Recherche fondamentale

Toutes les souris de ce projet subissent une chirurgie du crâne de vingt à trente-cinq minutes sous anesthésie générale, avec injection dans la zone de l'horloge interne. 600 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour vérifier après coup où l'injection a atteint le cerveau. Selon les lots, elles vivent trois semaines seules en cage avec une roue d'activité, passent 48 heures isolées en imagerie cérébrale, ou enchaînent quatre tests comportementaux en quatre jours. Le porteur indique que les procédures reproduisent une perturbation du cycle repos-activité pouvant conduire à un état assimilé à l'anxiété, sans nommer aucun des quatre tests.

Objectifs

L'hypothyroïdie concerne près de 10% de la population. Cette maladie induit notamment des troubles de l'humeur tels qu'irritabilité, anxiété ou dépression, qui restent mal compris. Ces troubles pourraient être liés à la perturbation de notre horloge interne qui régule le cycle veille-sommeil. Nos résultats obtenus chez des souris hypothyroïdiennes soutiennent cette hypothèse. Notre objectif est maintenant de comprendre plus précisément comment les hormones thyroïdiennes, dont le taux sanguin est diminué pendant la maladie, interfèrent avec le fonctionnement de l'horloge, située dans une zone précise du cerveau. Pour répondre à cette question, nous utiliserons 2 lignées de souris génétiquement modifiées permettant de modifier l'action de ces hormones spécifiquement au site de l'horloge. Des tests comportementaux et une imagerie cérébrale permettront d'évaluer l'état d'anxiété et la physiologie de l'horloge interne de ces souris.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la régulation de l'horloge circadienne par les hormones thyroïdiennes. Cette compréhension pourrait ouvrir sur de nouvelles approches des troubles psychiques associés à l'hypothyroïdie, en tenant compte des rythmes circadiens des patients. Plus généralement, les mécanismes identifiés constitueront de nouvelles cibles thérapeutiques pour une meilleure prise en charge des maladies mentales liées aux troubles circadiens dans une société moderne active 24 heures sur 24.

Procédures

Toutes les souris subiront une chirurgie crâniale sous anesthésie générale de 20 à 35 minutes. Un lot sera hébergé en cages individuelles enrichies d'une roue d'activité pendant 3 semaines, un autre lot subira une série de 4 tests comportementaux sur 4 jours consécutifs, et un autre lot suivra une session d'imagerie cérébrale en cage individuelle pendant 48h.

Impact sur les animaux

Les procédures devraient reproduire certains effets de l'hypothyroïdie liés à l'horloge circadienne, notamment une perturbation du cycle repos-activité, ce qui peut conduire à un état assimilé à l'anxiété. Dans de rares cas, l'approche chirurgicale du cerveau pourrait induire inflammation, infection ou inconfort. Les périodes en hébergement individuel sont source de stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour vérification des sites d'injection dans le cerveau

Remplacement

La réponse comportementale à une perturbation cérébrale telle que réalisée ici ne peut pas être étudiée par des méthodes alternatives. Toutefois, ce projet s'inscrit dans un cadre plus large visant à établir sur le long terme un modèle théorique du fonctionnement de l'horloge circadienne. Nous espérons aboutir à un modèle suffisamment riche et prédictif pour anticiper par le calcul sur ordinateur les réponses de l'horloge dans différentes situations physiopathologiques en complément/remplacement des modèles animaux.

Réduction

Sur la base de notre connaissance des tests comportementaux envisagés, nous avons utilisé un programme de calcul de puissance statistique. L'imagerie cérébrale permet de réduire le nombre d'animaux nécessaires car chaque animal est son propre contrôle au cours du temps, et plusieurs cellules sont enregistrées dans un même champ.

Raffinement

Pour toutes les souris subissant une intervention chirurgicale, la douleur sera prise en charge avant, pendant et après la chirurgie. Les points limites définis permettent une prise en charge suffisamment précoce des animaux pour limiter les nuisances subies à un niveau modéré. Toutes les souris seront habituées progressivement à l'environnement expérimental et aux personnels en charge de l'application des procédures.

Choix des espèces

La souris est un modèle mammifère de choix dont l'horloge interne et la physiologie thyroïdienne reposent sur les mêmes principes que l'espèce humaine. Cette espèce donne un accès unique à un large éventail d'outils génétiques, notamment les 2 lignées uniques utilisées dans ce projet. Les animaux seront utilisés à un stade de jeunes adultes, à partir de 6 semaines, lorsque la croissance du crâne est terminée.

240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever le foie, les muscles ou le pancréas. Elles subissent une à quatre prises de sang sur animal vigile, jusqu'à huit injections, pour certaines une chirurgie de moins de trente minutes, et une privation de nourriture ou d'eau de douze à quarante-huit heures. Le projet vise à valider chez la souris un biomarqueur sanguin déjà observé chez des patients atteints de lésions aiguës du foie, du muscle ou du pancréas. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit ces interactions dans un "organisme entier" et conclut que l'expérimentation animale reste "indispensable".

Objectifs

Certaines lésions aiguës affectant des organes vitaux tels que le foie, les muscles ou le pancréas peuvent déclencher des réponses inflammatoires et métaboliques systémiques sévères. Ces atteintes sont observées dans différents contextes pathologiques humains, notamment lors d’intoxications aiguës, de sepsis ou de maladies auto-immunes et peuvent évoluer vers une défaillance multiviscérale. Ces processus sont fréquemment associés à l’activation de mécanismes de mort cellulaire régulée, tels que l’apoptose, la nécroptose et la ferroptose, qui, lorsqu’ils sont activés de manière excessive ou non contrôlée, peuvent contribuer à l’aggravation des lésions tissulaires. L’objectif général du projet est d’identifier et de caractériser un mécanisme commun de signalisation systémique des lésions tissulaires aiguës reposant sur la libération, dans la circulation sanguine, d’un biomarqueur intracellulaire lors de la mort cellulaire. Le projet vise à valider et à approfondir des observations réalisées chez l’homme, notamment dans des cohortes de patients présentant des pathologies inflammatoires aiguës ou métaboliques, afin d’évaluer la valeur prédictive de ce biomarqueur vis-à-vis de la morbidité et de la mortalité, en complément des marqueurs actuellement utilisés.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’améliorer la compréhension des mécanismes biologiques impliqués lors de lésions aiguës touchant des organes vitaux. En s’appuyant sur plusieurs modèles expérimentaux complémentaires, il permet d’analyser comment des dommages cellulaires sévères peuvent être associés à la libération de signaux circulants reflétant l’intensité des atteintes tissulaires et la réponse globale de l’organisme. Les résultats attendus contribueront à mieux comprendre les liens entre les lésions locales d’un organe, les réponses systémiques observées dans l’organisme et l’évolution vers des formes graves de la maladie. Cette approche intégrée, combinant des observations issues de différents niveaux d’analyse, vise à identifier des indicateurs biologiques globaux permettant de mieux apprécier la sévérité des atteintes et leur évolution dans le temps. À plus long terme, ces travaux pourront apporter des connaissances utiles pour la recherche biomédicale, en particulier pour l’étude de pathologies inflammatoires aiguës ou chroniques pouvant conduire à une altération de plusieurs organes. Les bénéfices attendus concernent principalement l’amélioration des connaissances fondamentales sur les mécanismes en jeu, susceptibles de contribuer indirectement au développement de stratégies de prise en charge ou de prévention de ces pathologies chez l’homme ou l’animal.

Procédures

Toutes les souris feront l'objet de manipulations de routine nécessitant d'être brièvement maintenues. Afin de clarifier le parcours des animaux, les interventions se répartissent ainsi, selon les groupes étudiés : Prélèvements sanguins : chaque animal subira entre 1 et 4 prises de sang, réalisées sur animal vigile. Chaque geste dure quelques secondes. Injections : certains animaux recevront entre 1 et 8 injections, réalisées sur animal vigile ou sous anesthésie selon la nature de l’intervention. Chaque injection dure quelques secondes. Lorsque l’intervention est susceptible d’induire une douleur, un traitement analgésique préventif est administré en amont. Ces traitements analgésiques sont intégrés au nombre total d’injections prévues. Injection sous anesthésie générale : pour un groupe spécifique, une injection nécessaire à l’induction du modèle expérimental sera réalisée sous anesthésie générale de très courte durée. Le geste dure quelques minutes. Un traitement analgésique sera ensuite maintenu pendant la phase d’observation. Chirurgie : certaines souris subiront une unique intervention chirurgicale de moins de 30 minutes. Cet acte sera réalisé sous anesthésie générale profonde, associée à des traitements analgésiques préventifs locaux et généraux. Les animaux seront placés sur un tapis chauffant afin de prévenir l’hypothermie liée à l’anesthésie. Contrôle de l’alimentation ou de l’accès à l’eau : avant le début de certaines expériences, certains animaux vigiles seront soumis à une période unique et temporaire de retrait de la nourriture ou de l’eau, d’une durée comprise entre 12 et 48 heures selon la procédure concernée. Cette étape est nécessaire pour standardiser leur état métabolique ou reproduire les conditions physiopathologiques du modèle.

Impact sur les animaux

Des périodes de contrôle alimentaire sont prévues et peuvent induire une sensation de faim, une baisse transitoire d’activité et une gêne liée au jeûne. Un contrôle alimentaire plus prolongé peut majorer la sensation de faim, entraîner une perte de poids transitoire et une altération temporaire de l’état général. Un contrôle hydrique est également prévu et peut induire une sensation de soif et une gêne transitoire. La contention, les manipulations répétées, les administrations et les prélèvements réalisés sur animaux vigiles peuvent induire un stress aigu transitoire, une réaction d’évitement et une détresse ponctuelle. Le placement en dispositif de contention pour certaines administrations, ainsi que la répétition de gestes techniques au cours de certaines procédures, peuvent majorer ce stress transitoire. Certaines étapes impliquent une anesthésie et une intervention chirurgicale, susceptibles d’induire un stress physiologique, une baisse transitoire de la thermorégulation et, plus rarement, une détresse cardio-respiratoire pendant l’anesthésie ou au réveil. Certaines administrations nécessitent un réchauffement transitoire, pouvant constituer un stress thermique. Les prélèvements sanguins peuvent induire une douleur légère et transitoire, ainsi qu’un risque d’hématome ou de saignement local. Les administrations par injection peuvent induire une douleur brève au point d’injection et une irritation locale ; lorsqu’elles sont répétées, elles peuvent augmenter le risque de réaction inflammatoire locale et de complication interne. Les administrations intramusculaires peuvent induire une douleur locale et une gêne locomotrice transitoire. L’intervention chirurgicale peut induire une douleur post-opératoire, un risque d’inflammation locale, un risque d’infection et une altération transitoire de la mobilité. L’induction expérimentale de lésions aiguës peut entraîner une maladie avec inconfort, douleur modérée, baisse d’activité, troubles transitoires de l’alimentation et de l’hydratation.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

Notre laboratoire met en œuvre, en amont des expérimentations animales, des approches de remplacement visant à limiter le recours aux animaux lorsque cela sera possible. Les phases exploratoires et de mise au point reposent notamment sur des modèles in vitro (essais sur des cultures de cellules) et sur des approches in silico, utilisés pour tester des hypothèses, optimiser des conditions expérimentales et sélectionner les paramètres à mesurer. Toutefois, les objectifs de ce projet nécessitent des investigations in vivo. Les modèles retenus reposent sur l’induction de lésions d’organes ainsi que sur l’évaluation de leurs conséquences métaboliques. Ces phénomènes impliquent des interactions intégrées entre plusieurs organes et systèmes (notamment immunitaire, métabolique et nerveux). À ce jour, aucun modèle in vitro ou in silico ne permet de reproduire de façon suffisamment fidèle l’ensemble de ces interactions et leur dynamique dans un organisme entier, ni d’évaluer de manière intégrée les effets des procédures sur l’état général, la réponse inflammatoire et les paramètres biologiques mesurés aux temps précoces définis. En conséquence, l’expérimentation animale reste indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un nombre total maximal de 240 souris. La stratégie de réduction repose sur l’optimisation du plan expérimental afin de limiter le nombre d’animaux utilisés tout en maintenant la validité scientifique des résultats. Afin de réduire le recours à des animaux témoins distincts, chaque animal sera utilisé, lorsque le protocole le permet, comme son propre contrôle, grâce à la réalisation de prélèvements ou de mesures avant et après l’administration expérimentale. Cette approche permet des comparaisons pour un même individu et contribue à limiter le nombre total de souris nécessaires au projet. Par ailleurs, les expérimentations seront regroupées et planifiées de manière à mutualiser les lots lorsque cela est possible. Plusieurs tissus seront prélevés chez un même animal et utilisés pour différentes analyses afin de maximiser les informations obtenues. De plus, les échantillons seront partagés avec des collaborateurs dans un cadre défini afin d’éviter la réalisation d'expériences redondantes et de limiter la production de nouveaux lots d’animaux. La taille des effectifs a été établie de manière stricte grâce à un calcul de puissance : cette méthode permet de déterminer l’effectif minimal nécessaire pour observer un effet. En conséquence, chaque groupe expérimental comprendra 15 souris, ce qui permet de prendre en compte la variabilité naturelle entre les individus tout en limitant le nombre d’animaux. Enfin, sur ces effectifs réduits, il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques rigoureux pour garantir une interprétation fiable et solide des résultats.

Raffinement

Les conditions d’hébergement et de prise en charge des animaux respecteront strictement la réglementation en vigueur ainsi que les pratiques validées au sein de l’établissement utilisateur. Les animaux seront hébergés en cages collectives, avec un accès permanent à une alimentation standard et à l’eau ad libitum, sauf lorsque des périodes de privation ou de restriction seront explicitement prévues par certaines procédures expérimentales. L’environnement sera enrichi par la mise à disposition de matériaux de nidification et d’abris, afin de favoriser l’expression de comportements naturels et de limiter le stress. Une surveillance clinique régulière, adaptée à chaque procédure, sera assurée tout au long du projet. Elle permettra l’identification précoce de tout signe de mal-être ou d’altération de l’état général, tels qu’une diminution de l’activité, une posture anormale, une piloérection ou des modifications du comportement. Des points limites spécifiques à chaque modèle expérimental sont définis afin de limiter la douleur, la souffrance ou la détresse des animaux. L’apparition d’une altération marquée de l’état général ou de signes cliniques sévères conduira à une évaluation immédiate et, le cas échéant, à l’arrêt anticipé de la procédure pour l’animal concerné. Les sites d’injection et, lorsque cela est applicable, les zones chirurgicales feront l’objet d’une observation régulière afin de détecter précocement toute réaction locale ou complication. Un suivi attentif sera également assuré après les administrations ou les interventions chirurgicales, en particulier durant les phases critiques définies pour chaque procédure. Des mesures adaptées de prise en charge seront mises en œuvre afin de limiter l’inconfort lié aux actes expérimentaux, incluant le recours à des protocoles d’anesthésie et d’analgésie appropriés ainsi que des mesures de maintien de la température corporelle lorsque cela est nécessaire. En cas de diminution de la prise alimentaire, un apport nutritionnel complémentaire sous forme de gel alimentaire pourra être mis à disposition afin de garantir un apport énergétique suffisant. L’ensemble des actes expérimentaux sera réalisé par du personnel formé et habilité à l’expérimentation animale, conformément aux exigences réglementaires, afin d’assurer des manipulations maîtrisées, reproductibles et respectueuses du bien-être animal.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans ce projet seront des souris, incluant des souris commerciales non transgéniques et des souris génétiquement modifiées pour cibler des gènes spécifiques liés aux maladies étudiées. Ces souris sont fertiles, possèdent un système immunitaire normal et ne présentent aucun problème de santé lié à leur génétique dans des conditions d’élevage classiques. Le choix de la souris se justifie par la pertinence de cette espèce pour étudier les inflammations aiguës, les lésions des organes et les mécanismes de mort des cellules. La souris permet d’explorer globalement les interactions entre les systèmes immunitaire, métabolique et sanguin, qui sont au cœur de ce projet. Ces réactions complexes à l'échelle de l'organisme entier ne peuvent pas être reproduites de façon adéquate par des méthodes alternatives (comme des cultures de cellules). De plus, la souris constitue un modèle de référence pour lequel il existe une grande expertise en élevage, en soins vétérinaires, et de nombreux outils d’analyse fiables. La disponibilité de souris génétiquement modifiées et la grande similitude des mécanismes biologiques étudiés avec ceux observés chez l’humain rendent cette espèce particulièrement adaptée à nos objectifs. Les animaux seront utilisés à partir de l'âge de 8 semaines. À ce stade, les souris ont terminé leur développement et présentent un système immunitaire et un métabolisme adultes, ce qui est indispensable pour garantir la fiabilité scientifique des résultats de cette étude.

Jusqu'à trente gavages et cinq privations d'eau de quinze heures trente en cinq jours : 360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent une prise de sang et jusqu'à trois injections sur animal vigile, un isolement quotidien d'environ une heure pour mesurer la prise de boisson, et deux passages en pot de plastique jusqu'à ce que l'animal défèque. Le projet cherche à savoir si les souris qui absorbent mal le fructose en boivent moins par aversion, et si leur microbiote en est la cause. Toutes seront tuées pour prélever le cæcum et son contenu.

Objectifs

Le fructose est un sucre très présent dans notre alimentation et mal absorbé lorsqu’il est consommé en excès, on parle de malabsorption du fructose. Cette malabsorption, très fréquente chez les enfants et les jeunes adultes, cause des symptômes gastrointestinaux (production excessive de gaz, diarrhées, douleurs abdominales) et peut induire une sensation de satiété. Nous étudions ce phénomène à l’aide de modèles de souris qui présentent les mêmes difficultés d’absorption du fructose que les humains. Nous avons constaté que le fructose, consommé lors d’un repas ou sur le long terme : augmente une hormone digestive pouvant jouer un rôle dans les douleurs intestinales et la prise alimentaire, modifie la composition du microbiote intestinal, et change le comportement alimentaire des animaux : ils mangent moins pendant les deux premiers jours d’exposition au fructose, puis reviennent à la normale à partir du sixième jour. Nous voulons comprendre si dans ce contexte de mauvaise absorption du fructose, ces changements de comportement alimentaire traduisent un phénomène d’aversion (réaction négative ou ressentiment fort qui pousse à éviter ou à rejeter quelque chose) puis d’habituation suite à la consommation ponctuelle ou répétée à ce sucre et identifier les médiateurs biologiques impliqués. Nous souhaitons savoir si ces modifications de la prise alimentaire sont liés aux changements du microbiote et si ce dernier en est la cause directe. Pour cela, nous comparerons des souris normales à des souris qui absorbent mal le fructose, traitées ou non par des antibiotiques déplétant le microbiote. Elles recevront un régime sans fructose, puis seront soumises à un test visant à évaluer leur préférence ou leur refus de la solution de fructose par rapport à une solution neutre telle que l’eau, un test d’aversion lors d’une exposition ponctuelle, dite « aigüe » (5 min) ou répétée, dite « chronique » (10 jours) à ce sucre. Ce test a pour but de comparer le volume de fructose ingéré sous forme liquide dans la boisson à celui de l’eau afin d’évaluer la préférence de boisson des animaux et ainsi leur potentiel refus (aversion), vis-à-vis de ce sucre. Nous analyserons aussi le microbiote et marqueurs biologiques potentiellement liés à ces modifications du comportement alimentaire. L’objectif est de mieux caractériser la malabsorption du fructose et les mécanismes associés en clarifiant le lien entre le fructose, le microbiote, la douleur viscérale et la prise alimentaire.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est d’identifier les mécanismes impliqués dans les changements de comportement alimentaire observés chez les souris qui n’absorbent pas bien le fructose, suite à une exposition répétée ou ponctuelle à ce sucre. En effet, cela permettra de mieux comprendre la mise en place de ce phénomène et de déterminer s’il existe un lien entre ces changements de comportements alimentaires, la douleur intestinale, et les changements du microbiote. En effet, l’identification des médiateurs biologiques impliqués dans l’établissement de ces symptômes de malabsorption du fructose, pourraient permettre de développer à terme, de meilleures stratégies alimentaires ou thérapeutiques et ainsi améliorer la qualité de vie des personnes atteintes. De plus, on retrouve des symptômes similaires dans le syndrome de l’intestin irritable (SII), qui est le désordre intestinal le plus fréquent, avec 14,4 à 22 % des patients atteints qui n’absorbent pas bien le fructose. Ainsi, compte tenu de la forte prévalence du SII dans le monde, et d’un pourcentage non négligeable de malabsorption du fructose parmi les patients atteints de SII, il semble crucial d’en décrypter les mécanismes sous-jacents.

Procédures

Les animaux seront soumis à un et/ou deux tests comportementaux ayant pour objectif d’évaluer leur réaction (refus ou préférence) vis-à-vis du fructose via la mesure de sa consommation dans la boisson. Au cours de ce protocole qui durera au total 5 jours, les souris seront soumises à 5 périodes de restriction d’eau de 15h30, à un hébergement individuel (de courte durée (1h05/jour) nécessaire pour mesurer la prise hydrique, à un prélèvement sanguin (moins de 20 secondes) à l’état vigile, à maximum 3 injections (moins de 20 secondes/ injection) à l’état vigile, à maximum 30 gavages (moins de 20 secondes / gavage) à l’état vigile ainsi qu’à de la contention (quelques secondes) à l’état vigile. Les animaux seront soumis à deux prélèvements de fèces au total, au cours desquels les animaux seront placés dans un pot transparent, le temps (maximum 10 minutes) qu’ils évacuent deux fèces.

Impact sur les animaux

Les animaux seront susceptibles d’être seront susceptibles d’être soumis : A un stress et une potentielle déshydratation, lors des périodes de test de préférences et de mesure de la prise hydrique, nécessitant une période de restriction d’accès à l’eau. • A un stress lors de l’hébergement individuel de courte durée, nécessaire pour mesurer la prise hydrique au cours des tests d’aversion, lors de la récolte de fèces impliquant le placement de la souris dans un pot en plastique afin qu’elle émette des selles et lors du prélèvement de sang, nécessitant une contention de moins de 20 secondes. Au cours de ce prélèvement et des injections prévues, les animaux ressentiront une légère douleur due à la piqûre, de l’ordre de quelques secondes.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié afin de prélever certains tissus (caecum et contenu de caecum).

Remplacement

À ce jour, aucun modèle ou technique in vitro ou ex vivo ne permet de reproduire les interactions complexes entre le fructose, le microbiote et l’axe intestin-cerveau. Le recours à des animaux est donc indispensable pour intégrer et analyser de manière globale les données génétiques, physiologiques, du microbiote et de l’alimentation ainsi que les informations biologiques obtenues à partir des dosages hormonaux dans le sang et des analyses des tissus intestinaux et cérébraux.

Réduction

Nous avons prévu d’inclure 12 souris par groupe expérimental et par génotype afin d’obtenir des résultats fiables et significatifs. Ce nombre a été déterminé en prenant en compte la variabilité des mesures de prise hydrique et des dosages ainsi que la variabilité connue des réponses du microbiote et de son adaptation au fructose. Pour analyser les résultats, nous utiliserons des méthodes statistiques adaptées, en fonction du type de données recueillies, pour garantir des conclusions solides et précises. Dans cette perspective de réduction, nous prévoyons de n’inclure qu’un seul groupe contrôle, valable pour l’ensemble des groupes tests.

Raffinement

Pour assurer le bien-être des animaux, plusieurs mesures seront mises en place : • Un enrichissement du milieu de vie : Les souris disposeront de papier sopalin pour construire leur nid, d’un bâton à ronger, d’un abri en propylène rouge, ainsi que de deux hamacs pour réduire les risques de bagarres. • Les animaux seront en groupe ; • Une habituation à la contention : Les animaux seront habitués à la contention et à l’expérimentateur afin de minimiser leur stress pendant les manipulations expérimentales ; • Cages des souris placées côtes à côtes sur le même portoir dans des cages transparentes lors de l’hébergement individuel nécessaire au test de préférence et de mesure de la prise hydrique d’aversion ; • Une surveillance et une pesée seront réalisées quotidiennement pendant la période du test d’aversion, pour contrôler l’état des animaux et s’assurer de leur bien-être tout au long du test et pouvoir intervenir ; • Des points limites seront définis et appliqués.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement utilisé dans les recherches sur les maladies gastro-intestinales, en raison de sa pertinence scientifique. Nous disposons de données préliminaires sur ces modèles génétiques originaux, qui sont disponibles uniquement chez la souris et indispensables pour notre étude. De plus, la souris possède les mêmes transporteurs et enzymes impliqués dans le métabolisme du fructose que l’humain ce qui renforce sa pertinence pour cette étude. Enfin, la malabsorption du fructose observée chez l’homme l’est également chez la souris et fait intervenir chez l’un comme chez l’autre, une altération dans la voie du métabolisme du fructose. Les groupes de souris seront testées pour l’aversion au fructose à 7 semaines d’âge, ce qui correspond chez l’humain à environ la tranche d’âge « 18-25 ans », groupe démographique étant le plus grand consommateur de fructose dans la population humaine.

800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune passe six semaines seule en cage, subit une chirurgie crânienne d'au plus 80 minutes, puis dix jours de restriction alimentaire avant d'apprendre à appuyer sur un levier pour obtenir jusqu'à 60 récompenses par jour, l'activité de son cerveau étant enregistrée pendant environ trois heures de sommeil. Le porteur justifie l'isolement par la protection des implants et l'homogénéité de la restriction alimentaire, et reconnaît qu'il provoque du stress. Les retombées annoncées pour la santé humaine sont renvoyées à cinq ou dix ans, quand l'objectif immédiat reste de décrire des mécanismes de neuro-modulation chez la souris.

Objectifs

Les neuro-modulateurs sont importants pour les processus d'apprentissage et la consolidation de la mémoire. De plus, ils sont aussi des cibles pharmaceutiques de prédilection dans le cadre des traitements de certaines maladies psychiatriques (depression, anxiété, Parkinson). Malheureusement, les mécanismes de neuro-modulation impliqués dans l’apprentissage et la consolidation de la mémoire sont peu connus. Dans ce contexte, l’objectif principal du présent protocole est de découvrir les mécanismes de neuro-modulation impliqués dans l’apprentissage et la consolidation de la mémoire chez la souris.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra : à court terme (au terme du projet), d’identifier les mécanismes de neuro-modulation de l’apprentissage et la consolidation de la mémoire chez la souris. À moyen terme (5–10 ans), les données générées pourront servir de base de travail pour le développement de stratégies thérapeutiques ciblant les différents neuro-modulateurs pour la santé humaine.

Procédures

Opérations chirurgicales : tous les animaux sont soumis à une procédure chirurgicale qui dure maximum 80min. Tests comportementaux: tous les animaux sont soumis à une procédure comportermentale pendant laquelle elles apprennent à appuyer sur un levier pour obtenir une récompense. Pendant 5 jours, une fois par jour, les souris disposent au maximum de 60 min pour obtenir 60 récompenses. Des enregistremetns seront rélasés pendant la période de sommeil qui suit le premier jour d’apprentissage (environ 3 heures).

Impact sur les animaux

Les sources éventuelles de nuissances ou effets indésirables dans notre procédure : la chirurgie, l’hébergement individuel la restriction alimentaire et les test comportementaux. La chirurgie est susceptible d’occasionner un stress, une douleur et une perte de poids de manière aigüe (3 jours). L’hébergement individuel est necessaire pour garantir l’intégrité des implants et assurer une restriction alimentaire homogène. En effet, les restrictions alimentaires en cage collective exacerbent les hiérarchies et biaisent l'accés à la nouriture de certains individus. L'hébergement individuel commence avant la chirurgie jusqu'à la fin de la procédure, soit 6 semaines. Il occasionne un stress notamment au début. La restriction alimentaire, dure 10 jours et provoque une légère perte de poid. Lors des tests comportementaux les souris sont engagées dans une tâche de recherche de récompenses alimentaires; pour enregistrer l'activté cérébrale, elles sont connectées ce qui peut constituer une contrainte physique. Cependant au vue de nos données, le déplacement d'une souris connectée et non connectée est similaire.

Devenir

Euthanasie de l'ensemble des animaux à la fin de la procédure expérimentale afin de prélever le cerveau.

Remplacement

Chez l’homme, les neuro-modulateurs sont des cibles pharmaceutiques de prédilection dans le cadre des traitements de certaines maladies psychiatriques (depression, anxiété, Parkinson). De plus, chez l’homme, aucune méthode ne permet de comprendre les mécanismes cellulaires de la mémoire. Nous devons donc utiliser des méthodes permettant de mesurer et de manipuler l'activité de neurones ou de neuro-modulateurs avec des résolutions spatiales et temporelles élevées sur un cerveau intact et vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux transgéniques et non-transgéniques (N) utilisé sera réduit à son minimum, en calculant l’estimation de la variance observée avec ce type de données pour atteindre une signification statistique. Nous avons besoin de 480 souris non-transgéniques l’étude des dynamiques des différents neuro-modulateurs et de 320 transgéniques souris pour la manipulation de la libération des neuro-modulateurs. Pour la réalisation de toutes les expériences de ce protocole nous utiliserons 800 souris.

Raffinement

Tous les soins seront pris afin de limiter la douleur et le stress des souris au minimum. Une période de 2 semaines d'acclimatation à l'animalerie (en cage collective) sera respectée à l'arrivée des souris. Après cette période, une habituation à la manipulation sera effectuée pendant une semaine. Les souris subiront des actes chirurgicaux. Afin de réduire au minimum leur souffrance, nous appliquerons systématiquement un traitement antalgique avant et trois jours suivant les actes chirurgicaux qui sont réalisées sous anesthésie gazeuse. Après la chirurgie, l’évaluation de l’état général de l’animal et de son poids est effectuée de façon journalière à partir du moment de la chirurgie. Ces mesures sont consignées dans un cahier d’expérience prévu à cet effet. Pour identifier les dommages et contraintes subis par l’animal, nous avons définis des points limites au nombre de 5. Ces cinq aspects évalués au cours de nos expériences nous aident à déterminer un point final à l’expérimentation. Chaque critère est évalué de 0 à 3 et si un critère obtient le score maximal, ceci induit un arrêt immédiat de l’expérience. Sur la base des critères définis dans ces fiches, les expérimentateurs et les zootechniciens seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez les souris. A la suite de la chirurgie, les souris seront isolées. Le temps de maintien des souris en habitat isolé sera réduit à son minimum, et les souris auront néanmoins accès à des stimuli olfactifs, visuels et auditifs provenant d’autres cages (ventilation collective et cages transparentes)

Choix des espèces

La souris est un bon modèle pour les études comportementales. Son utilisation est généralisée dans le domaine des neurosciences et en particulier pour l’étude des circuits neuronaux impliquées dans les comportements. Nos objectifs scientifiques nécessitent l’enregistrement et/ou la manipulation des différents neuro-modulateurs. L’existence de différentes lignées de souris rend cette espèce la plus indiquée pour réaliser notre étude. Les animaux seront utilisés entre 2 et 6 mois post natal, soit un âge adulte, l’âge auquel les souris montrent de bonne performance d’apprentissage et de mémoire.

Une pompe osmotique implantée sous la peau diffuse de l'angiotensine II pendant quatre semaines pour provoquer une hypertension artérielle. 50 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. L'hypertension peut entraîner un épaississement du muscle cardiaque, une rétention d'eau et du sodium et des troubles du rythme, sans que la fréquence de ces atteintes soit précisée. L'objectif déclaré tient en une phrase, mieux comprendre les lésions de la valve aortique liées à un flux sanguin anormal, et la description des procédures subies par les souris en une seule ligne.

Objectifs

Les maladies des valves cardiaques, appelées valvulopathies, touchent environ 2,5% de la population générale et cette prévalence passe à 13% chez les personnes âgées de plus de 75 ans. Les valves jouent le rôle de clapets s’ouvrant et se fermant à chaque cycle cardiaque et empêchant le reflux sanguin. La valve aortique est une structure dynamique soumise en permanence à des contraintes mécaniques, notamment des forces de cisaillement liées au flux sanguin. Ces stimuli mécaniques sont perçus par les cellules valvulaires, notamment les cellules endothéliales valvulaires et convertis en signaux biologiques via des mécanismes de mécanotransduction. Dans des conditions physiologiques, un flux laminaire stable contribue au maintien de l’homéostasie valvulaire et participe à préserver l’intégrité structurelle du tissu valvulaire et les propriétés mécaniques et fonctionnelles de la valve. À l’inverse, des conditions hémodynamiques altérées, perturbent ces mécanismes de régulation. Ces contraintes pathologiques induisent une activation des voies de signalisation mécanosensibles dans les cellules valvulaires. Cela conduit à des réponses inflammatoires, et à un remodelage pathologique du tissu valvulaire. L’objectif de ce projet est d’étudier la physiopathologie de la valve aortique et les mécanismes conduisant aux lésions de celle-ci. Pour ce faire nous allons utiliser un modèle de souris présentant un flux sanguin anormal lié à une hypertension artérielle. Cette hypertension sera obtenue par la perfusion continue d’angiotensine à travers une pompe osmotique implantée en sous-cutané.

Bénéfices attendus

Nous attendons de ce projet d’augmenter les connaissances sur la physiopathologie des valvulopathies associées à un écoulement pathologique et ainsi améliorer au mieux la prise en charge thérapeutique des patients.

Procédures

Les animaux subiront une Implantation chirurgicale d’une pompe osmotique sous cutanée délivrant de l'angiotensine II pendant 4 semaines

Impact sur les animaux

l'implantation chirurgicale sous cutanée peut engendrer une gêne ou une douleur modérée dans les jours suivant l’intervention La délivrance de l'angiotensin II est utilisée pour augmenter l'hypertension artérielle. L'hypertension pouvant conduire à : 1) Hypertrophie myocardique et remodelage vasculaire. 2) Rétention d’eau et de sodium, diminution de la diurèse. 3) Troubles du rythme cardiaque.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélever les organes et réaliser des analyses post mortem.

Remplacement

Les premières étapes de notre projet ont consisté à étudier un modèle in vitro de cellules valvulaires soumises à un flux physiologique (écoulement maitrisé mimant les forces de cisaillement) et pathophysiologique sur un temps court (1h de culture). Malheureusement, le développement de la réponse cellulaire sur un temps plus long n’est pas possible et nous devons maintenant passer à l’analyse d’un modèle in vivo.

Réduction

Par une approche statistique nous réduirons au strict minimum le nombre d’animaux utilisés dans notre projet. Nous analyserons les données (morphologie et fonction) en utilisant un test de Mann et Whitney en prenant un risque alpha de 0,05, une puissance de test de 0,75 et une taille d’effet d=0,8. En fonction de ces paramètres, il nous faut au moins 21 souris par groupe. Afin de faire face à d’éventuelles pertes d’animaux ou incidents techniques, nous avons augmenté ce nombre de 20%, nous arrivons à un total de 25 souris par groupe.

Raffinement

Dès la réception des animaux dans notre établissement utilisateur, nous porterons une attention au bien-être animal. La manipulation des animaux sera faite par des personnes compétentes et sensibilisées à la manipulation à faible stress des souris contention. Lors du design expérimental, nous avons opté pour l’implantation d’une pompe osmotique permettant une libération continue du traitement afin d’éviter la réalisation d’injections quotidiennes qui sont stressantes et pouvant à terme devenir douloureuse pour les animaux. De plus, afin de suivre l’évolution de la pathologie, nous avons opté pour des approches non invasives de suivi de la pression artérielle et de la fonction cardiaque. Afin de limiter le risque de phénotype sévère pour les animaux, nous avons fait le choix de réaliser un suivi court (sur 4 semaines) et établi des points limites précoces et adaptés.

Choix des espèces

L’anatomie et la fonction du cœur des souris sont proches de celle du cœur humain. Les souris sont de bons modèles d’étude des pathologies cardiaques et de leurs évolutions. Notre modèle reproduira une pathologie valvulaire acquise. Pour cela, les souris utilisées seront adultes. Elles auront une hypertension artérielle induite par la perfusion d’angiotensine (pompe osmotique implantée) pendant 4 semaines.