Recherche fondamentale

Tous tués au terme de l'étude pour analyse de leur œil, 104 rats aveugles et immunodéprimés reçoivent une greffe de cellules rétiniennes humaines, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit sept anesthésies en trois mois pour la chirurgie intraoculaire, l'imagerie et l'enregistrement de l'activité électrique de la rétine. Le porteur signale des décollements localisés de rétine et de petites hémorragies oculaires possibles après injection, une perte de poils liée à la lignée qui s'accumule sous les paupières, et une mise à mort immédiate en cas d'inflammation ou d'infection de l'œil. Il retient un taux d'échec de 20 à 30 % lié à la chirurgie, au rejet de greffe ou à l'opacification du cristallin, chiffre intégré au calcul des effectifs.

Objectifs

Les rétinites pigmentaires (RP) entrainent des pertes sévères et rapides de la vision pouvant conduire jusqu’à la cécité et affectent des millions de personnes dans le monde. Les RP sont d’origine monogénique et affectent environ 200.000 personnes en France. Jusqu’à présent aucun traitement n’est disponible dans la plupart des cas. Dans ce contexte, la thérapie cellulaire visant à remplacer l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dysfonctionnel ou perdu constitue une piste déjà très avancée avec l’incroyable potentiel thérapeutique des cellules souches pluripotentes induites (cellules iPS). le projet consiste à greffer des cellules de patients RP modifiées génétiquement pour corriger la mutation à l'origine de la pathologie. Ainsi, cela permettra de démontrer que les cellules de patients sont devenues fonctionnelles.

Bénéfices attendus

Il n'existe peu ou pas de traitement pour soigner les rétinites pigmentaires ou pour restaurer la vision quand celle-ci est perdue. L 'objectif est de développer des approches de thérapie cellulaire à partir de cellules souches pluripotentes humaines différenciées en cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) pour préserver la vision dans ces maladies.

Procédures

Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale sera réalisée chez les rats. De plus, la chirurgie sera réalisée sous analgésie en complément de l’anesthésie. Cette opération consistera en la transplantation intraoculaire (sous la rétine) de trois types de cellules de la rétine différentes assemblée en un feuillet de cellules. Pour ces études une lignée de rats modélisant la rétinite pigmentaire et avec une immunodéficience (pour éviter les rejets de greffe) sera greffée avec les cellules. Cette opération sera rapide et durera 15 à 20 minutes. Elle ne sera réalisée qu’une seule fois par rat. Tous les animaux seront examinés par imagerie permettant l’observation de l’anatomie et la structure de la rétine (15 minutes par rat) et feront également l'objet d’un examen de l'activité électrique de la rétine (30 minutes par rat) qui permettra l’étude de la fonction de ce tissu. Ces examens qui nécessitent l’immobilité de l’animal se feront sous anesthésie générale. Les animaux seront également évalués avec un test comportemental à l’état vigil sans contrainte particulière. Ce test de la fonction visuelle est rapide (5 à 10 minutes environ). Tous ces examens seront réalisés une fois par mois (pendant 3 mois). Aucun prélèvement ne sera réalisé sur les animaux vivants. Les rats seront euthanasiés à la fin de l'étude par une méthode réglementaire en vue d'une analyse histologique de l'oeil.

Impact sur les animaux

-Anesthésies : 7 fois par animal au cours de l’étude qui dure 3 mois (risque cardio-respiratoire et d’hypothermie) -Les injections sous-rétiniennes/greffes peuvent provoquer des lésions temporaires comme des décollements localisés de la rétine et de petites hémorragies oculaires. -Un léger stress peut être engendré lors du changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’electroretinogramme). -Le phénotype nude entraine une perte de poils à 3 ou 4 semaines avec une réapparition par touffes au cours de la vie du rongeur. Ces poils peuvent s'accumuler dans l'oeil sous les paupières et cela nécessite donc un soin particulier pour éliminer cette accumulation. Les animaux sont plus susceptibles de développer des infections opportunistes du fait de leur statut immunodeficient.

Devenir

A la fin de chacune des procédures, les animaux sont euthanasiés pour permettre des analyses histologiques ou fonctionnelles (électrophysiologiques) des tissus (rétine). Ces explorations sont nécessaires pour évaluer le bénéfice de la transplantation au cœur du projet et le devenir des cellules transplantées (intégration au tissus de l’hôte, etc…).

Remplacement

Le projet consiste à évaluer la capacité d’une greffe de cellules à permettre une préservation de la fonction visuelle. Cette évaluation ne peut donc pas être faite par des approches in vitro. Les approches in vitro ne permettent d'évaluer que des paramètres isolés de culture et non des interactions avec une rétine. Il n'est ainsi pas possible de démontrer la fonctionnalité d'un produit de thérapie cellulaire de la rétine autrement que in vivo. Ce projet ne peut être réalisé que chez l’animal.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, les transplantations seront réalisées dans un seul oeil ; l’oeil controlatéral servira de contrôle évitant d’utiliser d’autres animaux dans ce but. Par ailleurs, la majorité des actes peuvent être réalisés sur les mêmes animaux permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Nous avons réduit le nombre d’animaux par groupe au minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables en tenant compte de la variabilité plus importantes des mesures effectuées (en raison d’un taux d’échec évalué à 20-30 pour cent (chirurgie, rejet de greffe, opacification du cristallin, etc..)) lors de nos précédentes études aux approches similaires. Le nombre a été calculé sur la base des données de la littérature pour des approches similaires et en fonction du devenir post-mortem des animaux. Pour limiter le nombre d’animaux, Les résultats seront analysés à l’aide de tests statistiques adaptés aux petits effectifs. Au total, 104 animaux sont prévus pour cette étude.

Raffinement

- Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la réglementation (cages de stabulation avec enrichissement (bâtons à ronger, lambeaux de papier kraft), nourriture et boisson à volonté). Dans ce modèle de rat, le phénotype immunodéprimé entraine une perte de poils à 3 ou 4 semaines avec une réapparition par touffes au cours de la vie du rongeur. Ces poils peuvent s'accumuler dans l'oeil sous les paupières et cela nécessite donc un soin particulier pour éliminer cette accumulation. Le phénotype aveugle ne gêne pas l'accès à l'eau et à la nourriture qui sont facilement accessibles et à volonté dans la cage. Les rats bénéficieront d’une anesthésie générale fixe. Pour les injections intraoculaires, une anesthésie préalable de la cornée sera réalisée. Le risque de douleur généré par la transplantation de tissus est géré en pré- et post-opératoire par l’injection d'analgésiques. Les animaux feront l’objet d’une surveillance plus accrue pendant les 24 heures suivant les différents actes (réveil post-anesthésie, état de la surface oculaire après les électrorétinogrammes, signe d’inflammation, etc…). Tout signe d’ inflammation ou d’infection de l’œil entraînera l’euthanasie.

Choix des espèces

Les rats sont couramment utilisés dans les études précliniques permettent une comparaison des résultats avec ceux de la littérature. La taille de l’animal rend le geste technique (transplantation sous-rétinienne) moins difficile que chez la souris par exemple, ce qui réduira significativement le risque d’échec de la procédure et donc le nombre d’animaux nécessaire à l’étude. Rats modèlisant la rétinite pigmentaire et immunodéficient : Ces rats portent une mutation spontanée qui conduit à la perte rapide de la vue et une autre mutation qui affaibli le système immunitaire (pour prévenir le rejet de greffe). Comme la perte des cellules de la rétine débute dès 3 semaines après la naissance, les rats seront opérés à 4 ou 5 semaines (début de la dégénérescence des photorécepteurs). L'ensembles des autres actes des différentes procédures seront réalisées au plus tôt un mois après la transplantation : à 2, 3 et 4 mois, le stade le plus tardif prévu par l’étude.

1 680 souris et 3 120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour l'étude histologique de leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut subir jusqu'à deux chirurgies cérébrales, des administrations répétées de nanoparticules et, en option, cinq à six heures d'enregistrements électrophysiologiques sous anesthésie. Le porteur décrit une récupération difficile après chirurgie, mobilité réduite, attitude de repli et poil terne, et affirme par ailleurs que le modèle de maladie neurodégénérative "n'entraîne pas de symptôme marqué". La description des procédures tient en quatre lignes pour 4 800 animaux, et les tests comportementaux annoncés au titre de la réduction ne sont jamais précisés.

Objectifs

Actuellement, Les maladies neurodégénératives ne possèdent pas de traitement curatif, mais seulement des traitements symptomatiques ayant un effet limité, accompagné d’effets indésirables. Le but de ce projet est de développer un outil thérapeutique visant à restaurer la voie de « nettoyage » des neurones en permettant ainsi l’élimination de protéines qui s’agrègent et tuent les neurones. Les lysosomes sont des organites cellulaires impliqués dans la survie des cellules, en dégradant certaines molécules anormales qui s’accumulent provoquant ainsi des pathologies neurodégénératives. Or chez les patients atteints de certaines formes de ces pathologies, la fonction lysosomale est perturbée et ne permet donc plus le nettoyage cellulaire dans les neurones, entrainant leur mort. La stratégie de ce projet est donc de développer et tester via différents modes d’administration des nanoparticules contenant des molécules permettant de refonctionnaliser la voie de « nettoyage » des neurones dans différents modèles animaux de la Maladie de Parkinson.

Bénéfices attendus

Les synucléinopathies comme la maladie de Parkinson touchent plus de 100.000 personnes en France, dont 80% sont âgées de plus de 65 ans, au cours des années à venir nous allons observer une augmentation importante du nombre de cas en raison du vieillissement de la population et de l'amélioration de l'espérance de vie. De ce fait la découverte d’un traitement curatif utilisant des nanoparticules est un des grands axes de notre recherche. Ce projet s’inscrit dans une optique à long terme avec à terme une application clinique du composé utilisé.

Procédures

Chirurgie : au maximum deux chirurgie de 30 minutes. Traitements avec les différents modes d'administration. Récolte d'urine excrétée. Enregistrements électrophysiologiques (optionnels) durée 5 à 6h sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Effets liés à la chirurgie, mais bien encadrés au niveau analgésie et avec un suivi postopératoire sur 3 jours minimum. Effets liés à la chirurgie pour les enregistrements électrophysiologiques (optionnels). Le modèle neurodégénératif chez la souris ou le rat n'entraine pas de symptome marqué, en effet les désordres sont plutôt visibles à l'échelle moléculaire.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de réaliser une étude histologique détaillée du cerveau.

Remplacement

Dans le respect du R de remplacer, dans l’état actuel des connaissances, nous ne pouvons pas nous passer d’animaux vivants, car il n’est pas possible de mimer le développement spatiotemporel des synucléinopathies dans des modèles in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux est calculé par une approche statistique afin d'obtenir des résultats significatifs en réalisant une cohorte par groupe. Nous utilisons des tests comportementaux qui sont non invasifs et permettent un suivi au long cours sur un même animal. Les organes étudiés en fin de procédure représenteront une banque de tissus utilisable pour d'autres analyses ultérieures au sein de notre Institut (cerveau en général et pour ce projet particulièrement reins, foie).

Raffinement

Acclimatation : une période de deux semaines d'acclimatation permet aux animaux de se familiariser avec leur nouvel environnement. Les animaux sont hébergés dans des cages transparentes placées sur portoirs ventilés et maintenues à 21°C et 55% d’humidité. L'enrichissement de leur milieu est représenté par des maisons en papier mâché que les animaux peuvent utiliser pour se cacher ou ronger. Des batonnets de bois sont aussi intégrés dans les cages pour permettre aux animaux de ronger. Anesthésie et analgésie : la douleur et l’inconfort générés par la chirurgie et les méthodes d’administration sont maitrisés par un recours à l’anesthésie (gazeuse) et l’utilisation d’analgésiques. Des points limites adaptés pour les deux espèces sont uivis : une mobilité réduite voir difficile suite à la chirurgie, une attitude de repli, une allure du poil terne et mal nettoyé (difficulté à récupérer le poids initial) dans les jours suivant la chirurgie. Un suivi post-opératoire est dans tous les cas réalisé grâce à une fiche de scorage qui évalue la perte de poids, la mobilité, les interactions avec les congénères, aspect du poil. Les animaux sont pesés de manière hebdomadaire pendant toute la durée de l’étude.

Choix des espèces

La souris et le rat sont des espèces de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est assez proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques à une échelle moléculaire. Cela rend les enseignements tirés de l'étude des tissus du rat largement transférables à l'homme. De plus, ces espèces permettent d’utiliser des animaux modifiés génétiquement. Les animaux sont utilisés à l'age adulte, de jeune adulte afin d'induire les modèles jusqu'a un age avancé afin de tester l'effet curatif des traitements.

Soumis à sept anesthésies générales en dix semaines, dont une pour leur retirer les deux tiers de l'estomac, 45 jeunes porcs femelles sont tués au terme du protocole, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit cinq fibroscopies, cinq mesures de pH œsophagien, cinq transits radiologiques et sept prises de sang, avant le prélèvement de l'œsophage, de l'estomac et du foie. Le porteur annonce des douleurs abdominales, des vomissements, un arrêt du transit, une mobilité réduite après la chirurgie, une ration réduite de moitié la première semaine, et la mise à mort en cas de douleur persistante ou de perte de poids de 30 %. L'objet du projet reste la comparaison de deux variantes de chirurgie de l'obésité, dont l'une n'a jamais été pratiquée ni chez l'humain ni chez le porc.

Objectifs

La chirurgie bariatrique a démontré une efficacité en termes de perte de poids, d’amélioration des comorbidités liées à l’obésité mais aussi en termes de mortalité. Cette chirurgie connaît un très grand essor en France. La sleeve gastrectomie (SG) ou gastrectomie en manchon est une intervention qui consiste à retirer environ 2/3 du volume de l’estomac afin de laisser en place un manchon gastrique tout en conservant sa continuité. Cette procédure peut potentiellement favoriser l'apparition ou l’aggravation en postopératoire d'un reflux gastro-oesophagien (RGO). Une technique de SG au cours de laquelle la tubulisation de l'estomac est effectuée le long de la grande courbure a récemment été décrite afin de potentiellement diminuer l'incidence du RGO en postopératoire. Le but de ce projet est d’étudier l’effet de la procédure de Sleeve Gastrectomie par tubulisation de l'estomac le long de la Grande Courbure (SGGC) chez le porc. L'objectif principal de cette étude est de montrer que cette technique permet une diminution de l'incidence et de la sévérité du RGO en comparaison à la technique classique de SG.

Bénéfices attendus

La sleeeve gastrectomie (SG) est l’intervention la plus fréquemment réalisée en chirurgie bariatrique. Il existe cependant un vrai questionnement autour de cette procédure sur un possible risque d’aggravation postopératoire du reflux gastro-oesophagien (RGO). Bien que cette chirurgie soit salvatrice pour les patients concernés, il y à un risque de développer ou d'agraver un RGO après SG (environ 20%) ainsi que de développer sur le long terme un oesophagite ou un endobrachyoesophage (respectivement de 28% et 8%). Le but de ce projet est de développer une nouvelle technique de chirurgie bariatrique ayant les avantages de la SG (technique relativement peu invasive qui garde la continuité du tube digestif) mais permettant de mieux contrôler le risque d’aggravation du RGO en postopératoire, et ainsi de prévenir l’oesophagite, l’endobrachyoesophage et une éventuelle dégénérescence de l’œsophage. Les bénéfices attendus pour les patients et la société sont donc potentiellement majeurs étant donné qu’en France environ 40 000 patients sont opérés d’une SG tous les ans et que plusieurs centaines de milliers de patients sont potentiellement candidats à cette chirurgie.

Procédures

Chaque porc recevra 7 anesthésies générales aux jours suivants : J-7, J0, J14, J28, J42, J56 et J63. Ces anesthésies nous permettrons de réaliser les différents gestes. Aucun geste n'est effectué sans anesthésie. Sept prélèvements sanguins auront lieu comme suit pour chaque animal : J-7, J0, J14, J28, J42, J56 et J63. Cinq fibroscopie auront lieu pour chaque animal comme suit : J-7, J14, J28, J42 et J56. Cinq mesures de phmétrie auront lieu pour chaque animal comme suit : J-7, J14, J28, J42 et J56. Cinq TOGD (Transit oesogastroduodénal) auront lieu pour chaque animal comme suit : J-7, J14, J28, J42 et J56. Sept prélèvements de selles auront lieu comme suit pour chaque animal : J-7, J0, J14, J28, J42, J56 et J63 pour l'analyse du microbiote. Ces prélèvements seront prélevés de la cage directement au moment du nettoyage de cette dernière, en l'occurence sans contact direct avec l'animal. Tous les animaux seront mis à mort à J63 de la première procédure afin de réaliser des mesures du volume de l'estomac, des prélèvements du bas oesophage, de l'estomac (fundus et antre) et de foie.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux sont des effets directement liés à l’intervention chirurgicale : douleur abdominale, vomissements, reprise tardive du transit (iléus paralytique), asthénie, mobilité réduite et devraient s’amender progressivement au bout d’une semaine après l’intervention chirurgicale. L'estimation de la souffrance des différentes interventions chirurgicales de la procédure est estimée à ''modérée'' mais gérée par l'anesthésie, l'analgésie et un monitoring spécifique. Des analgésiques seront administrés en per et post opératoire pour réduire les douleurs post opératoires des animaux. Des antiémétiques seront aussi administrés pour réduire les nausées et les vomissements post opératoires.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à J63 de la première procédure afin de réaliser des mesures du volume de l'estomac, des prélèvements du bas oesophage, de l'estomac (fundus et antre) et de foie.

Remplacement

Il n’existe aucun modèle alternatif non animal permettant d’étudier l’impact d’une nouvelle technique de chirurgie bariatrique telle que celle que nous souhaitons développer. L’étude faite sur les chiens est une étude de faisabilité de la technique. La comparaison entre la sleeve le long de la grande courbure et la sleeve classique a été basée uniquement sur la perte pondérale à 2 mois et sur les complications chirurgicales uniquement. Aucune mesure de ph oesophagien ou d’étude de reflux gastrooesophagien n’a été faite. Aucun Transit oesogastroduodénal évaluant la vidange gastrique n’a été réalisé. Aucune fibroscopie gastrique n’a été faite. La SGGC est toujours une technique en phase expérimentale et n’a jamais été réalisée ni chez l’homme, ni chez le porc. La seule étude qui rapporte cette technique est celle sur les chiens sus cité. L’utilisation d’un animal vivant (porc) est indispensable afin d’évaluer : la tolérance de la procédure (alimentation, vomissement), l’efficacité de la procédure en termes de perte pondérale, et l’impact de la procédure sur : le RGO (mesure du PH oesophagien et biopsie du bas œsophage), la vidange gastrique, le microbiote et au niveau métabolique et endocrinien. Le but de notre étude étant d’évaluer scientifiquement avec des critères objectifs la physiopathologie du reflux gastrooesophagien après les différentes techniques chirurgicales de Sleeve Gastrectomie, ce qui est non reproductible en dehors d'un organisme vivant complexe avec une anatomie proche de l'homme. Cela nous permettra d’avancer des résultats qui pourront favoriser une technique sur l’autre.

Réduction

L’analyse de la littérature permet d’estimer à environ 70% le taux d'acidité anormal (pH < 4 pendant au moins 4% du temps mesuré) après SG classique. Grace à la technique de SGGC, nous espérons obtenir un taux d'acidité anormal de 20%. Ces données nous ont permis de déterminer que le nombre de sujets nécessaires dans chaque groupe était de 15. Dans un principe de réduction du nombre d’animaux nécessaires à l’étude de l’impact physiologique et métabolique de la procédure d’innovation chirurgicale, l’ensemble des explorations (pH métrie, fibroscopie, recueil d’échantillons biologiques) seront réalisées sur chaque animal inclus dans le protocole.

Raffinement

Afin de réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux : - un traitement antalgique sera donné en per et postopératoire et un infitration de la cicatrice à l’aide d’anesthésiants locaux sera réalisée à la fin de la procédure chirurgicale. L’analgésie péri-opératoire est assurée par injection IV. En fin de procédure, une infiltration de part et d’autre de la laparotomie sera effectuée pour réduire les douleurs. L’analgésie post-opératoire sera assurée par un traitement médicamenteux adapté. - les rations alimentaires seront diminuées de moitié en postopératoire la premiere semaine qui suit la chirurgie afin de réduire le risque de douleurs abdominales et de vomissements. Notre point limite se situera à l’apparition des signes cliniques de douleur persistante malgré le traitement antalgique ou en cas de modifications évocatrices du comportement, qui sont chez le porc l’absence d’interaction avec les congénères, l’absence de recherche alimentaire (réduction du fouissage), le refus d’alimentation, la léthargie avec décubitus prolongé, la modification des vocalises. La persistance de l’atteinte du point limite une heure après nouvelle administration d’antalgiques entraînera la mise à mort de l’animal. Une perte de poids ≥ 30% entraînera aussi la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Nous avons choisi un modèle porcin pour différentes raisons: Les modèles ‘petits animaux’ ne permettent pas d’avoir une approche chirurgicale et anatomique suffisamment proche de l'Homme et nous ne pouvons pas de façon réaliste réduire toute la taille du système afin de l’adapter à de petits animaux. Le choix du modèle porcin est justifié par le fait qu'il a été largement utilisé comme modèle anatomique de validation dans de nombreux protocoles de chirurgie bariatrique. Par ailleurs, plusieurs chirurgiens de notre équipe enseignent dans des sessions de formation chirurgicale sur modèle porcin et ont donc l’expérience de la réalisation de SG dans ce modèle. Les animaux seront de jeunes porcs dits « à croissance lente » femelles, âgés de 2 à 3 mois. Ces porcs sont caractérisés par une évolution pondérale spontanée relativement stable en comparaison aux porcs classiquement utilisés pour l’expérimentation animale. Cette stabilité pondérale spontanée sera nécessaire pour évaluer l'impact direct des procédures sur le poids des animaux. Enfin, le choix du genre féminin se justifie par une meilleure stabilité pondérale spontanée et d’un comportement plus adapté à l’hébergement en groupe.

700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes puis allaitantes reçoivent des nanoparticules directement dans la trachée, une fois par semaine pendant six semaines, et leur descendance subit des mesures de fonction pulmonaire d'une heure à plusieurs stades de sa vie. Le porteur reconnaît que ces expositions répétées pourraient perturber le comportement maternel et provoquer des anomalies de développement chez les souriceaux. Il affirme dans le même temps que les femelles "tolèrent" l'exposition sans nuisance particulière, et présente le projet comme une contribution à l'évaluation des risques pour les femmes enceintes et allaitantes.

Objectifs

Les nanotechnologies sont en plein essor depuis le début du XXIème siècle. Les propriétés exceptionnelles des nanoparticules, acquises par leur taille nanométrique, les rendent intéressantes dans de nombreux secteurs industriels (agroalimentaire, cosmétique, pharmaceutique etc.). Cependant, leur utilisation exponentielle suscite des inquiétudes quant à leurs potentiels effets sur la sante de l’Homme et sur l’environnement. En effet, en raison de leur présence dans de nombreux produits du quotidien (produits cosmétiques, alimentation, produits d’entretien, expositions professionnelles etc.), nous y sommes régulièrement exposés, que ce soit par voie cutanée, orale ou pulmonaire. Des analyses toxicologiques sont donc nécessaires pour connaitre les risques liés à leur utilisation, notamment dans le cadre d’expositions pendant la période périnatale, lorsque l’organisme en développement est particulièrement sensible aux agressions environnementales. Des études récentes réalisées chez la souris ont montré que des nanoparticules administrées à des femelles gestantes ou lactantes peuvent atteindre le fœtus, traversant la barrière placentaire via la circulation sanguine, ou le souriceau après passage dans le lait maternel. Les conséquences de ces expositions périnatales jusqu’à l’âge adulte sont encore peu étudiées, il apparait cependant qu’elles peuvent provoquer des défauts dans divers organes (reins, foie, organes sexuels) chez la descendance. Une étude a montré qu’une exposition maternelle aux nanoparticules pendant la gestation (voie pulmonaire) provoque des anomalies de développement pulmonaire chez la descendance. Ce présent projet s’inscrit dans leur continuité. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer les conséquences d’une exposition maternelle aux nanoparticules pendant la période de lactation sur le développement et la fonction pulmonaires de la descendance et d’évaluer les potentiels effets combinés d’une exposition pendant la gestation et la lactation, à l’aide d’approches in vivo et in vitro complémentaires. Dans un premier temps, nous effectuerons des tests qui nous permettront de mettre au point un protocole d'exposition optimal, permettant une exposition post natale la plus précoce possible, avec un minimum de dommages pour la descendance. Les résultats obtenus permettront de contribuer à l’évaluation des risques liés à ce type d’exposition chez les femmes enceintes, allaitantes et leurs enfants.

Bénéfices attendus

Bien que l’impact d’une exposition directe aux nanoparticules sur le site d’exposition (poumons, système digestif) ait été bien décrit ces dernières années, les conséquences d’expositions maternelles aux nanoparticules sont relativement peu étudiées et se concentrent sur le développement prénatal de la descendance. Les analyses des conséquences à l’âge adulte d’expositions périnatales à ces nanoparticules sont rares, notamment dans le cas particulier du développement pulmonaire. Ce projet nous permettra donc d’en apprendre davantage sur la toxicité des nanoparticules chez la souris, dans un modèle in vivo permettant d’étudier la transmission de ces particules de la mère à la descendance (circulation sanguine, lait maternel) et ses conséquences sur le développement pulmonaire des souriceaux dans des conditions physiologiques. Ce projet aura pour bénéfice de contribuer à l’évaluation des risques liés à des expositions périnatales aux nanoparticules pour les femmes enceintes, allaitantes ainsi que leurs enfants.

Procédures

Les femelles gestantes et lactantes seront soumises à des expositions pulmonaires nanoparticules (administration par voie pulmonaire via la trachée) aux sous anesthésie de manière hebdomadaire pendant 6 semaines (geste technique réalisé en quelques minutes, réveil et récupération rapides pour l’animal). La descendance sera soumise à des mesures longitudinales non invasive de fonction pulmonaire sur animaux vigiles durant 1h à plusieurs stades de leurs vies.

Impact sur les animaux

Les souris femelles tolèrent l’exposition aux nanoparticules pendant la gestation sans nuisance particulière. Leur descendance ne présente pas de létalité excessive ou d’anomalies évidentes de développement, les souriceaux grandissent normalement jusqu’à l’âge adulte. La mesure de la fonction pulmonaire, non invasive, n’induit pas d’effets indésirables. Dans le cadre de ce projet, les expositions comprendront la période de gestation ainsi que celle de lactation. L’exposition des femelles chaque semaine pendant la gestation puis la lactation pourrait induire un stress conduisant à des troubles du comportement maternel. Des anomalies de développement pourraient apparaitre chez la descendance, une attention particulière sera portée à leur croissance dès les premiers jours de vie afin de détecter des troubles éventuels.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d'étudier les effets de l'exposition aux nanoparticules (prélèvement d'organes).

Remplacement

Notre étude porte sur l’impact d’une exposition maternelle aux nanoparticules sur le développement pulmonaire de la descendance. Ces nanoparticules peuvent passer des poumons de la mère à son système sanguin, s’accumuler dans ses organes et enfin atteindre la descendance, en traversant le placenta ou en passant dans le lait maternel ingéré par les nouveau-nés. Cette transmission résulte d'une complexité impossible à modéliser de manière bio-informatique ou par technique de culture cellulaire. Nous souhaitons ensuite mesurer les conséquences de cette exposition périnatale sur la physiologie et la fonction pulmonaires de la descendance jusqu’à l’âge adulte, que nous ne sommes pas en mesure de modéliser par des méthodes alternatives à l’heure actuelle. Notre étude sur modèle murin nous permettra justement de modéliser des expositions maternelles humaines bien plus complexes, pour lesquelles nous avons encore peu de données.

Réduction

Nous avons optimisé les protocoles afin d’étudier le phénotype pulmonaire à la fois des mâles et des femelles. Nous réalisons un maximum d’analyses sur le même animal afin d’utiliser tous les animaux générés dans nos procédures et d’en minimiser le nombre, tout en gardant la puissance statistique nécessaire pour mettre en évidence des variations biologiques Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, nous n’effectuerons que les seules expériences indispensables, et nous efforcerons de réutiliser les animaux lorsque cela est possible, notamment le contingent de mâles d’accouplement nécessaires pour générer des femelles gestantes.

Raffinement

Pour les besoins de notre étude, nous travaillerons avec les femelles gestantes et lactantes particulièrement sensibles au stress. Au cours de nos travaux antérieurs portant sur les femelles gestantes, nous avons mis au point un protocole permettant de minimiser ce stress, notamment en rangeant ces cages aux endroits de plus faible passage dans le box d’hébergement, et en les enrichissant fortement par l'ajout de refuges en carton, de carrés de cellulose et de lanière de papier. Après le sevrage, les souris de la descendance bénéficieront des mêmes conditions d’enrichissement, pour réduire leur stress et favoriser leur bien-être. Au cours de l’expérimentation, toutes les étapes de la procédure seront réalisées en limitant au maximum la souffrance et l’angoisse animale. Les animaux seront sous observation quotidienne pendant toute la durée du protocole, et l’évaluation permanente de l’état général des souris permettra de respecter le bien-être animal et d’appliquer la mise à mort rapide à l’atteinte d’un point limite.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi dans notre projet car la souris est le modèle le plus utilisé en toxicologie, la littérature à son sujet est donc abondante. Par ailleurs, le projet nécessite un modèle mammifère permettant la transmission des nanoparticules de la mère à la descendance par la circulation sanguine et le lait maternel. Or, les quelques études décrivant cette transmission ont été réalisées dans le modèle murin. Le but du projet est de caractériser les effets d’une exposition périnatale aux nanoparticules sur le développement et la fonction pulmonaire jusqu’à l’âge adulte, les poumons se développant chez la souris en pré et post-natal. Le phénotype pulmonaire de la descendance sera analysé à 2 stades : 1) au stade juvénile (jeune non sevré) afin de visualiser les effets d’une exposition post-natale pendant la période de lactation et 2) à l’âge adulte afin d’en évaluer les conséquences à long terme.

Équipés d'un dispositif d'enregistrement fixé en permanence sur le crâne sous anesthésie générale, 36 prosimiens vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour analyser leur cerveau. Ils portent pendant les séances jusqu'à 15 grammes de matériel, soit 20 % de leur poids, explorent une arène une heure par jour pendant trois à six semaines, puis passent en cage plus petite et en volière individuelle. Le porteur indique que la ration alimentaire quotidienne dépend de l'exploration active du dispositif, ce qui fait du rationnement un ressort de l'expérience, et signale une gêne possible dans les sauts et la locomotion. Il affirme que l'expérimentation animale reste "le seul moyen" d'accéder à ces circuits, l'objectif annoncé portant sur l'évolution du système visuel des premiers primates.

Objectifs

L’exploration de notre environnement est cruciale dans notre quotidien et la vision, notamment chez les primates, est particulièrement sollicitée lors de cette activité. Due à des limitations techniques, la plupart des études sur la vision des primates est faite sous anesthésie ou en éveil, mais avec des dispositifs d’enregistrement filaires, limitant ainsi les mouvements de la tête. Comment sont représentés les différents éléments de l’espace environnant au niveau neuronal pendant l’exploration libre reste une question encore ouverte. Dans ce projet, nous essaierons de répondre à cette question en étudiant des primates de petite taille, ce qui va nous permettre d’utiliser une série d’outils d’enregistrement optiques et électrophysiologiques innovants (légers, portables et sans fil), initialement développés pour la recherche avec les rongeurs, et permettant une liberté totale de mouvements pendant l’exploration comportementale. Nous allons en particulier étudier l’activité neuronale dans les aires visuelles du cortex, ainsi que dans l’hippocampe, une région du cerveau où les paramètres spatiaux sont bien représentés. Cette recherche promet donc de nous donner des informations importantes sur la façon dont le système visuel a évolué chez nos ancêtres et de mieux comprendre comment notre cerveau traite l’information visuelle lors de l’exploration active.

Bénéfices attendus

Cette étude livrera des informations précieuses sur la façon dont les primates, y compris les humains, perçoivent visuellement leur environnement pendant l’exploration active. En particulier, nous espérons mieux comprendre comment les informations spatiales et des objets sont intégrés avec des paramètres internes (mémoire, prise de décision, motivation). La compréhension fondamentale des circuits cérébraux impliqués dans la vision des primates peut avoir des implications importantes pour trouver de nouvelles solutions lorsque la vision est altérée au cours du développement, lors de maladies neurodégénératives ou lors d’un AVC. Les résultats de cette étude pourraient également être généralisés à d’autres circuits cérébraux, tels que les systèmes sensitifs (ex : le toucher) et moteurs.

Procédures

La procédure 1 consiste en une étude histologique de l’anatomie du système visuel par injection sous anesthésie générale d’un marqueur fluorescent dans le cerveau. Après une durée de 3-4 semaines, temps d’action du marqueur, les animaux seront euthanasiés pour une analyse histologique des cerveaux. L’objectif des procédures 2 et 3 est de combiner l’enregistrement de l’activité neuronale par électrophysiologie (résolution temporelle, procédure 2) et imagerie optique (résolution spatiale, procédure 3) pendant l’exploration active des animaux. Pour cela, des dispositifs permanents (maximum 3.5g, soit moins de 5% du poids de l’animal) seront disposés sur la tête des animaux sous anesthésie générale et seront gardés par les animaux jusqu’à la fin de chaque procédure. Dans la procédure 2, les animaux seront également équipés d’un collier (4gr ; dispositif temporaire) pourvu d’une diode pour suivre les mouvements des animaux. Les animaux seront ensuite suivis dans une grande arène, pendant des sessions d’exploration (1 session de 1h par jour). Les animaux porteront alors, en plus du dispositif permanent et du collier (pour la procédure 2), un dispositif temporaire permettant soit l’enregistrement électrophysiologique (procédure 2) ou optique (procédure 3) de l’activité neuronale. Dans les deux cas, la charge totale portée par les animaux pendant l’exploration libre sera au maximum de 15g, soit au maximum 20% du poids de l’animal. Les dispositifs temporaires seront enlevés à la fin de chaque session exploratoire (1 session de 1h par jour). Cette première phase durera 3 à 6 semaines, en fonction du temps nécessaire pour obtenir assez de données exploitables. Les animaux suivront ensuite une évaluation psychophysique (3 à 6 semaines, 1 session de 1h par jour) dans une petite cage offrant un meilleur contrôle expérimental. A l’issue des procédures 2 et 3, les animaux seront euthanasiés pour réaliser des analyses histologiques des cerveaux.

Impact sur les animaux

Les nuisances potentielles liées aux différents actes expérimentaux pourraient être: risque de complications (douleurs résiduelles ou gêne) après les chirurgies pour la pose sur la tête des dispositifs permanents d'enregistrement (prise en charge des douleurs éventuelles et protocole analgésique); inconfort (gêne au niveau des sauts et de la locomation par exemple) liée au port de dispositifs temporaires d’enregistrement automatiques sur la tête pendant les sessions expérimentales; inconfort ou stress lié à l'hébergement provisoire dans des systèmes automatisé pour tests et volière individuelle; inconfort ou stress lié au conditionnement alimentaire nécessitant une exploration active du dispositif pour que l'animal reçoive sa ration alimentaire journalière.

Devenir

Les animaux impliqués dans les 3 procédures seront euthanasiés pour étudier leur anatomie cérébrale.

Remplacement

Nos recherches sont axées sur la compréhension des circuits neuronaux impliqués dans la vision active des primates. Pour comprendre ces fonctions complexes et intégrées du système nerveux central et périphérique nous allons travailler avec des animaux éveillés et libres de déplacement pendant des tâches d’exploration comportementale. Les alternatives in vitro telles que les cultures cellulaires et les organoïdes (une version simplifiée d'un organe, fabriquée in vitro) n'ont pour le moment pas atteint le niveau approprié d'organisation biologique pour étudier ces questions. Finalement, en ce qui concerne les alternatives in silico, l'éthologie computationnelle est un domaine qui n’en est encore qu'à ses débuts. Les modèles théoriques sont encore très loin de la complexité comportementale des animaux. Ils ne peuvent ni proposer, ni empiriquement prouver les réponses à nos questions. L'expérimentation animale nous semble donc le seul moyen de découvrir les processus constitutifs de ces comportements visuels, les algorithmes sous-jacents et les circuits neuronaux impliqués.

Réduction

Nous avons pris plusieurs mesures pour réduire le nombre d'animaux utilisés dans cette étude. Tout d'abord, nous avons réduit le nombre d’animaux utilisés au strict minimum nécessaire statistiquement. Le nombre d’animaux maximum prévu par expérience (N=12) est calculé sur notre expérience de taux de succès (études publiées sur des modèles rongeurs) et sur le pouvoir statistique requis. Compte-tenu du fait que les animaux seront inclus séquentiellement dans les procédures (par groupe de 2 à 4) et dans le cas où le taux de succès serait atteint plus tôt que prévu, cela nous permettrait d’ajuster à la baisse le nombre d’animaux finalement utilisés dans chaque procédure. Les méthodes proposées, notamment l’imagerie optique, vont permettre d’enregistrer plusieurs centaines de neurones en parallèle, ce qui réduit aussi le nombre d’expériences nécessaires. Enfin, nous allons documenter et rendre les données accessibles à la communauté scientifique afin de réduire la nécessité de futures expériences sur le terrain.

Raffinement

La prise en charge de la douleur avant, pendant et après les interventions chirurgicales est assurée par une anesthésie et une analgésie optimisées, ainsi que par une surveillance quotidienne. Des mesures compensatoires telles que l’utilisation d’un tapis chauffant ou la réhydratation (pour limiter la déshydratation des animaux pendant l’anesthésie) sont mises en place pour toutes nos interventions. Les animaux inclus dans les procédures seront habitués à être manipulés régulièrement par des biologistes, en accord avec leur rythme journalier d’activité, ce qui contribue à diminuer leur stress. Dans leur cage, ils bénéficient d’un enrichissement environnemental multimodal (aménagement cage, social, alimentaire, cognitif). La recherche active de la nourriture pendant les tâches comportementales complexes, bien que réalisée dans un contexte de conditionnement alimentaire, motive l’animal à développer des stratégies flexibles, ce qui réduit le risque de développer des stéréotypies motrices. Enfin, nous avons réduit le nombre de session à 1 par jour, limitant ainsi à 1h le temps passé par un animal avec une charge dépassant 5% de son poids, notamment pour les procédures 2 et 3.

Choix des espèces

Dans notre recherche nous voulons déterminer les éléments essentiels qui ont permis l'émergence des adaptations visuelles chez les premiers primates et de les comparer à d’autres primates (y compris à l’humain). Les lémuriens sont d’excellents modèles vivants aux caractéristiques primitives très similaires aux primates ancestraux. Ils présentent la plupart des traits des premiers primates: petite taille, yeux dirigés vers le devant, mains préhensiles, métabolisme rapide, vie nocturne et arboricole, alimentation omnivore, etc. L'objectif de ce projet est d’utiliser une combinaison de tests comportementaux et d’enregistrements neuronaux complémentaires chez un petit primate, à l’âge adulte (2-4 ans, après la phase de développement, avant les effets du vieillissement) pour découvrir si et comment le système visuel des premiers primates était adapté (et potentiellement optimisé) pour l’exploration visuelle dans un environnement nocturne et arboricole.

Pour tester de nouveaux agents d'embolisation, 100 lapins sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever leurs tissus. L'arthrose du genou leur est provoquée par chirurgie, suivie d'une embolisation artérielle de deux heures, d'imageries hebdomadaires pendant dix semaines et d'une ponction de liquide synovial. Le porteur indique que l'induction peut entraîner un œdème et une boiterie gênant les déplacements, et que les microsphères injectées peuvent atteindre des zones non ciblées. Il décrit une présélection des produits in vitro, puis conclut que seule l'expérimentation sur l'animal vivant permet d'évaluer l'efficacité attendue chez l'humain.

Objectifs

L'arthrose du genou est une maladie courante qui peut provoquer des douleurs, un handicap fonctionnel voire une dépression chez les personnes affectées. La prévalence mondiale de l'arthrose du genou est estimée à 22,9 % chez les individus âgés de ≥ 40 ans, soit 654,1 millions de personnes dans le monde en 2020, et la plupart des patients vivent des décennies avec la maladie. De nouveaux traitements non chirurgicaux sont nécessaires pour répondre aux besoins cliniques non satisfaits. Le projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité de nouveaux agents d'embolisation (AE) sur un modèle de lapin arthrosique induit mécaniquement au niveau du genou. Ce sont des produits qui peuvent être issus de la recherche interne ou de partenariats académiques ou privés.

Bénéfices attendus

Sur le court terme, ce projet va permettre de documenter l’efficacité de nouveaux agents d'embolisation (AE) in vivo. La comparaison de nouveaux AE entre eux et par rapport à des agents déjà commercialisés ou en développement dans ce modèle animal a pour but de déterminer leurs performances et leurs limites. Sur le plus long terme, ce projet s’inscrit dans l’intérêt clinique des patients.

Procédures

-Induction de l'arthrose par chirurgie (durée : 1h) -Traitement par radiologie interventionnelle (durée : 2h) -Imagerie pour suivre l'efficacité du traitement (durée: 1h, fréquence : maximum 1 fois / semaine durant le suivi de 10 semaines) -Prélèvements de sang sur animal vigile (durée: 5-10min dans une cage à contention, prélèvement rapide puis point de compression efficace jusqu'à l'arrêt du saignement, fréquence : maximum 3 fois durant le suivi de 10 semaines espacé de plusieurs semaines) pour mesurer les marqueurs systémiques de l'inflammation -Prélèvement de liquide synovial sur animal anesthésié en point final (durée: 5-10 min, fréquence : uniquement avant l’euthanasie de l’animal) pour mesurer les marqueurs locaux de l'inflammation.

Impact sur les animaux

L'anesthésie prolongée peut provoquer une deshydratation de l'animal. Les anesthésies répétées diminuent les prises hydriques et alimentaires des lapins. L'induction de l'arthrose de genou peut entrainer un oedème/hématome provoquant une boiterie génant l'animal lors de ses déplacements. L'embolisation avec des matériaux solides (microsphères) peut atteindre des zones non ciblées et générer une légère ischémie de ces zones. L'administration des différents médicaments (analgésie / anesthésie) sur l'animal vigile induit une douleur légère.

Devenir

La procédure sera considérée comme modérée puisqu'un même animal aura une imagerie et/ou des prélèvements sanguins, une induction chirurgicale de la pathologie et/ou une procédure d'embolisation artérielle. Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l'étude afin de prélever les tissus pour une analyse histologique.

Remplacement

La réussite d'une embolisation est dépendante de différents paramètres. Il y a tout d'abord les paramètres intrinsèques à l'agent embolisant (taille, stabilité, viscosité ...) qui seront déterminés in vitro pour faire un premier tri des produits. En parallèle, des études sur des systèmes en flux donneront des premiers renseignements sur le pouvoir embolisant des différents produits et permettront de réduire le nombre d'agents d'embolisation à tester in vivo. Passée cette préselection, seule l’expérimentation in vivo permettra d'évaluer l'efficacité attendue chez l'Homme. En effet, il est nécessaire de prendre en compte toutes les interactions entre l'agent d'embolisation et le vaisseau comme le flux, la tortuosité des vaisseaux, les interactions avec la paroi vasculaire, les systèmes de coagulation...

Réduction

Chaque étude sera composée de n= 5 animaux par groupe pour chaque agent d’embolisation étudié. Il est nécessaire de comparer le nouvel agent d’embolisation à une référence clinique dans les mêmes conditions expérimentales. Un seul groupe d’animaux contrôle sera utilisé comme référence pour tous les agents d’embolisation d’une même classe. Le nombre de 5 animaux par groupe est nécessaire et suffisant pour réaliser des analyses statistiques et comparer ainsi l'efficacité des traitements.

Raffinement

Comme indiqué dans la description détaillée de la procédure, une prémédication à la buprenorphine est systématiquement mise en place avant la chirurgie / embolisation pour assurer une bonne analgésie. Pour pallier aux nuisances ou effets indésirables liés à la chirurgie les mesures suivantes sont mises en place : une hydratation sous cutanée avec 50 mL de NaCl est réalisée avant la chirurgie / embolisation, une injection IV d’héparine (bolus et maintien toutes les heures) est réalisée pour prévenir les complications post opératoires. Une couverture par un Anti Inflammatoire Non Stéroïdien (flunixine) est également mise en place sur les 7 jours post induction de l'arthrose de l’animal. Du foin (appétant pour les lapins) et une eau gélifiée sont placés dans la cage pour leur permettre de récupérer plus rapidement post chirurgie. L'enrichissement (balle, morceaux de bois...) est conservé dans la cage. Le comportement des animaux opérés et embolisés est observé par le zootechnicien quotidiennement.

Choix des espèces

Le lapin a été choisi car, du fait de sa taille, il répond à tous les critères permettant de réaliser l'ensemble des procédures. La mesure du flux sanguin est accessible par les méthodes non invasives (échographie, IRM) ou mini invasives (fluoroscopie) et la réalisation de l'embolisation sélective se fait par progression d'un microcathéter assisté d'un microguide (comme en clinique) via l'artère auriculaire. C'est également le modèle le plus référencé dans la littérature. Il est donc déjà validé et cela nous permettra de comparer nos résultats à ceux des autres agents embolisants. Enfin, l'expérience acquise dans le laboratoire sur cette espèce et avec des procédures similaires permet de s'assurer de la meilleure inclusion des animaux. Animaux adultes de plus de 10 semaines, d'environ 3 kg - 3.5 kg au moment de l'induction mécanique de l'arthrose. En effet, il faut que l'animal ait une croissance squelettique stable au moment de l'induction de la pathologie.

273 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un fragment de tumeur ovarienne humaine leur est greffé sous la peau, puis celles qui développent une tumeur subissent une ponction intracardiaque avant la mise à mort et le prélèvement de la tumeur. Le porteur indique que la tumeur peut s'ulcérer, provoquer une perte de poids ou une gêne au déplacement, la mise à mort intervenant quand elle dépasse 12 mm. Il affirme le recours à la souris "indispensable" faute de modèle alternatif, tout en annonçant que les tumeurs entretenues sur ces souris serviront ensuite à démontrer l'intérêt des organoïdes tumoraux.

Objectifs

Les cancers de l’ovaire restant particulièrement meurtriers du fait de leur capacité à développer une résistance aux chimiothérapies conventionnelles (association carboplatine/paclitaxel), le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques susceptibles de surmonter la chimiorésistance constitue un enjeu majeur pour l’amélioration de leur prise en charge. Il est donc indispensable de s’appuyer sur des modèles expérimentaux qui représentent de façon pertinente la pathologie afin d’identifier et valider de nouvelles cibles thérapeutiques, évaluer de nouveaux médicaments et leurs biomarqueurs associés, ainsi qu’étudier les mécanismes de résistance. Il existe donc un réel besoin de s’appuyer sur des modèles expérimentaux capable de refléter au mieux la situation chez les patientes atteintes de cancer de l’ovaire. Il est maintenant largement reconnu que les tumeurs dérivées de patients ou patient-derived tumor xenografts (PDXs) sont très proches de la tumeur du patient et constituent les modèles de référence dans l’industrie pharmaceutique. Ces modèles sont obtenus en implantant des morceaux de tumeurs de patients chez des souris avec un système immunitaire déficient pour permettre la croissance de la tumeur, puis la tumeur est maintenue in vivo par passage successifs de souris en souris. L’objectif de ce projet est de finaliser l’établissement d’un panel de modèles de PDX (22 sont déjà établis et 13 sont en cours d’établissement) afin de pouvoir disposer d’une cohorte représentative de l’hétérogénéité intra- et intertumorale de la maladie.

Bénéfices attendus

Nous attendons de ce projet en premier lieu qu’il permette de mettre en place un panel de PDX de cancer de l’ovaire qui puisse être utilisé pour les différents projets de recherche du laboratoire. Ces modèles seront utilisés pour tester l’efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques identifiées par le laboratoire, permettre l’évaluation de leur biodistribution et de leur toxicité, et identifier/valider des biomarqueurs (dans le sang ou dans la tumeur). Ces modèles seront aussi pour démonter l’intérêt de nouveaux modèles alternatifs tels que les organoïdes tumoraux.

Procédures

Un petit fragment tumoral de cancer de l’ovaire sera implanté en sous-cutané sur un nombre maximal de 273 souris immunodéprimées sous anesthésie générale et après administration d’un dérivé morphinique (analgésie). La plaie est refermée ensuite à l’aide de 3 agrafes. Cette procédure est très rapide (5 minutes maximum). Pour les animaux développant une tumeur, une ponction intracardiaque sous analgésie morphinique et anesthésie profonde sera réalisée préalablement à la collecte de la tumeur et à l’euthanasie de l’animal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables potentiels à la suite de l’implantation de fragment tumoraux humains sont : le développement d’un abcès (assez rare en raison de la localisation de tumeur d’origine et de l’expertise du laboratoire dans la réalisation de la chirurgie), la cachexie (perte de poids liée à la tumeur qui est limitée puisque les souris seront euthanasiées dès lors que la tumeur atteindra un diamètre de 12 mm x 12 mm), la formation de métastases (peu fréquentes dans le cadre d’implantations sous-cutanées), ou l’ulcération de la tumeur.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie jusqu’au développement d’une tumeur atteignant la taille éthique. En cas d’absence de pousse tumorale après 12 mois, les animaux sont euthanasiés.

Remplacement

Le recours au modèle animal est indispensable dans le cadre de notre étude puisqu’à l’heure actuelle, il n’existe pas de modèle alternatif pertinent permettant l’évaluation de la toxicité, de la biodistribution et de l’efficacité de traitements anticancéreux innovants.

Réduction

Afin d’éviter d’avoir à maintenir les tumeurs sur les souris, des fragments de tumeurs prélevées après euthanasie des animaux seront congelés au fur et à mesure pour permettre de futures réimplantations. Un test de décongélation sera réalisé 2 mois après congélation de fragments tumoraux afin de valider la bonne cryopréservation de ces échantillons. Par ailleurs, à plus long terme, ces modèles pourront être utilisés pour démontrer la pertinence de modèles aternatifs tels que les organoïdes tumoraux, des microtumeurs cultivées dans des boites, étant donné que plusieurs modèles de PDXs et organoïdes tumoraux ont été établis à partir de la même tumeur de patiente. De plus, les molécules à tester pourront être présélectionnés en premier lieu sur les organoïdes tumoraux appariés avant de passer chez l’animal pour réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans une animalerie nude dédiée à raison de 3 souris par cage. Les cages sont insérées dans un portoir ventilé, permettant le maintien d’un statut sanitaire exempt d’organismes opportunistes et pathogènes et d’éviter l’apparition d’infections. Les souris peuvent s’accrocher à la grille de nourriture, aux tétines de biberons, à des balançoires et grimper sur un rebord dans la cage. Les animaux sont hébergés dans des cages avec de la litière en copeaux de peuplier à laquelle y est ajoutée différents matériaux pour permettre aux animaux de confectionner un nid. Des batonnets à ronger et des tunnels en cartons sont également mis à disposition des animaux. Les conditions de cet hébergement répondent aux normes de la directive européenne 2010-63. La surveillance des animaux est réalisée quotidiennement (7J/7) et 2 fois par jour pendant la période critique : 2 jours suite à l’implantation afin de vérifier le comportement de l’animal. Concernant la procédure chirurgicale (implantation de fragments tumoraux), les souris seront injectées avec un analgésique (dérivé de la morphine) afin de réduire la douleur péri- et post-opératoire. Une anesthésie générale est ensuite réalisée lors de l’implantation sur une table chauffante. Le réveil des souris s’effectue sous lampe rouge afin d’éviter la baisse de température de l’animal. Pour les animaux développant une tumeur, une ponction intracardiaque sous analgésie morphinique et anesthésie profonde sera réalisée préalablement à la collecte de la tumeur et à l’euthanasie de l’animal. Une inspection détaillée et quotidienne de chaque animal est effectuée afin d’observer le comportement et les symptômes cliniques de l’animal. Une souffrance visible liée au développement tumoral (poids tumoral supérieur à 10% du poids de la souris, diamètre supérieur à 12 mm, ulcération de la tumeur ou gêne au déplacement/motricité) est considérée comme point limite. De même, une détresse caractérisée par une perte de poids supérieure à 15% ou une prostration de l’animal sont considérées comme des points limites.

Choix des espèces

L’implantation de cellules tumorales d’origine humaine n’est possible que chez des animaux immunodéprimés ; les souris immunodéprimées sont fréquemment utilisées dans ce type d’étude. Nous avons préalablement comparé différentes souches de souris et constaté que les souris nude de 4 semaines permettait une prise tumorale optimale (en termes de délai de prise tumorale et d’homogénéité entre les animaux).

Tous tués à l'issue, 185 rats reçoivent par gavage de la quétiapine à la moitié de la dose létale 50, seule ou associée à des opioïdes et des benzodiazépines, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur écrit s'attendre "possiblement au décès" en raison de la dose choisie, et décrit une sédation pouvant aller jusqu'au coma, avec hypothermie et dépression respiratoire. Chaque rat subit une chirurgie de vingt minutes à une heure, certains jusqu'à vingt prélèvements sanguins sur animal vigile, et ceux porteurs de sondes de télémétrie sont hébergés seuls jusqu'à la fin. L'objectif déclaré est de comprendre la toxicité d'un médicament de plus en plus impliqué dans des surdoses humaines.

Objectifs

La quétiapine est un antipsychotique de plus en plus prescrit dans la prise en charge de la dépression chez les patients bipolaires et dans la prise en charge de la schizophrénie ainsi que chez les patients présentant des troubles anxieux généralisés. En raison de la fragilité de ces patients et l’accès encore peu restreint en comparaison à d’autres médicaments tels que les opioïdes, le quétiapine est de plus en plus mésusée et se retrouvent impliqués dans un nombre d’overdoses grandissant au cours des 4 dernières années en particulier en Europe. Bien que la quétiapine ne soit décrite comme agissant directement sur les récepteurs aux opioïdes, la prise massive de quétiapine semble induire une dépression respiratoire en plus d’un effet cardiovasculaire qui peut aller jusqu’à entrainer le décès du patient, et pour laquelle le mécanisme d’action reste à ce jour inconnu. Ainsi, les effets neurorespiratoires délétères constatés en clinique en cas de surdosage à la quétiapine seule ou lors de poly-intoxications, nous ont conduits à concevoir ce travail expérimental chez le rat, avec pour objectifs de caractériser selon une approche pharmacocinétique/pharmacodynamique, les effets toxiques (neuro-respiratoires et cardiovasculaires) induits par l’administration par voie orale de quétiapine seule à forte dose, ou en association avec les dépresseurs du système nerveux central, notamment les opioïdes et les benzodiazépines que l’on retrouvent fréquemment détectés dans les prélèvements sanguins post-mortem des intoxications attribuées à la quétiapine.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de caractériser les mécanismes de toxicité en particulier d’ordre neurorespiratoires et cardiovasculaires induits par l’administration de la quétiapine seule ou en association avec d’autres dépresseurs du système nerveux central, et ainsi de mieux comprendre les mécanismes pharmacocinétiques et pharmacodynamiques des interactions entre ce neuroleptique et les psychotropes étudiés que l’on retrouve de plus en plus fréquemment dans les intoxications, en particulier chez les patients dépressifs, plus à risque de surconsommation médicamenteuse, et ainsi permettre l'optimisation ou le développement de nouvelles thérapeutiques au-delà du simple traitement symptomatologique pour la prise en charge des patients intoxiqués.

Procédures

Pour la caractérisation de la fonction ventilatoire, tous les animaux subiront une procédure chirurgicale (20 mins) + gavages de molécules (30 secondes – 1 minute par gavage). Pour l'étude cinétique et métabolique, les animaux subiront tous une procédure chirurgicale (30 mins) + gavages de molécules (30 secondes – 1 minute par gavage) + prélèvements de sang sur animaux vigiles (20 prélèvements ; 1 prélèvement : 30 secondes). Pour l'évaluation de la fonction respiratoire périphérique ou la fonction cardiaque, tous les animaux subiront une procédure chirurgicale (45 mins à 1h) + gavages de molécules (30 secondes – 1 minute par gavage).

Impact sur les animaux

On s’attend surtout à des effets indésirables de type sédation pouvant aller d’une réduction de l’activité locomotrice jusqu’au coma en particulier dans le cas des associations médicamenteuses avec hypothermie et dépression respiratoire. De par le choix de la dose (50% de la dose létale 50), on s’attend possiblement au décès. La présence de ces effets, leur durée ainsi que leur intensité varient en fonction des molécules et des associations qui seront administrées. De plus, un stress lié au gavage, aux anesthésies et aux injections pourrait être perçu par l’animal lors des procédures expérimentales. Un risque de fausse route suite au gavage est à prendre en compte. En outre, lors de la quantification de la réponse ventilatoire, les rats seront isolés seuls dans le système dédié pendant 6 heures. De plus, après la chirurgie d’implantation des sondes de télémétrie pour les mesures de la fonction diaphragmatique et cardiaque, les rats seront hébergés en cages individuelles jusqu’à la fin de l’expérimentation ce qui pourra également induire un stress.

Devenir

La réutilisation des animaux est impossible en raison de la récupération post-mortem de l'appareillage de télémétrie ou de l'atteinte d'un point limite (atteinte du volume sanguin de prélèvement maximal autorisé) qui requiert la mise à mort des animaux.

Remplacement

L’ensemble des procédures ne sont pas remplaçables par des expériences in silico ou in vitro, en raison d’une approche physiopathologique du système respiratoire et cardiovasculaire intégrée sur animal entier ainsi que la caractérisation du comportement pharmacocinétique de la quétiapine dont les différentes phases ne peuvent être évaluées dans leur intégralité que par l’utilisation d’animaux.

Réduction

D'après nos expériences précédentes avec des modèles animaux similaires, il a été déterminé que l'utilisation d'un groupe de 8 animaux est suffisante pour conduire une analyse statistique fiable. Ce nombre de 8 rats par groupe a été prédéfinie par une approche statistique adéquate. De plus, il est prévu d'utiliser le même animal pour les mesures des gaz du sang artériel, les mesures de lactatémie, ainsi que l’étude pharmacocinétique, ce qui permettra de réduire le nombre total d'animaux nécessaires grâce à une technique de dosage par microprélèvements. Enfin, si aucun effet ventilatoire significatif n’est perçu à la suite des associations médicamenteuses, celles-ci ne seront pas étudiées en gaz du sang, ni en électromyographie, dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

La surveillance quotidienne des animaux sera assurée par un personnel qualifié, et des points limites spécifiques adaptés seront mis en place pour détecter et réduire toute souffrance ou douleur. Si nécessaire, des antalgiques seront administrés, tout en veillant à ne pas perturber le déroulement de l'expérience. En cas de besoin, des procédures réglementaires de mise à mort anticipée seront appliquées . Toutes les interventions chirurgicales prévues dans ce projet seront réalisées sous anesthésie générale et accompagnées d'une gestion adéquate de la douleur pendant la période péri-opératoire. De plus, une ouate en silicone sera utilisée après la chirurgie pour favoriser une meilleure cicatrisation et une prise en charge plus rapide en cas de saignement. Enfin, l’étude pharmacocinétique sera réalisée à l’aide de microprélèvements dans le but de réduire au maximum le volume sanguin à prélever.

Choix des espèces

Le rongeur, et plus spécifiquement le rat, est un modèle très pertinent notamment du fait de sa physiologie respiratoire et cardiovasculaire très proche de la physiologie humaine. En plus de sa taille importante qui permet une facilité et une répétabilité des prélèvements, son métabolisme est très semblable à celui de l’Homme, ce qui facilitera la translation des données pharmacocinétiques à l’Homme. Pour les études télémétriques (pléthysmographie, éléctromyographie et électrocardiographie), la pose des sondes est plus aisée et donc plus reproductible. Des rats jeunes adultes âgés de 6 à 8 semaines ayant un poids de 250 à 350 g seront utilisés dans le but de pouvoir faire l’analogie avec ce que l'on retrouve dans la littérature scientifique, la population jeune étant la plus affectée par les problèmes de mésusage de substances en particulier dans un contexte de pathologie psychiatrique sous-jacente.