Recherche fondamentale

Une semaine d'acclimatation, puis une injection dans le liquide céphalorachidien chaque semaine pendant huit semaines, sous anesthésie générale à chaque fois, et entre deux injections des tests de motricité et de force musculaire de dix minutes chacun. Un test de mémoire intervient au deuxième ou au troisième mois, des prélèvements de sang ont lieu en cours d'étude, et un mois après la dernière injection les 396 souris sont tuées pour prélever des structures de leur système nerveux central. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et le porteur écrit qu'il est probable que les souris injectées perdent peu à peu leur mobilité et leur masse musculaire, la mise à mort devant intervenir avant qu'elles ne puissent plus se déplacer, s'alimenter ni boire. Ce qui leur est inoculé provient du système nerveux central de patients atteints de sclérose latérale amyotrophique, dans l'espoir de reproduire chez elles une maladie dont le porteur dit qu'aucun modèle animal fiable n'existe.

Objectifs

La Sclérose Latérale Amyotrophique (ou maladie de Charcot) est une maladie neurodégénérative qui touche les neurones du cerveau et de la moelle épinière, responsables du mouvement. La maladie débute en moyenne à l’âge de 60 ans et est responsable d’une paralysie progressive, de troubles de la parole et de la déglutition, et de difficultés respiratoires aboutissant au décès en 2 à 5 ans. Il n’existe, à ce jour, aucun traitement de la maladie, et la faible connaissance des mécanismes physiopathologiques impliqués associée à l’absence de modèles animaux fiables freinent la recherche sur la SLA. Deux formes de SLA existent, les formes héréditaires causées par des mutations génétiques (moins de 10% des patients), et les formes dites sporadiques qui représentent plus de 90% des patients et pour lesquelles l’origine de la maladie reste inconnue. Un acteur semble toutefois jouer un rôle central dans la maladie : la protéine TDP-43, qui s’accumule de manière anormale dans les neurones des patients atteints de SLA et semble jouer un rôle dans la propagation de la maladie au sein du système nerveux en se propageant de neurone en neurone. Des modèles animaux portant les mutations génétiques responsables de SLA familiales existent mais ne représentent que moins de 10% des patients. Il est donc indispensable de générer de nouveaux modèles représentatifs des 90% des patients atteints de la forme sporadique. Plusieurs équipes de recherche ont récemment tenté de reproduire la maladie en injectant la protéine TDP-43 issue de patients atteints de SLA dans le cerveau de souris. Ces études ont permis de reproduire des symptômes semblables à ceux présentés par les patients, et l’accumulation anormale de TDP-43 au sein des neurones des souris a été retrouvée comme celle observée chez les patients. Si ces résultats ouvrent des perspectives intéressantes, les modalités d’induction de la maladie restent pour le moment très invasives pour les animaux (injections intracérébrales) et difficiles à réaliser. Afin de pallier ces contraintes, nous souhaitons mettre au point un protocole d’induction de la maladie plus facile et moins invasif pour les animaux. L’objectif du projet est de répondre à l’absence de modèles animaux fiables dans la recherche sur la SLA en générant un modèle animal de SLA sporadique (inexistant à ce jour limitant les progrès de la recherche) pour permettre la compréhension des mécanismes physiopathologiques impliqués et appliquer des stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Si les souris développent une pathologie similaire à la SLA chez l’Homme, alors elle pourra être étudiée sur un modèle fiable de la maladie pour identifier les mécanismes physiopathologiques impliqués afin de mieux comprendre la genèse et la propagation de la maladie, et enfin permettre d’identifier et de tester de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Pour l’ensemble des procédures, les animaux seront manipulés par des personnes qualifiées et formées. Les souris subiront une injection par semaine pendant 8 semaines sous anesthésie générale courte. L’anesthésie générale dure en moyenne 15 minutes. La procédure démarre par environ une semaine d’acclimatation des animaux à leur nouvel environnement. Une semaine après chaque injection, et avant l’injection suivante, les animaux subiront des tests comportementaux. Ces tests sont au nombre de 2 et visent respectivement à évaluer la motricité et la force musculaire . La durée de ces tests est d’environ 20 minutes par souris (2 tests différents de 10 min chacun avec des temps de récupération entre chaque). Un test de mémoire sera réalisé entre 2 et 3 mois après le début de l'expérience ( test d'environ 10 minutes par souris). Une fois le modèle mis en place, les animaux recevront une substance test de manière aigue ou de manière chronique au cours de l’expérience. Classiquement, les administrations durent quelques secondes pour chaque animal. Des prélèvements sanguins peuvent être réalisés en cours d'étude (1 à 2 prélèvements avec au minimum une semaine d'intervalle, chaque prélèvement dure quelques secondes). Un mois après la dernière injection, les animaux seront euthanasiés pour prélèvements post-mortem et études biochimiques et d’imagerie.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les administrations par voie intrathécale et la procédure terminale de prélèvement peuvent induire un léger stress chez l'animal, du fait de l'anesthésie générale (total de 9 anesthésies sur 12 semaines). Les tests moteurs peuvent induire un léger stress chez l'animal. Si notre modèle permet d’induire une pathologie semblable à la SLA, il est probable que les souris du groupe expérimental présentent peu à peu une réduction de la mobilité et une perte musculaire progressive (entrainant une perte de poids). L'administration de nouveaux candidats médicaments par voie systémique ou orale peut également conduire à un léger stress chez l'animal vigile. Ces interventions peuvent générer un stress transitoire lié à la contention et une légère douleur comparable à l'introduction d'une l'aiguille selon l'art et la pratique vétérinaire. Il n'est pas attendue de douleur ou souffrance spécifique par les candidats médicaments eux-mêmes.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des 2 procédures pour exploration de la propagation de la maladie par des études biochimiques et histologiques. Ces analyses impliquent le prélèvement de structures du SNC et ne permettent donc pas le maintien en vie des animaux.

Remplacement

Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle par un modèle cellulaire car à ce jour il n’existe pas de méthodes alternatives pour étudier le rôle de la protéine TDP-43 dans l’induction et la propagation de la Sclérose Latérale Amyotrophique. En effet la physiopathologie de la SLA met en jeu l’organisme entier et plus particulièrement le système nerveux central. Les modèles cellulaires ne permettent d’évaluer le mode d’action qu’au niveau moléculaire et sub-cellulaire sans pour autant apporter des informations extrapolables à l’organe ou à l’organisme entier. Aussi, il n’existe pas de modélisation mathématique ou d’alternatives non animales dans ce domaine.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum tout en permettant l’obtention de résultats exploitables au niveau statistique. Les tests statistiques ont été choisis de manière à répondre le plus précisément possible aux questions scientifiques

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages aux normes suivant l’âge et le poids des animaux (4 à 6 souris par cage car ce sont des animaux sociaux), et les animaux évolueront dans un environnement enrichi (coton, tunnel, etc…). Les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel de l’animalerie et/ou les techniciens. La douleur susceptible d’être induite par les injections sera limitée car elles seront réalisées sous anesthésie par isofluorane. En revanche, si notre modèle permet d’induire une pathologie semblable à la SLA, il est probable que les souris du groupe expérimental présentent peu à peu une réduction de la mobilité et une perte musculaire progressive. Les animaux seront euthanasiés avant qu’ils ne développent des symptômes trop sévères les empêchant de se déplacer correctement et donc de s’alimenter et de boire correctement (point limite lié à ce protocole).

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour l’étude des maladies humaines car l’organisation de son ADN et l’expression de ses gènes sont similaires à celles de l’Homme. La souris est donc un outil précieux dans la plupart des domaines de recherche médicale et permet d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à de nombreuses pathologies humaines. De plus, c’est un modèle facile à entretenir, bien décrit et documenté. C’est un modèle utilisé dans le monde entier permettant ainsi de comparer les résultats entre les laboratoires de recherche. Les souris C57BL/6J seront âgées d’environ 4 mois, l’âge moyen pour avoir des animaux adultes et matures car la SLA est une maladie qui touche des adultes.

1 415 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leur foie et de leurs tumeurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles reçoivent une injection de virus dans une veine, d'anti-œstrogènes ou d'un agent chimique qui fait apparaître des tumeurs du foie, ce dernier chez des souriceaux de 14 jours, puis en moyenne huit échographies sous anesthésie, des injections d'anticorps tous les trois jours pendant deux mois au plus, une toxine qui provoque une hépatite ou une chirurgie abdominale terminale. Ces tumeurs peuvent conduire, selon le porteur, à une encéphalopathie mortelle sans perte de poids. L'équipe veut comprendre pourquoi une même mutation donne deux types de tumeurs du foie, résistantes à l'immunothérapie, et en tirer des pistes de traitement. Le porteur affirme qu'il est "crucial de travailler sur des modèles murins pertinents", tout en prévoyant de mettre au point des cultures de tumeurs en trois dimensions pour tester de futurs médicaments.

Objectifs

Ce projet s’intéresse aux cancers du foie de l'adulte et de l'enfant qui reste un problème majeur de santé public. Chez l’adulte, il est la quatrième cause de morts liées au cancer dans le monde et son incidence ne cesse d’augmenter avec l’épidémie de diabète et d’obésité. Il touche plus particulièrement les hommes même si l’évolution des facteurs de risque modifie quelque peu les proportions homme/femme. Récemment, l’immunothérapie a donné des résultats intéressants mais une majorité des tumeurs ne répondent pas à ces traitements. L’objectif de ce projet est de comprendre comment une même mutation conduit au développement de deux types de tumeurs hépatiques. Notre projet consiste à caractériser ces deux types de tumeurs émergeant sur foie sain ou malades induits par des régimes riches en gras et en sucre afin de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques et de comprendre pourquoi ces tumeurs sont résistantes aux immunothérapies. Notre objectif est aussi de développer des modèles de culture cellulaire tridimensionnelle pour tester de nouveaux médicaments tout en limitant le nombre de souris mais aussi de confirmer nos résultats chez la femelle, du fait du changement de proportions homme/femme touchés par la maladie.

Bénéfices attendus

En aidant à la compréhension des mécanismes moléculaires, métaboliques et immunitaires de développement et de réponse aux traitement des cancers du foie, ce projet permettra d'identifier de nouvelles pistes thérapeutiques administrées seules ou à coupler aux traitements d'immunothérapie émergeant ces dernières années et de proposer des biomarqueurs diagnostiques et pronostiques pour ce cancer au pronostic toujours aussi sombre. Enfin, il permettra de disposer de nouveaux modèles in vitro qui pourront être utilisés pour prédire la réponse à ces nouvelles thérapies.

Procédures

1) En premier geste, les animaux pourront subir soit : a) une injection intraveineuse unique de virus sous anesthésie générale en 30s b) une injection intrapéritonéale unique d'anti-oestrogènes sur animaux vigiles sous contention en 30s c) une injection intrapéritonéale unique d'un agent chimique induisant des tumeurs du foie sur animaux vigiles sous contention en 30s 2) En second geste, les animaux pourront subir: a) une échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10-25min tous les 15 jours (8 échographies en moyenne) b) une chirurgie abdominale terminale sous anesthésie générale et analgésie pendant 15min c) une injection intrapéritonéale d’anticorps ciblant le système immunitaire sur animaux vigiles sous contention tous les 3 jours en 30s (pendant 2 mois maximum) d) une injection intrapéritonéale unique de toxine induisant une hépatite sur animaux vigiles sous contention en 30s 3) Le dernier geste étant un prélèvement sanguin suite à une injection intrapéritonéale unique d’anesthésique sous contention sur animaux vigiles en 30s.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, la nuisance principale est liée au développement de tumeurs hépatiques pouvant conduire à une encéphalopathie létale sans perte de poids. Les injections intraveineuses de virus adéno-associés et les échographies réalisées sous anesthésie peuvent entraîner un stress thermique et un inconfort au réveil. Les injections intrapéritonéales peuvent entraîner un stress lors de la contention et une douleur de courte durée lors de l‘introduction de l’aiguille.

Devenir

L'ensemble des animaux de ce projet sera euthanasié pour analyse de leurs tissus hépatiques et de leurs tumeurs

Remplacement

Le foie est un organe composé de plusieurs types cellulaires. La transformation hépatocytaire requiert des interactions complexes avec le microenvironnement cellulaire mais aussi l’environnement métabolique et les autres organes pathologiques en cas d’obésité. L’usage exclusif de lignées cellulaires ne permet donc pas d’appréhender cette problématique dans sa globalité. Les lignées immortalisées perdent d'ailleurs beaucoup de leurs caractéristiques phénotypiques et métaboliques in vitro. C'est pourquoi il est crucial de travailler sur des modèles murins pertinents.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux transgéniques, une technique innovante d'édition génique nous permet d'éviter la création de lignées et de n'injecter que les animaux d'expérimentation. 585 animaux sur les 1415 nécessaires nécessaires au projet suivront ce protocole. Nous suivrons le développement des tumeurs pour 200 animaux par échographie ce qui permet un suivi longitudinal du développement tumoral. Ce suivi évite d'euthanasier les animaux à l'aveugle. Les tests statistiques utilisés seront des tests permettant l’analyse d’échantillons de petites tailles. Le nombre d’animaux a été choisi grâce à notre expertise : le suivi échographique de 20 animaux par lot est nécessaire et suffisant pour générer des résultats statistiquement fiables. Pour les études à court terme, seuls 15 animaux par lot sont nécessaires. De plus, nous souhaitons mettre au point des cultures in vitro de tumeurs murines pertinentes pour les cancers du foie qui nous permettront à terme de tester de nouvelles drogues anti-tumorales et ainsi de ne tester chez l’animal que les molécules préalablement efficaces sur ces cultures. Récemment, nous avons développé un nouveau modèle de cancer basé sur l'édition génique qui permet de générer moins d'animaux.

Raffinement

Nous suivrons le développement des tumeurs en échographies, ce qui permet un suivi longitudinal du développement tumoral. Ce suivi évite la souffrance due à un développement tumoral important (raffinement). Nous connaissons les phases possiblement délétères après invalidation génique, et les procédures se dérouleront avec une surveillance adaptée. Les injections stressantes et échographie seront réalisées sous anesthésie générale et les animaux mis sur tapis chauffant après anesthésie. Pour réduire le stress au quotidien, le milieu est enrichi par des cotons compactés, des tunnels en carton et des maisonnettes suspendues et les animaux hébergés à raison de 5 animaux par cage au maximum. Dans la fenêtre de temps où le phénotype délétère lié à l'activation de la beta-caténine peut avoir lieu, un suivi accru sera mis en place. Au cours du suivi échographique, si les points limites sont atteints, les animaux seront immédiatement euthanasiés. Au cours de ce suivi, l'euthanasie des animaux ayant atteint le point limite peut conduire à des animaux isolés dans les cages pour lesquels un suivi accru sera mis en place et le milieu enrichi (nids, tunnels, bois à ronger).

Choix des espèces

Pour ce projet l’espèce animale choisie est la souris. Ce choix est lié : 1) A notre expertise pour l’étude, l’utilisation et le développement de modèles murins. 2) A la possibilité de réaliser des manipulations génétiques de façon aisée dans cette espèce pour reproduire les mutations observées dans les cancers du foie humains. Un modèle de carcinogenèse chimique nécessite des souriceaux de 14 jours puisque c'est en injectant à cet âge que les tumeurs se développent . Pour les autres modèles, des souris adultes âgées de deux mois seront utilisées afin que le cancer se développe à partir d'une cellule mature.

440 souris, en grande majorité des femelles de 5 semaines, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et chacune peut subir jusqu'à trois interventions en sept semaines. Éveillées, elles reçoivent d'abord cinq jours d'injections dans le ventre d'un inducteur qui désactive le gène d'une enzyme, Alox15, dans leurs vaisseaux lymphatiques. Viennent ensuite une injection de cellules tumorales, une chirurgie qui provoque un lymphœdème ou une procédure d'inflammation que le résumé ne décrit pas, puis, pour certaines, une lymphographie par injection dans les pattes, sous une anesthésie dont elles ne se réveillent pas. Le porteur annonce des douleurs modérées dues aux chirurgies et aux tumeurs, pour des retombées qu'il présente comme de "nouvelles pistes d'exploration" contre les métastases et le lymphœdème après un cancer du sein.

Objectifs

Le système lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener à la circulation sanguine au niveau de la veine sous-clavière. Il est impliqué dans le transport des graisses et des macromolécules et joue un rôle important dans l’immunité en transportant les cellules de l’inflammation. Le réseau lymphatique est également impliqué dans de nombreuses pathologies telles que le lymphoedème, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde et dans la dissémination métastasique. Le lymphoedème est le résultat d’une obstruction ou d’une perturbation du système lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedème est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient après la chirurgie du cancer, cependant aucune thérapie visant la régulation du dysfonctionnement de ce réseau lymphatique n’est proposée. Lors d’une étude chez les patientes ayant développé un lymphoedème après cancer du sein, nous avons mis en évidence l’absence de lipides spécialisés dans la résolution de l’inflammation générés par l’enzyme ALOX15. Dans cette étude, nous proposons de traiter les animaux avec ces lipides afin de déterminer lesquels sont responsables de l’inflammation chronique. En parallèle, nous étudierons si l’absence de ces lipides peut influencer la lymphangiogenèse tumorale et avoir des conséquences sur la dissémination métastatique.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes de la résolution de l’inflammation associés au système vasculaire lymphatique. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Enfin, il permettra d’établir comment réduire l’apparition des lymphoedèmes post-cancer à l’aide des médiateurs de la résolution de l’inflammation.

Procédures

Les animaux seront soumis à jusqu'à 3 interventions au total. Ensuite, l'inhibition de l'expression de la 15-lipoxygenase est effectuée par injection intraperitonéale d'un inducteur en vigil pendant 5 jours consécutifs. Après, ils seront soumis à une injection de cellules tumorales ou à une procédure chirurgicale ayant pour but d'induire le lymphoedème secondaire sous anesthésie générale (durée

Impact sur les animaux

Les chirurgies ainsi que le développement de tumeurs vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet.

Remplacement

L’inflammation chronique fait intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques de cette molécule dans la fonction endothéliale lymphatique. De même, la croissance tumorale fait intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endothéliale lymphatique, inflammation, tissu adipeux..), il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre du traitement du lymphoedème après cancer du sein. De plus, le nombre d'animaux utilisés par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs afin de délimiter l'effet du génotype, du temps et/ou du traitement.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car l'invalidation génique de l’enzyme Alox15 a été générée seulement dans cette espèce. Nous utiliserons en particulier dans ce projet des souris conduisant à une invalidation de Alox15 de manière tissu-spécifique dans les cellules endothéliales lymphatiques. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée chez des souris femelles à l'âge de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 à 12 semaines.

Élevées sur place parce que ces lignées ne sont pas commercialisées ou coûtent cher à obtenir avec six mois de délai, 3 816 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les femelles porteuses du transgène développent spontanément des tumeurs mammaires à partir de 16 semaines, laissées croître jusqu'à 17 millimètres de diamètre pour récupérer un maximum de tissu cancéreux, avec une gêne mécanique, une nécrose possible et des ulcères douloureux parmi les effets décrits. Chaque animal subit une biopsie de la queue pour le génotypage, à l'état vigile ou sous anesthésie "en fonction de l'aisance du personnel". Les mâles qui n'expriment pas le transgène sont tués, les autres gardés pour la reproduction, et le porteur avance que cet élevage réduit les coûts.

Objectifs

Maintien de lignées génétiquement altérées par insertion d’un transgène constitutif induisant la formation de tumeurs mammaires spontanées pour l’étude de la formation des métastases des cancers du sein triple négatifs et caractérisation génétique de ces dernières par une méthode invasive.

Bénéfices attendus

Les lignées génétiquement altérées utilisées ici sont: soit non commercialisées et l’élevage permet donc l’obtention de lignées uniques; soit disponibles commercialement mais seulement par revitalisation (pas d’animaux vivants disponibles, obtention des animaux couteuse avec un délai d’environ 6 mois). L’élevage permet donc de réduire les coûts et d’avoir des animaux vivants disponibles pour mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la formation des métastases des cancers du sein triples négatifs. Le génotypage permet la caractérisation génétique de ces lignées pour optimiser la gestion des élevages et la production des animaux. (pas d’animaux vivants disponibles, obtention des animaux couteuse avec un délai d’environ 6 mois). L’élevage permet donc d’avoir des animaux vivants disponibles qui seront utilisé pour mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la formation des métastases des cancers du sein triples négatifs. Le génotypage permet la caractérisation génétique de ces lignées pour optimiser la gestion des élevages.

Procédures

Prélèvement de la queue (1mm) pour biopsie 1 fois sous anesthésie générale à l’isoflurane, durée inférieur à 5 minutes.

Impact sur les animaux

La biopsie au niveau de la queue peut entrainer de la douleur et du stress chez l'animal. Les lignées génétiquement altérées utilisées ici développent des cancers mammaires montrant une croissance tumorale rapide mais rarement métastatique (moins de 15% des animaux développent des métastases). La croissance de la ou des tumeurs primaires peut provoquer des effets indésirables sur les animaux. Particulièrement, l’animal peut subir une nuisance mécanique de la tumeur par son volume pouvant compliquer sa mobilité et son activité. La tumeur primaire, par sa croissance rapide, peut montrer une nécrose (mort cellulaire) et être associée à la formation d’ulcère entraînant une douleur pour l’animal. De manière plus générale, l’animal peut être touché par des signes plus généraux de mauvais état général comme la perte de poids et d’appétit. Des observations et examens cliniques seront réalisés tous les jours afin de mettre en lumière les animaux montrant des signes cliniques. Si des signes cliniques sont détectés, les animaux seront alors surveillés deux fois par jours afin de procéder à une mise à mort anticipée en cas d’atteinte de points limites.

Devenir

Les animaux de sexe masculin n'exprimant pas le transgène seront euthanasiés. Les animaux exprimant le transgène et les femelles sauvages seront gardés en vie pour le maintien des lignées (reproduction) et une utilisation continue.

Remplacement

Les souris générées dans ce projet permettront l’étude des mécanismes de la colonisation métastatique des cancers du sein triple négatifs. Il est très compliqué de mimer in vitro la formation de métastases. Une étape in vivo est donc nécessaire pour se rapprocher au plus près des conditions de clinique humaine, afin d’observer finement les mécanismes d’action des cellules tumorales au niveau de l’organe métastatique. De plus, il est compliqué de maintenir in vitro l’hétérogénéité des cellules cancéreuses observée in vivo. L’élevage de ces lignées génétiquement altérées permet de générer des tumeurs de cancer du sein triple négatif en conservant l’hétérogéinité des cellules cancéreuses et du stroma. Les cellules cancéreuses seront isolées et étudiées ex vivo avec des essais se rapprochant au plus près des conditions in vivo comme la culture en 3 dimensions de tumoroïdes. Notamment, afin d’étudier le rôle de gènes d’intérêts, l’effet de l’amplification ou de la délétion de ces gènes sera évalué ex vivo afin d’éliminer les gènes n’ayant pas d’effet sur les cellules cancéreuses. En ce qui concerne le prélèvement de tissu pour le génotypage nous ne disposons pas de méthodes de remplacement possible.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, un nombre minimum de deux à quatres cages de reproduction sera utilisé pour le maintien des lignées murines. Le schéma de reproduction de ces lignées génétiquement altérées permet d'obtenir seulement 50% des animaux avec le transgène. Parmis ces animaux, seule la moitié sera de sexe féminin et développera une tumeur mammaire utilisée pour notre étude. D’après notre expérience, ces souris génèrent 10-11 souriceaux toutes les 3 semaines ce qui correspond à 2 ou 3 souris femelles exprimant le transgène. Avec deux cages pour chaque lignée on estime obtenir 4 à 6 souris toutes les 3 semaines. Ces souris seront utilisées au laboratoire pour toutes nos expériences ex vivo (isolation de cellules tumorales primaires) mais aussi in vivo. Ce nombre de cages nous permettra de réaliser 4 à 6 expériences par mois par lignée. Le nombre de cage sera réduit si nos besoins diminuent.

Raffinement

Lors de la mise en accouplement, l’alimentation des mères est enrichie. Pour enrichir le nid, du Nestlet (coton) est ajouté en plus des frisottis. Afin de ne pas perturber les relations parents-petits, le change est décalé à minimum trois jours après la mise bas. De plus, pour limiter le stress, le nid parental est conservé pendant le change. Pour le génotypage, la biopsie de queue des animaux est réalisée lors du baguage soit en vigile soit sous anesthésie générale à l’isoflurane en fonction de l’aisance du personnel. Cette méthode est approuvée, précise, rapide et standardisée, ce qui limite les effets indésirables stress/douleurs. L’anesthésie permet de favoriser la bonne pose de la bague et le prélèvement de queue dans un environnement plus confortable pour le manipulateur et l’animal. Le prélèvement est ensuite stocké au congélateur jusqu’à utilisation pour le génotypage. Afin de faciliter l’accès à la nourriture aux petits lors des sevrages, des croquettes sont mises directement dans la cage. Pour le phénotype dommageable, les souris femelles développent des tumeurs mammaires à partir de 16 semaines. Le suivie tumoral se fera deux fois par semaine avec un pied à coulisse puis quotidiennement lorsque les tumeurs atteignent environ 10 mm de diamètre. Si des signes cliniques sont détectés, les animaux seront surveillés tous les jours afin de procéder à une mise à mort anticipée en cas d’atteinte de points limites.

Choix des espèces

La souris est l’espèce de choix pour ces essais : - Concordance des lignée murines génétiquement modifiées avec les observations cliniques chez les femmes atteintes de cancer du sein triple négatif - Similitudes de la physiologie et de la taille du génome entre la souris et l'homme - L'organisme évolue rapidement (courte durée de vie) et permet des analyses compatibles avec les impératifs de progrès thérapeutiques à apporter en clinique humaine - Certaines souches sont génétiquement modifiées, permettant la création de modèles tumoraux particuliers (expression de marqueur fluorescent permettant la détection des cellules cancéreuses). Les animaux seront génotypé à 21 jours. Les souris génétiquement altérées développent des tumeurs spontanées à partir de 16 semaines avec des tumeurs d’environ 17 mm de diamètre (1500 mm3, point limite) aux alentours de 24 semaines. Afin de récupérer un maximum de tissu cancéreux, les souris seront utilisées lorsqu’elles présenteront une tumeur de 17 mm de diamètre (environ 1500 mm3), sauf si un point limite est atteint avant.

Les souris qui atteignent un point limite sont mises à mort aussitôt, les autres une à huit semaines après l'injection, pour prélever leurs poumons. 620 souris sont utilisées dans ce projet, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit un virus une seule fois, par inhalation nasale ou par intubation de la trachée sous anesthésie et analgésie profondes, puis passe au scanner une fois par semaine sous une anesthésie d'un quart d'heure. Le porteur écrit que le projet a été mené jusqu'ici entièrement en culture cellulaire et qu'il lui est désormais "indispensable" de passer à l'animal pour comparer la reprogrammation cellulaire et la formation de cancers du poumon.

Objectifs

Lors du développement de l’embryon, à partir de quelques cellules dites cellules souches, des milliards de cellules vont être produites et acquérir une spécialisation (cellules de poumon, de peau, etc.) lors d’un processus appelé différenciation. Ces dernières années, des travaux montrant qu’il est possible de reprogrammer une cellule différenciée en une cellule souche, ont apporté la preuve que la différenciation est un processus réversible. Le mécanisme de reprogrammation partage des similarités avec ceux qui aboutissent à l’apparition de cellules cancéreuses (tumorigenèse). Des études réalisées à partir de cultures de cellules de peau de souris nous ont déjà permis d’identifier certaines de ces similarités. Afin de nous rapprocher de ce qui se passe chez l’Homme, nous souhaitons maintenant étendre notre étude comparative de la reprogrammation et de la tumorigenèse au poumon, chez la souris.

Bénéfices attendus

On sait aujourd’hui que le développement tumoral n’est pas seulement lié à une prolifération anarchique des cellules. Les changements d’identité cellulaire (modification de la nature et de la fonction d’une cellule) constituent un domaine émergeant et on sait maintenant qu’ils sont à l’initiation de certains cancers. L’étude de ces mécanismes est donc cruciale pour faire émerger de nouvelles thérapies mais également pour approfondir nos connaissances sur la biologie du cancer. Grâce à des modèles cellulaires en culture, nous avons identifié des mécanismes et des acteurs importants pour l’identité cellulaire. Nous souhaitons cette fois approfondir notre analyse dans un modèle murin et plus proche de la pathologie humaine en étudiant ces mécanismes dans le poumon.

Procédures

Les animaux seront tout d’abord soumis à une anesthésie puis inhalation intra-nasale de virus ou à une anesthésie / analgésie profonde puis injection intra-trachéale de virus par intubation. Dans le premier cas, la procédure totale dure environ 5 minutes (2 minutes d’endormissement, 3 minutes injection + réveil) et dans le second 20 minutes. Dans les deux cas, cette procédure n’est réalisée qu’une seule fois. Une à 8 semaines après inhalation / injection, les animaux sont mis à mort pour prélèvement d’organes. Nous réaliserons un suivi des poumons des animaux par imagerie telle que du scanner une fois par semaine. Pour ceci, les souris seront anesthésiées environ 15 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables liés à l’injection intra-nasale en elle-même sont très légers puisque l’anesthésie est très courte et la méthode d’injection n’est pas invasive. Les effets indésirables liés à l’injection intra-trachéale sont ceux pouvant résulter d’un acte opératoire classique sans chirurgie (il s’agit d’une intubation). Dans ce cas, une inflammation est possible due au passage du cathéter dans la trachée et une gêne est également envisageable due à l'injection d'un faible volume de liquide qui va descendre volontairement dans les poumons. Les effets indésirables liés à l’imagerie sont très légers puisque les animaux subissent seulement une courte anesthésie.

Devenir

Les animaux ne pouvant pas être réutilisés pour un autre projet, ils seront mis à mort à la fin de l’expérimentation, ou en cas d’atteinte d’un point limite conduisant à l’interruption de la procédure d’élevage.

Remplacement

Jusqu’à présent, le projet a complètement été mené grâce à des expériences in vitro, donc sans faire appel à aucun modèle animal. Dans un but de mener des études plus approfondies et pour se rapprocher de la biologie du cancer il nous est indispensable de passer à des modèles in vivo de manière complémentaire aux modèles in vitro que nous avons déjà.

Réduction

Les effectifs définis dans ce protocole ont été déterminés grâce au comportement connu de ces modèles expérimentaux et tiennent compte des exigences statistiques nécessaires à l’exploitation des résultats. Afin de limiter le nombre nécessaire de souris, nous avons réduit au maximum le nombre de souris utilisées (20/groupes) dans nos procédures sans en compromettre l’interprétation et la puissance statistique des analyses. D’autre part, le projet sera réalisé pas à pas ce qui permettra de ne pas inclure tous les animaux prévus s'il n'y a pas besoin.

Raffinement

Les procédures seront réalisées sous anesthésie / analgésie. Les animaux seront suivis 2 fois par jour sur les 48h suivant l’administration des adénovirus afin d’identifier toute complication liée au mode d’inoculation (gonflement de la trachée/région du cou). Les animaux seront par la suite observés 3 fois par semaine afin d’identifier tout signe potentiel de mal-être ou de souffrance. Nous avons défini une série de points limites conduisant à l’arrêt de nos protocoles et à la mise à mort immédiate des souris concernées.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus pertinente pour les études de cancérogénèse du fait de l’existence de nombreux modèles génétiquement modifiés bien caractérisés qui permettent de reproduire de manière fidèle la progression tumorale observée chez les patients. Les souris jeune adultes seront infectées entre l’âge de 6 et 8 semaines afin de standardiser nos groupes d’études.

Tous tués pour prélever leur sang, leur rate, leurs ganglions, leur moelle osseuse, leur foie, leurs intestins et leur thymus, 150 rats immunodéficients sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. À l'âge de deux à quatre jours, les ratons sont séparés de leur mère et irradiés quatre minutes, avec un risque qu'elle les rejette ensuite, puis reçoivent une injection de cellules humaines directement dans le foie. Trois prélèvements de sang derrière l'œil suivent, à douze, dix-huit et vingt-quatre semaines, en alternant œil droit et œil gauche. Le porteur présente ce rat "humanisé" comme une alternative aux souris humanisées, plus grande et plus proche de l'être humain, pour éprouver des médicaments agissant sur le système immunitaire.

Objectifs

A l'heure actuelle, l'étude de nouveaux médicaments permettant d'agir sur le système immunitaire ne peut pas être effectuer sans réaliser des expériences in vivo. Les résultats in vitro seuls ne peuvent présumés du potentiel réel et efficace d'une molécule. Afin de pouvoir répondre à ce type de problème, l'utilisation de modèle de souris dites "humanisés" (souris qui ne possèdent pas de système immunitaire propre mais on y trouve la présence de cellules humaines) permet de pallier la complexité de la réponse immunitaire. Suite à l'émergence de nouvelles procédures thérapeutiques, la mise à disposition d'un nouveau modèle d'animaux humanisés : le rat humanisé représentera une alternative intéressante aux souris humanisées. Principalement due à la taille du modèle, permettant de réaliser des modèles de greffes vasculaires mais également dû à la différence de pourcentage au niveau des cellules humaines. Ce projet expose donc la procédure utilisée afin de produire des rats dits humanisés à partir de rats immunodéficients (qui sont des animaux ne possédant pas de cellules au niveau du système immunitaire).

Bénéfices attendus

Sur le court terme, ce projet pourra montrer une meilleure compréhension du système immunitaire humain grâce à sa modélisation des rats humanisés immunodéficientes reconstitués avec un système immunitaire humain.

Procédures

Les différentes interventions sur les animaux sont : l'irradiation de ratons mâles et femelles âgés de 2 à 4 jours qui se déroule en seule fois et cela pendant 4 min, une seule injection intrahépatiques de cellules humaines sera effectuées sur des animaux anesthésiés (anesthésie rapide avec une durée de procédure n'éxcédant pas 5 min) ainsi que des prélèvements se déroulant à semaine 12, 18 et 24 post-injection d'une petite quantité de sang lors d'un prélèvement retro-orbitaire (10 min de procédure de l'endormissement au réveil).

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendues sont: le stress du à la séparation de la mère pouvant également induire un risque de rejet des petits par celle-ci, de la douleur pouvant être générés par les différentes procédures expérimentales ( l'injection intrahépatique, des prélèvements de sang ou de la contention des animaux ...). Les signes de souffrance éventuelle seront observés quotidiennement au cours de l'étude.

Devenir

A l'issue de cette procédure, les animaux seront euthanasiés pour permettre d'effectuer les différents prélèvements (sang, rate, ganglions, moelle osseuse, foie, intestins et thymus) ainsi qu’une analyse immunologique par cytométrie en flux.

Remplacement

Le développement de nouvelles thérapeutiques pour le traitement de maladies humaines nécessite une phase d'études pré-clinique réalisée chez l'animal. Ce modèle d'étude du mécanisme d'action d'anticorps et/ou médicaments chez le rat ayant un système immunitaire humain permettra de reproduire les mécanismes d'action susceptibles d'être mise en œuvre chez l'homme. Ces expérimentations in vivo sont les seules à pouvoir répondre à nos questions, le modèle des rats humanisées étant le seul à pouvoir juger dans des conditions physiologiques du rôle des molécules X et Y sur l'efficacité de la réponse immunitaire. Des résultats positifs in vitro seraient insuffisants pour être convaincu de la pertinence physiologique des observations et leur transposition à la clinique seraient freinés.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet a été déterminée de manière à pouvoir effectuer différents tests statistiques qui pourront permettre d'obtenir des résultats significatifs pour conclure sur le mécanisme d'action sur les T régulateurs.

Raffinement

Nous cherchons à raffiner au maximum nos protocoles pour limiter la souffrance. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les animaliers et par les responsables des procédures. Au moment des injections du traitement, une application au préalable de Lidocaïne sous forme de gel sera effectuée comme analgésie . Afin de limiter au minimum l’impact de la séparation maternelle, celui-ci est réduit grâce à l'imprégnation des gants de l’expérimentateur et d’une boite de Petri (qui sera mise dans la cage d’irradiation) avec la sciure de la cage maternelle Les rats seront hébergés à plusieurs dans des cages dont la surface sera adaptée au nombre d'individu et disposeront en permanence d'enrichissement (igloo en PVC...). Lors du prélèvement de sang par des sinus rétro orbitaire (effectuée totes les 6 semaines avec alternance œil droit/gauche) sur des rats anesthésiés, l'utilisation de tétracaïne 1% en collyre permettra une anesthésie locale. Nous procédons à l’euthanasie des rats en cas d’atteinte des points de limite préétablis.

Choix des espèces

Le choix du rat repose essentiellement sur le fait que ces animaux présentent de plus fortes similitudes immunologiques et génétiques avec l'homme que la souris et que les études fonctionnelles seront plus faciles à réaliser. Il est également à prendre en compte que certains modèles de greffes vasculaires ou autres modèles (ex : implantation d'organoïdes humains) seront plus simples à effectuer chez le rat humanisé par rapport aux modèles de souris humanisés Nous utiliserons des ratons âgés de 2 à 4 jours afin de faciliter la reconstitution du système immunitaire par des cellules humaines.