils ébouriffés, animal prostré, posture anormale, vocalisations, agitation, toilettage). S’il apparait un comportement correspondant aux points limites définis par la grille de scores, alors les animaux seront exclus de l'expérimentation.
Choix des espèces
La souche de rat Sprague-Dawley est couramment utilisée et est la plus adaptée pour les études comportementales dans le domaine de la douleur en santé humaine. Nous utiliserons des animaux entre 5 à 8 semaines (125 à 250 g), pour comparer avec les données du laboratoire.
Traitement de l’encéphalopathie par administration de produits sous forme de dialyse péritonéale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Vocalises spontanées, difficultés respiratoires, incapacité à se retourner, absence de réflexe pupillaire, ptôse palpébrale avec larmoiement : ces signes déclenchent la mise à mort anticipée des rats en phase de décompensation. 3 374 rats vont être utilisés au total, 1 368 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 1 356 un niveau modéré et 650 un niveau léger, tous tués pour l'analyse histologique du foie, des reins et du cerveau. Chacun reçoit jusqu'à 32 administrations de tétrachlorure de carbone, deux par semaine pendant seize semaines, ou subit une laparotomie avec ligature des voies biliaires, avant que des injections de lipopolysaccharide bactérien ou douze administrations d'éthanol ne déclenchent la défaillance hépatique. Le porteur écrit que la décompensation peut inéluctablement conduire l'animal à la mort, et n'appuie l'effectif de 3 374 rats sur aucun calcul.
Objectifs
L'encéphalopathie hépatique (EH) est un syndrome d'altération des fonctions cérébrales dû à une maladie hépatique aiguë ou chronique. Les manifestations peuvent aller de troubles psychiatriques, neurologiques subcliniques jusqu’au coma. Ce syndrome est associé à une morbidité, à un taux de mortalité élevé et nécessite des soins importants. La principale cause de cette pathologie est la cirrhose hépatique qui est caractérisée par la présence de tissus cicatriciels au niveau du foie en réponse à une agression répétée de l’organe.
Bénéfices attendus
La prévalence de l’encéphalopathie hépatique (EH) clinique concerne 30 à 45 % des patients cirrhotiques avec une incidence de 20 % par an. La prévalence de l’EH minime est plus difficilement estimable mais elle pourrait toucher plus de 2/3 des malades. La prévalence de la cirrhose est d’environ 2000 à 3500 cas par million d’habitants, soit en France 700000 cas avec 10 à 15 000 décès par an. Le passage d’une cirrhose compensée vers une cirrhose décompensée est associé à une diminution de la survie à court terme (3-5 ans). La survenue d’une EH constitue un facteur majeur de mauvais pronostic. En effet, le développement d’un premier épisode d’EH au cours de la cirrhose est un facteur de risque indépendant de mortalité avec un taux de survie cumulée à 1 an et 3 ans de respectivement 42 % et 23 %. Ce projet vise donc à bloquer et reverser le processus qui conduit à la mise en place de l’encéphalopathie hépatique et de lui permettre d’avoir accès à une transplantation hépatique (seul recours actuel à la décompensation hépatique).
Procédures
Période d’induction : Décompensation spontanée selon les procédures : Jusqu’à 32 administrations de CCl4 (tétrachlorure de carbone, agent fortement hépatotoxique) à raison de 2 par semaines pendant 16 semaines (15 secondes) ou Chirurgie avec laparotomie et ligature des voies biliaires sous anesthésie générale et couverture analgésique (durée 15’) Pour les études pilotes : un prélèvement de sang final (1 minute) sous anesthésie (3 minutes). Pour les études avec produits : un prélèvement de sang intermédiaire (1 minute) sous anesthésie (3 minutes). 4 administrations des composés à raison d’une fois par jour pendant 4 jours consécutifs (durée 1 minute) sous anesthésie (3 minutes). 4 Drainages du dialysat à raison d’une fois par jour pendant 4 jours consécutifs (15 minutes) sous anesthésie générale. un prélèvement de sang final (1 minute) sous anesthésie (3 minutes). Décompensation provoquée selon les procédures : Entre 18 et 20 administrations de CCl4 à raison de 2 par semaines pendant 9 ou 10 semaines (15 secondes) Ou Chirurgie avec laparotomie et ligature des voies biliaires sous anesthésie générale et couverture analgésique (durée 15’) un prélèvement de sang intermédiaire (1 minute) sous anesthésie (3 minutes). Déclenchement de la décompensation : Soi 4 administrations de LPS (Lipopolysaccharide: fragment de la paroi bactérienne entrainant une réaction inflammatoire à l'identique de celle rencontrée lors d'une infection) (15 secondes) à raison d’une administration journalière pendant 4 jours avec ou sans anesthésie selon la voie retenue soi 12 administrations d’éthanol à raison de 3 administrations par jour pendant 4 jours (15 secondes) un prélèvement de sang final (1 minute) sous anesthésie (3 minutes). Si procédure avec produit à étudier ajouter: 4 administrations des composés à raison d’une fois par jour pendant 4 jours consécutifs (durée 1 minute) sous anesthésie (3 minutes). 4 Drainages du dialysat à raison d’une fois par jour pendant 4 jours consécutifs (15 minutes) sous anesthésie générale. un prélèvement de sang final (1 minute) sous anesthésie (3 minutes).
Impact sur les animaux
Les modèles d’étude ne présentent pas de douleur ou d’inconfort pendant la phase d’induction de la fibrose ou de la cirrhose. Sur cette phase, le seul inconfort serait l’intervention chirurgical associée à la ligature des voies biliaires, celui-ci est géré par l’utilisation préventif d’un analgésique et en curatif pendant les deux jours qui suivent la période post-opératoire. L’encéphalopathie est une pathologie très lourde pouvant conduire au décès du patient. La décompensation qu’elle soit « spontanée » en prolongeant l’induction soit dans l’épisode aigu associé à l’administration de l’agent précipitant à un stade plus précoce de la cirrhose compensée peut inéluctablement le conduire à la mort, c'est par définition la caractéristique du modèle étudié dans ce projet. Nous reproduisons ces évènements qui surviennent chez les patients cirrhotiques qui décompensent qui dans le cadre d’une ACLF (décompensation ou aggravation d’une décompensation rapide et brutale par un agent précipitant - infection, absorption massive d’alcool, intoxication médicamenteuse, …- chez des patients souffrants d’une maladie chronique du foie) peuvent avoir une survie estimée à 28 jours dans 70% des cas. Des signes comme des vocalises spontanées, des difficultés respiratoires (dyspnée), une incapacité à se retourner (sauf dans le cadre du binge drinking où les pertes d’équilibres peuvent aller jusqu’à l’incapacité à se retourner), une absence de réflexe pupillaire, une ptose palpébrale avec larmoiement et une pâleur prononcée pourront être observés chez les animaux en phase de décompensation. Ils constitueront un point d’arrêt et une mise à mort des animaux par anticipation.
Devenir
L'évaluation histologique des organes majeurs (foie, reins et cerveau) et une investigation approfondie des biomarqueurs plasmatiques circulants imposent la mise à mort des animaux
Remplacement
Les modèles développés et décrits dans ce projet tentent de reproduire une cascade d’événements conduisant à la défaillance successive de plusieurs organes comme cela se produit chez le patient cirrhotique en phase de décompensation aigue ou chronique. Il n’existe pas de modèle in vitro permettant de reproduire la globalité ni la chronologie de la progression de la rupture multi organe. Les premières étapes du programme de recherche seront réalisées dans des tests in vitro pour évaluer les activités intéressantes sur des paramètres connus jouant un rôle dans l’évolution de la pathologie étudiée (par exemple l’inflammation, le stress oxydatif, ou la prolifération ou mort cellulaire etc.)
Réduction
Le nombre d’animaux estimé pour chaque procédure tient en compte de l’hétérogénéité associée aux modèles d’induction de la défaillance hépatiques. Le nombre initial de certaines procédures permettra l’élimination d’animaux sous ou sur-répondants, ce afin d’avoir une meilleure homogénéité après réponse à l’agent précipitant et donc in fine de réduire les groupes d’étude finaux. L’estimation du nombre d’animaux des groupes finaux a pour but de permettre une analyse robuste et fiable de l’effet des composés sur la pathologie. Les procédures de caractérisation des modèles permettront d’ajuster au mieux ce nombre d’animaux nécessaire à la mise en évidence d’un effet thérapeutique de composés.
Raffinement
L’encéphalopathie hépatique est une pathologie sévère, qui chez l’humain entraîne de nombreux décès dans un délai de 1 à 3 ans. Le modèle expérimental s’avère donc lui aussi sévère sur la phase finale de la procédure (prolongation de l’agent inducteur ou administration de l’agent précipitant). Nous avons établi une liste de signes cliniques de manière à ne pas conserver des animaux ayant atteint ces points limites. La liste de ces points limites pourra être réajustée après les procédures de caractérisation des modèles et afin d’éviter toute souffrance non nécessaire à l’établissement des résultats. Les procédures se feront avec un hébergement adapté au bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, tunnel ou igloo et éléments de nidification). Au cours des procédures, nous appliquerons pendant les périodes qui suivent les prélèvements sanguins, un apport d’aliment gélifié enrichi qui favorise la récupération des animaux suite à l’anesthésie. L’insuffisance hépatique qui conduit à l’encéphalopathie étant une pathologie multi-organe, l’étude de la maladie requiert l’utilisation d’animaux et ne peut être remplacée par des expérience in vitro.
Choix des espèces
Sur la base de la littérature scientifique, aucun modèle invertébré ne permet à ce jour dans le cadre de la cirrhose du foie de valider l’efficacité d’une nouvelle molécule dans le traitement de cette pathologie ou celles qui lui sont associées. Le génome des rongeurs et celui de l'homme ont 90% d’homologie, cela en fait un modèle de choix dans les études pharmacologiques. Le choix de l'espèce Rat a été fait en se basant sur la littérature scientifique et sur nos connaissances des caractéristiques des molécules à tester. Pour les études menées sur les rats avec une présensibilisation au phénobarbital, nous utiliserons des animaux de 4 semaines à l'arrivée (75-100 gr) âge préconisé dans: "Phenobarbitone induced enlargement of the liver : its relationship to carbon tetrachloride induced cirrhossis -Br. J.Exp.Pathol. 1981 Jun;62(3):283-8 », c’est en effet lorsque les rats ont atteint un poids de 100gfr environ que le ratio du poids du foie et le plus favorable, de même que l’expression du cytochrome P450 qui est plus stable.
Etude du rôle d’Arhgef18 dans la biologie endothéliale chez la souris_Amendement
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
420 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à des âges échelonnés de six jours à treize semaines. Les nouveau-nés reçoivent trois injections en trois jours, les adultes une injection intrapéritonéale par jour cinq jours par semaine pendant deux semaines, puis un prélèvement rétro-orbitaire et des mesures répétées de pression artérielle à la queue. Le porteur rattache ce travail sur une protéine des parois vasculaires à la prise en charge de l'anévrisme intracrânien, responsable selon lui de 36 000 hémorragies par an dans l'Union européenne, bénéfice qu'il situe à long terme. Aucun calcul n'appuie le chiffre de 420 souris, le porteur indiquant seulement que l'expérience de son équipe permettra d'en réduire le nombre.
Objectifs
La physiologie vasculaire est fortement influencée par la circulation sanguine qui génère des contraintes mécaniques variables sur la paroi des vaisseaux. Les artères sont principalement soumises à un fort flux sanguin générant de fortes contraintes de cisaillement sur les cellules endothéliales tapissant l’intérieur des vaisseaux. Ces contraintes participent à la production de facteurs vaso-actifs et à la quiescence des cellules endothéliales. Une modification de ces contraintes ou une perte de sensibilité des cellules endothéliales impactent la fonction de ces dernières. Aujourd’hui il est reconnu que les contraintes de cisaillements participent à certains processus développementaux et leur modification ou mauvaise perception par les cellules endothéliales contribue à de nombreuses pathologies cardiovasculaires comme l’athérosclérose ou l’anévrisme intracrânien. Mieux comprendre comment les cellules endothéliales perçoivent ces forces contribue, à terme, à l’identification de nouveaux axes de recherche pour prévenir, détecter et traiter les maladies cardiovasculaires. Grâce au travail réalisé in vitro, nous avons identifié une protéine mécano-sensible, ARHGEF18, contrôlant différentes fonctions endothéliales : l’adhésion, la prolifération et l’inflammation. Maintenant que nous avons déterminé la pertinence d’ARHGEF18 in vitro, nous souhaitons comprendre son rôle dans un système intégré plus complexe. Cela nous permettra de valider son impact sur les fonctions identifiées in vitro et d’identifier sa contribution exacte dans la physiologie vasculaire.
Bénéfices attendus
La rupture d'un anévrisme intracrânien, responsable de ~36 000 cas d'hémorragie sous-arachnoïdienne dans la communauté européenne, est l'une des principales causes de mort subite chez les jeunes sujets "sains" (pic d'âge entre 50 et 60 ans) avec un impact socio-économique considérable. Actuellement, il n'existe pas d'outils diagnostiques permettant de prédire le devenir d'un anévrisme intracrânien chez un individu donné, ni de médicaments permettant de limiter ou de prévenir la croissance de l'anévrisme intracrânien et sa progression vers la rupture. Les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l'initiation, de la croissance et de la rupture d'un anévrisme intracrânien sont encore inconnus. Malheureusement, il n'y a que peu de laboratoires travaillant sur la physiopathologie de l'anévrisme intracrânien. Le projet pour lequel cette saisine est déposée contribuera à répondre au besoin urgent d'améliorer la prise en charge des personnes atteintes d'anévrisme intracrânien. En identifiant le rôle d’ARHGEF18 dans la réponse aux forces mécaniques des artères cérébrales, ce projet facilitera la découverte de cibles thérapeutiques pertinentes pour prévenir la progression de la maladie, diminuer le risque de rupture et optimiser l'évaluation du risque pronostique pour prévenir les hémorragies aiguës. Les résultats obtenus pourront donc avoir un impact spécifique à long terme en ouvrant de nouvelles voies pour le développement de nouveaux médicaments. Une des perspectives de ce projet est le développement de nouveaux modulateurs pharmacologiques ciblant ARHGEF18 ou les voies de signalisation associées. Les résultats générés auront également, à long terme, un impact sociétal. De nos jours, la rupture d'anévrisme intracrânien est redoutée parce qu'elle est une cause de mort subite, et parce qu'elle survient sans symptômes cliniques préalables. La plupart des diagnostics sont faits sur la base de découvertes fortuites suite à une IRM. Les patients diagnostiqués savent qu'ils ne disposent d'aucun traitement préventif et non invasif. Par conséquent, ces patients vivent avec un stress permanent. Faciliter le diagnostic et offrir une perspective de traitement pharmacologique à ces patients soulagera leur anxiété et leur détresse.
Procédures
Procédure 1: injection intra-gastrique ou intra-péritonéale chez le nouveau-né: 3 injections sur 3 jours. Chaque injection dure moins d'une minute par animal. Procédure 2: injection intra-péritonéale chez l'adulte: 5 injections/semaine sur 2 semaines (cad 1injection IP/jour/5j/2semaines, à raison d'une minute par injection et par souris). Procédure 3: prélèvement rétro-orbitaire chez l'adulte. Le prélèvement est réalisé une seule fois et ne dure pas plus de 5 minutes. Procédure 4: prise de pression artérielle systolique chez l'adulte (tail cuff). 2 semaines d'acclimatation + 3 mesures définitives. Chaque cycle de mesures dure en moyenne une vintaine de minutes. Procédure 5: 1 injection intrapéritonéale à 6 jours d'âge. L'injection dure moins d'une minute par animal
Impact sur les animaux
Les procédures liées à ce projet sont réalisées en routine dans le laboratoire par du personnel qualifié. Nous n'attendons pas, à priori, de nuisances particulières. Toutefois, les risques potentiels sont: Injection de tamoxifen: les injections intrapéritoéales répétées (2x5jours) peuvent entrainer une irritation au site d'injection. C'est pourquoi une alternance Droite/Gauche est prévue, pour palier à ce problème. Prélèvement rétro-orbital: une douleur post-prélèvement peut survenir, c'est pourquoi un analgésique local à base de lidocaïne est appliqué après le prélèvement.
Devenir
Procédure 1: Lot 0: mis à mort après la fin d'entrainement Lot 1 : jusqu’à 6 jours de vie pour analyse de la rétine par immunofluorescence Lot 2 : jusqu’à 14 jours de vie pour analyse de la rétine par immunofluorescence Lot 3 : jusqu’à 10 semaines de vie pour prélèvement d'organes (culture cellulaire) Lot 4 : seront utilisés pour la procédure 3 et 4. Lot 7 : utilisés pour la procédure 5 pour analyse de la perméabilité vasculaire à 6 jours. Procédure 2: Lot 5 : jusqu’à 10 semaines de vie pour prélèvement d'organes (culture cellulaire). Lot 6 : seront utilisés pour la procédure 3 et 4. Procédure 3: Lot 4 et Lot 6 entièrement pour la procédure 4. Procédure 4: Mise à mort des Lots 4 et 6 pour prélèvement d'organes en vue d'analyse histologique.
Remplacement
Réutilisation : Les mêmes animaux serviront pour la prise de pression et le prélèvement sanguin. Il est impossible de réutiliser les animaux des groupes de prise de pression et de prise de sang pour l’isolation des cellules endothéliales car ces animaux seront trop vieux au moment de leur euthanasie et leur cerveau sera utilisé pour des marquages immunofluorescents. Réduction : Le modèle et les techniques seront mis en place par des personnes ayant déjà plusieurs années d’expérience ce qui permettra la réduction du nombre d’animaux utilisés. Aucune étape de mise au point n’est nécessaire pour les procédures décrites. Raffinement : Toutes les procédures seront réalisées avec les analgésiques adéquates dès que nécessaire.
Réduction
Réutilisation : Les mêmes animaux serviront pour la prise de pression et le prélèvement sanguin. Il est impossible de réutiliser les animaux des groupes de prise de pression et de prise de sang pour l’isolation des cellules endothéliales car ces animaux seront trop vieux au moment de leur euthanasie et leur cerveau sera utilisé pour des marquages immunofluorescents. Réduction : Le modèle et les techniques seront mis en place par des personnes ayant déjà plusieurs années d’expérience ce qui permettra la réduction du nombre d’animaux utilisés. Aucune étape de mise au point n’est nécessaire pour les procédures décrites.
Raffinement
Raffinement : Toutes les procédures seront réalisées avec les analgésiques adéquates dès que nécessaire.
Choix des espèces
Le modèle murin est le seul permettant la délétion inductible et tissu-spécifique de la protéine étudiée ainsi que la complexité nécessaire pour l’étude du rôle de la protéine sur le fonctionnement du système cardiovasculaire. Le but de cette saisine est d’établir le rôle d’ARHGEF18 dans le développement vasculaire et son homéostasie. Par conséquent, la recombinaison chez les animaux sera faite à deux stades : post-natal (procédure 1) ou à l’âge adulte (procédure 2). Pour la partie développementale, les animaux seront utilisés à P6 et P14. Pour la partie homéostasie vasculaire qui s’étudie à l’âge adulte, les souris seront utilisées entre 7 et 13 semaines (procédures 3 et 4).
Analyse de la connectivité cérébrale dans l’addiction à l’alcool à long terme
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune hébergée seule et en cycle inversé pendant les neuf semaines du protocole. Pendant sept semaines, elles ont le choix entre une bouteille d'eau et une bouteille d'alcool, accès que le porteur qualifie de volontaire et non forcé. Suivent un examen IRM de 56 minutes sous anesthésie et un prélèvement de 300 microlitres de sang, soit 15 % du volume sanguin total, puis la mise à mort et le prélèvement des organes. Le porteur reconnaît que l'isolement peut stresser les souris et qu'une consommation excessive d'alcool peut les déshydrater, et attend de l'étude une vue globale du connectome susceptible de servir à de futurs travaux translationnels.
Objectifs
Le trouble de consommation de l’alcool induit des modifications cérébrales complexes, se caractérisant par plusieurs stades associés à des adaptations spécifiques. En effet, une exposition prolongée et répétée à l’alcool peut être à l’origine d'altérations dans la communication entre les différentes régions du cerveau. Par ailleurs, des différences dans la vulnérabilité à la dépendance et à la toxicité de l'alcool entre les sexes ont déjà été mises en évidence à la fois chez l'Homme et dans des modèles de rongeurs. Ainsi l'objectif de cette étude est d'identifier par IRM dans quelle mesure les altérations de la communication cérébrale dépendent du sexe lors d'une consommation excessive et à long terme d'alcool. C'est pourquoi, après une consommation chronique de 7 semaines, des souris mâles et femelles sous exposition volontaire à l'alcool seront caractérisées par IRM multimodale afin de detecter les modification de la communication cérébrale. Ce projet tend donc à répondre aux questions suivantes ; quelles modifications cérébrales sont induites par la consommation d'alcool à long terme, quelles sont les différences d'altérations entre les sexes, et comment ces modifications peuvent être liées ou même prédire un comportement addictif ?
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude devraient contribuer à mieux comprendre les conséquences au niveau de la connectivité cérébrale dans l'addiction à l'alcool à long terme;, et l'influence du sexe dans les modifications observées. Ce projet devrait apporter une vue globale de la réorganisation du connectome chez les souris exposées à l’alcool, tout en permettant de cibler les aires cérébrales présentant des altérations spécifiques, et pouvant servir de cibles pour de futurs études translationnelles.
Procédures
Les animaux seront soumis à : 1) un protocole volontaire d'accès intermittent au choix entre 2 bouteilles : alcool versus eau pendant 7 semaines. 2) un examen IRM sous anesthésie incluant : un séquence d'IRM fonctionnel (16 minutes), une séquence d'IRM anatomique (10 minutes) et une séquence d'IRM de diffusion (30 minutes). 3) Un prélèvement sanguin de 300 µl maximum (15 % du volume sanguin total) réalisé sous anesthésie. Par ailleurs, les souris seront hébergées individuellement et en cycle inversé pour toute la durée du protocole, c'est-à-dire 9 semaines.
Impact sur les animaux
Le protocole de préférence de consommation de la solution d'alcool par rapport à l'eau par les souris est basée sur une action volontaire et non forcée. Des études précédentes chez la souris ont montré que le protocole induit une augmentation de la consommation après 2-3 semaines d’exposition. Cette consommation se stabilisent par la suite mais sa chronicité pendant 7 semaines reproduit le passage vers l’addiction à l’alcool, comme observées chez l’homme. Le protocole ne teste pas l’état de sevrage des souris car l’exposition à l’alcool n’est pas arrêté de manière prolongé, limitant ainsi les possibles nuisances. Les souris peuvent cependant présenter un état de déshydratation suite à la consommation excessive d’alcool. Ce protocole exige par ailleurs que les souris soient isolées ce qui peut induire un stress chez les animaux.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin d’effectuer des prélèvements d’organes d’intérêts.
Remplacement
Le modèle animal est, pour le moment, le seul modèle qui permet d’étudier dans son ensemble les phénomènes complexes mis en oeuvre dans l'addiction à l'alcool au niveau cérébrales à l'échelle du connectome. En effet ces atteintes sont multifactorielles, nécessitant un grand nombre d’acteurs, et toutes les conditions ne sont pas reproductibles fidèlement dans un modèle de culture cellulaire. L'utilisation de modèles murins pour le dévéloppement du projet est crucial. L'alcoolisme est une pathologie hétérogène qui implique une grande variabilité des profils symptomatiques. L'étude chez l'animal permet un suivi au cours du temps (du développement du modèle à l'établissement du phénotype de consommation excessive d'alcool) et un contrôle de l'historique de consommation incluant les niveaux de consommation, ses caractéristiques temporelles, ainsi que de l'environnement de l'exposition. Ce suivi est crucial pour l'identification et la caractérisation des phénotypes de consommation d'alcool et pour identifier les facteurs déterminants dans le passage à la consommation compulsive. Ces informations phénotypiques seront corrélées aux informations sur la connectivité cérébrale, mais également aux analyses cellulaires et moléculaires du tissu cérébral, ce qui nous apportera des informations sur les mécanismes de pathologie liées à la consommation excessive d'alcool. Ces questions ne peuvent être évaluées de manière contrôlées que dans des études chez l'animal. Chez l'humain le suivi historique non biaisé est impossible, cette évaluation étant basée sur la consommation d'alcool auto-déclarée. De plus, les facteurs environnementaux (stress, début de la consommation, comorbidités) sont des facteurs difficilement intégrables dans les études chez l'homme. Il n'est pas non plus possible de réaliser des prélèvements tissulaires chez l'humain. Le lien, entre des variables spécifiques (comme la quantité de consommation d'alcool), les phénotypes (comme le comportement de consommation compulsive) et les caractéristiques de la connectivité, permet la découverte de médicaments pour cibler des caractéristiques temporelles et catégorielles spécifiques de l'alcoolisme, dans le but de diminuer la consommation et éviter le passage vers l'addiction. Les médicaments ciblant l'alcoolisme pourraient influencer les jours d'abstinence, les niveaux d'alcool ou les changements de profils, qui ne peuvent être évalués avec précision que dans un cadre longitudinal et contrôlé.
Réduction
Le nombre de souris est réduit au minimum d’animaux nécessaires afin d’assurer l’efficacité des tests et obtenir des résultats fiables en fonction des expériences réalisées. Le nombre d’animaux pour l’analyse des résultats a été calculé à l’aide de tests statistiques et notre expérience montrant une forte variabilité des phénotypes de consommation d’alcool, amenant à 50 souris par groupe nécessaires pour analyser les résultats d'expérience IRM, conduisant à un total de 200 animaux
Raffinement
Le stress potentiellement engendré par la pratique expérimentale sera limité au maximum. A leur arrivée à l’animalerie, les souris bénéficieront d’une phase d’acclimatation à leur nouvel environnement de 2 semaines. Dans les cages d'hébergement, l'environnement sera enrichi par des carrés de coton pour l’édification du nid, des morceaux de bois pour que les animaux usent leurs dents, et des tubes pour fournir un abri. Pour limiter l’impact lié à l’isolement des animaux, les cages seront placées l’une à côté de l’autre pour maintenir les contacts olfactifs et visuels. Afin d’habituer les souris à la consommation d’alcool, le protocole d’accès intermittent au choix entre deux bouteilles comprend d’abord un accès pendant la première semaine à des bouteilles contenant un pourcentage croissant d’alcool. Durant l'examen IRM, le raffinement sera respecté par l'usage d'un anesthésie afin de réduire au maximum le stress de l'animal. Les yeux des animaux seront protégés du dessèchement grâce à l’application d’un gel de protection. La température et la respiration des animaux seront en permanence surveillées par un système de monitorage. En cas de chute de la température et/ou de la respiration non gérable, l'acquisition en cours sera immédiatement interrompue et l'animal sorti de l'IRM. Il sera alors placé dans une cage mis sous une lumière chauffante jusqu'à son réveil, sous surveillance. Des points limites ont été établis afin de soustraire les animaux à la douleur.
Choix des espèces
Pour ce projet nous utiliserons des souris mâles et femelles. Cette souche de souris est la plus utilisée dans l'étude du comportement lié à l'alcool. Les souris seront âgées de 8 à 10 semaines, étant l'équivalent de l'âge adulte chez l'homme. A cet âge, les souris ont atteint leur taille et poids adulte, ce qui permet une meilleure reproductibilité des résultats.