Recherche fondamentale

Greffées d'une tumeur sous la peau à l'état vigile, 612 souris reçoivent ensuite trois gavages et trois injections dans l'abdomen, certaines une radiothérapie sous anesthésie générale. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à la fin du suivi de croissance tumorale ou pour des analyses après la mort. Le porteur écrit que le développement de ces tumeurs n'entraînera "ni douleur ni gêne pour l'animal", tout en prévoyant une surveillance quotidienne, une grille de score et des points limites dont l'atteinte déclenche la mise à mort. Dix-huit souris par condition, six par expérience répétée trois fois, servent à éprouver in vivo une cible repérée en culture cellulaire.

Objectifs

L‘arsenal des traitements contre le cancer comprend la radiothérapie, la chimiothérapie et l’immunothérapie, c’est-à-dire la manipulation du système immunitaire du patient pour combattre la tumeur. Cependant, ces traitements ne sont pas efficaces contre tous les cancers ou seule une partie des patients répondent au traitement. L’efficacité du traitement dépend souvent de l’implication des cellules du système immunitaire. Ces dernières années, le rôle essentiel d’une population particulière de cellules immunitaires, appelées monocytes, a été mis en évidence. Le but de ce projet est de manipuler ces cellules afin de stimuler les réponses immunitaires contre les tumeurs, et de tester une stratégie thérapeutique permettant d’augmenter l’efficacité de la radiothérapie, la chimiothérapie et l’immunothérapie.

Bénéfices attendus

Nous avons identifié par des expériences in vitro une nouvelle cible thérapeutique potentielle qui pourrait stimuler les réponses immunitaires dans le contexte du cancer. Ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances essentielles pour évaluer l’intérêt de cette nouvelle cible thérapeutique dans un système physiologique in vivo. Ce projet permettra également de mieux comprendre l’importance des cellules immunitaires appelées monocytes dans les réponses immunitaires anti-tumorales. Ces avancées seront communiquées à la communauté scientifique dès la fin du projet. A plus long terme, ce projet ouvrira la voie à de nouvelles applications thérapeutiques chez l’homme, en particulier de nouvelles stratégies pour optimiser l'efficacité des traitements anti-tumoraux.

Procédures

Des cellules tumorales seront injectées par voie sous-cutanée à tous les animaux de ce projet (injection sur animaux vigiles1 fois au cours de l’expérience – durée du geste inf à 10 sec). Puis les animaux seront ensuite divisés en 2 lots pour recevoir des traitements différents. Les animaux vigiles recevront un traitement par gavage à raison d’une administration par jour tous les 2 à 3 jours (3 administrations au total – durée du geste inf à 10 sec). En parallèle, ces animaux recevront un second traitement par voir intrapéritonéale (directement dans l’abdomen). Les injections seront réalisées sur animaux vigiles à raison d’une administration par jour tous les 2 jours (3 injections au total – durée du geste inf à 10 sec)

Impact sur les animaux

Les animaux greffés avec des cellules tumorales développeront des tumeurs sous-cutanées au niveau du flanc qui seront mesurées régulièrement. Le développement de ces tumeurs n’entrainera pas de douleur ni de gêne pour l’animal Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection de produits non irritants par voie intrapéritonéale (directement dans l’abdomen) (gêne de courte durée),celles liées au gavage oral (gêne de courte durée )

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin du suivi de croissance tumorale ou pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Après des premières étapes d’analyse et de validation dans un modèle de culture in vitro, nous avons formulé l’hypothèse que notre cible d’intérêt pourrait stimuler les réponses immunitaires anti-tumorales. Cette hypothèse ne peut être testée que dans un modèle in vivo, dans un système physiologique représentant un organisme vivant intégré et autonome tel que la souris. Cette étape est indispensable à la compréhension du processus biologique et à l’évaluation du potentiel thérapeutique de l’approche proposée dans ce projet. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation de modèle animal reste indispensable pour pouvoir aborder la phase d’application de nos découvertes en clinique.

Réduction

Le nombre de souris par condition est de 18 (6 par expérience, répétée 3 fois) afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante, selon la différence que l’on souhaite mettre en évidence. Dans notre expérience préalable, ces effectifs sont suffisants pour mettre en évidence des différences significatives dans des modèles expérimentaux semblables. Dans certaines expériences, plusieurs organes seront prélevés post-mortem pour des analyses, ce qui optimise le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Dans le cadre des greffes de tumeurs, les animaux sont surveillés quotidiennement par l'équipe pour l’état général (7j/7). La radiothérapie sera réalisée sous anesthésie générale et les éventuelles douleurs soulagées par des analgésiques. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. En cas d’atteinte des points-limite les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche thérapeutique du cancer, car la physiologie de la souris est proche de celle de l’homme. D’autre part les mécanismes immunitaires sont bien caractérisés chez la souris, ce qui en fait un modèle particulièrement adapté pour étudier les réponses immunitaires anti-tumorales. La connaissance complète du génome murin permet d’utiliser de nombreux outils bien caractérisés, ce qui sera particulièrement pertinent dans le cadre de ce projet. Les souris seront utilisées à l'âge adulte (de 5 à 7 semaines) afin que les souris aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux.

210 rats subissent chacun une chirurgie de deux heures sous anesthésie générale pour se faire implanter un dispositif d'enregistrement cérébral, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour analyser leur cerveau. Cent vingt d'entre eux reçoivent en plus un cathéter veineux, vivent seuls en cage jusqu'au terme du projet, puis s'administrent de la cocaïne au cours de 25 sessions de six heures, suivies de deux mois d'abstinence. Le porteur indique que la prise chronique de drogue peut provoquer un état émotionnel négatif, visible au poil hérissé et à l'irritabilité, et que l'isolement peut causer un stress modéré. Le projet ne teste aucun traitement, il sert d'abord à mettre au point la technique d'enregistrement par fibre optique.

Objectifs

Le projet présenté ici s’inscrit dans un projet plus large visant à évaluer si le métabolisme du cholestérol cérébral représente une cible thérapeutique potentielle pour prévenir les rechutes et traiter l’addiction. En effet, quelques études ont montré que l’expression de protéines impliquées dans ce métabolisme était modifiée aussi bien chez l’homme, que dans des modèles animaux d’addiction, en réponse à la cocaïne ou à l’alcool. Pour cela, nous avons besoin dans un premier temps de mettre au point une technique d'enregistrement par fibre optique afin de déterminer les conditions optimales d’enregistrement de l'activité des neurones puis de valider ces conditions expérimentales avec l'étude de cette activité chez des rats en situation de rechute après une période d’addiction volontaire à la cocaïne puis une phase d'abstinence.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont la mise au point d’une technique innovante pour mesurer l’activité neuronale chez l’animal vigile. Cette technique, réalisée sur animal vigile, couplée à des mesures comportementales, nous permettra de mieux comprendre les processus neuronaux sous-tendant les phénomènes de rechute afin de mieux les combattre et promouvoir l’abstinence.

Procédures

Tous les rats (210) suivront une chirurgie sous anesthésie générale (durée : 2h00) afin d'implanter un dispositif pour mesurer l'activité neuronale. 120 rats seront soumis à une seconde procédure chirurgicale sous anesthésie générale (durée 15 min) pour implanter un cathéter veineux. Après leur chirurgie et jusqu'à la fin du projet, ces 120 rats seront hébergés seuls dans leur cage. L'auto-administration de drogue se fera avec ces 120 rats pendant 25 sessions, 1 session par jour (durée d'une session : 6 heures) en plaçant les animaux dans des cages spéciales dans lesquelles les animaux sont libres de leur mouvement. Les sessions d'auto-administration sont suivies d'une période d'abstinence d'une durée de 2 mois. Pour mesurer l'activité neuronale, tous les rats vigiles (210) seront placés pendant 1 heure dans une cage spéciale ; dans cette cage les rats sont libres de leur mouvement. 90 rats auront 3 sessions de mesure de l'activité neuronale (repartis sur 40 jours), 120 rats auront 1 seule session de mesure de l'activité neuronale. Tous les rats (210) seront pesés (2 fois par semaine, 15 semaines maximum, 10 secondes par pesée).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour cette procédure sont : -Chirurgies : douleurs soulagées par l'administration d'antalgiques et inconfort transitoire au réveil. - Dispositif de mesure de l'activité cérébrale : gène légère pendant la durée de l’expérience. - Cathéter intraveineux : gène légère pendant la durée de l’expérience. - Auto-administration : La prise de drogue chronique peut causer un stress modéré chez certains individus, ce qui est attendu car, comme chez l’Homme, un état « addict » chez le rat peut être associé à un état émotionnel négatif. Cet état peut se révéler par le poil hérissé, par une certaine irritabilité et agressivité envers l’expérimentateur mais pas envers ses congénères. Dans la plupart des cas, cet état est transitoire et l’état du pelage et les niveaux d’agressivité reviennent à la normale après quelques jours. - Période d’abstinence : peut causer un léger stress. - Isolement : peut causer un stress modéré.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience afin de procéder à des analyses sur le cerveau.

Remplacement

Ce type de recherche, vise à mettre au point une technique d’enregistrement de l’activité des neurones in vivo chez l’animal vigile au cours de tests comportementaux, ce qui implique d’utiliser des animaux vivants. L’étude de ce processus nécessite la présence de réseaux neuronaux intacts et fonctionnels qui sont uniquement accessibles dans des animaux intègres et donc vivants. Après vérification, il n’a pas été trouvé de test in vitro ou in silico permettant d’effectuer cette recherche et il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.

Réduction

Dans la première phase du projet, pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous progresserons pas à pas avec des groupes de 3 animaux. Nous testerons une condition à la fois, jusqu’à l’obtention de résultats satisfaisants. Nous avons fixé une limite maximale de 30 animaux par lot pour trouver les conditions optimales pour la mise au point de la technique d’enregistrement des neurones, soit 10 conditions expérimentales maximum. Dans la seconde phase de mesure de l'activité cérébrale chez les rats addicts, nous estimons à 20 rats par lot le nombre d’animaux nécessaire pour pouvoir faire les analyses statistiques de nos résultats.

Raffinement

Toutes les phases du projet seront réalisées par des personnels expérimentés. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide dans le suivi des points limites et des critères d’intervention et d’arrêt. En effet, ces points limites gradés précis et spécifiques sont définis de façon suffisamment précoces sont définis dans une grille de suivi. Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape, avec un recours à l’anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques ainsi que d’un maintien de la température par un tapis chauffant et d’une hydratation régulière des tissus lors des procédures de chirurgie. Les expérimentateurs sont compétents en chirurgie. A leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger pour assouvir leur besoin naturel de ronger) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum.

Choix des espèces

Le rat est l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux. Les rats ont des réponses aux drogues qui sont similaires à celles de l’Homme et ils s’auto-administrent toutes les drogues abusées par l’Homme de façon spontanée, ce qui n’est pas aussi évident avec une autre espèce, pour laquelle la réalisation de tâches opérantes modélisant l’addiction est plus difficile à obtenir. Nous utiliserons des rats de la lignée « Sprague-Dawley ». Il s’agit de rats « outbred », c’est-à-dire avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus pour un meilleur reflet de ce que l’on trouve chez l’Homme. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet, pour faciliter l’apprentissage et pour pouvoir effectuer des expériences de longue durée sans facteur confondant de déclin cognitif lié au vieillissement.

Les souris de ce projet portent des modifications génétiques qui les font développer spontanément des lymphomes et des leucémies, avec réduction de l'activité, prostration, poil hérissé et abdomen gonflé parmi les signes attendus. 262 d'entre elles sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Cent soixante subissent cinq à sept injections sous la peau et cinq prises de sang à l'état vigile, un lot de quarante allant jusqu'à 43 prélèvements sanguins hebdomadaires, et 90 jeunes souris sont poinçonnées à l'oreille pour le génotypage. Le porteur écrit qu'il est "indispensable" de mettre à mort tous les animaux dès qu'un point limite est atteint, puisque toutes sont exposées au risque de développer un cancer.

Objectifs

L’immunosurveillance est la capacité du système immunitaire à lutter contre les cellules tumorales. Cette immunosurveillance peut être inhiber au cours de la vie, favorisant le développement de tumeur. Des travaux précédent ont montré que dans certaines circonstances des anticorps neutralisant cette immunosurveillance, favorisaient les maladies virales et par conséquent pourraient favoriser le développement de cancers tels que les cancers hématologiques. Ce projet consiste donc à immuniser des souris afin qu'elles produisent ces anticorps neutralisant l'immunosurveillance et de mesurer l'impact de ces anticorps sur le développement plus rapide des cancers hématologiques apparaissant dans les modèles murins utilisés.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra potentiellement de décrire un nouveau mécanisme favorisant l’immuno-évasion et le développement de cancers hématologiques et pourra ouvrir une nouvelle perspective de traitement pour les patients atteints de cette maladie. En effet, malgré l’essor récent des thérapies ciblées et de l’immunothérapie, la plupart des patients rechutent avec des tumeurs résistantes.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à de la contention. 160 souris subiront au minimum 5-7 injections sous la peau (qui dureront moins d'une minute sur animaux vigiles), ainsi que 5 prélèvements de sang sur animaux vigiles, qui dureront quelques secondes. Parmi ces 160 souris, 40 souris seront en plus d'abord anesthésiées puis auront une injection intraveineuse qui durera quelques secondes et un prélévement sanguin qui durera moins d'une minute. 40 autres souris auront aussi en plus un prélévement sang hebdomadaire (soit 43 max) qui durera moins d'une minute sur animaux vigiles. 40 autres souris vigiles auront en plus une injection dans la veine de la queue après avoir placer la queue de la souris quelques secondes sous une lampe chauffante. 90 jeunes souris (à J14 minimum) subiront un prélèvement d'oreille par poinçonnage pour le génotypage, à l'état vigile. Le prélèvement durera quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les injections et les prélèvements seront sources de stress et de douleur (inflammation sur le site d'injection), cependant le volume injecté ou prélévé reste faible et l'acte est rapide (inférieur à une minute). Les effets indésirables attendus liés au développement des lymphomes (souffrance modérée) seront la réduction de l’activité, la prostration, le gonflement exacerbé de l'abdomen. Les effets indésirables attendus liés au développement de la leucémie (souffrance modérée) seront la réduction de l’activité, la prostration, le poil hérissé, les yeux plissés ou bridés et un envahissement du sang par les cellules leucémiques.

Devenir

l'ensemble des animaux seront à risque de développer des cancers, il est donc indispensable de mettre à mort l'ensemble des animaux de chacunes des procédures dès qu' un point limite est atteint ou au plus tard au moment définissant la fin des procédures.

Remplacement

Des études préliminaires sur des modèles celullaires ont été réalisées et ont permis à la fois de démontrer l'efficacité de l'immunisation permettant la production des anticorps neutralisant l'immuniosurveillance. En parallèle, des analyses complémentaires ont été et seront réalisées sur des prélèvements de patients, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Cependant, les approches in vitro ont des limites et ne permettent pas l'étude du système immunitaire. C’est pourquoi le recours aux animaux est nécessaire dans notre projet.

Réduction

Le nombre maximal de souris utilisées dans ce projet (n=262) a été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables pour la cinétique de développement des différentes tumeurs hématologiques. De plus, un animal permettra d’obtenir des résultats dans plusieurs expériences (incidence des tumeurs, analyse phénotypique des tumeurs, analyse de marqueurs sanguins).

Raffinement

L'élevage des souris génétiquement modifiées pouvant développés des tumeurs spontanément sera adapté et limité dans le temps afin de limiter l'apparition de ces tumeurs. Les transfert de cellules seront précédés d'une anesthésie qui limitera la douleur des souris. La bonne connaissance des modèles expérimentaux, le suivi adapté des points limites précoces et clairement définis, et la manipulation des animaux en générant le moins de stress possible par des personnes compétentes en expérimentation animale permettent de limiter au maximum toute douleur ou souffrance des souris. Nous évaluerons l'état de bien-être ou de souffrance des animaux au minimum 3x/semaine. Au fur et à mesure de l'apparition des tumeurs hématologiques et des mises à mort des animaux, des souris se retrouveront isolées dans les cages. Ces animaux recevront un enrichissement supplémentaire (coton et igloo pour nidification, morceau de bois)

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus pertinente pour les études de développement de cancers hématologiques car c'est un modèle proche de la pathologie humaine qui reproduit les caractéristiques histologiques. De plus, un modèle vivant est indispensable pour l’étude de de la répônse immunitaire sur le développement tumorale. Les souris utilisées seront toutes des souris adultes permettant ainsi un bon développement du système immunitaire. Nous disposons également d'outils, d'expériences et de compétences solides pour réaliser cette étude dans les meilleures conditions chez la souris.

Pour comprendre comment un récepteur de l'inflammation contribue à l'obésité et aux maladies auto-immunes, 56 souris sont nourries jusqu'à l'obésité pendant toute la durée du protocole, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune passe 48 heures isolée de ses congénères en cage calorimétrique et une heure et demie sous anesthésie pour une imagerie. Toutes seront tuées pour prélever leurs tissus, le porteur jugeant leur mise en liberté inconcevable du fait de leur modification génétique. Des points limites gradés et un arbre décisionnel sont prévus, et le porteur précise qu'aucune analgésie n'est prévue dans ce protocole.

Objectifs

L'obésité est un problème majeur de santé publique dans le monde entier, lié aux maladies auto-immunes et à l'inflammation chronique, mais les mécanismes sous-jacents sont inconnus. Les récepteurs de l'inflammation jouent un rôle essentiel dans la conduite des réponses immunitaires et ont été identifiés comme contribuant à l'obésité et aux maladies auto-immunes chez la souris et l'homme. Le ciblage de ces récepteurs pourrait constituer une nouvelle approche thérapeutique de l'obésité et des maladies inflammatoires. Ce projet vise à comprendre comment ce récepteur contribue à l'obésité et aux maladies auto-immunes et à tester l'hypothèse selon laquelle le contrôle de la fonction de ce récepteur peut prévenir leurs effets néfastes. Le projet explorera le métabolisme énergétique, la répartition des masses grasses et maigres et la fonction cardiaque chez la souris ne possédant plus ce récepteur.

Bénéfices attendus

L'obésité est liée à un risque plus élevé de troubles auto-immuns et inflammatoires, qui ont tous deux augmenté de manière significative dans les pays occidentaux. Il est donc nécessaire de trouver de nouvelles stratégies de prévention et de traitement. Les modèles murins d'obésité et de lupus induits par l'alimentation ont permis de comprendre le rôle d'un récepteur de l'inflammation dans les maladies auto-immunes et l'obésité. D'autres études animales sont nécessaires pour comprendre les mécanismes exacts impliqués dans l'autoréactivité et durant l'obésité. Nos études permettront de mieux comprendre la contribution d'un récepteur de l'inflammation à l'obésité et aux maladies auto-immunes et pourraient déboucher sur de nouvelles approches en matière de prévention et de traitement, réduisant ainsi le fardeau social et économique de ces troubles.

Procédures

Les animaux passeront 48 h en cage calorimétrique. Aucun risque particulier n'est associé à cet examen non invasif. L’IRM sera réalisée sur l’animal anesthésié, c’est un examen non invasif, l’examen dure environ 1h30, les risques sont liés à l’anesthésie. Les animaux seront manipulés quelques minutes chaque semaine lors des mesures de masse. De plus ils seront soumis à une alimentation les rendant obèses durant toute la durée du protocole.

Impact sur les animaux

Les animaux seront manipulés une fois par semaine pour la prise de poids. Ils seront passés en cage calorimétrique durant 48 heures et seront donc isolés de leur congénères. Pour l'imagerie, les animaux seront anesthésiés, ce qui est une source de nuisance. Enfin le régime est destiné à rendre les animaux obèses, ce qui sera également une source de nuisance.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés à l'issue de la procédure pour prélever post-mortem différents tissus. Etant donné que nous travaillons sur des souris génétiquement modifiées, leur mise en liberté est inconcevable.

Remplacement

Il n'existe à l'heure actuelle aucune méthode de substitution in vitro pour étudier l'impact de l'obésité induite. Les systèmes organoïdes au niveau immunitaire et intestinaux sont insuffisants, face à ces contraintes notre projet nécessite un organisme (souris) vivant entier. La souris est un donc modèle de choix car elle présente des mécanismes physiologiques proches de ceux qui sont observables chez l'homme. Le but de ce projet est de rechercher les conséquences métaboliques d'une lignée de souris transgéniques pour TLR7. Ce processus est complexe et met en jeu de nombreux organes et systèmes métaboliques, qu’il n’est pas possible de reproduire in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux est le minimum nécessaire pour étudier la variabilité biologique des souris. Ce nombre minimal est également nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives, à l'aide les tests statistiques, entre les groupes. Le nombre d'animaux sera de 6 à 10 par génotype.

Raffinement

Un délai d'acclimatation minimum de 8 jours sera assuré. Les animaux seront hébergés en cage de 4 pour les mâles et les femelles, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique ou en carton, du coton, des rondins de bois à ronger, une roue d'activtié…. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle pour une durée inférieure à 24h, avant d'etre replacé avec ses congénères jusqu’à la fin du protocole. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en fonction des observations faites permettra l'application des points limites et la mise en application de critères d'arrêt. Aucune analgésie n'est prévue lors de ce protocole.

Choix des espèces

La souris est un modèle classiquement utilisé dans les études concernant les désordres métaboliques causés par l’alimentation en raison des similitudes avec l’homme et permet d’avoir accès à des modifications génétiques contrôlées. Les animaux seront âgés d’environ 8 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondant tels que le vieillissement.

Un score de 3 sur la grille de surveillance suffit à retirer une souris de l'étude, mais les 288 souris de ce projet finissent toutes tuées par dislocation cervicale pour analyser leur foie. Elles subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré, une injection dans la veine de la queue d'un virus qui éteint le gène FGF21 dans le foie, deux prises de sang et une mise à jeun de 20 heures dont 8 heures de nuit. Le porteur indique que le jeûne peut entraîner une légère hypoglycémie et l'injection du transgène une inflammation temporaire. L'enjeu déclaré reste la connaissance, comprendre le rôle d'une hormone produite par le foie dont des analogues sont déjà en essai clinique chez l'être humain.

Objectifs

Le jeûne est pratiqué depuis longtemps et ses effets bénéfiques sur la santé générale et la longévité ont plus récemment été mis en avant. En effet, le jeûne représente un bon stress physiologique qui force l’organisme à s’adapter et à survivre. Ainsi, le jeûne permet d’optimiser l’utilisation de l’énergie et de réduire l’inflammation et le stress oxydant. Chez les mammifères, le foie joue un rôle majeur lors du jeûne. Il permet notamment de produire du sucre qui est utilisé par les différents tissus de l’organisme en période de carence en nutriments. Lors de période de jeûne, le foie produit également une hormone, appelée FGF21. Elle est libérée dans le sang lors du jeûne mais aussi lors d’une surcharge en sucre. Elle a des actions bénéfiques sur le poids corporel et sur le niveau de sucre dans le sang. Ainsi, de nombreuses molécules similaires à FGF21 font actuellement l’objet d’essais cliniques pour le traitement de maladies métaboliques comme le diabète. Bien que FGF21 soit produite en grande quantité lors de période de jeûne, son rôle dans ce contexte est peu compris. Dans ce projet, pour approfondir les connaissances sur le rôle de FGF21 lors du jeûne, nous générerons des souris dont le gène FGF21 n’est plus fonctionnel dans le foie et nous les soumettrons à une période de jeûne.

Bénéfices attendus

Avec ce projet nous souhaitons approfondir les connaissances sur le rôle hépatique de FGF21 lors du jeûne. En effet, FGF21 est produite en grande quantité lors du jeûne mais son rôle dans ce contexte est encore mal compris. Des analogues de FGF21 faisant l'objet d'essais cliniques dans le cadre de plusieurs maladies métaboliques, mieux comprendre son rôle en physiologie est d'une importance majeure.

Procédures

Les animaux recevront une injection intraveineuse prenant environ 20 secondes (1 fois), et il sera pratiqué 1 fois par semaine une prise de sang prenant environ 15 secondes (2 fois), ainsi qu'une mise à jeun de 20h, dont 8h pendant la période nocturne et un prélèvement de sang juste avant la mise à mort.

Impact sur les animaux

L'injection au niveau de la veine de la queue demande une contention de l’animal qui peut entraîner un stress. L'injection du transgène peut engendrer éventuellement une inflammation temporaire. La mise à jeun peut entrainer une légère hypoglycémie. Les prélèvements de sang peuvent entraîner un stress lié à la contention ainsi qu'une légère douleur.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale afin de réaliser des analyses sur les échantillons de foie.

Remplacement

Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux de laboratoire car le jeûne est un processus biologique complexe qui fait intervenir différents tissus agissant en synergie (foie, tissus adipeux, intestin, cerveau, muscle). Il est impossible de mimer ceci par l’utilisation de méthodes alternatives. L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car il est possible d’étudier la protéine d’intérêt (FGF21) grâce à l’utilisation de souris génétiquement modifiées.

Réduction

Le nombre d’animaux pour ce projet est défini pour permettre d’une part de répondre aux questions scientifiques et d’autre part de respecter la réduction du nombre d’animaux au maximum. Ainsi, nous utiliserons le plus petit nombre d’animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d’animaux a été déterminé par un test statistique adapté et est basé sur des données provenant d’expériences antérieures de jeûne du laboratoire.. De plus, en fonction de l'amplitude de réponse à la transgénèse, ces tests pourront être refaits avec de nouvelles données, et le nombre d'individus par lot révisé au cours du projet.

Raffinement

Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement. Ainsi, les souris seront en hébergement collectif (4 ou 5 animaux/cage) et dans un environnement contrôlé (température, hygrométrie). Des enrichissements du milieu de vie (cabanes en inox et ouate de coton ou de cellulose) seront disposés dans la cage afin de pouvoir se distraire, se cacher et fabriquer des nids. Pour un meilleur raffinement et limiter le stress, les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Nous procèderons également à une surveillance accrue des souris après l'injection à la veine de la queue du transgène et après le prélèvement sanguin à la joue. Plus généralement, nous surveillerons attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux, et nous mesurerons leur consommation alimentaire et hydrique afin de vérifier la bonne tolérance des différentes expérimentations. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres (indice 0 = normal ou léger, indice 3 = changements importants par rapport à la normale). Si un animal présente un signe quelconque de souffrance avec un score de 3 après évaluation de ces paramètres, le critère d’arrêt sera atteint. L’animal sera aussitôt retiré de l’étude et replacé dans des conditions d’hébergement standard (régime standard et aucune procédure réalisée) après examination par la vétérinaire référente. Concernant la gestion de la douleur nous appliquerons un analgésique local sur la queue avant l'injection. Pour être la moins pénible, la période de jeûne est planifiée ainsi : 12h pendant toute la période de jour durant laquelle les souris dorment et ne mangent que 10% de leur bol alimentaire quotidien, et 8h en période de nuit. Ce jeûne permet d’arriver au pic d’activité de FGF21, tout en évitant une période de privation de nourriture trop longue.

Choix des espèces

L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques (ici FGF21) en utilisant des souris transgéniques. Ces modèles ne sont disponible que chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car le développement du foie est terminé et nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.

Irradiées, puis greffées avec de la moelle osseuse d'un animal déficient, 40 souris reçoivent enfin une toxine injectée dans le muscle de la patte pour y provoquer une lésion. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour prélever leurs organes. Le porteur décrit une immunodépression, une fatigue générale, une mobilité réduite pendant quatre jours et une perte de poids allant jusqu'à 15 % après l'irradiation, tout en qualifiant la lésion musculaire d'"inconfort passager" après lequel la mobilité "n'apparaît pas affectée". L'effectif tient à 6 ou 7 individus par point d'analyse, pour une étude que le porteur présente lui-même comme une preuve de concept préalable à des travaux plus complets.

Objectifs

Le muscle adulte a la capacité de régénérer complètement après une lésion, grâce aux cellules souches musculaires et aux cellules de l'immunité qui jouent un rôle important dans ce processus. Une protéine a été identifiée comme un candidat important impliqué dans la fonction des cellules immunitaires au cours de la régénération musculaire, ce qui a été validé par des expériences réalisées sur des cellules in vitro. La validation du rôle de cette molécule dans les cellules immunitaires au cours de la régénération musculaire in vivo nécessite l’utilisation d’un modèle de souris présentant une inactivation de cette molécule spécifiquement dans ces cellules. Une approche économe en nombre d'animaux consiste à transplanter les cellules de la moelle osseuse d’un animal déficient pour la molécule dans des souris receveuses normales. De cette manière, seules les cellules immunitaires sont inactivées pour la molécule dans les animaux transplantés. Ensuite, une blessure musculaire est réalisée afin de pouvoir analyser les muscles de ces souris. L’objectif de cette étude est de valider la pertinence de l’inactivation spécifique de la molécule dans les cellules immunitaires au cours de la régénération musculaire en réalisant des expériences de transplantation de moelle et de lésion musculaire sur un petit nombre d’animaux.

Bénéfices attendus

Cette étude preuve de concept permettra d'identifier si la molécule est nécessaire dans les cellules de l'immunité pour la régénération musculaire. Le cas échéant, des études plus complètes seront mises en place ultérieurement afin d'en analyser le fonctionnement moléculaire. A terme, la compréhension des mécanismes permettant la régulation de l'inflammation au cours de la réparation tissulaire sera bénéfique pour améliorer les conditions de vie des patients atteints d'inflammation persistante en général, et de dystrophies musculaires en particulier

Procédures

- irradiation (1 fois 1 minute) - injection intraveineuse de moelle osseuse (1 fois 10 minutes sous anesthésie) - injection sous-cutanée d'analgésique (1 fois 1 minute) - induction de blessure musculaire : injection d’un agent chimique dans le muscle situé le long du tibia (1 fois 10 minutes sous anesthésie)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues incluent le stress dû à la manipulation des animaux lors des transfert de cage et du transport et lors du déplacement dans la boite d’anesthésie lors des injections intraveineuse et intramusculaire. L'irradiation puis la transplantation provoquent une immunodépression transitoire. Ceci induit une fatigue générale chez les animaux et peut entrainer une réduction de mobilité pendant environ 4 jours, conduisant à une perte jusqu'à 15% de poids de corps 4 jours après l'irradiation, et qui est récupérée à partir du 6ème jour. L'irradiation peut également, dans de très rares cas, induire une pousse des dents. L'induction de la blessure musculaire engendre un inconfort passager chez les animaux, avec une diminution transitoire de l’activité après l’injection de la toxine (24h) bien que la mobilité des animaux n’apparaît pas affectée

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement des organes

Remplacement

Les alternatives non animales ont déjà été utilisées dans ce projet. Il s'agit des expériences de co-culture cellulaire in vitro dans des modèles qui miment la régénération musculaire in vitro. Il est désormais nécessaire de valider ces résultats in vivo afin de les intégrer dans l’organisation complexe du tissu musculaire dans l’organisme.

Réduction

Le modèle mis en œuvre dans ce projet a été choisi car c’est celui qui permet de réduire le plus possible le nombre d’animaux nécessaire. Des outils statistiques ont permis de définir que 6 à 7 individus par point d’analyse, en fonction des analyses réalisées, sont suffisants pour réaliser des statistiques robustes.

Raffinement

Des mesures sont prises pour améliorer les conditions d’élevage et de bien-être afin d’enrichir l’environnement des souris. Le raffinement inclut l'anesthésie lors de l'injection de la moelle osseuse, de l'induction de la blessure musculaire et lors de la mise à mort des animaux, ainsi que l'administration d'analgésique lors de la lésion musculaire. Le raffinement inclut le maintien des animaux dans des conditions sanitaires propres et une surveillance quotidienne des animaux après l'irradiation comprenant le dépôt de nourriture hydratée et de gel nourrissant directement dans la cage, une pesée tous les 2 jours, la surveillance d’une pousse des dents en plus de la surveillance de l'état général des individus. Ces mesures de raffinement sont issues de recommandations publiées issues de travaux de la communauté scientifique. Des points limites qui auront pour effet l’arrêt de la procédure ont été définis.

Choix des espèces

Le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l'Homme dans sa structure et son fonctionnement, avec les mêmes séquences de l'inflammation chez la souris et chez l'homme au cours de la régénération musculaire. Le projet s'intéressant aux mécanismes de réparation tissulaire à l'âge adulte, les souris sont utilisées à l'âge adulte, soit entre 8 et 12 semaines.