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Exploration du métabolisme du fer en physiologie et dans les maladies neurodégénératives et inflammatoires_1
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
368 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 48 d'entre elles étant anesthésiées puis tuées sans réveil. Modèle d'une maladie neurodégénérative pédiatrique, la maladie de Sanfilippo, 160 d'entre elles reçoivent une injection de fer et l'ensemble subit des prélèvements sanguins avant une euthanasie terminale pour nécropsie. Le porteur indique remplacer quand c'est possible l'animal par des cultures cellulaires, qui restent issues des souris, et affirme que la complexité physiologique du projet ne peut être reproduite in vitro. Il justifie l'espèce par la disponibilité d'une souche mutée et d'outils développés de longue date.
Objectifs
Les héparanes sulfate (HS) sont des sucres complexes. Des mutations ou des défauts dans cette machinerie de recyclage des HS provoquent généralement une accumulation progressive de fragments de sucres partiellement dégradés dans un compartiment cellulaire spécifique; le lysosome. Cela conduit à une pathologie métabolique grave nommée mucopolysaccharidose de type III. Cette maladie neurodégénérative pédiatrique est caractérisée par l’accumulation de sucres défectueux essentiellement dans le cerveau. Les conséquences cliniques de celle-ci sont la perte des facultés d’élocution, de compréhension et de motricité des jeunes enfants atteints ainsi que des décès prématurés. A l’heure actuelle, établir un diagnostic précoce de la pathologie est complexe et aucun traitement ne permet de ralentir la détérioration mentale. Des essais de thérapie génique sont en cours d'étude (notre équipe et collaborateurs). Un premier essai à base de vecteurs a été réalisé chez 4 patients, le suivi de 5 ans montre des résultats encourageants. La poursuite de l’amélioration de cette approche prometteuse continue et des essais précliniques avec le vecteur sont en cours dans notre équipe. Ainsi, d’autres alternatives thérapeutiques restent à être recherchées pour les patients qui seront exclus de cette approche et pour les patients chez qui la thérapie génique aurait échoué. Parmi elles, l’exploration de l’accumulation du fer observée dans le cerveau de patients et dans notre modèle de souris. Les dépôts de fer s’accumulent progressivement avec l’âge aussi bien chez les patients que dans le modèle de souris. Le fer est extrêmement toxique et est capable de produire du stress oxydant, de l’inflammation, voire une mort cellulaire dépendante du fer ou ferroptose. De ce fait, nous souhaitons explorer la ferroptose dans la maladie, en vue de diagnostic et/ou traitement associant la thérapie génique en cours. Les objectifs de ce projet sont de mettre en évidence de la ferroptose dans cette maladie et identifier les populations cellulaires touchées dans le contexte de la maladie de Sanfilippo.
Bénéfices attendus
Ce travail va nous permettre de mieux comprendre la physiopathologie de la maladie de Sanfilippo . A travers l'étude approfondie des cultures cellulaires issues des animaux, nous allons pouvoir decrypter les mécanismes de la ferropotose associés. La modélisation de la surcharge en fer va aussi nous permettre d'étudier avec précision aussi bien sur l’inflammation que le stress oxydant. l'étape suivante sera la perspective de se projeter vers une solution thérapeutique majeure à cette pathologie pédiatrique grave qui n’est actuellement toujours pas soignée.
Procédures
80 animaux vont subir un prélevement sanguin à la veine caudale. Pour les 80 souris cela se fera en quelques secondes avec une couverture analgésique et un anesthésique approprié. Toutes les 368 souris (males et femelles) suivront une anesthésie et analgésie terminale en vue d'une euthanalise réglementaire necessaire à la bonne réalisation des expériences de nécropsie associées (immunologie et culture). 160 souris vont avoir une injection non douloureuse de fer en solution ou de serum physiologique en intrapéritonéale en une seule fois avec un volume réglementaire. c'est un geste qui sera réalisé avec un minimum de contention par des personnes habitués et qui dure moins de 10 secondes.
Impact sur les animaux
160 souris de ce projet recoivent une injection unique en intrapéritonéale d'une solution tamponnée contenant du fer. L'observation de l'animal en continu dans l'heure qui suit permet de déceller toute anomalie synonyme de douleurs (prostration, changement dans l'aspect de l'animal). Le personnel de la zootechnie qui les observent quotidiennement peut détecter d’éventuelles blessures, un comportement anormal ou un amaigrissement. Il n'est pas attendu d'effets particulier car nous avons une euthanasie de l'animal qui se déroule 7 jours après l'injection de fer.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à l'issue de chaque procédure expérimentale
Remplacement
Quand cela est possible, le modèle animal est remplacé par des cultures cellulaires mais qui reste issues de l’animal. Nous avons une étape « in vitro » indispensable à la compréhension et au décryptage des interactions cellulaires et des voies de signalisation de la ferroptose dans notre modèle Afin de valider ces interactions cellulaires au sein du cerveau, actuellement seul le modèle in vivo peut modéliser les interactions entre plusieurs cellules du cerveau pour une démarche thérapeutique. Nous sommes également vigilantes sur les avancées des modèles organoïdes afin de mettre en perspective le remplacement de notre modèle animal. Pour l’instant, la complexité physiologique et les réponses systémiques de ce projet ne peuvent pas être reproduites in vitro.
Réduction
Un nombre restreint de souris est utilisé dans chaque groupe (n=10) afin de perfectionner la procédure et de maximiser les chances de réussite et de réduire le nombre de pertes potentiels. Notre étude utilise des méthodes expérimentales validées, publiées et utilisées extensivement par les laboratoires de recherche. Les analyses statistiques seront effectuées à l'aide d'un logiciel de statistique performant. des tests statistiques adaptés seront utilisés. Les résultats avec p
Raffinement
Afin de réduire au maximum les douleurs et l’inconfort des animaux, cette étude sera conduite par un expérimentateur formé à l’expérimentation animale et avec le diplôme de chirurgie. Pour les injections IP, elles seront réalisées par un personnel compétent et habitué. De toute façon, nos procédures nécessitent une manipulation fréquente des animaux qui permettra à l’expérimentateur d’observer et d’évaluer l’état de santé de l’animal ainsi que son évolution dans le temps. En particulier, nous observerons : Les altérations physiques : • Les variations du poids de l’animal (et variations de l’ingestion de nourriture et d’eau), flan creusé/dos vouté, yeux enfoncés/vitreux • Les signes cliniques observables (fréquence respiratoire et cardiaque) •Les changements du comportement •Les réponses comportementales aux stimuli externes Tout écart de la normalité sera répertorié et des solutions seront considérées pour pallier à cette situation. L’ensemble de ces 4 critères sera utilisé pour déterminer l’état de santé de l’animale. Dans le cas où une souris montrerait un état de santé détérioré qui ne pourra être amélioré par les traitements (antidouleur, antibiotiques, administrations de solutions glucosées, etc…), la souris sera euthanasiée. En tous cas, une perte de poids supérieure à 20 % dans l’espace d’une semaine est considérée en soi comme un point limite et engendra l’euthanasie de l’animal. Ces cas sont très rares, dans le cadre de nos expériences mais le nombre d’animaux utilisés prend en considération ces éventuelles pertes pour les tests statistiques. Nous réaliserons les expériences anatomiques, cellulaires et moléculaires sur les mêmes animaux utilisés. La technique de préhension de l’animal sera réalisée sans lui tenir la queue suivant les recommandations du service du bien-être animal.
Choix des espèces
Le métabolisme du fer a été très étudié chez la souris qui s'est révélé être un modèle pertinent. Les hypothèses scientifiques sur lesquelles reposent le projet ont été élaborée sur la base de travaux déjà publiés chez la souris. Cette souche mutée pour l’enzyme alpha-N acetylglucosaminidase (Naglu) est adaptée pour examiner la pathophysiologie de la maladie de Sanfilippo B et développer des thérapies pour les maladies lysosomales. Notre projet de recherche est basé sur l’utilisation de modèles animaux génétiquement modifiés qui nécessitent d’utiliser des animaux contrôles sauvages. Aucune autre espèce n’est disponible avec autant d’outils précieux (Ac, protéines recombinantes) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Les stades de développements sont adaptés aux caractéristiques physiopathologiques de la maladie que nous voulons étudier. Les animaux seront utilisés à 2 et 5 mois. Ce sont des ages assez précoce qui vont nous permettre de pourvoir étudier le développement de la pathologie + ou- en présence de fer exogène. A 2 mois ces animaux ont les 1er influx de fer et à 5 mois on peut voir les consequences de cette accumulation les fonctions du cerveau et des differents types cellulaires qui y coexistent.
Etude des mécanismes de réparation tissulaire de la jonction anorectale et de leurs conséquences sur le développement des cancers
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
109 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Certaines, génétiquement modifiées, développent spontanément un cancer anorectal accompagné d'une inflammation intestinale, avec perte de poids, prostration et diarrhée à partir de six ou sept mois. D'autres subissent des microlésions de la jonction anorectale qui provoquent des saignements de l'anus, ainsi que des injections rétro-orbitaires et une phalangectomie. Le porteur évoque les organoïdes comme alternative mais affirme qu'aucun ne reproduit aujourd'hui cette région, et conclut au recours à la souris.
Objectifs
Avec plus de 40 000 cas par an en France, le cancer colorectal est la deuxième cause de décès par cancer tous sexes confondus. Les services de santé publique s’accordent tous sur le fait que ce nombre de cas sera plus que doublé d’ici 2035. Faute de connaissance des mécanismes précoces conduisant à ce cancer, son diagnostic est très souvent tardif expliquant une prise en charge à un stade trop avancé de la maladie et donc le fort taux de mortalité. Il y a donc urgence de comprendre les étapes précoces de la maladie pour la soigner à son début. Ce cancer se localise préférentiellement dans la partie basse du rectum dans la région entre le rectum et l’anus, appelé la jonction anorectale. Chez l’Homme plusieurs arguments suggèrent que des micro-cassures spontanées de la région anorectale notamment lors du passage de selles, provoqueraient une entrée des bactéries qui vivent dans le rectum et donc créeraient une inflammation à l‘origine du cancer. Ce projet de recherche vise à comprendre comment la région anorectale se répare pour prévenir l‘entrée des bactéries et de l’inflammation. L’hypothèse basée sur des études antérieures suggère que le système immunitaire et plus particulièrement certains globules blancs contribuent à la réparation de la jonction anorectale.
Bénéfices attendus
Ainsi, en validant que certains globules blancs sont capables réparer les micro-cassures de la jonction anorectale, ce projet devrait permettre de considérer les patients présentant un défaut de ces globules blancs comme des sujets à risque de développer un cancer colorectal et ainsi de mettre en place une prise charge à un stade très précoce la maladie afin d’augmenter leur survie.
Procédures
Certains animaux servent à l’élevage et ne subissent pas de gestes techniques autres qu'une phalangectomie, d’autres subissent au maximum une unique procédure avant la mise à mort, consistant à réaliser des microlésions de la jonction anorectale, cette intervention sera réalisée une unique fois par animal.
Impact sur les animaux
Les souris ayant une réponse incomplète à la molécule d'intérêt développe un cancer anorectal, associé à une inflammation intestinale qui se manifeste par la perte de poids de la souris, sa prostration et la présence de diarrhée, à partir de 6-7 mois de vie. La procédure de microlésions de la jonction anorectale peut provoquer des micro saignements de l’anus, observables par tapotement avec un mouchoir en papier blanc (petites traces rouges). Ces micro saignements ne durent pas plus de 30 minutes. L’injection intra- veineuse par voie retro-orbitaire est une procédure courante, mais qui peut toutefois causer une douleur courte. Dans l’ensemble des procédures, les contentions des souris sont également une source de stress à ne pas négliger.
Devenir
L’ensemble des animaux seront mis à mort soit suite à la fin des procédures, soit lorsqu’un point limite est atteint.
Remplacement
Une alternative à l’utilisation d’animaux pour des pathologies intestinales serait la génération d’organes in vitro, appelé organoïdes qui, en théorie, impliquerait un seul animal. Si ces organoïdes de côlon sont facilement mis en place dans les laboratoires, il n’existe pas aujourd’hui de méthode permettant la génération d’organoïdes comprenant l’anus, le rectum et la jonction anorectale. La génération de tels organoïdes reste encore un challenge technologique qui impliquerait plusieurs dizaines d’animaux du fait que cette région est unique. Par ailleurs, des bactéries commensales devraient être placées dans la lumière. Une telle approche alternative demanderait dans ses mises au point plus de 30 souris. Par ailleurs, les facteurs physiologiques tels que les tensions physiques dues au passage des selles ne seraient pas prises en compte, excluant toutes conclusions physiologiques des observations qui pourraient être faites in vitro.
Réduction
Le développement de la pathologie dans les souris développant un cancer anorectal est standardisé. 100% des animaux développent spontanément un cancer. Par ailleurs, le site de transformation est très précis et spécifiquement localisé à la jonction entre l’anus et le rectum. Ces conditions font que nous obtenons une puissance statistique forte avec 6 animaux par groupe par rapport aux modèles d’injection de cellules tumorales ou d’agents oncogéniques communément utilisés en cancérologie (le nombre de souris a été calculé à l'aide d'un logiciel de statistique). Le genre n’ayant pas d’effet sur la pathologie observée, les animaux des deux sexes seront utilisés afin de réduire le nombre d’animaux générés Par ailleurs, les moelles osseuses des animaux mis à mort seront systématiquement congelées. Elles permettront de recréer un système immunitaire génétiquement modifié dans des souris receveuses. Une moelle pouvant générer un système immunitaire dans plus de 20 souris, ces moelles seront partagées avec des chercheurs du monde entier, évitant la génération d’animaux.
Raffinement
Les procédures de microlésions impliqueront en plus d’une anesthésie gazeuse, une injection d’analgésique et une pommade anesthésiante, appliquée en région anale 5 min avant les microlésions. Ces 2 produits sont efficaces dès les premières minutes et durent entre 1h30 et 4h, délai au-delà duquel la fonction de défécation doit être revenue. Par ailleurs, le geste de microlésion est maitrisé par les expérimentateurs qui ont été formés par l’équipe ayant décrit la méthode des microlésions. Les animaux ne seront jamais isolés directement afin d’éviter tout stress et si un isolement est obligatoire il se fera via un système de plexiglass assurant un maintien olfactif et visuel. En plus des observations faites par les responsables de protocoles et le personnel technique, une observation quotidienne des animaux par les responsables bien être sera réalisée. Les expérimentateurs surveilleront le moindre signe de souffrance de l'animal selon un système de score, ce qui permettra une réponse adaptée à la douleur en question.
Choix des espèces
La complexité du système immunitaire impose que cette étude ne se fasse que dans un système proche de celui de l’Homme. La souris, apparaît comme un modèle d’expérimentation animale de choix. De plus la physiologie de la jonction anorectale est identique à celle de l’Homme et correspond à une région à fort potentiel de transformation. Enfin, les outils d’analyse indispensables à ce projet de recherche, sont développés chez cette espèce animale. Pour les souris dont le phénotype est potentiellement dommageable, les premiers signes cliniques sont observés après l’âge de 6-7 mois de vie. Dans ce contexte, y compris pour les accouplements, aucun animal au-delà de 6-7 mois de vie ne sera utilisé. La maturité du système immunitaire au niveau de l’intestin est établie après 2 mois. Tous les animaux utilisés en procédure auront entre 2 et 6 mois de vie.
Psoriasis et dysbiose vaginale, sont ils des déclencheurs des spondyloarthrites ?
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
1 490 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, la majorité tuée à l'issue et 560 mâles susceptibles d'être réutilisés dans d'autres projets. Porteuses d'un déficit immunitaire, elles reçoivent des injections destinées à déclencher une arthrite qui se traduit par un gonflement des articulations, une baisse d'activité et une perte de poids pouvant être importante. Le porteur décrit aussi l'induction d'une inflammation cutanée de type psoriasis et d'une infection vaginale, croisées pour tester l'apparition de spondyloarthrites. Les femelles sont mises à mort pour examen des tissus articulaires, tandis que les mâles en excès sont tués au sevrage ou orientés vers d'autres protocoles.
Objectifs
Les spondyloarthrites sont des rhumatismes inflammatoires fréquents (0,3% de la population française) touchant les articulations, les tendons mais aussi d’autres organes (inflammation des yeux, de la peau et du tube digestif). Les spondyloarthrites entrainent une altération de la qualité de vie. Les raisons du déclenchement de cette maladie sont à ce jour mal comprises. Il y a parfois l’association d’une susceptibilité génétique et d’un environnement déclencheur comme une infection, parfois l'influence de la flore intestinale est suspectée, parfois la présence de lésions de psoriasis sur la peau, mais la relation de cause à effet reste non prouvée. 2% de la population française est touchée par le psoriasis, maladie inflammatoire chronique de la peau. 30% de ces patients développeront au cours de leur vie un rhumatisme psoriasique, en moyenne 10 ans après le début du psoriasis. Comparativement au psoriasis isolé, le rhumatisme psoriasique, comme toutes les autres spondyloarthrites, entraîne un surcoût important pour le système de santé, notamment du fait des traitements biologiques utilisés au long cours pour contrôler cette maladie. Notre premier objectif est d’étudier sur modèle animal la transition entre psoriasis local et le rhumatisme psoriasique. La dysbiose vaginale, est une perturbation de l'équilibre de la flore vaginale. C’est la maladie génitale la plus fréquente au monde chez les femmes en âge d'être sexuellement actives, avec une fréquence de 23 à 29 %. Elle est associée à une susceptibilité aux infections sexuellement transmissibles et à un risque accru de maladie inflammatoire. Nous suspectons une plus grande susceptibilité aux spondyloarthrites chez les femmes atteintes de dysbiose vaginale. Notre second objectif est d’établir une relation causale entre une dysbiose vaginale et la survenue d’une spondyloarthrites, dans notre modèle de souris. Le troisième objectif est d’élever les souris avec un déficit immunitaire les rendant susceptibles aux spondyloarthrites afin de pouvoir mener ces études.
Bénéfices attendus
Entre les premières lésions de psoriasis et le déclenchement du rhumatisme psoriasique, il y a l’opportunité de traiter par des médicaments afin d’éviter la survenue de ce dernier. Notre recherche, une fois le modèle de cette transition établie permettra d’identifier les types de traitements susceptibles de bloquer ou retarder cette transition, voire de tester des médicaments. De même, si nous arrivons à démontrer le lien entre dysbiose vaginale et spondyloarthrites, nous pourrons identifier les types de traitements susceptibles de bloquer ou retarder cette transition puis tester des médicaments.
Procédures
Les diamètres des chevilles et poignets des souris seront mesurées toutes les semaines, parfois deux fois par semaine. Suivant le protocole pour induire la maladie, elles auront une injection intrapéritonéale d’hormone pour synchroniser leurs chaleurs, et quelques jours plus tard un dépôt intravaginal, pour induire la maladie. Ce sera fait sous anesthésie générale courte (de 3 à 15 minutes) et couplé à une prise de sang. Elles pourront avoir jusqu’à 5 autres prises de sang. Il y aura aussi jusqu'à sept écouvillonnages vaginaux. Dans l’autre protocole, elles subiront jusqu’à 5 injections sous cutanées (éventuellement répété une fois après plus d’un mois) pour induire la maladie. Elles auront des prises de sang (maximum 6) sous anesthésie générale courte (de 3 à 15 minutes). Selon l’avancée de nos connaissances, elles pourront avoir des injections de traitements en intrapéritonéal, dont les fréquences pourront varier de 1 par jour pendant 4 semaines à 1 par semaine pendant 20 semaines.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront des contentions pour les peser et mesurer le diamètre de leurs poignets et de leurs chevilles, une à deux fois par semaine. Le stress de ces mesures disparait après 2 à quatre mesures. Ils subiront des courtes anesthésies (3-15 min) pour l’injection qui déclenche la maladie et les prises de sang. Ils pourront aussi subir des injections (ip) jusqu’à une par jour, pour favoriser le déclenchement (synchronisation du cycle oestrale), induire un traitement, une atténuation des symptômes, ou de façon inattendue une exacerbation de ceux-ci. Il y aura une irritation et une inflammation locale après induction du psoriasis. Cette irritation sera inférieure à celle qui déclenche une réaction de grattage nuisible. L’infection vaginale déclenchera une inflammation de l’utérus (décrite en post mortem dans la littérature sans qu’il soit fait mention d’altération de l’état général). L’arthrite que nous cherchons à induire se traduit par un gonflement des articulations (chevilles et poignets), une baisse de l’activité (détectable par actimétrie continue sur une journée, il ne s’agit pas d’une prostration), une rougeur transitoire des oreilles, une possible conjonctivite. La perte de poids peut être importante quand la maladie est installée.
Devenir
Les femelles de la procédure d’élevage sont gardés en vie soit comme reproducteurs soit pour servir dans les expériences. A la fin des expériences, nous avons besoin de faire des examens sur les tissus articulaires des animaux donc ils sont mis à mort, tant pour les malades que pour les contrôles. Il y aura un excès d’animaux mâles (610-50, nos expériences se feront quasi-exclusivement sur des femelles). La majorité sera mise à mort au sevrage, mais la totalité de ces 560 animaux mâles pourront être potentiellement réutilisés dans d'autres projets. Il faudra que les conditions sanitaires de cette réutilisation permettent de les utiliser sans que leur déficit immunitaire les handicape.
Remplacement
Actuellement, il n’existe aucun modèle in vitro capable de mimer les spondylarthrites ou de comprendre son mécanisme, son déclenchement cellulaire ou moléculaire. Le développement de cette maladie complexe et donc son étude nécessitent l’intervention d’un système immunitaire complet en plus d'un tissus cartilagineux, voire d'une articulation, et des autres organes dont nous voulons démontrer l’implication (peau ou utérus). Nous faisons des expériences en complément de celles décrites ici ; in vivo : mesures d’activités enzymatiques, calibrage des inoculum bactériens ; ex vivo : mise en culture des cellules immunitaires, cytométrie sur les cellules immunitaires, analyses sanguines, histologie, PCR…
Réduction
Les effectifs des expériences ont été calculés afin de réduire le nombre d’animaux. Dans les expériences longues durée, nous tenons compte du taux de réussite habituel d’induction de la maladie, et de la variabilité de la grosseur des articulations. Nous synchronisons les chaleurs des femelles par une injection d’hormone afin d’augmenter les chances d’induction de la maladie. D’autres expériences seront faites sur des temps plus court pour explorer les mécanismes mis en jeu, elles se feront sur des effectifs très réduits car nous voulons alors détecter des effets tout ou rien et non des variations sur le diamètre des articulations Enfin, nous mettrons en commun les animaux contrôles sur la première expérience entre les procédures 1 et 2 et nous répéterons cela chaque fois que ce sera possible.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions sanitaires très strictes (air filtré, nourriture et eau stériles) qui font que leur déficit immunitaire n’est pas un handicap. L'enrichissement sera conforme aux préconisations de la structure de bien-être animal de l’établissement. Le geste technique de mesure des diamètres est toujours réalisé par la même personne afin que les souris soient habituées à cette manipulation qui est contraignante pour elles en termes de durée de contention et afin de réduire cette durée de contention. Les prises de sang seront faites sous anesthésie générale. Un analgésique sera administré après. Les anesthésies générales seront de courte durée (3 à 15 minutes) afin que la perturbation du rythme de vie soit de moins de 24h (l’équivalent d’un examen sous anesthésie générale en ambulatoire chez l’homme). Nous avons une grille d’évaluation des souffrances subies par les animaux. Les critères intermédiaires entrainent des mesures d’aide : ainsi en cas de perte de poids de 10%, pour un individu ou pour tout le groupe si plus de 4 en sont à ce stade, une alimentation riche et humide leur sera donnée dans la cage en plus des croquettes sèches habituelles. Les critères terminaux de cette grille correspondent à une mise à mort pour éviter des souffrances inutiles et ces critères sont atteints avant que la détérioration de l’état général ou la perte de poids n’atteignent un stade sévère.
Choix des espèces
Nous élevons une lignée de souris avec un déficit immunitaire qui les rend susceptibles à des maladies auto-immunes. Ces souris sont un bon modèle de spondylarthrite car elles vérifient assez bien ou très bien les trois critères d’un modèle animal de maladie humaine : - Elles développent des symptômes qui sont très proches de la maladie humaine. - La mutation génétique à l’origine de leur auto-immunité n’est pas décrite chez l’homme (donc ce modèle n’est pas parfait), mais la perturbation des cellules immunitaires qui en découle est retrouvée dans la maladie humaine. - Une des biothérapies efficaces en clinique est aussi efficace sur les spondyloarthrites classiques induites chez ces souris. Nous avons donc un grand espoir que pour les variantes de spondyloarthrites que nous voulons induire chez ces souris, leurs réponses aux médicaments seront prédictives de ce qui sera efficace dans l’espèce humaine. L’âge des souris au début des expériences est compris entre 5 et 10 semaines pour 1) avoir des animaux adultes ; et 2) ne pas avoir des animaux vieillissant en fin d’expérience. Pour l’élevage nous aurons des animaux de leur naissance à la réforme (à 6-8 mois).
Rôle de la toxicité cellulaire dans le remodelage cardiaque après l’infarctus du myocarde chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
9 830 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie subit un infarctus du myocarde provoqué chirurgicalement, suivi d'échocardiographies sous anesthésie, de prélèvements sanguins par voie sous-mandibulaire sur animal vigile et d'injections répétées, dont certaines par voie rétro-orbitaire. Le porteur affirme que ces modèles murins sont une étape "indispensable" et un préalable absolu à la validation de stratégies thérapeutiques, les modèles in vitro ne pouvant selon lui recréer l'ensemble des interactions cellulaires. Les souris sont mises à mort pour analyses histologiques du cœur.
Objectifs
L’incidence de l’insuffisance cardiaque consécutive à un infarctus du myocarde est en augmentation constante, et la mortalité à court et moyen terme reste élevée, ce qui constitue un enjeu médical et sociétal majeur. Notre projet a pour but de comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent le rôle délétère de certaines cellules de l’immunité, après un infarctus du myocarde chez la souris. Nous utiliserons des modèles de déplétion cellulaires pour étudier la contribution de ces populations. L’utilisation de modèles de souris génétiquement modifiées nous permettra d’analyser spécifiquement le rôle de ces cellules et de certaines protéines associées. Ces animaux subiront un infarctus du myocarde induit chirurgicalement accompagné d'injection d'anticorps, de cellules ou de molécules pharmacologiques. Nous analyserons la fonction cardiaque des souris par échocardiographie et étudierons également le remodelage cardiaque et la réponse inflammatoire post-infarctus. Ce projet est constitué de 4 procédures impliquant au total 9830 souris sur une durée de 5 ans.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre, à court terme, une meilleure compréhension des mécanismes du remodelage cardiaque après infarctus. En particulier, l’identification des mécanismes moléculaires activés au sein de ces cellules est essentielle pour le développement à plus long terme de stratégies thérapeutiques innovantes visant à limiter les dommages tissulaires après un infarctus du myocarde et par conséquent, limiter le développement de l’insuffisance cardiaque et réduire la mortalité post-infarctus.
Procédures
Ce projet comporte une partie d'élevage de souris déficientes pour certains gènes d'intérêt. Lors du sevrage, ces animaux subiront une biopsie de queue ou d'oreille pour génotypage. Une partie des animaux va subir une procédure chirurgicale de 30 min au cours de laquelle un infarctus du myocarde est réalisé. Quatre injections sous-cutanées d’analgésiques (durée inférieure à 30 secondes pour chaque injection) sont prévues, dont une en préopératoire. A différents temps après l’opération, une échocardiographie non-invasive indolore sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse, d’une durée maximale de 15 minutes. Une partie des animaux va subir une injection intrapéritonéale d'une durée maximale de 30 seconde ainsi qu'un prélèvement sanguin hebdomadaire par voie sub-mandibulaire en étant vigile, d'une durée maximale d'une minute (4 prélèvements maximum); une autre partie des animaux va subir des injections intrapéritonéales pour traitement d'une durée maximale de 30 secondes (au maximum une par jour pendant 7 jours soit 7 injections au total) ; une dernière partie des animaux va subir une injection intraveineuse par voie rétro-orbitaire, d'une durée maximale de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à l’expérimentation : inconfort lié à la préhension et contention des animaux, potentielle douleur au point d'injection, stress lié à l'anesthésie. Effets de la chirurgie : douleur post-opératoire, mobilité transitoirement réduite suite à l'anesthésie (8 heures). Bien que l'infarctus induise une perte de fonction cardiaque, il n’altère cependant pas la mobilité des souris dans leur cage ni leur comportement.
Devenir
Les animaux issus de la procédure 1 seront utilisés pour constituer les groupes expérimentaux des autres procédure ou au sein de la procédure 1 pour contribuer au maintien de l'élevage des lignées de souris s'ils sont d'un génotype d'intérêt, ils seront mis à mort sinon. Les animaux en fin de procédure 2, 3, et 4 seront utilisés pour réaliser des analyses histologiques ou d'inflammation dans le coeur.
Remplacement
Nous avons évalué nos hypothèses in vitro avant de les étudier dans nos modèles murins. Ces derniers sont une étape indispensable dans la compréhension des mécanismes survenant au cours de l’infarctus du myocarde. En effet, ces événements sont des phénomènes complexes impliquant un grand nombre de types cellulaires, ce que des modèles in vitro ne pourraient pas permettre de recréer dans leur entièreté. Nous voulons, in vivo, comprendre les différentes interactions cellulaires, mais également tissulaires qui sont mises en jeu au cours des phénomènes de réparation tissulaire consécutifs à une atteinte cardiaque. Ces modèles murins pré-cliniques sont également un préalable absolument nécessaire et indispensable pour la validation des stratégies thérapeutiques afin de les mettre en application chez des patients présentant un infarctus du myocarde.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation de ce projet a été calculé au plus juste. En utilisant des calculs de puissance pour déterminer la taille minimale suffisante des groupes expérimentaux, nous obtenons une taille d’échantillon de 15 souris par groupe. En tenant compte des aléas inhérents à la procédure chirurgicale, nous estimons une taille de groupe à 20 animaux. Les résultats obtenus seront analysés avec des tests statistiques adaptés. Pour réduire le nombre d’animaux, nous analyserons plusieurs paramètres sur le même animal. En ce qui concerne l'élevage, nous aurons une stratégie de croisement des animaux permettant d'optimiser la génération des animaux en fonction des groupes nécessaires pour les expériences et pour la gestion des lignées, à l'aide des tableaux de croisement.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cages enrichies dans l’animalerie où les conditions d'hébergement et d'élevage sont standardisées et contrôlées durant toute la vie des souris. Par ailleurs, il y aura un enrichissement complémentaire dans certains cas particuliers. Lors des procédures expérimentales, la souffrance animale sera réduite au maximum par l'utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptées, et par, l’établissement et l'application de points limites stricts et spécifiques au projet. Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière et renforcée par les expérimentateurs confirmés et par le personnel technique qualifié de l’animalerie pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être. Les grilles de score de suivi des points limites seront remplies sous contrôle de la personne responsable de la mise en oeuvre du projet.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour l'étude des maladies cardiovasculaires. De plus, c’est le seul modèle dans lequel ont été générées les lignées déficientes pour l’expression des protéines que nous souhaitons étudier. La souris permet de garantir l’homogénéité des résultats et la possibilité de surveiller le développement des complications vasculaires dans un espace de temps raisonnable. Grace à ces modèles souris, nous pourrons obtenir rapidement des résultats très importants pour notre projet, ce qui ne serait pas le cas avec une autre espèce qui prendrait beaucoup plus de temps à se reproduire et où le nombre de naissance serait nettement moins important. Nous utiliserons des souris adultes non sénescentes, âgées de 10 semaines minium et chez lesquelles le système cardio-vasculaire est arrivé à maturité. En dessous de cet âge, la variabilité est accrue dans le remodelage et la survie est fortement réduite à la suite d’un infarctus du myocarde.
Impact de la malnutrition maternelle sur le risque d’infection par le streptocoque du groupe B chez le nouveau-né, chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des femelles gestantes soumises à des régimes de dénutrition ou de suralimentation subissent des prélèvements sanguins hebdomadaires, et leurs souriceaux sont infectés par gavage avec le streptocoque du groupe B avant d'être eux aussi prélevés. Le porteur indique que la dose bactérienne rapportée dans la littérature n'a pas d'incidence grave chez les nouveau-nés, et que le gavage comporte un risque de fausse route ou de perforation de l'œsophage. Femelles et petits sont mis à mort pour collecter leurs organes.
Objectifs
Le Streptocoque du groupe B (SGB) est une bactérie appartenant à la flore vaginale et digestive, présente chez 15 % des individus. Cette bactérie est inoffensive pour l’adulte en bonne santé, mais elle est la première cause d’infection bactérienne néonatale dans les pays industrialisés. La première étape dans l’infection par cette bactérie est le franchissement des muqueuses et notamment de la muqueuse digestive pour atteindre la circulation sanguine. Les infections néonatales avec cette bactérie sont rares (300 cas par an en France), mais sont associées à un taux de mortalité important et à des séquelles significatives, notamment sur le plan neurologique. Les facteurs de risque d’infection par cette bactérie sont peu connus. Ce projet vise à étudier l’impact de la malnutrition maternelle sur le risque de développer des infections d’origine digestive chez le nouveau-né. Plus particulièrement nous étudierons l’impact de la malnutrition maternelle (à la fois sur- et sous-nutrition) sur le risque d’infection par la bactérie. La complexité de la barrière intestinale est difficilement simulable in vitro. De même les modèles in vitro ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions hôte/pathogène à différents stades de développement (nouveau-né/jeune vs adulte). Ainsi, seule l’expérience chez l’animal permettra d’étudier les mécanismes permettant à la bactérie de franchir la barrière intestinale chez le nouveau-né. La souris est un modèle animal pertinent et validé pour l’étude des infections à SGB et l’animal de choix pour étudier le franchissement de la barrière intestinale par le SGB. Par ailleurs, nous utiliserons des modèles de malnutrition maternelle validés. Le projet utilisera des souris adultes (femelles gestantes), ainsi que des nouveaux-nés.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier des facteurs de risque des infections néonatales par une bactérie Streptocoque de groupe B et permettra de sensibiliser aux risques de la malnutrition sur la santé, en particulier pendant la période périnatale.
Procédures
Un prélèvement de sang sera réalisé sur les femelles en gestation, chaque semaine soit 3 fois. Ce geste durera 20 secondes max. Les souriceaux seront gavés 2 fois au total : le 1er gavage durera 10 secondes puis le 2è gavage 6h après prendra également 10 secondes. Ces souriceaux auront 2 prélèvements de sang et ce geste durera 20 secondes max.
Impact sur les animaux
Les régimes alimentaires utilisés dans ce projet sont maitrisés par la communauté scientifique et ont déjà fait l’objet de publications. Cependant, un suivi des femelles gestantes mises sous ces régimes sera réalisé par des personnes qualifiées et expérimentées, tout au long de la gestation (pesée, observation) afin de contrôler les effets pouvant être liés à la malnutrition (stress, agressivité des animaux). Par ailleurs, les expériences d’infection chez le nouveau-né seront très courtes, 24h maximum. La dose de bactéries utilisée pour l’infection est rapportée dans la littérature comme n’ayant pas d’incidence grave chez les nouveaux-nés de souris Balbc. Une attention particulière sera portée sur nos animaux tout au long de l’expérimentation. Les gavages (bactéries ou marqueur fluorescent) seront réalisés par une personne expérimentée en vue de réduire et/ou identifier un risque de fausse route, de perforation de l’œsophage ou un léger stress.
Devenir
A l’issue des premières expérimentations, les souris femelles ayant eue une gestation et sous traitement seront mises à mort pour collecter différents organes et effectuer des analyses ex vivo. Les souriceaux intégreront la suite des expérimentations et seront mis à mort à l’issue de celles-ci pour collecte des tissus (intestins, foie, rate, …) et effectuer des études bactériennes, protéiques et sur l’ADN.
Remplacement
Les modèles in vitro ne peuvent restituer ni la complexité des barrières physiologiques, ni l’intégralité du processus infectieux allant de la colonisation digestive jusqu’à la méningite, ni les interactions bactéries-hôte mises en jeu lors de l’infection. Ainsi, seule l’expérience chez l’animal permettra de déterminer l’impact de l’infection bactérienne sur la perméabilité intestinale et différentes cellules du tissu intestinal, comme le système nerveux entérique. La souris, et en particulier la lignée Balbc, est un modèle animal pertinent et validé pour l’étude des infections avec notre bactérie d’intérêt et l’animal de choix pour étudier le franchissement de la barrière intestinale.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum possible tout en permettant une analyse statistique fiable. Nous prévoyons d'utiliser les mêmes souris mâles pour chacun des cycles de reproduction. Nous estimons à 5 petits par portée. Nous avons prévu 15 animaux/groupe pour la procédure d’infection bactérienne et ce nombre a été déterminé par rapport à notre expérience dans le domaine de l’expérimentation animale (gestation, nombre d’animaux par portée et nombre d’animaux minimum pour effectuer nos expériences).
Raffinement
Les souris seront conservées dans des cages de taille suffisante, avec un accès libre à l'eau et à la nourriture. Un enrichissement sera apporté par l’ajout de frisottis. Le bien-être des souris sera surveillé tout au long de l’étude. La prise de poids sera suivie tout au long de l’étude (3 fois/semaine). Des points limites seront mis en place pour évaluer le mal-être des animaux (douleur, stress, souffrance). En cas d'éventuels signes de souffrance les animaux seront mis à mort par une personne compétente.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal pertinent et validé pour l’étude des infections avec notre bactérie d’intérêt et l’animal de choix pour étudier le franchissement de la barrière intestinale. Nous utiliserons des souris femelles de 7-10 semaines au moment de l’accouplement et des mâles de 7-10 semaines également. Les souriceaux issus de ces accouplements seront infectés par voie orale par la bactérie à l’âge de 2 semaines. Ceci est un modèle d’infection néonatale, comme ce qui est rencontré chez l’Homme
Etude du lien entre les cellules immunitaires intestinales et cutanées dans le développement de tumeur.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
516 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer une inflammation puis des tumeurs cutanées vers 8 à 10 mois, elles subissent des fibroscopies par voie rectale, une phalangectomie pour le génotypage et des applications répétées d'adhésif sur l'oreille destinées à provoquer une inflammation. Le porteur affirme qu'aucune méthode sans animaux ne reproduit les échanges entre intestin, microbiote, système immunitaire et peau à l'échelle de l'"organisme entier", et conclut que le recours à la souris est "indispensable". Les retombées annoncées, de nouvelles cibles contre les cancers de la peau, restent renvoyées à une étape ultérieure.
Objectifs
Les tumeurs présentent des caractéristiques et capacités particulières qui sont essentielles à leur développement. Parmi celles-ci, on peut retrouver leur capacité à proliférer indéfiniment, leur capacité à muter et à échapper au système immunitaire. De nouvelles études suggèrent que le microbiote, micro-organismes vivants dans notre corps, impacte aussi la croissance tumorale. Dans le cas du mélanome par exemple, un déséquilibre du microbiote intestinal est lié à une meilleure progression de la tumeur, de plus, le remplacement du microbiote « malsain » par un microbiote "sain" chez les patients atteints de mélanome permet d’améliorer l’efficacité des traitements par immunothérapie. De même, les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI telle que la maladie de Crohn), maladie où le microbiote intestinal joue une rôle important, présentent régulièrement des symptômes cutanés tels que des dermatites, de l’acné, une rosacée. Ceci suggère un lien entre microbiote intestinal, efficacité du système immunitaire et développement tumoral cutané ou d’une inflammation cutanée. Le projet proposé ici vise à étudier le lien qui peut exister entre ces trois acteurs. Pour ce faire, l’utilisation de modèles animaux est nécessaire afin de pouvoir étudier les interactions, échanges et influences du microbiote et système immunitaire sur le développement tumoral à distance.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment notre système immunitaire agit dans nos intestins et sur notre peau. Le but est de découvrir les mécanismes permettant la mise en place d’une inflammation cutanée qui mène au développement de tumeurs ; ainsi que l’impact du microbiote sur ces mécanismes et réponses. Ceci nous permettra ensuite d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des cancers de la peau et de proposer une nouvelle approche pour soulager les problèmes de peau chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI).
Procédures
Une fibroscopie, comparable à une coloscopie chez l’Homme, sera effectuée sur certains animaux afin d’étudier la communication immunitaire entre intestins et peau. Cette fibroscopie ne durera pas plus de 10 min par animal et sera réalisée 1 fois sur les animaux, à l’exception des animaux d’une manipulation où le geste sera répété 3 fois en 20 jours. Avant chaque fibroscopie, une injection d’analgésique sera faite sur les animaux. Celle-ci durera 10 secondes au total par animal. Les animaux seront anesthésiés avant la fibroscopie. Certains animaux seront traités par antibiotiques par voie orale. L'identification et le genotypage des animaux se fera par phalangectomie distale donc en un seul geste avant calcification. Certains animaux auront une application d’adhésif sur l’oreille permettant de mimer l’apparition de lésions cutanées. Cette application sera répétée 3 fois sur une oreille et entrainera une inflammation au site de « l’épilation ».
Impact sur les animaux
Le projet implique l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés qui développent une inflammation et des tumeurs cutanées. Ces animaux vivent normalement pendant les 6 premiers mois de vie sans aucun symptôme. Ils commencent à développer une inflammation cutanée vers 6 mois de vie et des tumeurs cutanées vers 8/10 mois de vie. Certaines expérimentations impliquent l’insertion d’une fibre optique par voie rectale dans l’animal. Celle-ci ne devrait normalement pas générer de lésions ou de gêne puisque cela s’apparente à l’insertion d’un thermomètre rectal chez l’Homme. Certains animaux auront un endommagement de la barrière cutanée de l’oreille des souris, à l’aide d’un ruban adhésif.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort soit suite à la fin de la procédure afin de prélever les organes, soit lorsqu’un point limite est atteint et qu’aucun geste ne permet un retour à l’état normal et ce afin d’éviter toute souffrance.
Remplacement
L’étude de la migration des cellules immunitaires entre deux organes ne peut se faire, pour le moment, qu’à l’échelle de l’organisme entier. Aucune technologie actuelle n'est capable de mimer les interactions entre le système digestif, le microbiote, le système immunitaire et la peau. Cette étude ne peut se faire qu'à l'échelle d'un organisme entier. De plus, la complexité du système immunitaire ainsi que son contrôle et sa régulation imposent que cette étude se fasse dans un système intégré, à l’échelle de l’organisme entier. L’utilisation d’animaux est donc indispensable à l’avancée de ce projet.
Réduction
De précédentes études montrent que 100% des animaux développent une inflammation intestinale/colorectale ainsi qu’une transformation tumorale cutanée. L’effet étant indépendant du sexe de l’animal, tous les animaux générés pourront être utilisés. Cela permet donc de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. De plus, lors de la mise à mort des individus, certains organes pourront être collectés afin de servir à un autre projet développé dans le laboratoire, permettant ainsi de ne pas utiliser d’autres souris pour cet autre projet. Également, les animaux des groupes contrôles seront mutualisés, permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés ici. Afin de réduire encore plus le nombre d’animaux, une formation au geste de « fibroscopie » a été réalisée en suivant un protocole établi et utilisé en routine par d’autres manipulateurs. Pour le calcul du nombre de souris utilisables par groupe, nous avons réalisé des simulations statistiques afin d’utiliser le nombre minimal d’animaux pour la validation des objectifs.
Raffinement
Des éléments d’enrichissement seront systématiquement mis dans les hébergements afin de favoriser le bien-être animal. Les animaux qui seront anesthésiés feront l’objet d’une surveillance accrue post-anesthésie. Pendant la période d’anesthésie, un gel hydratant et protecteur sera appliqué sur leurs yeux afin d’éviter toute déshydratation et donc toute gêne pour l’animal. Un analgésique sera également administré aux animaux en prévention de tout geste. Afin d’augmenter le raffinement, l’application d’une pommade anesthésique et d’un lubrifiant au niveau anal sera faite pour tous les animaux qui auront une endoscopie/fibroscopie afin de faciliter la fibroscopie (amélioration du protocole). En plus de la surveillance mise en place pour assurer le bon réveil des animaux, une surveillance supplémentaire 1 heure après le réveil des animaux sera faite afin de détecter de potentiels saignements chez les animaux ayant subi la fibroscopie. Si des saignements sont détectés et durent plus d’une heure, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
La complexité du système immunitaire ainsi que son contrôle et sa régulation font que l’étude ne peut se faire que dans un système intégré et donc à l’échelle de l’organisme entier. L’étude de la transformation tumorale cutanée, sous l’influence du microbiote intestinal, implique que les expérimentations soient menées à l’échelle physiopathologique sur un modèle animal de choix. La souris (mus musculus) correspond à ces critères. Premièrement, les souris présentent un système immunitaire similaire à celui de l’Homme. De plus, le rôle de la molécule d’intérêt est conservé à plus de 97% entre l’Homme et la souris, ce qui permet de transposer facilement les études réalisées sur la souris chez l’Homme et inversement. Également, le microbiote de cette espèce est particulièrement bien caractérisé et peut-être facilement contrôlé et étudié, ce qui est important pour le projet que l’on souhaite mettre en place. Enfin, l’ensemble des outils nécessaires à l’étude, comme les anticorps, protocoles et kits, sont développés sur le modèle murin depuis plus de 20 ans. La souris est donc le modèle le plus adapté pour l’exécution de ce projet. Le but du projet est de comprendre l’impact de la signalisation de la molécule d’intérêt sur la réponse du système immunitaire au microbiote et le lien avec le développement tumoral cutané. Cette transformation peut commencer vers 6 mois de vie mais est complétement visible à 8-10 mois de vie. De plus, la maturité du système immunitaire intestinal est établie après 2 mois et l’intestin de souris est mature après 45 jours de vie. De ce fait, seules des souris adultes seront utilisées. Elles seront utilisées à 2, 6 et 8/10 mois de vie (la sortie des animaux entre 8 et 10 mois de vie dépendra des signes cliniques observés lors de la surveillance quotidienne dont feront l’objet les souris).
Neuroprotection des photorécepteurs à cone chez un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des yeux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation dégradant les photorécepteurs dès la naissance, elles reçoivent une injection quotidienne pendant trente-deux jours puis un électrorétinogramme sous anesthésie, pour cribler jusqu'à quarante molécules censées protéger la vision. Le porteur indique que les injections répétées peuvent provoquer une inflammation et une douleur, l'animal étant tué s'il souffre. Il précise avoir testé les molécules sur cellules et tissus mais affirme que leur fonctionnalité "ne peut être évaluée que sur un modèle vivant".
Objectifs
La dégénérescence maculaire lié à l’âge (DMLA) est une maladie chronique de la macula, zone centrale de la rétine où sont concentrés les photorécepteurs à cônes. Ces derniers sont indispensables à la vision fine et centrale. S’ils dégénèrent, le patient perd l’information visuelle et aperçoit des scotomes (tâche noire) qui comble ce manque d’information. La DMLA est la première cause de handicap visuel chez les personnes de plus de 50 ans dans le monde. Il existe deux formes de DMLA : sèche et humide. A l’heure actuelle, il n’existe aucun traitement curatif, seulement quelques traitements permettant de ralentir la propagation de la forme humide. Pour la forme sèche, qui représente 80pourcents des cas de DMLA, de nouveaux traitements sont actuellement en phase clinique. Ces traitements sont des antioxydants (vitamine E) ou bien des traitements agissant sur le système immunitaire, mais aucun de ces traitements ciblent spécifiquement le mécanisme de mort cellulaire des photorécepteurs à cônes. Ainsi, le but du projet est de trouver une/des molécule(s) protégeant les photorécepteurs à cônes de la dégénérescence lorsqu’un patient est atteint de DMLA. Avant de passer sur un modèle vivant, des tests préalables in vitro (photorécepteurs en culture et explants de tissus rétinien) ont été réalisés pour évaluer les effets potentiels neuroprotecteurs des molécules.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but d’identifier des molécules qui préviennent la dégénérescence des photorécepteurs à cône. Si une ou des molécule(s) est, sont identifiée(s), un traitement pourra ensuite être envisagé pour soigner les millions de patients atteints de DMLA (dégénérescence maculaire lié à l'âge) dans le monde.
Procédures
Injection intrapéritonéale : Nous allons procéder à des injections intrapéritonéales quotidiennement sur animal vigile, pendant 32 jours. Chaque injection dure moins d’une minute par animal. Anesthésie générale : Au bout du 33ème jours, une anesthésie générale sera effectuée sur chaque animal afin de réaliser l’ERG. L’anesthésie générale sera injectée en intrapéritonéale. Electrorétinogramme (ERG) : Cet examen clinique permet de mesurer l’activité des photorécepteurs suite à un stimulus lumineux. Ainsi, cet examen nous permettra de déterminé si l’animal à une vision restauré ou non selon les molécules injectées. Pour cela, la cornée sera anesthésiée localement et la pupille sera dilatée par médication. Des électrodes seront placées afin d’enregistrer l’activité électrique généré par la rétine suite à un stimulus lumineux. Les deux yeux seront soumis à cette procédure. L’ERG dure environ 40 minutes par animal. Les souris passeront 1 fois par cette étape expérimentale. Les souris seront placées en chambre de réveil chauffée à 32 degrés et seront surveillées jusqu’à leur complet réveil après l’anesthésie. Les souris seront euthanasiées par une méthode réglementaire à la fin de la période de maintien afin de réaliser le prélèvement des yeux et les analyses nécessaires.
Impact sur les animaux
Une inflammation peut être entraînée par les injections intrapéritonéales au niveau abdominal ainsi qu’un léger stress et une douleur de courte durée lors de l’introduction de l’aiguille. Un léger stress peut être engendré lors du changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme). Risque faible de mauvaise réaction à l’anesthésie générale lors de l’électrorétinogramme.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés et les yeux prélevés (après euthanasie) pour permettre des analyses histologiques complémentaires. Tous les animaux des procédures seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Remplacement
Les molécules qui seront injectées in vivo ont été préalablement sélectionnées. En effet, celles-ci ont été testées sur deux modèles différents : l’un cellulaire et l’autre tissulaire dont tous deux présentaient une dégénérescence des photorécepteurs à cône. Grâce à ces modèles nous avons sélectionné des molécules ayant une double action,1) de protection contre la mort cellulaire et 2) de préservation de la structure des photorécepteurs à cône. La fonctionnalité des photorécepteurs ne peut quant à elle être évaluée uniquement sur un modèle vivant. Dans le cas présent nous effectuerons les tests sur un modèle murin présentant une dégénérescence similaire à celle de l’Homme.
Réduction
Suite à un calcul de puissance, nous estimons que 10 souris par groupe (1 groupe correspondant à 1 molécule ou 1 véhicule) est suffisant pour réaliser des tests statistiques. Nous prévoyons de tester un maximum de 40 molécules sur les 5 ans. Soit un total de 800 souris. Les lots seront composés de la manière suivante : souris et molécule ou souris et véhicule (témoin). Pour une interprétation fiable des résultats, ces derniers seront soumis à des tests statistiques. De plus, dans un esprit de réduction du nombre d’animaux, nous regrouperons les témoins pour les molécules aillant le même véhicule.
Raffinement
Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Les animaux seront hébergés dans des cages de stabulation avec enrichissement (coton pour le nid, maison en carton), alimentation et abreuvement à volonté. Pour la réalisation des électrorétinogrammes, les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale associée à une anesthésie locale de la cornée. Un gel hydratant sera utilisé pour protéger la surface cornéenne pendant la procédure. L’anesthésie pouvant provoquer une hypothermie, les souris seront placées sur un tapis chauffant durant toute la durée de l’anesthésie et en chambre thermostatée jusqu’à leur complet réveil. Une nouvelle aiguille sera utilisée pour chaque animal pour limiter la douleur induite lors d’injections intrapéritonéale. Nous appliquerons une noisette de pommade anti-inflammatoire et antibactérienne à la fin de l’électrorétinogramme. Pour limiter le stress des animaux lors du changement d’environnement (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme), les souris resteront dans leur cage habituelle d’hébergement, avec leurs congénères et l’enrichissement habituel (coton pour le nid, maison en carton), ainsi que nourriture et eau à volonté. Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. Des critères d’arrêt ou points limites ont été déterminés pour chaque étape de la procédure expérimentale. Les animaux utilisés dans ce projet naissent dans notre animalerie. Les injections intrapéritonéales répétées peuvent induire une douleur chez les animaux. Si cela se produit, l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
La souris utilisée dans ce projet est un modèle lié à une mutation spontanée induisant une dégénérescence précoce des photorécepteurs. Ce modèle est très utilisé par la communauté scientifique dans le cadre de rétinopathie pigmentaire récessive très utilisé par la communauté scientifique. Ces molécules seront injectées sur ces sourisqui , présentent une dégénérescence précoce des photorécepteurs dès leur naissance.. La dystrophie des photorécepteurs à cône débute aux alentours de 14 jours après la naissance (P14) des animaux et se termine à 90 jours après leur naissance. D’après une étude, nous pouvons réduire la fenêtre de dégénérescence de P14 à P45, où moins de 50 pourcents des corps cellulaires et moins de 25 pourcents des segments externes sont encore présent chez les photorécepteurs à cônes. Donc, nous injecterons les animaux entre P14 à P45, soit la période à laquelle les photorécepteurs à cône dégénèrent.
Évaluation de l’innocuité d’une nouvelle molécule, administrée par voie intranasale, chez la souris saine
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
160 souris saines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une à trois administrations intranasales d'une molécule sous anesthésie, pour évaluer sa tolérance avant des essais d'activité contre une bactérie et le virus de la grippe. Le porteur indique n'attendre aucun effet secondaire, la molécule s'étant montrée non toxique en culture cellulaire, mais prévoit un suivi du poids et de la température. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne renseigne sur la tolérance d'un "organisme entier", d'où le recours aux souris pour cette étape préalable.
Objectifs
Chaque année, dans le monde, le nombre de cas de grippe est d’environ 1 milliard et le nombre de décès liés à la grippe est estimé entre 290 000 et 600 000. L’émergence d’une pandémie, comme celle de COVID-19, met fortement en évidence l’impact sanitaire, social et économique d’une infection virale incontrôlée. Ainsi, chaque pays est également confronté à des défis de sécurité. Même si la vaccination est la stratégie la plus efficace contre les virus, la courte durée de l’immunité induite par le vaccin, associée à la dérive antigénique intrinsèque des virus, affecte négativement cette protection. En parallèle, l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) alerte aussi sur les maladies résistantes aux médicaments, qui pourraient être responsables de 10 millions de décès chaque année d’ici à 2050. Parmi ces maladies, celles ayant pour origine des bactéries multi-résistantes aux antibiotiques présentent un risque critique, avec une menace particulière dans les hôpitaux, les maisons de retraite, etc. Une liste de bactéries a été publiée et comporte notamment Pseudomonas aeruginosa dont certaines souches sont devenues multi-résistantes aux antibiotiques. Ces souches peuvent entraîner des infections sévères, telles que des pneumonies qui peuvent conduire au décès des patients. De nouvelles molécules antivirales et antibactériennes sont donc à développer de toute urgence. Le projet actuel a pour objectif d’évaluer in vivo l'innocuité d’une molécule que nous appelerons M, pour déterminer les doses auxquelles elle pourra être utilisée ensuite dans une autre demande d'autorisation de projet pour évaluer ses activités antibactérienne et antivirale, dans le contexte d’une infection par P. aeruginosa ou par le virus de la grippe, chez la souris. En effet, cette molécule a déjà montré une activité antivirale et antibactérienne in vitro, sans toxicité aux doses utilisées.
Bénéfices attendus
Notre projet consiste à évaluer l'innocuité d’une nouvelle molécule M prometteuse chez la souris saine. Cette molécule M possède une activité in vitro contre P. aeruginosa et contre le virus de la grippe, à des doses non cytotoxiques. Les expériences montrent que cette molécule ne semble pas favoriser la résistance et propose une solution de traitement avec une administration par voie nasale, ce qui permet d’interagir directement avec la muqueuse nasale et pulmonaire. Les expériences permettront de déterminer la dose la plus appropriée à utiliser pour démontrer son activité antivirale et antibactérienne in vivo. Ceci concernera une autre demande puisque les expériences devront être réalisées dans une animalerie A2 qui permet d'utiliser des micro-organismes de classe de risque 2, c'est-à-dire des pathogènes pouvant provoquer une maladie chez l'homme et pour lesquels une prophylaxie ou/et des traitements sont efficaces. Cette nouvelle molécule permettrait ainsi d’apporter une nouvelle stratégie pour lutter contre Pseudomonas aeruginosa et contre le virus de la grippe.
Procédures
Dans une première expérience, les souris recevront 1 seule administration intranasale de la molécule M ou de solution contrôle, sous anesthésie générale induite par voie intrapéritonéale. Dans une seconde expérience, les souris recevront 2 ou 3 administrations intranasales de la molécule M ou de solution contrôle, sous anesthésie générale induite par voie gazeuse. La durée d’une administration intranasale, anesthésie comprise, dure environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les contentions engendrent du stress pour l'animal et l'injection intrapéritonéale pour l'anesthésie générale peut entraîner une légère douleur au niveau du site de l'injection. L’administration de la molécule M ne devrait pas provoquer d’effets secondaires car les tests en culture cellulaire ne montrent pas de cytotoxicité aux doses efficaces, mais les souris feront l’objet d’un suivi bi-quotidien et nous mesurerons notamment la température corporelle et le poids et nous observerons attentivement leur comportement.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à la fin de chaque plan expérimental afin de prélever des organes et d’analyser les différents paramètres de la tolérance.
Remplacement
Dans notre étude, les expériences que nous souhaitons réaliser sur les souris ne peuvent pas être remplacées par des méthodes alternatives car actuellement, aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de connaître la tolérance d’un organisme entier. Par conséquent, les modèles animaux sont nécessaires à notre étude. Nous souhaitons rajouter que la molécule a déjà démontré in vitro son efficacité antibactérienne et antivirale à des doses non cytotoxiques en culture cellulaire.
Réduction
Chaque procédure a été conçue pour utiliser le minimum de souris, en utilisant les tests statistiques adaptés. De plus, les expérimentations sont également conduites en recherchant un éventuel « effet sexe ». Ainsi, un total de 160 souris est donc nécessaire pour ce projet.
Raffinement
Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec du sopalin, des fragments de boîtes d’œufs et des jouets en plastique. Toutes les manipulations sur les souris ne seront effectuées que par du personnel qualifié ayant suffisamment d’expérience avec les procédures décrites pour minimiser toute douleur et inconfort possible pour les animaux. Tout au long du déroulement des expériences, une observation systématique de leur état clinique sera réalisée de façon pluriquotidienne par les animaliers et les expérimentateurs, afin de détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale. Les souris seront habituées aux manipulations les jours précédant l’expérimentation, en les sortant de la cage et en associant la manipulation à un renforcement positif en donnant une récompense alimentaire (bout de biscuit, pomme, etc.). De plus, l'administration intranasale sera effectuée sous anesthésie générale suivie d’une analgésie éventuelle (paracétamol 200 mg/kg). Afin d’identifier la souffrance et la douleur, nous avons établi une grille permettant d’évaluer différents paramètres et de prendre en considération différents points limites.
Choix des espèces
Lors de ce projet, nous utiliserons la même souche de souris qui sera ensuite utilisée pour étudier l’inflammation et les réponses immunitaires. De plus, la souris, de par sa petite taille, permet une logistique aisée, et constitue un bon support pour tester les nouvelles approches thérapeutiques dans les modèles précliniques. Ainsi, cette souche de souris limite de ce fait le nombre d’animaux utilisés pour des études préliminaires. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (entre 8 semaines et 12 semaines) pour avoir un système immunitaire mature mais non vieillissant en vue des doses à utiliser dans un contexte infectieux pour tester l'activité antivirale et antibactérienne de la molécule M. De plus, les expériences seront conduites en utilisant des souris mâles et de femelles afin de rechercher un éventuel « effet sexe ».
Role intrinsèque de l’enzyme AspNAT dans l’expansion des cellules souches hématopoïétiques 2/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des tissus hématopoïétiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation ou un traitement détruisant leur moelle, une greffe de cellules par voie intraveineuse ou intra-fémorale, puis des prélèvements de sang et de moelle répétés pendant un an. Le porteur indique que le conditionnement peut faire chuter le poids et que les prélèvements intra-fémoraux peuvent provoquer un boitement. Il affirme qu'aucun test ne remplace l'injection de ces cellules dans une souris hôte et conclut à "aucune possibilité de remplacement", ce volet étant la seconde partie d'une étude sur une enzyme des cellules souches du sang.
Objectifs
La fabrication des cellules du sang (globules blancs, rouges et plaquettes) dont la durée de vie est limitée dans le temps se fait à partir de cellules souches (appelées CSH). Ce processus se passe dans la moelle osseuse où sont localisées les CSH (chez la souris il se déroule également dans la rate). L'objectif ce projet de recherche fondamentale est de déterminer le rôle d'une enzyme dans le processus de fabrication des cellules sanguines en particulier si en agissant sur cette enzyme il est possible d’augmenter le nombre et d’améliorer la fonction des CSH.
Bénéfices attendus
Il est à noter qu'à ce jour pour certaines hémopathies la greffe de cellules souches hématopoïétiques est la seule option thérapeutique curative mais l'une des limites à cette approche reste le faible nombre de cellules ; il est donc essentiel de mieux comprendre leur mode de régulation et de trouver des moyens d'augmenter leur nombre. 40 000 greffes de CSH ont été faites en Europe en 2018 et les chiffres montrent que ce nombre est en augmentation.
Procédures
Les animaux subiront les mêmes procédures que celles utilisées aujourd'hui en clinique. Tout d'abord une irradiation ou un traitement myéloabatif: pour l'irradiation il y aura un transport d'une animalerie à l'autre. La procédure d’irradiation (trajet inclus) durera moins de 1h30. Pour le traitement myéloablatif, il y aura une injection par jour pendant 5 jour en IP sur animal vigile (temps du geste 1 minute). Ensuite les animaux subiront une greffe de cellules : cela se fait par injection en intra veineux dans la veine de la queue sur animal vigile (le geste dure moins d’une minute) ou par injection intra-fémorale sur animal anesthésié (le geste dure moins de 10 minutes). Enfin le suivi de la prise de greffe se fait par prélèvement. Le prélèvement sanguin submandibulaire : 50μL de sang prélevé une fois par mois pendant 1 an maximum. Ce geste, de moins d’une minute, est réalisé sur animal vigile et dure moins d'une minute. Le prélèvement intrafémoral : 25µL de moelle osseuse, prélevée tous les 3 mois et nous alternerons les genoux donc genou droit 2 prélèvements à 3 et 9 mois, gauche 1 prélèvement à 6 mois. Ce geste réalisé sous anesthésie dure moins de 5 minutes. Le prélèvement sanguin rétro-orbitaire : 200µL de sang prélevé une seule fois avant l'euthanasie. Ce geste réalisé sous anesthésie dure moins d'une minute.
Impact sur les animaux
L'étape de conditionnement peut entrainer une baisse transitoire (1 à 2 semaines) de prise de poids. L'injection ou le prélévement intra-fémoral peuvent entrainer un léger boitement sur 12h maximum. Le prélèvement sanguin en mandibulaire nécessite une contention qui peut engendrer un stress.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter les tissus hématopoïétiques (moelle osseuse, rate et thymus) pour les analyser.
Remplacement
Pour analyser les CSH il n'existe qu'un seul test, qui consiste à injecter ces cellules dans une souris hôte et regarder comment ces cellules participent à la production des cellules sanguines de cet hôte. Pour cela, les CSH ont besoin d'être dans leur organe physiologique et à ce jour, il n'est pas possible de recréer cet environnement complexe in vitro, il n’y a donc aucune possibilité de Remplacement.
Réduction
Dans le respect de la règle des 3R, comme il n’existe pas de possibilité de Remplacement, nous combinerons nos lots témoins dans le but de Réduire le nombre d'animaux. Nous avons réduit le nombre de souris à 6 dans les lots pour lesquels nous attendons une faible variabilité des résultats. Pour les lots où il y a une étape de culture cellulaire nous aurons besoin de 12 souris par lot car la variabilité des résultats sera plus forte. Ces nombres ont été calculés afin que les résultats obtenus puissent être analysés par des tests statistiques appropriés.
Raffinement
Afin de respecter la notion de Raffinement, le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance jusqu'à leur mort (enrichissement de la nourriture lors de l’élevage et de l’expérimentation per se, enrichissement de l’environnement avec ajout de laine de peupliers pour "faire des nids" et présence d'une structure en plexiglace rouge transparente dans lequel la souris peut se cacher...). Les souris étant des animaux grégaires ils seront élevés en groupe. Les souris seront suivies quotidiennement par les animaliers. Enfin nous avons mis en place une grille de score qui nous permet d'évaluer la "bonne forme" des animaux et déterminer ainsi si un animal atteint un point limite: sont ainsi évalués, la bonne forme générale, le comportement, l'état de la peau, le poids ainsi que des critères plus spécifiques à la procédure comme l'état de l'oeil, de la veine caudale et du genou (les sites d'injection/prélèvement). L'étape de conditionnement peut entrainer une baisse transitoire (1 à 2 semaines) de prise de poids. Les animaux seront donc soumis à un régime de nourriture enrichie. Des anesthésiques et analgésiques seront utilisés pour les gestes pouvant générer de l'inconfort.
Choix des espèces
La souris est le modèle classiquement utilisé pour étudier les cellules souches hématopoïétiques. Les souris seront utilisées à l'âge adulte entre 8 semaines et 15 semaines. À cet âge-là, la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l'injection de cellules. De plus il a été démontré que la prise de greffe était optimale à cette age-là. Le suivi des souris greffées se fera sur du long-terme (jusqu'à 1 an) afin de s'assurer de la pérennité de la reconstitution hématopoiétique.
Développement de stratégies pharmacologiques pour limiter la sévérité des Accidents Vasculaires Cérébraux survenant en contexte de Maladie Rénale Chronique
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système urogénital
Rats : 920
3 180 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélèvement des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour la plus grande partie d'entre eux. Ils subissent une chirurgie provoquant un arrêt transitoire de la circulation cérébrale, équivalent d'un AVC, ou l'ablation de cinq sixièmes de la masse rénale, une maladie rénale pouvant aussi être induite par un régime enrichi en adénine. Le porteur reconnaît que ces interventions provoquent "indubitablement" douleur, altération de l'état général et stress. Il affirme que la communication entre rein et cerveau est "impossible à modéliser autrement que [par] l'animal", le bénéfice pour les patients restant présenté comme une possibilité.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de caractériser les atteintes cérébrales au cours d'une maladie rénale chronique, et après un Accident Vasculaire Cérébral survenant dans un contexte de Maladie Rénale Chronique, particulièrement sur la dysfonction de la barrière-hémato-encéphalique (barrière biologique séparant la circulation sanguine du système nerveux) et de neuroinflammation (inflammation au niveau cérébral), dans différents modèles murins. En complément, nous développerons une approche pharmacologique afin d’identifier des voies impliquées et proposer des cibles thérapeutiques innovantes dans ce contexte.
Bénéfices attendus
La possibilité d'améliorer la prise en charge et le pronostic neurologique des patients atteint d'une maladie rénale chronique présentera un bénéfice en santé humaine.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie (acte chirurgical d'environ 30 minutes) visant à induire un arrêt de la circulation cérébrale transitoire (équivalent à un accident vasculaire cérébrale) ou une néphrectomie (retrait de 5/6 de la masse rénale totale). Les animaux seront soumis à une administration d'un candidat médicament. Les imageries (jusqu'à 4 par animal) seront espacées d'au moins 24h pour une durée maximale de 30minutes. Enfin une quantité de sang des animaux sera prélevée à la fin de l'étude.
Impact sur les animaux
L'ablation de 5/6e de la masse rénale totale, l'occlusion de l'artère cérébrale moyenne et l'induction d'une maladie rénale par un régime riche en adénine provoquent indubitablement une douleur, une altération de l'état général et un stress de l'animal : douleur provoquée par la procédure chirgurgicale - une alétration de l'état général : une perte de poids, une déshydratation - hémorragie per-opératoire (rare). L'imagerie et l'injection de traceurs nécessiteront une anesthésie et pourront engendrer un stress. Les tests comportementaux pourront induire un stress par des manipulations quotidiennes.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort au terme de la procédure.Les organes seront prélevés pour réaliser des analyses histologique et biochimique
Remplacement
Partant de nos résultats observés chez le rat et la souris. Nous étudions une communication entre des organes qui sont le rein et le cerveaux et qu'il est impossible de modéliserautrement que pour l'animal. De plus, pour caractériser les atteintes neurologiques fonctionnelles lors d'une maladie rénale chronique, nous réalisons des évaluation neuro-comportementales des animaux, qui n'est pas modélisable in vitro ou in silico.
Réduction
Comme évalué dans des expériences précédentes notamment concernant les études neurocomportementales, des lots de 9 animaux sont nécessaires afin d’obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences significatives entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre et ainsi obtenir un échantillon de taille suffisante pour l’étude de nos résultats. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants pour s’affranchir d’une variabilité liée au lot.
Raffinement
Pour assurer le bien-être des animaux pendant et après la chirurgie, tous les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie et s'accompagneront d'une prise en charge peri-opératoire de la douleur (injection d'analgésique avant, pendant et après la chirurgie). Après chirurgie de la nourriture humidifiée sera mise à disposition des animaux à volonté pour anticiper des difficultés de mobilité de l'animal. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne, par du personnel qualifié et formé, de l’aspect et de la motricité ainsi que d'une pesée quotidienne pendant toute la durée du protocole. Les critères d’arrêt sont la prostration, la présence de plaies ne cicatrisant pas, ou la perte de 20% du poids initial.
Choix des espèces
Les modèles de MRC proposé ont été développé et validé chez le rongeur. De plus, ces espèces permettent également le recours à des techniques validées d’évaluation neurocomportementale, d’imagerie cérébrale, et d’immuno-histochimie cérébrale, permettant de répondre à nos hypothèses. Tous les rats sont livrés à l'âge de 5 semaines. Une période d'acclimatation d'une semaine est respectée avant le début des procédures. Les rats sont donc soumis aux procédures à l'âge de 6 semaines. Toutes les souris sont livrés à l'âge de 7 semaines. Une période d'acclimatation de 2-3 semaines est respectée avant le début des procédures. Les animaux sont donc soumis aux procédures à l'âge de 9-10 semaines. Des animaux jeunes sont utilisés pour éviter l'accumulation de tissu adipeux autour du pédicule rénal, qui peut géner l'interruption de la circulation.
Etude des comportements de prise de décision et de leurs bases neuronales chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour extraction du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une à deux chirurgies crâniennes pour fixer une barre d'acier, implanter une fenêtre de verre ou insérer des fibres optiques et des sondes, puis un entraînement d'un à cinq mois sous restriction hydrique à 85 % de leur poids, la tête fixée pendant les tests. Le porteur reconnaît l'isolement, la restriction d'eau, les risques d'hémorragie ou d'infection et la gêne des implants. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou informatique ne remplace le modèle et écarte la drosophile, ces techniques invasives ne pouvant être menées sur des humains sains.
Objectifs
Ce projet vise à comprendre comment notre cerveau est capable de changer nos actions rapidement. Nous pensons que le cerveau peut imaginer et préparer différentes décisions en même temps, ce qui facilite le changement de décision lorsque la situation évolue. Pour étudier cela, nous utiliserons des tâches comportementales avec des souris dans un environnement virtuel. Nous allons également utiliser des techniques spéciales pour enregistrer et manipuler l'activité des cellules cérébrales, combinant l'électrophysiologie, l'imagerie et la stimulation lumineuse. Notre objectif est d'observer comment des centaines de neurones travaillent ensemble dans le cerveau pour contrôler nos actions et prendre des décisions. Nous nous concentrerons sur un comportement important, la recherche de ressources alimentaires ou en eau, appelée "foraging".
Bénéfices attendus
Ce projet va générer une grande quantité de données précieuses pour différentes études scientifiques. Une fois les résultats publiés, ces données seront partagées avec la communauté scientifique, pouvant ainsi être utilisées pour répondre à diverses questions scientifiques. En particulier, les découvertes de ce projet pourraient apporter une nouvelle perspective sur la façon dont nous pensons et prenons des décisions. De plus, le projet nous aidera à comprendre pourquoi les gens prennent des décisions différemment, ouvrant la voie à une meilleure compréhension de la diversité des comportements et ses dysfonctionnements cognitifs.
Procédures
Pour enregistrer les cellules du cerveau pendant une tache de comportement, des méthodes invasives sont nécessaires. Une première procédure chirurgicale s’effectuera sur tous les animaux (250 au total) sous anesthésie générale pour poser une barre en acier sur la tête des animaux. Cet implant est nécessaire pour stabiliser les enregistrements de cellules. Pour observer l’activité du cerveau au microscope dans un groupe de 50 animaux, les cellules seront rendues fluorescentes grâce a une injection de virus. Une petite fenêtre en verre sera ensuite implantée pour visualiser la fluorescence. Pour activer les cellules du cerveau avec de la lumière dans un autre groupe de 100 animaux, de fines fibres optiques seront délicatement insérées dans leur cerveau. Chaque opération dure entre 1 et 3 heures par animal. Les animaux sont ensuite soumis à des entrainements quotidiens dans une plateforme expérimentale et ils sont récompensés par des gouttes d’eau sucrées. Cette phase dure entre 1 et 5 mois, en fonction de la performance de l'animal. Environ 225 animaux déjà entraînés subissent une seconde opération sous anesthésie générale pour réaliser de petites ouvertures dans le crâne ce qui permet d’insérer des petites sondes d’enregistrement. Cette intervention est rapide, d'environ 20 à 30 minutes. Les enregistrements sont alors répétés quotidiennement pendant plusieurs jours (maximum 15) pendant 1h. Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure.
Impact sur les animaux
Plusieurs effets plus ou moins nuisibles à la santé des animaux peuvent être attendus. 1) Isolement : pour leur protection, les animaux devront être hébergés individuellement dans leur cage 2) Restriction hydrique : les animaux seront maintenus à 85% de leur poids originel 3) Interventions chirurgicales sous anesthésie : les conséquences de ces interventions sont parfois néfastes (hémorragie, infection, détresse respiratoire, douleurs post-opératoires) 4) Implants : potentielle gêne occasionnée par un corp étranger 5) Stress lié à la manipulation : les animaux seront manipulés durant les phases de tests 6) Restriction des mouvements : les animaux auront la tête fixée durant les périodes de tests
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de cette procédure dans le but de procéder à l'extraction du cerveau à des fins histologiques.
Remplacement
Pour évaluer la complexité des comportements adaptatifs, comme proposé dans ce projet, il est fondamental d'utiliser un modèle animal approprié qui ne peut être facilement remplacé par des expériences in vitro ou des modèles informatiques. D’autre part, l'étude des bases neuronales de la prise de décision par l’enregistrement et la manipulation sélective de l’activité des neurones nécessitent des techniques invasives qui ne peuvent pas être réalisées chez des sujets humains sains et extrêmement rarement chez des sujets malades. Certaines espèces d'invertébrés, telles que la mouche des fruits (drosophile), pourrait sembler adaptées à l’étude du comportement de foraging et aux manipulations génétiques des systèmes cérébraux. Cependant, l'anatomie du circuit neuronal de la drosophile est considérablement différente de celle des mammifères. Ainsi, les résultats scientifiques obtenus chez ces espèces ne sont pas facilement généralisables aux questions abordées dans ce projet. En l'absence de méthode de remplacement possible, il s’avère donc nécessaire d'avoir recours au modèle animal murin dans ce projet.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés sera réduit au minimum nécessaire pour pouvoir obtenir des résultats statistiques fiables et significatifs. L'utilisation de méthode d’enregistrement a grande échelle réduira aussi considérablement le nombre de sessions d'enregistrement et d'animaux nécessaires pour obtenir des statistiques fiables. Par ailleurs, les données comportementales et neuronales seront extraites des mêmes individus pour réduire encore d’avantage le nombre d’animaux. D’après nos études précédentes, nous estimons que 45 souris par groupe sont nécessaires (5 groupes, soit 125 animaux au total). Etant donné la difficulté technique qu’implique la réalisation des enregistrements et la bonne performance des animaux dans la tâche, un pourcentage de perte de l’ordre de 10% ou plus est à prévoir, ce qui augmente l’estimation finale à 250 animaux pour les 5 ans.
Raffinement
Des méthodes de raffinement seront mises en place dans le but d’atténuer les nuisances provoquées par les procédures expérimentales. Le poids des animaux sera surveillé quotidiennement et la poursuite du protocole de restriction hydrique sera décidée en fonction du bien-être des animaux. L’eau naturelle ad-libitum sera remise à disposition pour assurer la récupération totale du poids si la perte de poids est supérieure à 20%. Afin de réduire le stress, les animaux seront habitués, par étapes, à la présence et aux interactions avec l’expérimentateur plusieurs jours avant le début des tests. L’angoisse éventuellement ressenti par l’animal due à la contention sera atténuée par une habituation renforcée positivement via des récompenses (eau sucrée). Pour prévenir la douleur et les inflammations, nous administrerons à chaque chirurgie des médicaments aux propriétés antalgiques, antipyrétiques et anti-inflammatoires.En cas de sècheresse ou rougeur légère de la peau autour de l’implant, l’animal sera traité localement par une solution dermatologique. Dès l’apparition de comportements anormaux (ex : absence de toilettage, perte de plus de 20% du poids) ou autres signes de souffrance (évalués sur une grille d’évaluation de la douleur) survenant après l’implantation, l’animal recevra un traitement analgésique en sous cutané. Si des signes de souffrances persistent plus de 72h l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est le modèle animal le plus approprié pour ce projet et il n'existe pas d'alternative méthodologique. Tout d’abord, l'organisation du néocortex chez la souris comporte des similitudes avec d'autres espèces de mammifères, y compris les humains, et peut donc être utilisée pour révéler des principes généraux de prise de décision. Les souris peuvent aussi être entraînées à effectuer des tâches assez complexes dans des environnements expérimentaux contrôles. Les outils génétiques pour cibler et moduler des populations spécifiques de neurones sont également très bien développés chez la souris et relativement faciles à utiliser. Comme les souris ont un cerveau relativement petit, il est aussi possible d’enregistrer plusieurs régions cérébrales simultanément. Le fait que toutes ces procédures soient devenues l'état de l'art chez la souris facilitera et accélèrera donc grandement l'avancement du projet. Nous utiliserons de jeunes adultes au moment de l’implantation (âgées de 8 à 12 semaines). Il est important que les animaux soient relativement jeunes pour un apprentissage plus rapide et une meilleure performance dans la tâche. Cependant, les animaux doivent avoir terminé leur croissance pour éviter que la taille de la boite crânienne ne change au cours de l’expérience.
Identification des neuroadaptations suite à l’administration de drogues d’abus chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des structures cérébrales, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 280 et modéré pour 320. Elles reçoivent des injections répétées de cocaïne, d'héroïne ou de THC, une chirurgie de délivrance de nicotine ou une exposition à des vapeurs d'alcool, pour chercher des adaptations moléculaires communes à cinq drogues. Le porteur indique que les injections répétées provoquent un stress et que les animaux peuvent développer des symptômes d'addiction. Il affirme que ces effets ne peuvent pas être étudiés sur des modèles cellulaires et "nécessite[nt] l'analyse d'organismes vivants et entiers", et souligne que la souris partage 99 % de son génome avec l'humain.
Objectifs
Ce projet de recherche s’intéresse aux troubles liées à l’usage de substances psychoactives et particulièrement à la toxicomanie et vise à identifier les mécanismes moléculaires et épigénétiques ( c’est-à-dire l’étude des changement dans le contrôle de l’expression des gènes n’impliquant pas de changement dans la séquence d’ADN ) impliqués et participant au développement de ces troubles cérébraux. Bien que chaque substance psychoactive ait des profils pharmacologiques et des cibles distincts dans le cerveau, leur symptomatologie commune reflète l'hypothèse générale selon laquelle elles recrutent des mécanismes physiopathologiques convergents. Les processus et adaptations moléculaires communs de ces diverses drogues d'abus restent très peu étudiés. L’objectif de ce projet est de combiner des études post mortem sur l'homme et des études sur les rongeurs, afin de caractériser de façon moléculaire les tissus cérébraux et d’identifier les adaptations spécifiquement associées à l’exposition à 5 drogues d’abus : alcool, cocaïne, THC, héroïne et nicotine. Les études portées chez la souris consisteront à réaliser une administration de chaque drogue d'abus séparément, permettant alors de décomposer leur contribution respective aux effets moléculaires précédemment observés chez les polytoxicomanes humains.
Bénéfices attendus
Les études sur les souris devraient nous permettre d'identifier les adaptations épigénétiques épigénétiques ( c’est-à-dire l’étude des changement dans le contrôle de l’expression des gènes n’impliquant pas de changement dans la séquence d’ADN ) spécifiquement associées à l'exposition aux quatre principales drogues d'abus, et les comparer à ceux parallèlement observer chez des patients polytoxicomanes. Afin de caractériser les adaptations moléculaires la polytoxicomanie dans le cerveau.
Procédures
les aniLes animaux seront soit soumis à des injections de cocaïne (10 injections), d’héroïne (11 injections) et de THC (10 injections), à une chirurgie permettant la délivrance de la nicotine (durant 6 jours), ou seront exposés à des vapeurs d’alcool (durant 9 jours). Durée maximale des injections est de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront présenter un état de stress en lien avec les injections répétées avec une douleur considérée comme légère, et des risques de nuisance dues aux actes chirurgicaux vec une douleur considérée comme modérée. De plus, les animaux pourront présenter des symptômes d’addiction, entrainant une douleur considérée comme légère.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérience afin de réaliser le prélèvement des structures cérébrales d’intérêt.
Remplacement
"Remplacer" : les effets moléculaires des drogues d’abus, sur le cerveau et d’autres tissus de l’organisme, ne peuvent pas être étudiés en utilisant des modèles cellulaires, qui par nature ne récapitulent ni la complexité de l’organisation cérébrale en réseaux complexes de structures interconnectées, ni les communications inter- tissulaires. L’étude de ces effets nécessite donc l’analyse d’organismes vivants et entiers.
Réduction
"Réduire" : Les animaux utilisés étant consanguins, la variabilité phénotypique est limitée, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux tout en mettant potentiellement en évidence un effet statistiquement significatif. Ainsi, au regard des données de la littérature et de la variabilité interindividuelle attendue, les groupes expérimentaux destinés à caractériser les comportements liés aux effets de récompense seront constitués de 20 souris chacun (par sexe) identifié comme étant le minimum d’animaux nécessaires pour un résultat statistiquement significatif fiables et robustes.
Raffinement
"Raffiner" : nous avons choisi d’utiliser des protocoles expérimentaux qui minimisent au maximum l’inconfort des animaux tout en permettant néanmoins d’étudier les propriétés des drogues d’abus. Les conditions d’hébergement sont optimisées en fonction des comportements naturels des rongeurs : les souris sont hébergées en groupe sociaux, et chaque cage est enrichie avec un barreau à ronger et des papiers absorbants pour faire un nid. De plus, lors de la réalisation de procédures chirurgicales, les animaux seront sous anesthésie générale et recevront un traitement antidouleur (anesthésique local autour du site de chirurgie et traitement par un anti- inflammatoire non stéroïdien), et la température corporelle de l’animal sera maintenue grâce à un tapis chauffant thermostaté jusqu’au complet réveil de l’animal Enfin, des points limites seront déterminés après les procédures chirurgicales et après les injections répétées afin d’apporter un suivi individuel à chaque animal permettant de limiter ou arrêter la souffrance de l’animal. Pour cela nous utiliserons une grille d’évaluation jusqu’à leur mise à mort incluant des signes d’apparence (inactif, moins actif, ataxique, pelage hirsute, regard morne, animaux blottis, isolé, paupières mi-closes, absence de toilettage) et des signes lors de la manipulation (agressif, réticent à se déplacer, vocalisations, hyperactif, perte de poids corporel). Avant de commencer les expérimentations les animaux seront pris en mains afin d’être habitués aux manipulateurs.
Choix des espèces
La souris est aujourd’hui utilisée comme modèle standard pour l’étude de la plupart des pathologies de son génome (99 % identique à celui de l'humain) et permet de contrôler l’administration de drogues ce qui n’est pas possible chez l’humain. De plus ces études complèteront des études antérieures et parallèles effectuées chez la souris. Pour ce projet, des animaux adultes, âgés de 8 semaines au début de l’expérience, seront utilisés puisque l’étude repose sur l’exploration de comportements complexes qui nécessitent des systèmes neurobiologiques matures.