Recherche fondamentale

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux sont séparés de leur mère puis exposés de façon répétée à une baisse d'oxygène (hypoxie intermittente), avec imagerie du cerveau sous anesthésie et tests d'exploration, pour étudier les conséquences de l'apnée du sommeil de l'enfant. Le porteur indique que la séparation maternelle peut générer de l'angoisse et que le protocole ralentit la croissance, et que toutes les souris sont tuées entre 30 et 35 jours pour prélever leur cerveau. Il affirme que les méthodes sans animaux ne peuvent répondre à la complexité d'un "organisme entier" et juge le modèle animal "indispensable".

Objectifs

Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil (SAOS) de l’enfant est une maladie fréquente (4% des enfants) responsable à moyen terme de difficultés scolaires, de troubles du déficit de l’attention avec ou sans hyperactivité et à long terme potentiellement de complications cardiovasculaires. Le SAOS est caractérisé par une alternance de périodes d’apnées et de périodes de respiration sans apnées. Durant les phases d’apnées, les patients présentent une diminution du taux d’oxygène (hypoxie) dans le sang pouvant être plus ou moins sévère. Le modèle de SAOS le plus utilisé est l'hypoxie intermittente caractérisée par des épisodes de diminution du taux d’oxygène dans le sang. Pour ce faire, nous faisons alors varier la quantité inspirée en oxygène et sa durée et mesurer les conséquences. Ce modèle permet donc d’étudier de façon spécifique les conséquences d’une hypoxie intermittente sur le plan cognitif et physiologique dans un modèle murin juvénile.

Bénéfices attendus

Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil chez l’enfant est très peu étudié pourtant cela concerne beaucoup d’enfants (4% de la population). Ce projet permetterait de mieux comprendre les déterminants du pronostic de ce syndrome en terme de fonction cognitive (mémoire) et de fonction cardio-vasculaire. Une meilleure compréhension permet une meilleure prise en charge.

Procédures

Séparation maternelle de 2 fois 3h pour les souris âgées de 15 à 27 jours. Entre 30 et 35 jours de vie : ces souris seront soumises une fois à une courte anesthésie (30 minutes maximum) afin de réaliser une imagerie ultrasonore fonctionnelle à temps réel du cerveau . C'est une imagerie éveillée sur boîte cranienne et peau intactes (sans cranioctomie) ) qui mesure les variations du flux sanguin cérébral et renseigne ainsi l’activité cérébrale. Gestes techniques : prise de poids et de température, tests de comportements par exposition des animaux dans une arène vide puis dans une arène munie de deux objets, préhension des animaux pour la lecture du tatouage d'identification sur les pattes, pour le déplacement dans les chambres d'exposition et pour l’administration une fois d’anesthésiant et le rasage au niveau de la tête pour l'imagerie fonctionnelle

Impact sur les animaux

- séparation maternelle limitant le contact maternel pouvant générer de l'angoisse - troubles cardio-vasculaires selon le protocole d'hypoxie intermittente (hypoxie intermittente = épisode de diminution de la fraction inspirée en oxygène réalisée de manière intermittente et non continue) - croissance pondérale ralentit selon le protocole.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort avant prélèvement du cerveau pour des études histologiques entre 30 et 35 jours de vie.

Remplacement

Dans le SAOS, les études épidémiologiques enrichissent déjà les connaissances de la maladie mais sont limitées par la possibilité d’étudier plus finement les paramètres connus et ceux potentiellement contributifs pour des raisons éthiques évidentes des tests chez l’humain. Bien que des méthodes non-animales jouent un rôle important dans la recherche scientifique pour comprendre isolément des mécanismes, elles ne peuvent pas répondre à la complexité d’un système intégré d’un organisme entier. De plus, les animaux et les humains partagent une grande similarité aussi bien sur le plan anatomique, génétique que fonctionnel. Pour étudier les maladies humaines et répondre aux exigences de sécurité pour la santé humaine, l’utilisation de modèle animal est indispensable.

Réduction

Nos méthodes de mesures étant non invasives, nous privilégions au maximum une étude longitudinale ce qui réduit le nombre d’animaux utilisés. Ainsi, nous effectuerons le bilan physiologique (ventilation, fréquence cardiaque, croissance pondérale,....), cognitif (mémoire) et cérébro-vasculaire (activité neuronal, fluctuatio du débit sanguin cérébral) sur les mêmes portées. Compte tenu de la grande variabilité inter-individuelle dans les paramètres physiologiques, nous avons déterminé un lot expérimental de 30 animaux par groupe pour mettre en évidence une différence biologiquement significative. Si toutefois, par des analyses intermédiaires, nous obtenons une puissance statistique suffisante dans le test de nos hypothèses, nous n’augmenterons pas le nombre d’animaux pour respecter le lot de 30 animaux.

Raffinement

Mesures pour minimiser une possible angoisse des animaux : durée de mesure courte, regroupement des souris lors de l’exposition à l’hypoxie intermittente, fourniture d’une quantité de sciure maternelle dans les chambres d’exposition (boîtes dans lesquelles les souris sont exposées à l'hypoxie intermittente), remise à la mère d’une heure entre les 2 sessions journalière d’hypoxie intermittente afin de maintenir le contact maternel. Fréquence de la surveillance : pesée journalière pendant l’exposition à l’hypoxie intermittente (15 à 27 jours) et à chaque point de mesure (tests comportementaux, mesures physiologiques), vérification journalière pour les besoins en eau et nourriture de la mère et de sa portée, vérification journalière des points limites (état du pelage, du comportement de la souris dans sa portée et comportement de la mère envers sa portée). Une dose letale d'aneshésiant est administrée à l'animal avant le prélèvement de cerveau pour des études histologiques.

Choix des espèces

Les souris, étant des mammifères, elles sont suffisamment proches de l’Homme. Nous partageons 95% de nos gènes avec la souris. La souris est de petite taille, la reproduction est rapide car la durée de gestation est courte, la manipulation est facile ce qui en fait un modèle efficace pour la recherche. La période choisie pour l’exposition à l’hypoxie intermittente correspond à la petite enfance jusqu'au début de l’adolescence, période de manifestation du syndrome d’apnées obstructives du sommeil de l’enfant.

424 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit des injections quotidiennes pendant quatorze jours, une autre subit une chirurgie du cerveau, et toutes passent un test de sociabilité de dix minutes avant une perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde. Le porteur décrit un risque d'inflammation aux points d'injection et de complications post-opératoires comme une hémorragie ou une infection. Il conclut que l'autisme, faute de marqueur biologique, ne peut être modélisé qu'au niveau de l'animal entier exprimant son répertoire comportemental, et justifie ainsi le recours à la souris.

Objectifs

Parmi les troubles affectant la capacité à interagir socialement, les troubles du spectre autistique (TSA) sont les plus courants, touchant environ 1% de la population selon des études récentes à grande échelle. Ces troubles englobent des pathologies dont les causes sont connues (syndrome du X fragile, de Prader-Willi, de Rett) et d'autres dont l'origine reste inconnue, regroupées sous le terme de "troubles du spectre autistique" (TSA). Ce projet de recherche vise à approfondir notre compréhension des bases neurobiologiques des TSA et à développer des molécules atténuant les symptômes, en particulier les déficits d'interaction sociale, particulièrement impactants pour les patients et leurs proches. Le défi majeur ici est de trouver de nouvelles molécules agissant sur divers modèles précliniques des TSA. Des études récentes ont mis en évidence un déséquilibre dans la transmission d'informations nerveuses dans certains modèles de souris TSA, notamment celles présentant une déficience génétique pour des protéines spécifiques. Des traitements pharmacologiques ont montré des effets bénéfiques en atténuant les déficits sociaux et les comportements stéréotypés chez ces souris. Ces résultats indiquent que moduler l'activité de deux récepteur peut soulager ces symptômes. L'objectif actuel de la recherche est d'explorer les mécanismes biologiques sous-jacents à ces effets bénéfiques, en se concentrant sur des modèles murins d'autisme.

Bénéfices attendus

Le projet permettra une meilleure compréhension des populations de neurones impliquées dans le développement de l'autisme et proposera de nouvelles solutions thérapeutiques pour soulager cette pathologie.

Procédures

Une partie des animaux de nos procédures expérimentales seront soumis à des injections chroniques (14 jours) de composés par voie intrapéritonéale. Un groupe d'animaux subira une chirurgie stéréotaxique. Tous les animaux seront exposés à une tâche de sociabilité d'une durée de 10 minutes.

Impact sur les animaux

Des animaux seront soumis à des administrations répétées d'agents pharmacologiques par voie intrapéritonéale. On ne peut donc pas exclure une inflammation au niveau du site d'injection. D'autres animaux feront l'objet d'une chirurgie stéréotaxique. Ces animaux subiront donc une douleur post-opératoire, les conséquences d'une anesthésie et un risque de complication post-opératoire (hémorragie, infection). L'ensemble des animaux sera soumis à une perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde.

Devenir

A la fin de chaque expérience, les animaux seront mis a mort pour des expériences ex-vivo ultérieur

Remplacement

e développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement de l'autisme nécessite la mise à disposition de la communauté scientifique de modèles précliniques de ces pathologies. Plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées ont été créées à cette fin, basées sur les mutations identifiées chez les patients autistes. L'évaluation des effets bénéfiques d'un traitement ne peut être réalisée dans ces modèles qu'au niveau comportemental. En effet, il n'existe pas de marqueur biologique pour l'autisme, et le diagnostic clinique repose entièrement sur une évaluation comportementale. Cette pathologie ne peut donc être modélisée qu'au niveau de l'animal entier, exprimant toute la variété de son répertoire comportemental.

Réduction

Les effectifs ont été calculés afin de permettre une réduction des effectifs optimisée permettant de suivre les recommandations éthiques en maintenant une puissance statistique adéquate

Raffinement

Nous prendrons en charge l’ensemble des contraintes que subissent les animaux au cours des expériences. Concernant l’hébergement, les souris seront regroupées en groupes sociaux de 2 à 4 individus, avec du matériel approprié pour la construction de nids (ouate et cabane en carton). Les animaux seront manipulés quotidiennement par le même expérimentateur. Pour réduire le nombre d’animaux, nous utiliserons des individus des deux sexes, les testerons dans différentes tâches, et appliquerons les tests statistiques appropriés. Pendant les expériences, nous surveillerons quotidiennement le bien-être des animaux, en particulier leur poids, leur posture et leur point d’injection. Pour les chirurgies, nous mettrons en place une procédure d'anesthésie appropriée (anesthésique associé à un analgésique), ainsi qu'un suivi post-opératoire renforcé. Nous administrerons un traitement anti-inflammatoire pour réduire la douleur, et nous assurerons un suivi quotidien de la cicatrisation de la plaie, du poids et de la posture des animaux. Des critères limites seront établis pour éviter toute souffrance inutile aux animaux. Bien que nous ne puissions nous passer du modèle animal, l'autisme étant une pathologie complexe, nous veillerons à minimiser la détresse des animaux en exprimant l'ensemble de leur répertoire comportemental.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux sociaux chez lesquels les altérations des compétences sociales, symptômes clés de la pathologie autistique, peuvent être aisément étudiées. De plus, le répertoire comportemental de ces animaux est suffisamment étendu pour compléter cette étude par une évaluation de nombreuses autres réponses comportementales connues pour être affectées par la pathologie autistique. Plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées sont disponibles pour modéliser cette pathologie au niveau préclinique. Les déficits comportementaux détectés chez ces souris modèles sont suffisamment importants et robustes pour permettre de révéler des effets bénéfiques potentiels de composés pharmacologiques. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8-12 semaines), alors que le répertoire comportemental est totalement développé et les éventuels déficits comportementaux fixés.

1 940 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe d'îlots pancréatiques sous anesthésie, des injections de lymphocytes, des dosages de glycémie trois fois par semaine pendant quatre mois et une biopsie de la queue, pour étudier le rôle d'une protéine dans le diabète de type 1 sur la souris NOD, qui développe spontanément un diabète. Le porteur indique que le diabète provoque soif, déshydratation et perte de poids, et que la greffe d'îlots peut entraîner douleurs et mobilité réduite. La retombée annoncée, une nouvelle cible thérapeutique, reste conditionnelle, tandis que le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne remplace la souris, qu'il décrit comme un "outil incontournable".

Objectifs

Le diabète représente un enjeu majeur de santé publique dont l’importance ne cesse de s’accroitre Le diabète de type 1 est une maladie auto-immune complexe qui résulte de la destruction spécifique des cellules pancréatiques qui produisent l'insuline et de la perte de la capacité́ à contrôler le niveau de glucose dans le sang. La maladie survient suite à une réaction anormale du système immunitaire. Des cellules du système immunitaire, les lymphocytes T, identifient les cellules du pancréas comme des cellules étrangères à l’organisme du patient, et les éliminent. Au cours d’une réponse immune ces cellules jouent un rôle crucial dans la reconnaissance et élimination des cellules qui présentent des fragments des protéines appelés peptides, issues de pathogènes ou des protéines de notre organisme. Ce projet vise à examiner le rôle d’une protéine responsable de la réduction des peptides à la taille optimale pour l’activation du système immunitaire dans la physiopathologie du diabète auto-immun et à étudier les mécanismes qui contribuent à déclencher la réponse auto-immune. Le modèle de la souris non-obèse diabétique, qui développe un diabète auto-immun spontané partageant de nombreuses caractéristiques avec le diabète de type I humain sera utilisé dans ce projet. Ce travail pourrait, à terme, permettre l’identification et l’utilisation de cette protéine comme une nouvelle cible thérapeutique dans le diabète auto-immun.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu du projet est la détermination du rôle de la protéine étudiée dans la pathogenèse du diabète auto-immun. Si cette protéine est impliquée dans l’apparition du diabète elle pourrait faire l’objet d’un ciblage thérapeutique.

Procédures

Le dosage glycémique avec un lecteur de glycémie capillaire, pour suivre l’évolution du diabète sera effectué par prélèvements d’une goutte de sang lorsque la glycosurie mesurée avec une bandelette urinaire s’avère positive. Le temps estimé pour effectuer le dosage de glycosurie ou de glycémie est environ 10 secondes par souris. La frequence sera de 3 fois par semaine sur un periode de 4 mois. L'administration des produits par voie intrapéritonéale se fera une seule fois et le temps necessaire est de 5 secondes par souris. L’injection des lymphocytes par voie intraveineuse se fera une seule fois, après induction de l’anesthésie, le temps necessaire est de 5 secondes par souris. La greffe d'îlot sera effectuée une seule fois sous anesthésie generale et la durée de l'intervention est de 15 minutes. La biopsie de la queue avant sevrage entre 2 et 4 semaines se fera une seule fois, ce prélèvement s'ajoutera au marquage des animaux par tatouage réalisé par le personnel de l'animalerie. Le temps necessaire est de 5 secondes par souris.

Impact sur les animaux

Le degré de sévérité des procédures expérimentales dans lesquelles sont inclus les animaux est modéré. Le diabète est responsable d’une augmentation de la soif et d’une déshydratation et tardivement une perte de poids. Ces manifestations sont précédées d’une augmentation du taux de sucre dans le sang et les urines. Les injections intrapéritonéales et les prélèvements sanguins au niveau de la veine mandibulaire ou de la veine caudale induisent un douleur de courte durée. L’animal peut subir un stress au cours de l’anesthésie. Les greffes d’îlots peuvent induire chez les animaux des douleurs les jours suivant la chirurgie accompagnées d’une perte de poids et d'une mobilité́ réduite.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures. Ceci est justifié par le fait que l'incidence du diabete sera determinée et la reponse immune alors caractérisés.

Remplacement

Les modèles animaux représentent un outil incontournable dans l’étude des mécanismes immuno-pathologiques. Aucun modèle alternatif in vitro n’est disponible pour étudier les mécanismes immunitaires complexes intervenant dans la physiopathologie du diabète auto-immun, alors que la souris NOD représente un modèle très performant et hautement informatif. Étant donné que le paramètre principal étudié dans ce projet est la survenue d’une maladie résultant d’un ensemble complexe d’acteurs cellulaires et de médiateurs solubles, l’utilisation du modèle de la souris est incontournable.

Réduction

Le nombre de souris utilisées est maintenu au minimum pour obtenir des résultats statistiquement interprétables. L’incidence du diabète et les différences entre les populations lymphocytaires au cours des différents traitements seront analysées par un test statistique adapté. Le protocole expérimental prévoit l’analyse du système immunitaire des animaux pour limiter la répétition des expériences. La stratégie d’accouplement qui a été choisie permet de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les points finaux pour chaque procédure ont été établis afin d’éviter toute souffrance indésirable des souris. Les animaux sont hébergés dans des cages adaptées, 3-5 souris par cage pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de disputes ou de stress engendrés par une surpopulation. L’environnement est enrichi par des objets. Les animaux sont observés quotidiennement par le personnel de l'animalerie formé au bien-être des animaux et par les expérimentateurs. Les injections intraveineuses sont effectuées sous anesthésie générale. Les animaux qui ont subi une greffe d’ilots seront suivis quotidiennement la première semaine puis 3 fois par semaine par la suite. Du dietgel sera ajouté dans les cages la première semaine pour faciliter l’alimentation.

Choix des espèces

La souris NOD est considérée comme le meilleur modèle du diabète spontané insulino-dépendant auto-immun et permet d’étudier la maladie et la réponse immunitaire diabétogène. La souris NOD développe un diabète auto-immun entre 13 et 30 semaines d'âge. Les modèles animaux représentent un outil incontournable dans l'étude de cette maladie, en effet les mécanismes immunopathologiques décrits à l'aide des modèles murins se sont avérés très similaires aux mécanismes de la maladie chez l'homme. Aucun modèle alternatif in vitro n'est disponible pour étudier les mécanismes immunitaires complexes intervenant dans la physiopathologie du diabète auto-immun. Les souris NOD femelles adultes développent un diabète auto-immun entre 13 et 30 semaines d'âge. Notre étude d’incidence se concentre sur des animaux déclarant un diabète entre 13 et 22 semaines d’âge.

140 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent deux anesthésies générales et une chirurgie provoquant un infarctus du myocarde par fermeture transitoire d'une coronaire, suivie d'une injection d'un produit censé protéger le cœur. Le porteur reconnaît un risque d'arrêt cardiaque définitif pendant l'intervention, qui l'amène à prévoir davantage d'animaux. Tous les cochons sont mis à mort pour l'étude histologique du cœur.

Objectifs

L'infarctus du myocarde (crise cardiaque) est une destruction d’une partie du cœur due à un manque de sang et d’oxygène (ischémie). Cela se produit lorsqu’une artère coronaire (vaisseau sanguin apportant le sang et l’oxygène au cœur) s’obstrue. Les lésions forment une zone tissulaire morte dite infarcie qui ne permet plus une bonne contraction du cœur. La zone infarcie provoque une modification structurelle du cœur appelée remodelage, modification inévitable mais pathologique. Le remodelage est la cause la plus fréquente d’insuffisance cardiaque, caractérisé par une hypertrophie-dilatation du cœur associée au développement d’une fibrose myocardique délétère. Il faut savoir qu’il y a environ 120000 infarctus du myocarde en France tous les ans avec un taux de mortalité autour de 25%. Il existe des techniques médico-chirurgicales qui contribuent à améliorer ce taux en débouchant physiquement l’artère, mais les conséquences à long terme restent potentiellement néfastes. C’est pourquoi il est impératif de trouver des traitements complémentaires. Notre projet a donc pour but de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques pouvant protéger le cœur en diminuant la taille de la zone infarcie et en limitant le remodelage, et ainsi améliorer la qualité de vie des personnes ayant eu une crise cardiaque. Actuellement, par leur caractère préclinique, et en complément des études in vitro, les modèles animaux sont une étape indispensable pour tester de nouvelles stratégies cardio-protectrices permettant de réduire les conséquences de l’infarctus du myocarde. La fréquence cardiaque, la taille du cœur, l’anatomie coronaire, l’innervation du porc sont très proches de celle de l’Homme. Le plan général du projet est d’anesthésier les animaux, de pratiquer un acte chirurgical afin de simuler un infarctus du myocarde en fermant transitoirement une coronaire, puis d’administrer le traitement (ou le placebo) consistant en une injection de produit à visée cardio-protectrice (angiopoïetine-like-4). Ensuite, une analyse tissulaire après prélèvement de la totalité du myocarde sera effectuée, éventuellement complétée par des échocardiographies permettant l’analyse du fonctionnement du myocarde, afin d’évaluer l’efficacité du traitement. Seule l’utilisation d’animaux permet d’atteindre l’objectif du projet, qui doit rester proche de la réalité clinique humaine pour rester scientifiquement valable, et l’anesthésie/analgésie seront adaptées afin de n’induire aucune souffrance inutile.

Bénéfices attendus

Le projet permet d’évaluer de manière très prédictive des stratégies de protection cardiaque, dont les résultats bénéfiques à long terme valent autant pour la santé humaine que pour la santé animale, et jouent sur l’amélioration globale de la qualité de vie, grâce à une amélioration de la fonction cardiaque.

Procédures

Chaque animal sera soumis 2 fois à une anesthésie générale, la première d’environ 1h30 permettant la mise place d’un infarctus, et la seconde d’environ 30 minutes se terminant par la récupération du myocarde. Tous les autres actes sont indolores et consistent en des soins ou à des échocardiographies effectués sous sédation légère afin que l’animal soit bien calme. Quelques prélèvements sanguins sont prévus totalisant au maximum 70mL sur 28j.

Impact sur les animaux

La nuisance principale de ce projet est la possibilité d’un arrêt cardiaque définitif (fibrillation ventriculaire réfractaire) lors de la mise en place de l’infarctus sous anesthésie, malgré tous nos efforts pour empêcher cela. Cela oblige à prévoir un nombre plus important d’animaux à utiliser.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour récupérer le coeur afin d'en faire l'étude histologique.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet actuellement de tester totalement une stratégie de protection cardiaque sans passer finalement par l’expérimentation animale. Le traitement envisagé a déjà été testé in vitro ou sur des animaux de petite taille (rongeurs) aux caractéristiques cardiaques trop dissemblables de l’Homme. Seuls des essais effectués sur un modèle d’étude cardiaque proche de l’Homme sont scientifiquement acceptables pour envisager une extrapolation vers la pratique clinique humaine.

Réduction

Il est prévu d’utiliser le minimum d’animaux pour chaque groupe, et le nombre par lot est fixé à 9. De plus, à chaque fois que c’est possible, les animaux des lots témoins sont mutualisés pour chaque stratégie.

Raffinement

Des antalgiques, des anesthésiques et des tranquillisants sont utilisées à des doses adaptées. Il est à noter que chez l’Humain, l’infarctus en lui-même peut entrainer de la douleur, mais dans nos conditions expérimentales, elle n’a pas été objectivée (pas de différences comportementales entre avant et après l’infarctus). Des signes indicatifs de fatigue inhérents au modèle expérimental seront possiblement observés en fin de protocole lorsque les animaux seront gardés longtemps, et cette période sera plus particulièrement surveillée. Les animaux bénéficient de sciure pour satisfaire leurs réflexes de fouissage, et de jouets pour améliorer leur qualité de vie. Ils sont logés par petit groupe, hormis le jour de leur manipulation.

Choix des espèces

L’animal choisi est le modèle le plus adapté pour ce projet, et validé depuis plusieurs années dans notre laboratoire. Le porc, par sa fréquence cardiaque, la taille de son myocarde, son anatomie coronaire, son innervation et l’absence de circulation collatérale native, est un modèle proche de l’Homme. Il permet de réaliser des études précliniques très prédictives sur le plan cardiovasculaire. A 2 mois ½ (25kg), âge minimal souhaité et poids maximal souhaité.

154 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent deux anesthésies générales et une chirurgie qui provoque un infarctus du myocarde en fermant transitoirement une artère coronaire, suivie d'un traitement par une fraise vibrante placée dans la coronaire. Le porteur reconnaît un risque d'arrêt cardiaque définitif pendant l'intervention, qui l'amène à prévoir davantage d'animaux. Tous les cochons sont mis à mort pour l'étude histologique du cœur.

Objectifs

L'infarctus du myocarde, appelé couramment crise cardiaque, est une destruction d’une partie du cœur due à un manque de sang et d’oxygène (ischémie). Cela se produit lorsqu’une artère coronaire (vaisseau sanguin apportant le sang et l’oxygène au cœur) s’obstrue. Les lésions forment une zone tissulaire morte dite infarcie qui ne permet plus une bonne contraction du cœur. La zone infarcie provoque une modification structurelle du cœur appelée remodelage, modification inévitable mais pathologique. Le remodelage est la cause la plus fréquente d’insuffisance cardiaque, caractérisé par une hypertrophie-dilatation du cœur associée au développement d’une fibrose myocardique délétère. Il existe des techniques médico-chirurgicales qui contribuent à améliorer cela en débouchant physiquement l’artère, mais les conséquences à long terme restent potentiellement néfastes. C’est pourquoi il est impératif de trouver des traitements complémentaires. Notre projet a donc pour but de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques pouvant protéger le cœur en diminuant la taille de la zone infarcie et en limitant le remodelage, et ainsi améliorer la qualité de vie des personnes ayant eu une crise cardiaque. Actuellement, par leur caractère préclinique, et en complément des études in vitro, les modèles animaux sont une étape indispensable pour tester de nouvelles stratégies cardio-protectrices permettant de réduire les conséquences de l’infarctus du myocarde. La fréquence cardiaque, la taille du cœur, l’anatomie coronaire, l’innervation du porc sont très proches de celle de l’Homme. Le plan général du projet est d’anesthésier les animaux, de pratiquer un acte chirurgical afin de simuler un infarctus du myocarde en fermant transitoirement une coronaire, puis de réaliser un traitement cardio-protecteur basé sur des vibrations à très haute fréquence produites par une micro-fraise vibrante au bout d’une tige métallique très fine placée dans la coronaire (système Rotablator). Ensuite, une analyse tissulaire après prélèvement de la totalité du myocarde sera effectuée, éventuellement complétée par des échocardiographies permettant l’analyse du fonctionnement du myocarde, afin d’évaluer l’efficacité du traitement. Seule l’utilisation d’animaux permet d’atteindre l’objectif du projet, qui doit rester proche de la réalité clinique humaine pour rester scientifiquement valable, et l’anesthésie et l’analgésie seront adaptées afin de n’induire aucune souffrance inutile.

Bénéfices attendus

Le projet permet d’évaluer de manière très prédictive des stratégies de protection cardiaque, dont les résultats bénéfiques à long terme valent autant pour la santé humaine que pour la santé animale, et jouent sur l’amélioration globale de la qualité de vie, grâce à une amélioration de la fonction cardiaque.

Procédures

Chaque animal sera soumis 2 fois à une anesthésie générale, la première d’environ 2h permettant la mise place d’un infarctus, et la seconde d’environ 30 minutes se terminant par la récupération du myocarde. Tous les autres actes sont indolores et consistent en des soins ou à des échocardiographies effectués sous sédation légère afin que l’animal soit bien calme. Quelques prélèvements sanguins sont prévus totalisant au maximum 70mL sur 28j.

Impact sur les animaux

La nuisance principale de ce projet est la possibilité d’un arrêt cardiaque définitif (fibrillation ventriculaire réfractaire) lors de la mise en place de l’infarctus sous anesthésie, malgré tous nos efforts pour empêcher cela. De plus, nous ne pouvons aussi exclure une des rares complications mortelles de l’utilisation du Rotablator, principalement la perforation de la coronaire, entrainant un décès non souhaité. Cela oblige à prévoir un nombre plus important d’animaux à utiliser.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour récupérer le coeur afin d'en faire l'étude histologique.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet actuellement de tester totalement une stratégie de protection cardiaque sans passer finalement par l’expérimentation animale. Il ne parait pas justifié d’effectuer le traitement envisagé in vitro ou sur des animaux de petite taille (rongeurs) aux caractéristiques cardiaques trop dissemblables de l’Homme, alors qu’il a donné des résultats sur notre modèle animal utilisé. Seuls des essais effectués sur un modèle d’étude cardiaque proche de l’Homme sont scientifiquement acceptables pour envisager une extrapolation vers la pratique clinique humaine.

Réduction

Il est prévu d’utiliser le minimum d’animaux pour chaque groupe, et le nombre par lot est fixé à 9. De plus, à chaque fois que c’est possible, les animaux des lots témoins sont mutualisés pour chaque stratégie.

Raffinement

Des antalgiques, des anesthésiques et des tranquillisants sont utilisées à des doses adaptées. Il est à noter que chez l’Humain, l’infarctus en lui-même peut entrainer de la douleur, mais dans nos conditions expérimentales, elle n’a pas été objectivée (pas de différences comportementales entre avant et après l’infarctus). Des signes indicatifs de fatigue inhérents au modèle expérimental seront possiblement observés en fin de protocole lorsque les animaux seront gardés longtemps, et cette période sera plus particulièrement surveillée. Les animaux bénéficient de sciure pour satisfaire leurs réflexes de fouissage, et de jouets pour améliorer leur qualité de vie. Ils sont logés par petit groupe, hormis le jour de leur manipulation.

Choix des espèces

L’animal choisi est le modèle le plus adapté pour ce projet, et validé depuis plusieurs années dans notre laboratoire. Le porc, par sa fréquence cardiaque, la taille de son myocarde, son anatomie coronaire, son innervation et l’absence de circulation collatérale native, est un modèle proche de l’Homme. Il permet de réaliser des études précliniques très prédictives sur le plan cardiovasculaire. A 2 mois ½ (25kg), âge minimal souhaité et poids maximal souhaité.

808 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumises jusqu'à vingt semaines à un régime gras destiné à provoquer une fibrose du foie, elles reçoivent jusqu'à onze injections intraveineuses sous anesthésie, avec un risque de lésion ou de douleur de l'œil. Le porteur indique que le régime entraîne une perte de poids les premières semaines puis une reprise, et que toutes les souris développent la fibrose. Leur foie est prélevé après la mise à mort pour récolter les cellules étudiées.

Objectifs

La fibrose hépatique correspond à une cicatrisation du foie, en réaction à une agression, qui finit par entraîner un mauvais fonctionnement de cet organe. La cause première est l'alcoolisme, mais les maladies chroniques du foie comme les hépatites, ou les maladies métaboliques liées à l’obésité, sont aussi à l'origine de fibroses. Une fibrose peut à son tour dégénérer en cirrhose, puis en cancer du foie - l'un des plus mortels. Or il n'existe à l'heure actuelle pas de traitement contre la fibrose. Vu l’augmentation de l’obésité dans la population, les maladies du foie vont devenir un problème mondial de santé publique dans les années à venir. L’objectif de ce projet est d’étudier un type de cellules du foie, connu pour être impliqué dans la fibrose hépatique, les cellules stellaires hépatiques. Il a été récemment découvert que certaines de ces cellules prenaient une forme particulière lors de la maladie hépatique, qualifié de cellules stellaires "hypertrophiées". Ces cellules ont été découvertes à la fois sur des modèles animaux et sur des biopsies de patients atteints de fibrose hépatique. Nous évaluerons dans un modèle murin qui mime la fibrose hépatique chez l’homme, l’efficacité d’un traitement sur la disparition de la fibrose et la forme des cellules stellaires. L’étude approfondie de ces cellules au cours de ce projet permettra de mieux comprendre leur rôle dans la fibrose hépatique et de déterminer de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter la fibrose du foie.

Bénéfices attendus

La fibrose hépatique n’ayant à ce jour pas de traitement, nous pensons que cette étude pourra permettre d’identifier des cibles potentielles pour le développement de médicaments pour soigner la fibrose et la cirrhose hépatiques, actuellement incurables.

Procédures

Les administrations de molécules thérapeutiques seront réalisées par voie intraveineuse sous anesthésie générale (durée de l’anesthésie 10 min, durée de l’injection 30 secondes) toutes les 2 semaines pendant 5 mois maximum, soit 11 injections au maximum. A la fin de l’expérience, une anesthésie profonce de l’animal est réalisée (injection de l’anesthésique = 20s) et un prélèvement sanguin est réalisé (30 secondes). Les animaux seront soumis à un régime alimentaire spécifique (riche en gras et à quantité contrôlée en acides aminés) pendant 20 semaines maximum.

Impact sur les animaux

Le régime alimentaire utilisé pour induire une fibrose hépatique aux animaux entraine une légère perte de poids des animaux pendant les 3 premières semaines pour reprendre ensuite une croissance normale. Les injections répétées peuvent induire un stress, une lésion ou des douleurs potentielles de l’œil.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin des expériences car il est indispensable de récupérer le foie pour récolter les cellules d’intérêt ou de récolter leur foie et leur sang pour étudier les effets du traitement testé sur la fibrose hépatique.

Remplacement

Les expérimentations nécessaires à ce projet ont été élaborées et réfléchies afin de minimiser le nombre d’animaux tout en permettant de réaliser une étude statistique valable. Nous avons préalablement évalué plusieurs formulations de notre molécule in vitro pour ne tester chez l’animal que celles optimales.

Réduction

Ce modèle de fibrose hépatique présente une très faible variabilité d’apparition de la maladie entre les souris (sur plus de 100 souris étudiées, toutes développent une fibrose hépatique). Mais la qualité des cellules d’intérêt obtenues à partir du foie des souris ayant développée une fibrose peut être variable. Ainsi le nombre d’animaux nécessaire a été calculé pour pour obtenir un nombre suffisant de résultats exploitables. De plus suivant les durées de régime, l’expression de certains marqueurs peut être plus ou moins variable. Ainsi, le nombre d’animaux nécessaire pour étudier l’efficacité d’agents thérapeutiques a été calculé pour pouvoir exploiter les résultats statistiquement. Toutes les expériences seront réalisées d’abord sur un premier petit groupe d’animaux, la validité statistique des résultats sera testée, et l’expérience sera poursuivie sur des animaux supplémentaires si nécéssaire. Ainsi, le nombre d’animaux indiqué est un nombre maximum. Dans un souci de réduction, certains animaux âgés de 6 à 18 mois seront des anciens reproducteurs issus de fournisseurs agrées.

Raffinement

Ce régime entraine une perte de poids des animaux pendant les 3 premières semaines. Les souris reprennent ensuite une croissance normale. L’état des souris sera surveillé quotidiennement et leur poids mesuré toutes les semaines. Le milieu sera enrichi pour le bien-être des animaux (cotons de nidifications, bâtonnets et igloos…). Les injections de médicaments seront réalisées sous anesthésie générale et un suivi attentif des animaux est prévu à chaque étape des expériences. Les animaux seront régulièrement évalués à l’aide de points limites bien définis. Pour chaque animal mis à mort, nous exploiterons un maximum de données disponibles.

Choix des espèces

Pour ce projet, l’espèce animale choisie est la souris. Les modèles de maladie hépatique chez la souris, en particulier de fibrose hépatique, ont été très largement décrits dans la littérature et sont bien connus. La souris présente en effet les mêmes étapes de développement de la maladie que la fibrose humaine, ce qui en fait une espèce de choix pour l’étude de nos cellules d’intérêt et l’élaboration de nouveaux agents thérapeutiques. Comme cela est largement décrit dans la littérature, les animaux malades utilisés devront être des souris âgées de 6 semaines (1,5 mois) afin de s’assurer que leur système gastro-intestinal soit bien développé. Et les souris contrôles devront être âgées de 6 mois à 18 mois pour obtenir un nombre suffisant de cellules d’intérêt (car plus les souris sont âgées plus le nombre de ces cellules augmente).

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection sous-cutanée de la bactérie responsable de la tularémie et subissent des prises de température rectale, pour comparer la virulence de mutants bactériens à une souche de référence. Le porteur affirme que l'analyse in vivo est "indispensable" et que les modèles in vitro ne miment pas la complexité des interactions hôte-pathogène. Toutes les souris sont mises à mort pour mesurer la multiplication bactérienne dans leurs organes.

Objectifs

La tularémie est une maladie zoonotique (c'est à dire que se transmet des animaux vers l'homme) qui est fréquente en Scandinavie (pays du Nord de l'Europe: Norvège, Suède, Finlande). Cette maladie se traduit par un syndrome de type grippal (c'est à dire ressemblant beaucoup à une grippe) mais peut évoluer vers des formes sévères voire létales (c'est à dire entraînant la mort). Cette maladie est une maladie infectieuse causée par un microbe (ou microorganisme) et plus précisément une bactérie. Cette bactérie est dite pathogène car elle peut causer une maladie. L'objectif du projet est de valider l'importance de certains facteurs d'une bactérie pathogène dans un modèle murin (i.e. chez la souris) de la maladie. Pour cela des mutants bactériens sélectionnés et validés au préalable dans des expériences in vitro seront testées en compétition avec une bactérie virulente de référence pour déterminer leur virulence dans la souris. L'objectif est de vérifier le role clef des facteurs testés en vue de faire progresser la connaissance sur cette bactérie et sur la maladie et à long terme de les cibler par des médicaments.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de faire progresser la connaissance sur une bactérie pathogène qui cause une maladie appelée tularémie. Cette maladie peut tuer des humains et touche une centaine de patients par an en France et beaucoup plus en Scandinavie. A terme ce projet devrait permettre de mettre en place des thérapies innovantes pour lutter contre cette bactérie.

Procédures

prise de température rectale (durée < 1min, 3 fois: jour 0 et 24h, 30h, J0 sous anesthésie gazeuse, 24h-30h animaux vigiles, pour tous les animaux) Injection de bactéries sous la peau (durée < 1 min) sous anesthésie gazeuse (c'est à dire que les souris sont endormies pendant cette procédure), 1 fois à j0 pour tous les animaux.

Impact sur les animaux

L'injection de bactéries sous la peau sous anesthésie gazeuse est une source potentielle de douleur locale et/ou de stress transitoire (qui ne perdure pas) pour les animaux. Pendant les deux jours d'infection, les souris pourraient resentir les effets de l'infection même si les doses et les temps d'étude devraient limiter les effets indésirables.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux pour anayse de la multiplication des bactéries dans les différents organes en vue de faire progresser la connaissance sur la bactérie et la maladie qu'elle cause et à long terme de développer des traitements.

Remplacement

L'analyse in vivo est indispensable pour remplir les objectifs du projet et valider l'importance des facteurs étudiés dans la virulence de la bactérie. En particulier, les modèles in vitro étudient la réplication de la bactérie dans un seul type de cellule dans un contexte non-inflammatoire et ne peuvent pas mimer la complexité des interactions hôte-pathogène rencontrées lors d'une infection.

Réduction

Les expériences in vivo arrivent en fin de projet après une sélection fine des mutants in vitro de façon à limiter le nombre de mutants à tester in vivo et donc le nombre d'animaux. De plus, la technique utilisée dite "index de compétitivité" diminue la variabilité interindividuelle et donc le nombre de souris pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Finalement, la chronologie des expérimentations a été définie de façon à ajuster et à limiter le nombre d'animaux requis pour obtenir une information fiable.

Raffinement

Nous prévoyons les points de raffinement suivants: 1) anesthésie lors de l'inoculation des bactéries 2) Les points limites sont définis spécifiquement pour ce projet de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux 3) les doses de bactéries inoculées sont non-létales sur la durée de l'expérimentation et ont été choisies avec soin sur la base d'expérimentations passées et de la litérature 4) les signes de fièvre sont suivis régulièrement par la prise de température 5) en cas de fièvre, un analgésique est administré aux souris avec un suivi de l'efficacité du traitement.

Choix des espèces

Le modèle murin utilisé est le modèle standard (car il mime très bien la maladie humaine) dans le domaine (comme en atteste de nombreuses publications scientifiques validées par des pairs) pour tester la virulence de mutants bactériens. Les animaux utilisés seront de 6 à 12 semaines (age adulte pour la souris avec donc un système immunitaire mature).