Recherche fondamentale

Porteurs pour une partie d'entre eux de récepteurs à l'ocytocine génétiquement modifiés, 12 macaques rhésus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une à trois neurochirurgies d'une journée sous anesthésie générale, pour l'injection de marqueurs intracrâniens, l'implantation d'électrodes puis leur retrait, ainsi que deux IRM, un scanner et quatre examens de tomographie par émission de positons, tous sous anesthésie. Ils reçoivent en plus une injection intramusculaire trois fois par semaine pendant dix semaines, avant des séances d'observation en volière portant sur des intrusions dans leur territoire. Le porteur prévoit des micro-lésions cérébrales dues à la présence des électrodes, annonce la mise à mort de 4 macaques à des fins scientifiques et présente les 8 autres comme candidats à la reproduction en centre de primatologie, ou à défaut au placement en sanctuaire, sous réserve de l'évaluation rétrospective.

Objectifs

L'espace est une ressource limitée pour de nombreuses espèces, les poussant à délimiter et à défendre leur territoire. L’objet de ce projet est de comprendre les mécanismes neuronaux qui régulent le comportement territorial. Ce comportement est à la source de nombreux conflits, chez l’humain comme chez l’animal, lorsqu’un individu franchit les frontières d'un territoire. Nous faisons l’hypothèse que l'ocytocine (OT), un neuropeptide hypothalamique connu pour son rôle de régulation sociale chez les mammifères, module l'activité neuronale dans les zones clés liées à la perception de l’espace dans le processus d'appropriation et de défense territoriale. Notre étude se concentre sur le macaque dont les systèmes neuronaux et comportementaux sont proches de ceux des humains. Des données préliminaires suggèrent que la distribution des récepteurs d'ocytocine diffère considérablement entre les rongeurs et les primates, ce qui justifie notre choix du macaque comme modèle. De plus, la régulation territoriale chez le macaque repose davantage sur des indices visuels et des règles sociales hiérarchiques que sur des indices olfactifs, comme c'est le cas chez les rongeurs. Nous analyserons comment les neurones spatiaux et émotionnels réagissent aux changements territoriaux tels que l’approche d’un intrus sous l'influence de l'ocytocine. Comprendre ces mécanismes pourrait éclairer les conflits territoriaux humains et les moyens de les résoudre.

Bénéfices attendus

1. Le projet apportera une connaissance approfondie de l'anatomie du système oxytocinergique chez le primate, de son effet sur l’activité neuronale au sein du complexe amygdalo-hippocampique, Ces données sont impossibles à obtenir chez l'humain du fait de l'impossibilité de faire des marquages pré mortem qui seront révélés dans l'anatomie post mortem. 2. Ce projet renseignera sur les systèmes neuronaux qui contrôlent les comportements sociaux et territoriaux ainsi que leur modulation par l’action de l'ocytocine. 3. Le projet permettra d'apporter des éléments sur la faisabilité et l'action potentielle des approches pharmaco-génétiques pour agir sur le comportement et l'activité neuronale chez le primate non humain. Cette étape est essentielle au développement d’outils pharmaco-génétiques dans une perspective translationnelle. De fait, le projet vise à ouvrir la voie à la possibilité de manipulation pharmacologique ciblant des zones spécifiques du cerveau humain afin de bénéficier à des patients ayant des troubles psychiatriques.

Procédures

Les animaux des deux premier lots seront soumis trois procédures chirurgicales sous anesthésie générale d’une journée : une première destinée à l’administration de marqueur intracrânien, une deuxième destinée à l'implantation d'électrode et la dernière à retirer les implants. Les animaux seront aussi soumis à 2 examens d'imagerie par résonnance magnétique et de CT scan d’une durée d’une ½ chacun, et 4 examens de tomographie par émission de positon, couplés à des prises de sang pour des dosages hormonaux (1/2 journée). Les animaux seront mis sous anesthésie générale pour ces 1examens. Les animaux recevront une injection intramusculaire par jour de ligands pharmacogénétiques 3x par semaine pendant 10 semaines avant des sessions de mesures comportementales en volière. Les animaux du deuxième lot seront soumis à un examen sous anesthésie générale d’une ½ journée et une chirurgie d’une journée.

Impact sur les animaux

Les animaux seront tous soumis à 1 ou 3 neuro-chirurgies (selon les lots) effectuées sous anesthésie générale. La chirurgie suscitera un inconfort post-opératoire passager. A terme, des micro-lésions cérébrales sont à prévoir, dûes à la présence d’électrodes dans le cerveau. Les aninaux recevront des injections intramusculaires qui peuvent génèrer une douleur localisée mais passagère. Nous nous attendons à ce que le produit injecté modifie le comportement territorial pour induire moins de compétition territoriale. Les animaux seront testés sans mise en conflit, mais plutôt en observant des intrusions dans leur territoire. Ces situations peuvent générer un stress passager, mais équivalent à un stress naturel. Les animaux seront aussi soumis à des examens d'imagerie par résonnance magnétique, radio (Tomographie à émission de positon) et les prises de sang capillaire à l’oreille pour des dosages, pour lesquels ils seront mis sous anesthésie générale, ce qui provoquera également un inconfort au réveil.

Devenir

A la fin du protocole, 8 des animaux subiront une chirurgie de dés-implantation et seront candidats à une réutilisation pour de la reproduction en centre de primatologie si l'évaluation rétrospective le permet. En cas contraire, ils seront candidats pour un replacement en sanctuaire. Par ailleurs, notre protocole nécessite l'euthanasie de 4 des animaux pour des fins scientifiques.

Remplacement

Dans notre cas, le remplacement des primates par d'autres espèces vertébrées ou non vertébrées, voire par d'autres espèces de primates n'est pas encore possible. Les humains ne peuvent pas être utilisés en raison de la nature invasive des méthodes expérimentales. Il est impossible d'injecter des marqueurs en prémortem pour effectuer du traceur anatomique et ni d’injecter des vecteurs viraux permettant de cibler les circuits anatomies précis chez l'homme et d'en vérifier les effets des manipulations sur le comportement. De même une approche in silico, ne permet pas d'appréhender ni la complexité des circuits anatomiques ni le comportement. Phylogénétiquement, le modèle d’étude pré-clinique (macaque) est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle. Ainsi, les informations obtenues seront plus facilement comparables transposables et identifiables à une application chez l’humain. De plus, des taches comportementales variées peuvent être réalisées par ces animaux permettant ainsi l’étude d’un large spectre de comportements complexes. Aucun autre modèle animal ne présente ces caractéristiques.

Réduction

La taille de la cohorte a pour but d'utiliser le moins d'animaux possible permettant d’obtenir des résultats significatifs et généralisables. Nous déterminerons les effets de la manipulation du système ocytocynergiques en comparant les effets obtenus d’un agent activateur (ligand) chez des animaux porteurs de récepteurs modifiés de l’ocytocine (groupe test, n=6) et chez les animaux contrôle (n=4). L’utilisation du groupe contrôle permet de vérifier que notre effet est bien le fruit d’une activation des récepteurs modifiés et non, un simple effet du ligand. C’est pourquoi, la condition sans stimulation du groupe test ne peut être son propre contrôle. De plus, les résultats électrophysiologiques du groupe contrôle sont intéressants en soi car ils permettront d’établie une physiologie de base. Le nombre d’animaux a été déterminé selon une approche statistique conservatrice et, mais les expériences n’engageront pas 10 animaux simultanément. Nous procéderons au test d’une première cohorte, puis les données seront évaluées et complétées afin d’atteindre une significativité en procédant par étape, notamment en évaluant l’expression des récepteurs modifiés grâce à l’examen TEP (tomographie à émission de positon) chez le groupe test et la caractérisation de l’activité neuronale chez le groupe contrôle. Comme indiqué, les résultats du groupe contrôle seront traités même si le groupe test n’est pas continué, et complétés au fur et à mesure.

Raffinement

Plusieurs éléments de raffinement sont mis en œuvre : Recours à l’imagerie (IRM et TEP), qui se substitue pour la plupart des animaux à l’histologie post-mortem et permet d’envisager leur replacement en sanctuaire à l'issue des expériences. Utilisation de microélectrodes chroniques à contacts multiples de supprimer la phase de manipulation des électrodes et de réduire à minima les moments d’immobilisation de la tête. Les expériences seront conduites en conditions semi-éthologiques sans contrainte physique. Pré-entraînement par renforcement positif des animaux en salle de stabulation visant à réduire le temps et le stress induit par les prélèvements buccaux ou les injections. Nous utilisons des analgésiques, et anesthésiants pendant et après les chirurgies. La douleur et le comportement de l’animal sont scorés en post chirurgical, et le bien-être de l’animal est scoré de façon quotidienne. Enfin, les point limites stricts et spécifiques du projet sont déterminés et un score quotidien ou hebdomadaire est obtenu en fonction des étapes, et permet de mener les actions adéquates en fonction du score obtenu.

Choix des espèces

Notre projet utilise des singes macaques car certaines parties de leur cerveau et certains comportements sociaux que nous étudions ne se trouvent pas chez les rongeurs. Par exemple, les macaques utilisent principalement la vue pour comprendre leur environnement et montrent leurs émotions à travers leurs expressions faciales. Contrairement aux rongeurs, les macaques ont un système cérébral plus développé pour reconnaître les visages, les expressions faciales et interpréter le regard, ce qui est important pour réguler leur territoire. En utilisant des singes, nous pouvons mieux comprendre comment le cerveau traite ces informations. De plus, notre projet se concentre sur l'impact de l'ocytocine sur le comportement territorial. Chez les primates, les récepteurs de l'ocytocine sont présents dans plusieurs parties du cerveau liées à la vision et à l'attention, ce qui n'est pas le cas chez les souris. Nous allons également utiliser des techniques génétiques et pharmacologiques qui ont été efficaces chez les souris, mais qui nécessitent encore des tests chez les singes avant d'être appliquées chez l'homme. Nous travaillons avec des singes adultes car c'est à cet âge qu'ils développent un comportement territorial. Chez les macaques, les deux sexes participent à la défense du territoire. Ils vivent en groupes où plusieurs femelles cohabitent avec un mâle dominant, qui tolère quelques autres mâles. Les disputes territoriales ne sont pas seulement une question de hiérarchie, mais aussi de rivalité entre les groupes. En laboratoire, nous pouvons recréer cette situation en délimitant des "territoires" différents pour chaque groupe dans les volières.

Dépilées sur le dos sous anesthésie puis exposées vingt minutes aux ultraviolets, 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs tissus. Le porteur indique que l'irradiation peut provoquer une inflammation de la peau du dos, une perte de poids et des modifications de comportement. L'objectif est de caractériser des candidats analgésiques non-opioïdes en suivant l'action des cellules immunitaires de la peau et des neurones sensoriels. Les 30 souris ajoutées aux 270 calculées le sont pour parer à une éventuelle mauvaise qualité des ARN extraits, et les tests de sensibilité mécanique pratiqués sur animaux vigiles ne sont pas nommés.

Objectifs

Les solutions actuelles pour soulager la douleur des patients ont une efficacité limitée (effet de tolérance) et des effets secondaires graves. Actuellement les traitements disponibles pour les douleurs modérées et sévères/persistantes comme les opioïdes présentent de nombreux inconvénients. Ainsi, le développement de nouveaux médicaments pouvant traiter les douleurs aiguës est donc très important et s'avère d'une utilité publique majeure. C’est dans ce contexte que nous développons plusieurs nouveaux composés pharmaceutiques qui combleraient une lacune sur le marché de la douleur. Le rôle de ces composés ont déjà été démontré dans la gestion de la douleur, ainsi que dans la réparation des tissus. Cependant, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour déterminer les mécanismes moléculaires mis en jeu par ces composés pour moduler l’action des cellules immunitaires dans la régulation des voies de la douleur. La peau représente la première barrière physique contre les menaces extérieures et son intégrité est orchestrée par des cellules immunitaires résidentes spécialisées réparties dans les différentes couches qui la composent. La peau contient également un réseau dense de neurones sensoriels impliqués dans la perception du touché léger et de la douleur. De récentes études montrent également que le système nerveux sensoriel peut influencer l’activité des cellules immunitaires et ainsi optimiser les défenses contre une agression extérieure. Ainsi, pour répondre a ces questions nous avons choisis le modèle de lésions cutanés induite par une exposition aux ultraviolets (UV). Nous étudierons l’activité des cellules immunitaires de la peau et des neurones du système sensoriel (DRG) dans ces souris après exposition aux UV, traités ou non avec les différents composés pour déterminer l’impact du traitement sur la réponse immunitaire et la sensibilité mécanique.

Bénéfices attendus

La douleur est un problème majeur de santé public. Mieux comprendre comment TAFA4 module le système immunitaire dans les processus de mise en place de la douleur est primordial pour améliorer à terme le confort des patients atteints de douleurs chroniques et approfondir la compréhension de son mécanisme d’action. A terme, cette étude permettra de développer de nouveaux médicaments pour le traitement de la douleur inflammatoire sans effet secondaire. Des études précliniques réglementaires de toxicologie et de sécurité ont déjà été réalisées avec un composé utilisant le même mode d’action sans mettre en évidence d’effets secondaires, ni de phénomène d’accoutumance : problèmes majeurs des analgésiques actuellement sur le marché (opioïdes, paracétamol, etc...).

Procédures

Toutes les souris subiront une anesthésie générale afin de subir une dépilation sur la peau du dos puis une exposition aux UV pendant 20 minutes de la zone dépilée, toujours sous anesthésie. Nous réaliserons également des études de comportement pour tester la sensibilité mécanique induite par l’exposition aux UV sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les animaux seront amenés à subir une irradiation aux UV qui pourraient induire une perte de poids, des modifications de comportement en plus d'une inflammation de la peau du dos. Toutes ces procédures seront réalisées par un personnel qualifié et expérimenté et tout sera mis en œuvre pour minimiser la nuisance provoquée. De plus une observation approfondie est effectuée quotidiennement à l’aide de la grille d’observation (Annexe) après la mise en place du modèle inflammatoire afin de prévenir toute complication.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés car le prélèvement des différents tissus est indispensable pour étudier le recrutement cellulaire de la réponse inflammatoire au niveau des tissus étudiés.

Remplacement

TAFA4 a déjà été testé pour son activité analgésique dans différents modèles de douleurs. Le recours à l’utilisation d’animaux est nécessaire pour appréhender l’effet analgésique sur ce modèle post-ultraviolets dans son contexte physiologique mettant en jeu le système immunitaire et le système nerveux sensoriel. De plus la douleur ne peut être dissociée du système biologique global de l’animal, ainsi l’expérimentation animale sur des souris est indispensable à l’étude des phénomènes physiologiques et à la réalisation de notre projet.

Réduction

Pour répondre convenablement aux réponses scientifiques soulevées, nous estimons le nombre minimal de souris nécessaires à 270 animaux, auquel nous ajoutons une marge de 30 animaux au cas où il serait nécessaire d’ajouter des animaux pour compléter l’étude (par exemple, si certains ARNs purifiés à partir des tissus prélevés n’étaient pas d’assez bonne qualité pour pouvoir réaliser l’analyse transcriptionnelle). Un total de 300 animaux est prévu pour cette étude. Ce chiffre a été déterminé après l’utilisation d’outils statistiques (logiciel GraphPad) permettant d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaires avec une différence significative (p

Raffinement

Les souris utilisées dans ce projet sont élevées en groupes sociaux, dans des environnements complexes pour leur permettre de se comporter normalement. Les animaux sont élevés en présence d’objets permettant le raffinement de l’environnement dans des cages standards à toit ouvert (couvercle à filtre) avec de la sciure de bois utilisée comme litière et un accès ad libitum à un bidon d’eau et à un régime alimentaire standard. Nous utilisons alternativement des carrés de ouates pour que les animaux puissent faire un nid, des dômes en cellulose ou des tunnels en carton, qui sont changés chaque semaine. Les élevages sont effectués au sein d’un établissement agréé où 5 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages et ainsi tous les jours l’état sanitaire et environnemental des animaux est contrôlé. De plus, le week-end, la personne en charge du projet sera d’astreinte pour le suivi des animaux. D’autre part, le recours aux analgésiques est prévu dans le cas où l’état sanitaire des animaux le demandera (annexe grille de suivi). Nous avons recours à l’anesthésie/analgésie lors de l’exposition aux UV et des soins pré-, per- et post-opératoires adéquats sont administrés. Une planification fine des procédures expérimentale sera effectuée (disponibilité des locaux d’expérimentation, du matériel, période d’acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation et dans l’animalerie) permettant de diminuer le stress des animaux et favoriser la validité des expériences. Notamment lors du test de la sensibilité mécanique, les animaux seront acclimatés à l’enceinte 30 minutes avant d’effectuer les mesures afin de diminuer leur niveau de stress. Enfin l’établissement des points limites selon la grille en annexe avec un suivi quotidien consistera en une vérification du poids, de la vivacité et de l’état du pelage des animaux avant de continuer l’expérience ou non en fonction des signes vitaux des animaux. Une souris ayant perdu 20% de son poids initial sera systématiquement euthanasiée. Toutes ces stratégies d’optimisation seront mises en place dans le but de réduire voire supprimer la souffrance chez l’animal.

Choix des espèces

Le niveau de similarité entre la souris et l’homme justifie son utilisation. L’état des connaissances actuelles, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation font de la souris le modèle idéal à l’étude des systèmes immunitaires et nerveux. En effet les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires entre la souris et l’Homme. Des souris de 8 à 12 semaines seront utilisées car à ce stade elles ont atteint leur maturité en termes de défenses immunitaires et une maturité développementale du système nerveux. Ainsi, les animaux auront été commandés à 7 semaines auprès du fournisseur agréé de manière à ce qu'ils s'acclimatent à notre animalerie pendant au moins une semaine

Capturés au piège dans leur milieu, 150 mulots sylvestres et mulots à collier sauvages sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis relâchés. Chacun subit sous anesthésie gazeuse une prise de sang dans le sinus rétro-orbitaire, geste que le porteur chiffre à trois minutes entre la sortie du piège et la fin du prélèvement. Le projet poursuit deux objectifs déclarés, former des étudiants de master aux métiers de la conservation et suivre les pathogènes des rongeurs sauvages. Le porteur admet un taux de mortalité de l'ordre de 3 % lié au piégeage, par arrêt cardiaque, rupture des cervicales ou refroidissement, et justifie le choix de ces deux espèces par leur abondance et leur "facilité de capture".

Objectifs

Le présent projet s’inscrit dans des objectifs de formation pédagogique et scientifique des étudiants de niveau Master ayant pour projet professionnel de travailler dans les métiers de l’environnement appliqués à la conservation d’animaux sauvages. Les objectifs sont i) de fournir un niveau de connaissance adapté à l’utilisation d’animaux de la faune sauvage à travers une approche éthique (présentation des comités d’étiques en expérimentation animale, règle des 3R,…) ; ii) initier les étudiants à la capture de Micromammifères (essentiellement le Mulot sylvestre (Apodemus sylvaticus), le Mulot à collier (Apodemus flavicollis) et le Campagnol roussâtre (Myodes glareolus), potentiellement d’autres espèces sauvages moins abondantes ; le présent projet portera cependant uniquement sur les 2 espèces de Mulots, les autres espèces seront relâchées immédiatement, cf ci-dessous) ; iii) présenter les risques liés à la contention et les bonnes pratiques de terrain ; et iv) intégrer le bien-être animal en condition de captivité. Les échantillons récoltés avec les étudiants permettront ensuite de réaliser un suivi à long terme de l’état de santé des populations de rongeurs à l’échelle régionale et de maintenir une surveillance des pathogènes présents chez les rongeurs.

Bénéfices attendus

L’apport de connaissances nouvelles à des étudiants pouvant être amenés à manipuler des animaux sauvages dans leur cursus professionnel, et l’obtention de données nouvelles, remplissent un objectif à la fois pédagogique et scientifique à travers une approche non-létale. La formation à l’éthique et au bien-être animal répond ainsi aux enjeux sociétaux et de perfectionnement personnel d’une pratique encadrée par un context légal et qui s’inscrit directement dans les plans de carrière de certains étudiants. De plus, la formation à une démarche non létale sur des mesures hématologiques, immunologiques et hormonales est innovante et offrira un panel de compétences attractives auprès de leurs futurs employeurs. Sur le plan scientifique, le suivi de l’état de santé de rongeurs sauvages sur les sites d’études permettrait une meilleure compréhension des enjeux sociétaux actuels, mais aussi de définir des risques épidémioloques pour la présence de zoonoses dans l’environnement.

Procédures

Les animaux subiront une prise de sang dans le sinus rétro-orbitaire sous anesthésie. Cette procédure sera réalisée par un personnel formé et expérimenté. Le temps estimé d’une prise de sang (avec identification spécifique, sexage et mesures morphométriques) est de l’ordre de 3 minutes de la sortie du piège à la fin du prélèvement.

Impact sur les animaux

Au cours de la manipulation, les animaux peuvent ressentir un stress lié à la capture, la contention, et la manipulation. Les parties potentiellement douloureuses ou particulièrement stressantes (prise de sang notamment) se font cependant sous anesthéise gazeuse. L’anesthésie gazeuse évite une injection (intrapéritonéale), l’induction de l’anesthésie est rapide (de l’ordre de 30 secondes) et l’anesthésie elle-même est brève (de l’ordre de 3 min, permettant l’identification spécifique, le sexage, les mesures morphométriques et la prise de sang), évitant une hypothermie. A l’issue de la prise de sang dans le sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, un lubrifiant oculaire et un anesthéisant local seront appliqués sur l’œil des individus. Par la suite, les animaux seront placés dans des boîtes dortoirs pour être remis en liberté après un temps de repos (minimum 1 heure) et la vérification préalable de leur bon état de santé (œil en bon état, comportement normal, cf § relatif aux points-limites ci-dessous). Cette méthode de prise de sang n’est pas substituable à un prélèvement dans la queue qui donne un volume trop faible ou dans le sillon mandibulaire . De précédents tests de prise de sang dans le sinus mandibulaire ont été effectués par des personnes qualifiées à ce type de prélèvement sur souris de laboratoire mais n’ont pas permis de réaliser des prises de sang. L’absence de ce sinus chez les Mulots est suspectée.

Devenir

Les animaux seront relâchés à l’issue de chaque procèdure en considérant qu’aucun traitement pouvant moduler leur réponse immunitaire ou affecter leur comportement ou fonction écologique ne pourrait affecter le devenir de ces animaux en condition naturelle. Cette remise à l’état sauvage prend en compte l’expérience des responsables du projet et le travail de la SBEA ayant statué à l’unhanimité sur la possibilité de réaliser un prélèvement sanguin comme indiqué dans chaque procédure suivi du relâcher des animaux.

Remplacement

Le double objectif du projet est (i) de former des étudiants aux méthodes éthiques et réglementaires d’utilisation d’animaux de la faune sauvage à des fins scientifiques et (ii) d’acquérir des données de long terme sur l’état de santé et les pathogènes de micromammifères sauvages. L’utilisation d’animaux est requise car, à notre connaissance, aucune approche de modélisation ne permettrait d’obtenir de telles données. Des études comparatives sur le système immunitaire de rongeurs ayant montré que la réponse immunitaire d’individus sauvages et d’animaux de laboratoire différait significativement (Abolins et al., 2017; Viney and Riley, 2017),l’utilisation d’animaux sauvages est également requise. L’étude pathogènes potentiellement zoonotiques ne peut par ailleurs se faire que sur animaux capturés dans l’environnement et non sur animaux-modèles de laboratoire.

Réduction

La variabilité inter-individuelle des réponses immunitaires est très forte en conditions naturelles et la reproduction de ces mêmes conditions n’est pas possible en laboratoire. De nombreuses études scientifiques commencent à intégrer les conditions environnementales comme effets modulateurs de la réponse immunitaire face aux infections (Flies and wild comparative immunology consortium, 2020). Parmi les agents infectieux susceptibles d’étre identifié, Borrelia burgdorferi, l’agent responsable de la maladie de Lyme présente des prévalences parfois très faibles au sein de populations de Mulot sylvestre (Apodemus sylvaticus) et de Mulot à collier (Apodemus flavicollis). Sur la base de ces informations, les effectifs prévus pour les procédures 1 and 2 ne peuvent être inférieurs à 30 rongeurs (Procédure 1) et 30 rongeurs (Procédure 2) par site d’étude et par an pour garantir une puissance statistique suffisante et la valorisation scientifique des résultats.

Raffinement

En ce qui concerne les captures, les pièges sont relevés au moins une fois par jour. Cependant, la littérature ainsi que l’expérience des personnels impliqués dans ce programme laissent envisager un taux de mortalité de l’ordre de 3%. Les causes de décès peuvent être un stress conduisant à un arrêt cardiaque, une rupture des cervicales ou un refroidissement en période froide (peu probable au printemps) et/ou pluvieuse dans les pièges). En dehors de l’arrêt des captures en cas de conditions météorologiques défavorables, ces mortalités indésirables sont difficilement totalement évitables. Les conditions de captivité des animaux seront conformes aux conditions des Rongeurs de laboratoires (Cages normalisées, nourriture et eau fournis ad libitum), sauf en ce qui concerne la captivité individuelle, mais avec un enrichissement aussi élaboré que possible (Dortoir et coton permettant la confection d’un nid, structures de carton, roue et balle pour le jeu). Les animaux seront hébergés sous tente avec un contrôle des conditions environnementales (Température, hygrométrie) et les anesthésies, mesures et prélèvements seront effectués dans le véhicule agréé pour expérimentation animale, donc en des lieux séparés. Les mesures et prélèvements seront effectués sous anesthésie par du personnel qualifié.

Choix des espèces

Les espèces choisies sont le Mulot sylvestre (Apodemus sylvaticus) et le Mulot à collier (Apodemus flavicollis). Le Mulot sylvestre et le Mulot à collier sont des Micromammifères abondants, ubiquistes, opportunistes avec un régime alimentaire varié. Leur positionnement trophique intermédiaire les place comme une source de nourriture de premier choix pour un grand nombre de prédateurs (Rapaces et Mammifères) incluant des espèces patrimoniales (Milan royal par exemple). Leur utilisation dans des travaux scientifiques en écologie, écotoxicologie, ou écoépidemiologie est fréquente, permettant une relation des résultats obtenus ici avec la littérature internationale, tant par les étudiants concernés que par l’équipe de recherche (Chrono-environnement). Leur facilité de capture et leur capacité à être maintenus en captivité en font un modèle biologique idéal par rapport aux objectifs scientifiques de cette étude. Seuls les Rongeurs d’âge adulte et les femelles non gestantes seront utilisés pour cette étude.

Anesthésiés, pesés, mesurés, sexés, puis micropucés sous la peau en moins d'une minute de contention, 500 crapauds communs sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cent d'entre eux reçoivent en plus une peinture fluorescente sur le ventre, et trente un écouvillonnage du mucus. L'objectif déclaré est d'évaluer si les tunnels et les parois de guidage installés le long d'une route départementale permettent aux crapauds d'atteindre leurs mares de reproduction sans se faire écraser. Tous sont relâchés, mais le porteur prévoit la mise à mort des individus capturés trop blessés ou trop maigres, ainsi que de ceux qui ne retrouvent pas un comportement normal après deux heures d'observation.

Objectifs

Les amphibiens ont un cycle de vie complexe, composé d’une phase aquatique (reproduction et stade larvaire) mais aussi d’une importante phase terrestre généralement forestière qui constitue la plus grande partie du cycle de vie. Si la première phase est très étudiée, les connaissances sur la phase terrestre sont en revanche plus limitées, du fait de la difficulté de suivre des individus en déplacement. L’étude portera sur une population de crapaud commun dont les habitats terrestres et aquatiques se situent de part et d’autre d’une route départementale. Cette route a été récemment équipée de paroi de guidage et de tunnels de manière à faciliter l’accès des crapauds aux mares et limiter les risques d’écrasements routiers. Le projet a pour but la conservation de cette population en agissant sur l’amélioration de la connectivité des habitats occupés par l’espèce. L’objectif est d’évaluer le comportement des crapauds communs au voisinage de la route : fonctionnalité des dispositifs de guidage, attractivité et franchissabilité des tunnels. La méthodologie proposée implique l’implantation de micropuces sous la peau des crapauds, ainsi que l’installation de systèmes de détection des puces au niveau de 2 tunnels afin de caractériser le comportement des crapauds et mettre en œuvre le cas échéant des mesures complémentaires pour améliorer leur efficacité (attractivité et franchissabilité). Le suivi sera réalisé sur deux années minimum et jusqu’à 5 ans pour prendre en compte la variabilité des conditions environnementales et tester d’éventuelles mesures correctives. Si le quota d’animaux marqué n’est pas atteint, le projet prévoit le report des marquages l’année suivante.

Bénéfices attendus

Cette étude devrait permettre de mieux connaître le comportement des crapauds communs au niveau des tunnels lors de la migration de reproduction ainsi que les déplacements retour après reproduction, encore peu décrits. Les résultats permettront de mettre en évidence les blocages éventuels des animaux, les risques d’écrasements routiers ou encore la mauvaise efficacité des tunnels. Des aménagements seront alors envisagés pour améliorer ces dispositifs et leur efficacité sera évaluée en appliquant le même protocole de marquage et de suivi.

Procédures

Après anesthésie et analgésie et un temps d’attente de 5 minutes, les animaux seront mesurés pesés, et sexés puis une micropuce sera injectée sous la peau de 500 crapauds. Un marquage temporaire à l’aide d’une peinture fluorescente sera appliqué sur le ventre de 100 crapauds et un écouvillons permettra de recueillir un peu de mucus sur 30 individus. Ces interventions nécessiteront de maintenir les crapauds pendant 1 minute.

Impact sur les animaux

La probabilité d’apparition d’effets indésirables voire de mortalité des individus à la suite d’un stress dû à la capture, à la manipulation lors de la biométrie et au marquage ne peut être réduite à zéro. Cependant ces risques restent faibles : l’espèce cicatrise bien et la bonne formation des opérateurs mène à un risque quasi-nul de complication post-marquage.

Devenir

Tous les individus capturés puis marqués seront relâchés pour l'étude de leur comportement in situ.

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du comportement d’amphibiens sauvages doit obligatoirement être réalisée in situ sur les espèces cibles. Il est nécessaire de capturer des animaux sauvages, de les marquer individuellement et de les relâcher vivants au niveau de la zone de capture. Ensuite, les déplacements sont évalués en utilisant des dispositifs de détection fixes. Peu de données existent quant aux comportements des crapauds communs entre leurs habitats terrestres et aquatiques. On ne peut donc pas se référer à la littérature ni avoir recours à des avis d’expert pour évaluer des comportements théoriques attendus pour cette espèce : une expérimentation in situ reste indispensable.

Réduction

Les captures et marquages sont prévus sur deux ans (maximum 5 ans si reports des marquages en cas de conditions environnementales défavorables). Les effectifs prévus tiennent compte de la densité d’individus lors des derniers comptages en 2022 et sont un minimum (250 individus / an ; règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire des comportements. L’effectif a été déterminé en prenant en compte les risques de mortalité post-opératoire (très limités en respectant les préconisations de tailles minimales), la possibilité de perte de la puce (peu probable mais possible dans les semaines / mois suivant l'implantation), la possibilité que les crapauds ne rentrent pas dans les tunnels ou traversent au niveau d’un tunnel non équipé d’antennes de détection. En outre, les risques de mortalité naturelle (prédation, maladie, écrasement routiers) ne sont pas à exlure. L’effectif prévu tient compte de ces phénomènes, pour garantir un minimum d’enregistrements au niveau des dispositif de détection fixes (a minima 50 individus détectés par tunnel). Il n'est pas prévu d'analyses statistiques dans le cadre de cette étude comportementale in natura, en-dehors des statistiques descriptives (taux d’entrée, taux de franchissement, refus, durée moyenne de déplacement, taux de survie apparent) et des statistiques sur le temps d’induction moyen de l’anesthésiant et le temps de réveil moyen des animaux.

Raffinement

Le raffinement des procédures sera pris en compte de la capture des animaux jusqu’au relâcher dans leur milieu naturel. Les animaux seront capturés dans des seaux percés enrichis de litière humide et seront stockés dans un bac sombre jusqu’au marquage également enrichi de terre/litière humide/abris. Seuls les individus jugés en bon état sanitaire (absence de blessure, d’infections visibles ou de troubles du comportement) seront marqués, les autres seront soit relâchés sans marquage, après stabulation, soit mis à mort si les signes cliniques observés (blessures profondes, signes marqués d’infection, maigreur excessive) nécessitent une mise à mort compassionnelle. La taille des micropuces sera adaptée à la taille de l’animal et seuls les crapauds de taille suffisante seront marqués pour supporter la micropuce. Le matériel d’injection sera désinfecté et les opérateurs porteront des gants non poudrés. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre un anesthésiant-analgésique sera appliqué au niveau du point d’injection 5 minutes avant injection. L’accent sera mis sur la rapidité d’exécution des mesures biométriques et du marquage, l’expérience du personnel permet de réduire le temps global de manipulation à moins d’une minute. Le comportement après marquage sera contrôlé pendant 20 à 30 minutes, avant remise en liberté, de manière à déterminer l’atteinte de points limites : léthargie ou réticence à se déplacer, changement dans la démarche. En cas de difficulté à recouvrer un comportement normal ou en cas de changement significatif de comportement, la phase d’observation sera prolongée pendant 2 heures maximum avant mise à mort.

Choix des espèces

Le but est d’étudier le comportement du crapaud commun au cours de sa migration entre son habitat forestier et ses habitats de reproduction (mares), de manière à assurer sa conservation ; ainsi le remplacer par une autre espèce n’est pas envisageable. Seuls les crapauds adultes seront étudiés, car ils correspondent aux individus en migration de reproduction.

Un lapin par groupe sera tué pour analyse des tissus, soit 8 sur 32, le porteur écrivant qu'il tentera de replacer les 24 autres dans la mesure du possible. Les 32 lapins vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun subit jusqu'à quatre anesthésies générales de deux heures et huit prélèvements sanguins de 3 à 5 ml, effectués sur animal vigile dans une cage de contention, pour tester si des comprimés d'ARN messager placés sous la langue déclenchent une réponse en anticorps. Le porteur affirme avoir mené les tests possibles sur cellules avant d'en venir aux lapins, mais conclut qu'un essai sur "organisme entier" reste "nécessaire" puisque des cellules ne produisent pas de réponse immunitaire.

Objectifs

La vaccination génétique par ARN messager administré par voie intramusculaire a récemment fait preuve de son efficacité clinique dans le contexte de l'épidémie de COVID-19. Néanmoins, les formulations actuellement utilisées nécessitent une conservation au froid, à -20°C au mieux, voire -80°C. Nous avons développé une formulation sous forme de comprimés muco-adhésifs stables à température ambiante, ou à 4°C, et destinée à une administration mucosale par voie buccale (sous la langue ou contre les joues). Le projet d'expérimentation animale décrit ici concerne une étude de l'efficacité éventuelle de ces comprimés d'ARN messagers pour induire une réponse immunitaire chez le lapin, par administration buccale. Cela permettra de déterminer si ces comprimés peuvent poursuivre un développement vaccinal pré-clinique, puis clinique plus poussé.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre de la mise au point d'une nouvelle formulation vaccinale par ARNm. Il permettra de déterminer si les formulations étudiées (dont l'activité est démontrée) peuvent être administrés par voie buccale sans toxicité particulière, et permettre l'induction d'une réponse immunitaire de type anticorps. En cas de réponse positive, cela permettrait ultérieurement de poursuivre le développement de ces formulations dans un but vaccinal. Ces formulations seraient particulièrement avantageuses du fait de leur stabilité à température ambiante, permettant un stockage plus facile, et donc un accès à des vaccins pour une population plus large.

Procédures

Les animaux seront soumis à quatre anesthésies générales au maximum de 2h environ, et à 8 prélèvements sanguins de 3 à 5ml sur animaux vigiles placés dans une cage de contention. La durée d'un prélèvement est de l'ordre de deux minutes

Impact sur les animaux

Il s'agit ici d'une administration muscosale par voie buccale (placement sous la langue et contre les joues) de comprimés muco-adhésifs. Les comprimés seront réalisés avec des excipients déjà utilisés en clinique humaine, et n'ayant pas de toxicité particulière connue. Néanmoins, les animaux seront soumis à 4 anesthésies générales au maximum, et au stress induit par cette procédure, ainsi qu'à celui dû aux différentes prises de sang (et à l'utilisation de la cage de contention pendant quelques minutes).

Devenir

Pour analyse de tissus, un animal par groupe sera mis à mort. Nous tenterons de replacer les 24 autres dans la mesure du possible

Remplacement

Avant de recourir à l'expérimentation animale, les tests alternatifs réalisables ont été faits : évaluation de la fonctionnalité des ARN messager comprimés et efficacité d'expression de l'antigène par des tests sur culture cellulaire, tests de toxicité sur culture cellulaire également. Néanmoins, un test sur organisme entier est nécessaire, les tests sur cellules ne pouvant induire une réponse immunitaire.

Réduction

Nous avons décidé de n'étudier qu'une partie des formulations sous forme de comprimés réalisées. Il s'agit ici d'examiner si les formulations étudiées peuvent, ou non, engendrer une réponse immunitaire importante. Nous avons prévu des groupes de 4 animaux par formulation, la variation interindividuelle dans le domaine de la vaccination pouvant être importante. La réponse que nous attendons est de type "tout ou rien", et chaque animal est son propre contrôle. En conséquence, aucune analyse statistique n'est nécessaire dans ce projet. Si les résultats (réponse immunitaire chez un ou plusieurs animaux) permettent d'envisager un développement plus poussé des produits, cela sera l'objet d'un projet ultérieur. Par ailleurs, pour chaque formulation, nous commencerons par immuniser 2 animaux. Si la réponse en anticorps est analysable, nous n'incluerons pas les 2 autres animaux prévus dans le groupe.

Raffinement

Le protocole expérimental n'induit pas de souffrance particulière autre que celle due à des anesthésies générales. Le projet nécessite des prises de sang régulières. La première prise de sang sera effectuée une semaine avant le début des immunisations pour permettre une récupération totale. Les prises de sang seront limitées à quelques millilitres, 5ml au maximum. Par ailleurs, les animaux seront surveillés jusqu'au réveil de leur anesthésie. Ils seront ensuite suivis quodiennement lors d'une veille sanitaire, et suivis par le porteur de projet deux fois par semaine en regard de points limites pré-établis.

Choix des espèces

Le lapin est adapté pour ce type d'expérience car les rongeurs habituellement utilisés (rats, souris) ont une cavité buccale dont les propriétés de perméabilité sont non représentatives de celle de l'humain. Le lapin a, lui, une cavité buccale dont la structure mucosale est très semblable à l'humain, et donc beaucoup plus représentative. Les animaux utilisés devront avoir un système immunitaire fonctionnel : Ce seront des lapins de 2 à 3 mois, âge à partir duquel ils sont habituellement vaccinés (en tant qu'animaux domestiques), et avec lesquels nous avons toujours obtenu de bons résultats.

96 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour exploration anatomique et histologique. Chacune reçoit quinze gavages quotidiens de tamoxifène ou d'huile de maïs à partir de la sixième semaine de vie, puis cinq injections intrapéritonéales étalées sur deux mois. Elles portent une mutation qui provoque des lésions vasculaires vers quatre à six mois et des saignements vers douze, le porteur prévoyant de les tuer avant huit mois pour rester en deçà du phénotype dommageable. Il qualifie pourtant ce protocole de "peu invasif" et écrit que le gavage "ne devrait pas induire de douleur", tout en reconnaissant un risque de fausse route.

Objectifs

1)Meilleur compréhension de la fonction d'un gène et de de l'arrêt de la croissance cellulaire irreversible dans les cellules graisseuses dans un contexte de la maladie des syndromes d'hypercroissance dysharmonieuse. 2)Tester l’efficacité d'une thérapie génique en surexprimant une molécule d'interrêt.

Bénéfices attendus

Trouver une nouvelle cible thérapeutique dans ce syndrome.

Procédures

Un gavage au tamoxifene ou à l'huile de maïs sera réalisé à 6 semaines de vie. Des injections intra-péritonéales seront effectuées par un technicien expérimenté. Les injections débuteront à la semaine 6 de vie toutes les 2 semaines pendant 2 mois. Les animaux seront injectés soit par le véhicule (AAV9-GFP) soit par AAV9-G3PP. Un gavage oral sur souris vigiles sera réalisé à 6 semaines de vie et répété quotidiennement pendant 2 semaines soit au total 15 gavage par souris (1 minute par gavage). Des injections intrapéritonéales sur souris vigiles seront effectuées à la semaine 6 de vie toutes les 2 semaines pendant 2 mois soit 5 injections/souris d'une durée de 30 secondes par souris/injection

Impact sur les animaux

Une injection intra-péritonéale peut engendrer des irritations. Elles nécessitent une contention et induisent une douleur légère de courte durée peu invasives. Le gavage quotidien peut engendrer des risques de fausse route. Le geste ne devrait pas induire de douleur car le geste est parfaitement maîtrisé et les sondes de gavage utilisées sont flexibles et adaptées à la morphologie de l'animal. Les souris développent des lésions vasculaires non dommageables à 4-6 mois puis un phénotype métabolique à 12 mois avec l'apparition de saignements, cependant nous étudierons les souris jusqu'à 8 mois maximum avant l'apparition du phénotype dommageable.

Devenir

Procédure 1: animaux mis à mort pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Dans un contexte de recherche physiopathologique sur les syndromes d'hypercroissance, les expérimentations in vivo ne peuvent en aucun cas être remplacées par des expériences in vitro, où les cellules sont sorties de leur environnement. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas utilisables dans ce contexte car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu. Les résultats obtenus in vitro nous ont permis d'identifier un gène d'interrêt que nous allons tester in vivo.

Réduction

La taille des groupes utilisés (n=16), minimum nécessaire et suffisante pour l’obtention de résultats significatifs, en utilisant des tests statistiques adaptés, qui satisfait à l’objectif de réduction du nombre d’animaux exposés dans ce projet.

Raffinement

Ce protocole est peu invasif puisque les injections intra-péritonéales seront réalisées sur des souris mises dans des conditons de calme, par un technicien expérimenté. Les injections débuteront à la semaine 6 de vie pendant 2 mois. Les animaux seront injectés soit par le véhicule soit par un outil moléculaire. Aucun prélevement ne sera effectué chez les souris. A priori la surexpression de notre molécule devrait améliorer le phénotype des souris qui seront surveillées quotidiennement.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de faciliter d’élevage et de reproduction. Ces souris sont particulièrement intéressantes pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines d'interrêt). La souris est le seul animal pour lequel la protéine d'interrêt a été mutée. Les jeunes souris de 6 semaines sont utilisées car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée.