Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
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- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
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- Système respiratoire
- Système urogénital
Rôle de DICER dans l’homéostasie du muscle squelettique
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Gavées quotidiennement pendant sept jours, injectées dans l'abdomen, soumises à un test de force d'agrippement, 360 souris privées de micro-ARN dans leurs fibres musculaires vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 240 d'entre elles et modéré pour 120. Le porteur conclut que ces interventions restent "transitoires et réversibles, sans conséquence durable sur la santé des animaux", tout en indiquant que ces souris présentent une faiblesse musculaire et qu'une alimentation en gel sera ajoutée dans la cage de celles qui n'accèdent plus normalement à la nourriture. Deux traitements aux glucocorticoïdes, prednisone par gavage et dexaméthasone par injection, servent à mesurer la part de l'inflammation dans les atteintes musculaires. Toutes sont tuées à l'issue, pour prélever leurs muscles et d'autres tissus.
Objectifs
Les micro-ARN (ou miARN) sont de très petites molécules présentes dans nos cellules, qui jouent un rôle important pour contrôler le fonctionnement des gènes. Ils agissent un peu comme des interrupteurs qui ajustent la production de protéines selon les besoins de la cellule. On sait déjà qu’ils sont essentiels pour la formation des muscles pendant le développement de l’embryon, mais on connaît encore mal leur rôle une fois que le muscle est formé, notamment chez l’adulte. Dans ce projet, nous utilisons un modèle de souris dans lequel les micro-ARN sont supprimés uniquement dans les fibres musculaires, grâce à la désactivation d’un gène appelé Dicer, nécessaire à leur fabrication. Cela nous permettra d’observer comment les muscles réagissent lorsqu’ils ne peuvent plus produire ces petites molécules : leur structure, leur force, et leur capacité à bien fonctionner au quotidien. L’objectif est de mieux comprendre comment les micro-ARN participent à l’équilibre et à la santé du muscle. À plus long terme, ces recherches pourraient aider à développer de nouvelles pistes pour prévenir ou traiter certaines maladies qui provoquent la faiblesse ou la dégénérescence musculaire.
Bénéfices attendus
Ce projet cherche à mieux comprendre le rôle des micro-ARN, de petites molécules qui aident les cellules à fonctionner correctement, dans la santé du muscle après la naissance. Nous nous intéressons plus particulièrement à leur influence sur la structure des fibres musculaires et sur la régulation de l’inflammation au sein du muscle. Pour cela, nous étudierons des souris chez lesquelles ces micro-ARN sont absents dans les fibres musculaires. En observant ces souris à différents âges (4 semaines, 2 mois et 8 mois), nous pourrons suivre l’évolution des éventuelles altérations du muscle et identifier les périodes où ces petites molécules jouent un rôle clé. Grâce à des analyses précises des tissus et des protéines musculaires, nous chercherons à comprendre quels mécanismes sont touchés par la perte des micro-ARN. Nous testerons également deux traitements anti-inflammatoires à base de glucocorticoïdes (prednisone par gavage et dexaméthasone par injection intrapéritonéale) afin d’évaluer dans quelle mesure l’inflammation contribue aux altérations musculaires observées. En résumé, ce projet permettra de mieux comprendre comment le muscle adulte garde son équilibre et se protège au fil du temps. Ces connaissances pourraient, à terme, aider à développer de nouvelles stratégies pour prévenir ou traiter certaines maladies musculaires liées à la dégénérescence ou à une inflammation chronique.
Procédures
1) Gavage oral : administration quotidienne pendant 7 jours consécutifs et habituation pendant 3 jours en amont (environ 30 secondes à 1 minute par souri). 2) Injection intrapéritonéale (IP) : administration quotidienne pendant 7 jours consécutifs (selon le groupe, 30 secondes maximum par souris). 3) Prélèvement sanguin : effectué une seule fois par animal, au moment prévu après le GRIP test et avant l'euthanasie (environ 30 secondes à 1 minute par souri). 4) GRIP test : réalisé une seule fois par animal, conformément au calendrier expérimental (environ 20 seconds par souris). 5) Contention : utilisée pendant les manipulations nécessaires (gavage, IP, prélèvement sanguin, GRIP test) uniquement pour la durée de l’intervention (environ 10 à 20 secondes par souris).
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, les différentes interventions expérimentales peuvent entraîner des effets indésirables ou des gênes temporaires pour les animaux. Le gavage oral, peut provoquer un léger stress transitoire, une gêne liée à la contention, ainsi que de petites irritations de l’œsophage et, plus rarement, de brèves complications respiratoires. Une légère perte de poids ou des variations temporaires du comportement alimentaire peuvent également survenir. L’injection intrapéritonéale peut provoquer un inconfort local au point d’injection et un stress léger lors de la manipulation, ainsi que, très rarement, une irritation ou inflammation locale. Le prélèvement sanguin nécessite une immobilisation brève, pouvant entraîner un stress léger et passager, et une gêne locale mineure au point de ponction, sans douleur durable ni lésion significative. Le GRIP test implique également une courte contention et une mobilisation des membres, ce qui peut occasionner un stress transitoire et une fatigue musculaire passagère. Dans l’ensemble, toutes ces interventions entraînent un niveau de contrainte modéré, avec des effets transitoires et réversibles, sans conséquence durable sur la santé des animaux.
Devenir
À l’issue des différentes procédures expérimentales, tous les animaux seront euthanasiés de manière conforme aux recommandations réglementaires (arrêté du 1er février 2013, annexe IV de la directive 2010/63/UE). Cette étape est nécessaire afin de prélever les muscles et autres tissus d’intérêt pour réaliser les analyses moléculaires, histologiques et biochimiques prévues dans le protocole.
Remplacement
Pour comprendre le rôle des micro-ARN dans le bon fonctionnement et l’équilibre du muscle, il est nécessaire d’étudier un organisme vivant dans son ensemble. En effet, le muscle ne fonctionne pas isolément : il dépend de nombreux types de cellules, ainsi que de facteurs hormonaux et physiologiques qui agissent ensemble pour maintenir sa structure et sa force. Aujourd’hui, il n’existe aucun modèle en laboratoire (in vitro) capable de reproduire fidèlement ces interactions complexes entre les cellules du muscle et leur environnement. C’est pourquoi l’utilisation d’un modèle vivant (in vivo) est indispensable pour obtenir des résultats fiables et représentatifs du fonctionnement réel du muscle. La souris est l’espèce la plus adaptée pour ce type d’étude, car son organisation musculaire et sa fonction contractile sont très similaires à celles de l’être humain. Cela permet de mieux comprendre les mécanismes en jeu chez l’Homme et, à terme, de favoriser le développement de nouvelles approches thérapeutiques contre les maladies musculaires.
Réduction
Les recherches précédentes menées dans notre laboratoire ont permis d’acquérir une solide expérience du modèle utilisé et de la méthodologie expérimentale. Cela nous permet aujourd’hui de réaliser des expériences précises, bien contrôlées et de qualité, tout en limitant au maximum le nombre d’animaux nécessaires. Chaque expérience sera menée sur un nombre réduit de souris, défini pour garantir à la fois la fiabilité scientifique et le respect du bien-être animal. Pour chaque animal, une patte servira aux analyses moléculaires et l’autre aux observations histologiques, ce qui évite de multiplier les animaux pour différentes analyses. Ce choix garantit donc une utilisation raisonnée et éthique des animaux.
Raffinement
Les animaux seront observés quotidiennement afin de vérifier leur état général. Bien que les souris utilisées dans ce projet puissent présenter une légère faiblesse musculaire, les études précédentes ont montré qu’elles conservent une bonne mobilité et peuvent se nourrir et s’hydrater normalement. Leur déplacement sera toutefois surveillé régulièrement pour repérer tout signe de difficulté (ralentissement, boitement ou absence de mouvement). Avant le début des traitements, les animaux seront habitués au GRIP test et au gavage pendant une semaine, afin de réduire le stress et faciliter la tolérance à ces manipulations. En cas de gêne, des mesures rapides seront prises pour éviter toute souffrance inutile. Si un animal montre des signes de faiblesse empêchant un accès normal à la nourriture, une alimentation en gel sera ajoutée directement dans la cage pour faciliter la prise alimentaire. En cas de perte de poids ou si un point limite de souffrance est atteint, l’animal sera immédiatement euthanasié de manière rapide et indolore, conformément aux recommandations éthiques. Le traitement médicamenteux administré est habituellement bien toléré et ne provoque pas d’effets indésirables significatifs. Le prélèvement sanguin, réalisé sur une petite veine de la tête, représentera un volume très minime de sang et sera effectué au moment de l’euthanasie afin d’éviter tout stress ou inconfort supplémentaire.
Choix des espèces
Les études réalisées uniquement sur des cellules en culture ne permettent pas de comprendre le rôle des micro-ARN dans la structure et le bon fonctionnement du muscle, ni d’observer les interactions naturelles entre les différentes cellules qui composent le tissu musculaire. Les modèles de muscles reconstitués en laboratoire (appelés muscle-on-chip ou organoïdes) sont encore en développement et ne reproduisent pas fidèlement le comportement des micro-ARN ni la complexité des échanges cellulaires observés dans un organisme vivant. Ces limites rendent difficile l’étude précise des mécanismes biologiques impliqués dans la régulation du muscle. C’est pourquoi nous avons choisi d’utiliser la souris, un modèle reconnu et bien documenté, pour lequel tous les outils génétiques et moléculaires nécessaires à cette étude sont disponibles. La sélection de différents stades – 4 semaines, 2 mois et 8 mois – permet d’observer l’évolution des altérations musculaires au fil du temps : 4 semaines correspond à l’âge post-sevrage, où les premières modifications du muscle peuvent être détectées ; 2 mois représente l’âge jeune adulte, période où la fonction musculaire est stabilisée ; et 8 mois correspond à un âge adulte intermédiaire, permettant d’évaluer l’impact à plus long terme de l’absence de micro-ARN sur la structure et la physiologie du muscle. De plus, la grande similarité entre la souris et l’être humain (environ 99 % des gènes sont communs) permet d’obtenir des résultats pertinents et transposables à la compréhension des maladies musculaires humaines.
Interaction cœur-poumon et effet du préconditionnement ischémique dans la greffe pulmonaire chez le porc
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
30 porcs de 50 à 70 kg vont être opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil. Après ouverture du thorax, les artères pulmonaires droite et gauche sont cerclées puis alternativement bloquées et rouvertes pendant six heures pour la plupart des animaux, ce qui provoque des désaturations et des fibrillations cardiaques que le porteur annonce comme attendues. L'objectif déclaré porte sur la prévention de la dysfonction du greffon après une transplantation pulmonaire chez l'humain, les organes prélevés servant aux analyses, la tête et les viscères à des formations en chirurgie viscérale et ORL. Après des travaux sur des greffons humains rejetés et des modèles d'ischémie in vitro, le porteur affirme qu'il était "incontournable" de passer sur un modèle proche de l'humain.
Objectifs
Notre étude a pour but de montrer: L'effet du préconditionnement ischémique : Étudier si de brefs cycles d'arrêt de circulation/reprise de circulation du sang dans l'artère pulmonaire avant le prélèvement des poumons peuvent limiter les dommages tissulaires et inflammatoires L'interaction cœur-poumon : Évaluer les conséquences d'un arrêt de circulation sanguine pulmonaire sur la fonction et l'intégrité tissulaire du coeur, notamment en raison de l'augmentation brutale de la post-charge induite par le clampage de l'artère pulmonaire.
Bénéfices attendus
L'objectif final est d'améliorer la prévention de la dysfonction primaire du greffon pour réduire la mortalité postopératoire chez l'humain. Cette étude vise ainsi à valider de nouvelles stratégies thérapeutiques protectrices pour le cœur et les poumons.
Procédures
Tous les animaux vont subir une induction par injection intramusculaire. Suivant les différents groupes les animaux vont subir: une anesthésie générale et une chirurgie avec thoracotomie avec cerclage des artères pulmonaires droite et gauche. La durée de cette intervention sera d'environ 1h. Pour les groupe HNF, sans HNF 6 h d'ischémie reperfusion droite et gauche en alternance. Pour le groupe préconditinnement 30 min d'ischémie reperfusion droite et gauche en alternance. Puis pour tous les animaux une mise à mort.
Impact sur les animaux
Les animaux vont subir une perte de conscience lors de l’induction ils seront désorientés. Durant l’intervention ils vont être sujet a désaturation du fait des clampages successifs et des fibrillations cardiaques ventriculaires ou auriculaires.
Devenir
Tous les animaux seront mise à mort à la fin de la procédure pour un prélèvement des tissus et organes à analyser.
Remplacement
Après de nombreuses analyses sur des prélèvements humains de greffes rejetées, des analyses poussées sur de potentielles causes et des modèles in-vitro d’ischémies il était incontournable de passer sur un modèle animal proche de l’homme avec des réactions hémodynamiques très proche voir similaires.
Réduction
Pour répondre au principe de réduction nous avons liés 2 études complémentaires qui ont pour but d’améliorer la qualité du greffon en le conditionnant tel un entrainement et la survie du receveur en limitant les atteintes cardiaques du ventricule droit par des moyens pharmacologiques. De ce fait nous pouvons multiplier les organes à analyser sans augmenter le nombre d’animaux utilisés de plus les témoins permettant d’évaluer les niveaux de base des métabolites sont commun aux deux études. Nous avons ensuite utilisé les premiers résultats obtenus chez le rat pour modéliser et donc apprécier statistiquement le modèle et le calquer sur le porc qui est un modèle beaucoup plus proche de l’homme.
Raffinement
L’ensemble de l’étude sera sans réveil. Elle sera effectuée sous anesthésie générale avec une analgésie très poussée et des temps opératoires réduits à l’extrême. Les procédures chirurgicales complexes sont effectuées par des chirurgiens humain spécialiste de la greffe pulmonaire et formés à l'expérimentation animale. L’anesthésie l’analgésie et le monitoring sera suivit par des vétérinaires car ce projet est en partenariat avec une école vétérinaire. Un médecin anesthésiste réanimateur habilité a l'expérimentation animale sera aussi présent pour assurer les gestes de réanimation nécessaire durant la procédure. Après prélèvement des organes à analyser, les viscères et la tête seront récupérées pour être utiliser dans des formations en chirurgie viscérale et ORL. La carcasse sera donnée au laboratoire d’anatomie de l’école vétérinaire.
Choix des espèces
On peut considérer le modèle porcin comme un modèle de haute-fidélité pour les chirurgiens thoraciques. L'anatomie cardio-pulmonaire est extrêmement proche ainsi que l'abord chirurgical. Il permet de recréer les tempêtes hémodynamiques et inflammatoires de la greffe dans un environnement contrôlé, afin de tester des manœuvres de "pilotage" (comme le préconditionnement ou le prélèvement) avant de les appliquer en conditions réelles sur des patients. Les porcs seront des jeunes de 50 à 70 kg pour pouvoir supporter plus facilement la chirurgie tout en conservant une anatomie proche de l’homme et être facilement manipulable.
Traitement avec de nouvelles molécules inhibitrices sur des modèles de souris xénogreffées avec des cellules leucémiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les souris utilisées sont immunodéficientes, ce qui permet d'y implanter des cellules leucémiques prélevées sur des patients pour qu'elles développent la maladie. 210 souris vont ainsi être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Après la transplantation, chacune reçoit quatre injections de polychimiothérapie et de molécules inhibitrices sur animal éveillé, puis un prélèvement sanguin trente-cinq jours plus tard. Elles sont tuées pour prélever moelles osseuses et rates et y doser les cellules leucémiques restantes, ou plus tôt si les points limites sont atteints.
Objectifs
La Leucémie Aiguë Lymphoblastique (LAL) est un cancer du sang. Elle représente environ 1,5 nouveau cas pour 100000 habitants par an, soit environ 1000 nouveaux cas par an en France. Elle se déclare en majorité chez l’enfant de 2 à 5 ans, 75% des malades ont moins de 18 ans. La LAL représente 30% des cancers de l’enfant. Malgré les améliorations du traitement des LAL, les taux de rechute restent élevés (de l’ordre de 20%). Ainsi, pour traiter avec succès les patients en rechute, il est encore nécessaire de développer de nouvelles thérapies. Dans ce projet, nous transplantons des cellules leucémiques issues de patients dans des souris immunodéficientes. Ces souris développent alors la maladie, permettant ainsi de créer des modèles de xénogreffes. Ces modèles sont utilisés pour étudier, en phase préclinique, l’effet thérapeutique de nouvelles molécules anticancéreuses inhibitrices. Comme cela est fréquemment observé après des traitements de polychimiothérapie chez les enfants, des cellules leucémiques résiduelles peuvent persister dans la moelle osseuse. Ce phénomène est également observé dans nos modèles de souris xénogreffées. Dans ce projet, nous étudierons si de nouvelles molécules inhibitrices peuvent renforcer l’efficacité de la polychimiothérapie et permettre l’élimination de ces cellules résistantes.
Bénéfices attendus
En effectuant des expérimentations in vitro sur nos modèles de leucémies, nous avons identifié de nouveaux composés qui bloquent la prolifération des cellules cancéreuses. Après avoir validé in vitro leurs efficacités, nous souhaitons maintenant tester leurs efficacités sur nos modèles murins in vivo lors d’études précliniques. Le bénéfice attendu du projet concerne donc la découverte de nouvelles molécules inhibitrices et donc de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le traitement des Leucémies Aiguës Lymphoblastiques.
Procédures
Les animaux vigiles seront soumis à des transplantations de cellules leucémiques. Une seule injection est prévue par souris, durée de 5 minutes par injection. Après la transplantation, des injections de polychimiothérapies et des molécules inhibitrices spécifiquement testées dans ce projet se feront sur animaux vigiles. Quatre injections par souris sont prévues, durée par injection de 5 minutes. Trente-cinq jours après la transplantation, un prélèvement de sang sur animaux vigiles est prévu. Un seul prélèvement par souris, durée du prélèvement de 5 minutes. Après euthanasie des animaux sous anesthésie, des prélèvements post mortem de rates, et de moelles osseuses seront réalisées pour effectuer des analyses.
Impact sur les animaux
Les animaux vont développer des cancers (leucémies), avec une multiplication proliférative des cellules leucémiques lymphoblastiques dans la moelle osseuse, le sang et la rate des animaux. Les injections et prélèvements sur animaux vigiles engendreront du stress et de la douleur au point de piqure.
Devenir
La mise à mort sera effectuée sur les animaux soit en fin de procédure, soit lorsque des points limites auront été atteints. Les animaux seront tous mis à mort à l’issue de la procédure afin de prélever des tissus (les moelles osseuses et les rates) afin de doser la présence des cellules leucémiques.
Remplacement
Pour remplacer des modèles animaux, il est parfois possible de travailler sur des cellules ou des tissus (in vitro). Le recours aux modèles in vitro doit être l’objectif du chercheur si son expérimentation le permet. Les inhibiteurs chimiques que nous allons tester dans ce projet préclinique ont d’ores et déjà été testé in vitro sur des méthodes alternatives ; sur des cellules primaires isolées de patients, ainsi que sur des lignées cellulaires. Ceci nous permet d’être sûr que ces molécules qui vont être étudiées in vivo sont fonctionnelles sur les cellules cancéreuses. Il nous faut maintenant valider sur des études précliniques in vivo l’efficacité de ces molécules et le remplacement par des méthodes alternatives n’est plus possible à ce stade du projet de recherche.
Réduction
Dans ce projet, nous allons diminuer le nombre d’animaux utilisés à des fins de recherche par : la limitation aux seules expériences considérées comme absolument indispensables. S’il est essentiel d’utiliser le plus petit nombre d’animaux possibles, il faut néanmoins éviter que cet effort de réduction nuise à la fiabilité des résultats. Une réflexion biostatistique a alors été intégrée à la construction de ce projet. Pour les tests sur la viabilité cellulaire, nous utiliserons des groupes de 7 souris afin de réaliser des tests ANOVA.
Raffinement
Afin de réduire, supprimer ou soulager la douleur ou la détresse des animaux, et ainsi améliorer leur bien-être, en amont des expériences, nous allons planifier les protocoles nous allons aussi planifier et établir les points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure. Afin de limiter le stress des animaux, ils sont placés par groupe de 5 à 10 dans des cages agrémentées d’éléments en carton ou en plastique leur permettant de se regrouper dans un nid. Comme il s’agit d’animaux immunodéficients, un couvercle filtrant sera placé sur toutes les cages. La litière des cages est changée une fois par semaine et les animaliers veillent quotidiennement à ce que les animaux ne manquent ni d’eau, ni de nourriture. Afin qu’une prise en charge des animaux puisse se faire le plus rapidement possible, nous communiquerons les points limites au personnel de l’animalerie. Après le prélèvement de sang et les injections, nous donnons des soins adéquats, la queue de la souris en légèrement pincée pendant 30 secondes pour éviter tout saignement. Les souris pour lesquelles nous avons prélevé le sang ou injecté sont placées dans une nouvelle cage et dans une litière propre. Une surveillance des animaux sera également réalisée par les expérimentateurs tout le long de la procédure (au minimum 2 fois par semaine puis tous les jours après 35 jours). Nous avons établi les points limites de nos procédures expérimentales. Les procédures d’euthanasie appropriées seront appliquées des lors où un des points limites est observé.
Choix des espèces
Pour qu’un nouveau traitement puisse être lancé en étude clinique, il est nécessaire de mener des études précliniques, afin de prouver son efficacité, d'optimiser les dosages mais aussi d'identifier ses effets indésirables possibles. Les études précliniques nécessitent d’avoir recours à des animaux. Nous disposons d’échantillons de cellules leucémiques provenant de patients que l’on peut transplanter à des souris immunodéficientes. Quelques semaines après l’injection, les cellules leucémiques humaines sont présentes dans la moelle osseuse et la rate des souris qui constituent un modèle d’étude reproduisant la physiopathologie de cette maladie. Ces études ne peuvent se réaliser que dans le modèle murin. L’hématopoïèse et la leucémogenèse des souris (mus musculus) est celle qui se rapproche le plus de l’homme. Les animaux âgés entre 2 et 5 mois seront utilisés, ceci correspond à un âge optimal pour la greffe des cellules leucémiques.
Etude du rôle des cellules dendritiques dans la réponse immunitaire dans le mélanome et le cancer du pancréas chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Rasées sous anesthésie puis injectées sous la peau du flanc avec des cellules tumorales, 174 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Les tumeurs sont mesurées trois fois par semaine, les animaux pesés une fois par semaine. Le projet porte sur le rôle de cellules dendritiques dans le mélanome et le cancer du pancréas, deux cancers auxquels le porteur attribue plus de 500 000 morts dans le monde en 2022, et il n'annonce comme résultat que l'identification de cibles thérapeutiques "potentielles". Il indique que les tumeurs peuvent nécroser et provoquer une douleur modérée, et annonce un suivi de points limites "précoces et prédictifs" trois fois par semaine.
Objectifs
Le mélanome cutané et le cancer du pancréas sont deux maladies agressives ayant causé la mort de plus de 500.000 patients dans le monde en 2022. Malgré les progrès récents dans le domaine des immunothérapies du cancer, la majorité des patients ne répond pas durablement à ces traitements, en particulier du fait de la mise en place de mécanismes intracellulaires encore mal compris. Nous avons identifié une famille de molécules susceptibles de soutenir la progression du mélanome et du cancer du pancréas et leur résistance aux immunothérapies. L’objectif de ce projet est de comprendre la fonction d’une population de globules blancs nommés cellules dendritiques, dans l’action de ces molécules.
Bénéfices attendus
Ces travaux pourraient permettre d’identifier de nouveaux mécanismes permettant la progression du mélanome et du cancer du pancréas, et leur échappement au système immunitaire, constituant de fait des cibles thérapeutiques potentielles.
Procédures
- Rasage du flanc des souris sous anesthésie (1x 2 minutes/souris) - Injection sous-cutanée dans le flanc de cellules tumorales, sous anesthésie (1x 2 minute/souris) – Pesées (30 secondes, une fois par semaine) – Mesure des volumes tumoraux (30 secondes, 3 fois par semaine)
Impact sur les animaux
L’évaluation des volumes tumoraux et les pesées nécessitent une contention de quelques secondes, pouvant engendrer un stress léger. Les injections de cellules tumorales peuvent entraîner des douleurs courtes sur le flanc. -La progression des tumeurs sur le flanc des souris peut induire une douleur modérée. Dans de très rares cas, les tumeurs peuvent nécroser.
Devenir
Afin d’effectuer des analyses sur les tumeurs, rates et ganglions lymphatiques, les souris seront mises à mort et ces tissus seront prélevés pour analyse. Ceci permettra de documenter la fonction des protéines d’intérêt non seulement dans la croissance tumorale mais aussi dans la composition et distribution du microenvironnement immunitaire.
Remplacement
Nous avons effectué une série d’expériences in vitro et d’analyses in silico pour établir le rôle des trois protéines d’intérêt dans la croissance tumorale et l’échappement immunitaire, et pour dresser des hypothèses de mécanisme. Néanmoins à notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de l’informatique, les interactions entre les cellules tumorales, immunitaires et leur microenvironnement, ne peuvent actuellement pas être remplacées par des systèmes in vitro fiables.
Réduction
Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Notre analyse statistique a priori se base sur des données bien établies de la littérature.
Raffinement
Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs (3 fois par semaine), et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Le rasage et les injections sous-cutanées seront faites sous anesthésie gazeuse. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, tunnel en carton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage. En cas d’altération du bien être ou de perte de poids limitée, de la nourriture liquide, de l’eau gélifiée, pourront être utilisés. En cas de douleur détectable, un analgésique sera administré.
Choix des espèces
Le choix de l’expérimentation sur la souris est justifié par l’existence de différents modèles de mélanomes, de souris transgéniques, et de protocoles bien établis dans la littérature, nous permettant de mesurer le rôle nos molécules d’intérêt dans la progression des cancers. Les souris seront âgées de 7 à 15 semaines, ce qui correspond à un état de maturité du système immunitaire. L’âge sera homogène dans chaque procédure. Les animaux seront distribués à 50/50 entre mâles et femelles, hormis pour un modèle de mélanome porteur d’une protéine reconnue uniquement chez la femelle.
Mise au point de modèles tumoraux murins et études d’efficacité de nouveaux composés thérapeutiques anticancéreux dans le cadre d’une plateforme préclinique
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
En moyenne trente-cinq mesures par souris sur douze semaines de croissance tumorale : 9 840 souris vont être utilisées dans cette plateforme préclinique, toutes tuées à l'issue, 9 780 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 60 en gravité sévère. Chacune reçoit une greffe de cellules tumorales, une puce implantée sous la peau sous anesthésie, des administrations de composés dont certaines par gavage, et des prélèvements sanguins. Une partie des souris sont immunodéficientes puis reconstituées avec un système immunitaire humain, une autre génétiquement modifiée pour exprimer des protéines humaines. Les études pilotes servent à écarter les lignées tumorales "trop agressives", et le porteur indique n'y appliquer aucun test statistique.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’évaluer de nouveaux modèles tumoraux chez la souris et d’utiliser ces modèles dans des études d’efficacité visant à tester de nouvelles thérapies anticancéreuses. Les modèles utilisés sont soit des souris génétiquement modifiées exprimant une ou plusieurs protéines humaines en remplacement de leurs équivalents murins, correspondant à des cibles pertinentes pour les traitements anticancéreux, soit des souris immunodéficientes reconstituées avec un système immunitaire humain fonctionnel. Ces derniers modèles permettent de reproduire les interactions entre des cellules tumorales humaines et un système immunitaire humain. Le projet comprend dans un premier temps des études pilotes, nécessaires avant toute étude d’efficacité. Ces études pilotes ont pour but d’évaluer de nouvelles lignées de cellules tumorales, de définir des conditions expérimentales adaptées permettant d’obtenir une croissance tumorale homogène et reproductible, et d’identifier et d’exclure les lignées trop agressives. Ces dernières pourraient en effet compromettre le bien‑être des animaux et rendre les études scientifiquement non exploitables. Le projet inclut également des études pilotes de tolérance, réalisées chez un nombre limité de souris, afin d’évaluer la toxicité de nouvelles molécules anticancéreuses n’ayant pas encore été utilisées chez l’animal. Les composés présentant une toxicité inacceptable sont exclus, ou bien les conditions expérimentales (dose, voie et/ou fréquence d’administration) sont ajustées afin d’assurer une utilisation sûre chez l’animal. Enfin, lorsque les conditions expérimentales sont validées, le projet comprend des études d’efficacité au cours desquelles les nouvelles molécules anticancéreuses sont évaluées dans les modèles tumoraux précédemment caractérisés.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à contribuer à la recherche anticancéreuse en développant, caractérisant et utilisant des modèles tumoraux chez la souris présentant une forte pertinence biologique. Les modèles employés reposent sur des souris génétiquement modifiées exprimant des protéines humaines du système immunitaire, ou sur des souris reconstituées avec un système immunitaire humain fonctionnel. Ces modèles permettent de reproduire de manière plus représentative certaines interactions entre les tumeurs et le système immunitaire humain. Les études réalisées à l’aide de ces modèles ont pour objectif d’améliorer l’évaluation préclinique de nouvelles molécules anticancéreuses, en fournissant des données plus pertinentes sur leur efficacité et leur tolérance avant toute utilisation chez l’Homme. En renforçant la valeur prédictive des études précliniques, ce projet contribue à améliorer la transposition des résultats vers la situation clinique, à réduire le risque d’échec lors du développement ultérieur des médicaments et à limiter l’exposition inutile des patients à des traitements inefficaces ou toxiques. À terme, ces travaux participent à l’optimisation du développement de stratégies thérapeutiques innovantes contre le cancer et visent à faciliter l’accès des patients à de nouveaux traitements mieux adaptés.
Procédures
Les interventions réalisées dans le cadre de ce projet comprennent la greffe de cellules tumorales, le suivi de la croissance tumorale, l’administration de composés et des prélèvements sanguins. La greffe de cellules tumorales consiste en une injection unique, réalisée le plus souvent par voie sous cutanée (SC) dans le flanc, et plus rarement par voie intraveineuse (IV). Les injections SC sont effectuées sous anesthésie (≤10 min) afin d’éviter les mouvements de l’animal, d’assurer une injection homogène et de limiter le stress. Les injections IV, très rapides (quelques secondes), sont réalisées sans anesthésie. Tous les souris reçoivent une puce électronique implantée par voie SC sous anesthésie, permettant l’identification individuelle et le suivi de la température corporelle, en remplacement de méthodes plus invasives, réduisant ainsi le stress lié aux manipulations répétées. La croissance tumorale est suivie par des mesures du volume tumoral, réalisées soit à l’aide d’un pied à coulisse chez un animal vigile, soit par imagerie in vivo sous anesthésie, selon le type de tumeur. La contention nécessaire à la mesure au pied à coulisse est brève (
Impact sur les animaux
Certaines souches de souris sont immunodéficientes et présentent une sensibilité accrue aux infections opportunistes ; elles sont donc maintenues sous des conditions sanitaires strictes. En l’absence d’infection, ces animaux restent en bon état général. Les manipulations peuvent être associées à un stress transitoire, limité par des contentions brèves et adaptées. Les injections réalisées chez des animaux vigiles sont de courte durée et peuvent entraîner une gêne légère et transitoire. Bien que très rares, des irritations locales ou des complications au site d’injection peuvent survenir. Dans des cas spécifiques et exceptionnels, des volumes plus importants peuvent être injectés, ce qui peut entraîner des effets physiologiques légers, aigus et transitoires durant quelques minutes (modifications respiratoires ou cardiaques, baisse temporaire de l’activité) (modifications respiratoires ou cardiaques, baisse temporaire d’activité). Les injections sous cutanées de cellules tumorales sont réalisées sous anesthésie afin d’éviter les mouvements de l’animal et d’assurer une injection homogène ; une douleur locale légère et transitoire peut être observée après le réveil. Le gavage peut occasionnellement provoquer un inconfort léger et transitoire et, plus rarement, des complications mécaniques. Les prélèvements sanguins, réalisés sous anesthésie, peuvent être associés à une douleur légère et transitoire, avec un risque très faible de complications locales. La croissance de tumeurs solides peut entraîner une gêne locomotrice ou des altérations cutanées, tandis que les tumeurs disséminées peuvent provoquer des signes généraux modérés. Enfin, certains composés ou pré traitements peuvent induire des réactions locales ou systémiques transitoires. Les composés dont le profil est encore inconnu peuvent présenter une toxicité. Des études pilotes permettent d’identifier et d’exclure précocement les lignées cellulaires tumorales ou les composés susceptibles d’entraîner des situations défavorables pour le bien‑être animal. Des signes cliniques non anticipés peuvent survenir ; les signes modérés sont pris en charge et intégrés aux points limites, tandis que les signes sévères entraînent l’arrêt de l’étude.
Devenir
Afin de recueillir un maximum d’informations scientifiques à l’issue des études, des prélèvements sont réalisés sur les tumeurs ainsi que, le cas échéant, sur d’autres organes et sur le sang. Ces prélèvements nécessitent la mise à mort des animaux à la fin de l’étude. Pour cette raison, l’ensemble des animaux inclus dans le projet est mis à mort à l’issue des procédures, afin de permettre la collecte des échantillons nécessaires à l’analyse
Remplacement
Les lignées tumorales et les composés étudiés font l’objet d’une phase préalable de caractérisation approfondie en laboratoire, notamment par des essais réalisés sur cellules en culture. Ces travaux permettent d’évaluer les caractéristiques biologiques pertinentes, telles que le comportement des cellules et la présence de cibles thérapeutiques, sans utiliser d’animaux. Les études décrites dans ce projet ne sont mises en œuvre chez l’animal qu’après l’achèvement de ces étapes préalables et lorsque les méthodes alternatives disponibles ont été exploitées. Le recours à un modèle animal intervient uniquement lorsque les données obtenues in vitro ne permettent plus de répondre aux questions scientifiques posées et que l’étude dans un organisme vivant constitue l’étape suivante nécessaire du développement préclinique.
Réduction
Le nombre de souris utilisées par lot est limité au strict minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables et interprétables. Ce nombre est défini en tenant compte de la variabilité naturelle de la croissance tumorale, du risque de prise tumorale variable pour des lignées encore peu caractérisées, ainsi que de la variabilité biologique observée dans certains modèles, en particulier ceux reposant sur la reconstitution d’un système immunitaire humain. Des études pilotes sont mises en œuvre lorsque les données disponibles chez l’animal sont insuffisantes. Elles permettent de tester des lignées cellulaires ou des composés sur un nombre limité d’animaux, afin d’identifier les conditions expérimentales les plus pertinentes et d’exclure précocement des lignées trop agressives ou des composés présentant une toxicité inacceptable, avant toute utilisation dans des études d’efficacité impliquant des effectifs plus importants. Ces études sont conçues à partir de l’ensemble des informations disponibles, incluant les données issues de la littérature scientifique et, le cas échéant, celles provenant de composés comparables, afin de limiter le nombre de conditions testées. En raison de leur caractère exploratoire et afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, aucun test statistique n’y est réalisé et les effectifs sont maintenus au minimum nécessaire. Pour les études d’efficacité, le nombre d’animaux est calculé de manière à permettre la réalisation d’analyses statistiques adaptées, tout en restant aussi faible que possible. Les effectifs retenus permettent de prendre en compte l’hétérogénéité biologique tout en garantissant la robustesse scientifique des résultats. Enfin, à l’issue de chaque étude, des prélèvements biologiques (tumeurs, sang et/ou des organes) peuvent être réalisés post mortem afin de maximiser les données obtenues et d’éviter des répétitions expérimentales inutiles, conformément au principe de réduction des 3R.
Raffinement
Les conditions d’hébergement, de manipulation et de suivi des souris sont mises en œuvre afin de limiter au maximum le stress, la douleur et l’inconfort. Les animaux sont hébergés sous statut sanitaire contrôlé, en groupes sociaux stables, dans des cages enrichies comportant du matériel favorisant les comportements naturels, avec un accès libre à l’eau et à l’alimentation. Une période d’acclimatation est respectée avant le début des études. Les souris sont équipées de puces implantables permettant leur identification individuelle et le suivi de la température corporelle. L’utilisation de ces puces remplace des méthodes d’identification et de mesure plus invasives et permet de simplifier les manipulations, tout en réduisant le stress lié aux interventions répétées. Les manipulations sont réduites au strict nécessaire et réalisées sous anesthésie lorsque cela est recommandé. Les injections sont effectuées à l’aide de matériel adapté et dans le respect des volumes autorisés. Les prélèvements sanguins sont réalisés sous anesthésie, limités au nécessaire, et espacés afin de permettre une récupération adéquate. Les sites de prélèvement peuvent être alternés pour éviter toute irritation ou lésion liée à des ponctions répétées. Un suivi clinique régulier est assuré tout au long des études, avec une fréquence adaptée à la procédure. Des dispositifs de suivi peu invasifs sont privilégiés afin de réduire le stress, notamment pour la mesure de la température corporelle. Des points limites spécifiques, classés en modérés ou sévères, sont définis pour chaque procédure afin de permettre une prise en charge rapide des animaux présentant des signes cliniques. Une souris présentant trois signes modérés ou un signe sévère est mise à mort. En cas de signes modérés, un suivi renforcé et des mesures de soutien adaptées peuvent être mis en place. Tout signe clinique inattendu est évalué avec le vétérinaire et la structure en charge du bien‑être animal, puis intégré aux points limites pour les études ultérieures.
Choix des espèces
La souris a été choisie pour ce projet car elle constitue l’espèce de référence pour les études précliniques en oncologie et l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques anticancéreuses. Les modèles murins, y compris les modèles génétiquement modifiés ou humanisés, permettent de reproduire des processus biologiques complexes impliqués dans la croissance des tumeurs et la réponse aux traitements, notamment les interactions entre la tumeur, son environnement et le système immunitaire. Ces interactions ne peuvent pas être reproduites de manière satisfaisante par des méthodes alternatives réalisées uniquement sur cellules ou tissus isolés. La souris présente également des avantages scientifiques et pratiques importants, tels qu’une taille adaptée aux procédures expérimentales, une manipulation facilitée, une cinétique de développement tumoral compatible avec les objectifs des études, ainsi qu’une large base de connaissances scientifiques permettant une interprétation fiable des résultats. Le recours à cette espèce permet ainsi d’obtenir des données pertinentes pour la recherche sur le cancer. Les souris immunocompétentes génétiquement modifiées sont utilisées à l’âge de jeune adulte, période à laquelle leur développement physiologique et immunitaire est stabilisé. Ce stade permet une croissance tumorale reproductible et une bonne tolérance aux procédures expérimentales. Les souris immunodéficientes reconstituées avec un système immunitaire humain sont utilisées à un âge plus avancé, nécessaire à la mise en place et à la stabilisation fonctionnelle du système immunitaire humain.
Barrière immunitaire aux produits de thérapie génique : mécanismes et nouvelles stratégies d’évitement chez la souris MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
5 100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures que le porteur déclare intégralement en gravité légère. Chacune reçoit deux à quatre injections, dont une de cellules immunitaires et une du vecteur de thérapie génique, puis subit jusqu'à neuf prélèvements sanguins étalés sur six mois. Elles sont tuées pour analyser les lymphocytes dans le sang, la rate, les ganglions, le foie et les muscles, et une perte de poids supérieure à 20 % déclenche la mise à mort. Pour justifier de ne pas anesthésier certains gestes, le porteur note que ces injections "sont pratiquées chez l'homme sans anesthésie, ni administration d'analgésique".
Objectifs
Les vecteurs dérivés de virus adéno-associés (AAV) sont les plus utilisés en thérapie génique dans le traitement des maladies génétiques. Ces vecteurs sont bien tolérés chez l’homme, et leur bénéfice thérapeutique est tel que plusieurs d’entre eux ont reçu des autorisations de mise sur le marché. Cependant, quelques barrières subsistent et viennent limiter leur efficacité et leur utilisation. L’une d’entre elles est la barrière de la réponse immunitaire. En effet, notre système immunitaire a pour fonction de préserver l’intégrité de l'organisme en éliminant les éléments qui viendraient perturber trop fortement l’équilibre maintenu avec notre environnement. Il est ainsi logique que l’administration du vecteur de thérapie génique d’origine virale, puisse pâtir d’une réponse immunitaire qui tente de contrôler voire d’éliminer le produit injecté. Fort heureusement, certaines stratégies basées sur la modification des composants du vecteur ainsi que sur l’utilisation de médicaments immunomodulateurs visant à réduire la réponse immunitaire, peuvent atténuer ces effets immuns délétères en induisant une tolérance immune permettant ainsi un bénéfice thérapeutique pour le patient. Toutefois, ces stratégies sont encore mal maîtrisées. Afin d’élargir l’application de ces traitements au plus grand nombre de patients et de maladies génétiques différentes, notre projet vise, chez la souris, à caractériser certains paramètres impliqués dans l’établissement d’une tolérance immune à l’encontre des vecteurs AAV et à développer des co-traitements immunomodulateurs plus efficaces et moins toxiques pour le patient. Plus spécifiquement, nous étudierons à l’aide de différents modèles de souris les cellules de l’immunité que sont les lymphocytes T et B, et le rôle du ciblage par les vecteurs AAV de certains tissus tels le foie ou le muscle dans la balance immunité/tolérance.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de clarifier certains aspects de la tolérance immunitaire vis à vis des vecteurs AAV en disséquant les réponses lymphocytaires qui sont induites de manière différentielle en fonction du tissu et des cellules ciblées par le vecteur. Il permettra aussi de définir les caractéristiques du vecteur AAV qui peuvent diminuer la réponse immunitaire, et idéalement, induire une tolérance robuste. Enfin, il permettra de proposer de nouveaux traitements immunosuppresseurs adaptées à ces traitements AAV innovants. Comme nous l’avons fait depuis 20 ans, les résultats que nous obtiendrons seront rapidement publiés dans des revues internationales afin de renforcer la connaissance de la communauté scientifique sur le sujet et, le cas échéant, d’accélérer le passage en phase préclinique de certains vecteurs AAV développés par notre institution ou par d’autres.
Procédures
__ Partie 1 du projet : Les souris receverons deux injections: 1x injection de cellules immunitaires par voie intraveineuse, suivie après 24 heures par 1x injection du vecteur médicament AAV (intraveineuse ou intramusculaire). Les souris seront ensuite suivies sur une période allant de 2 semaines (avec 2 prélèvements de sang), à 6 mois (avec 9 prélèvements de sang). __Partie 2 Les souris receverons trois injections: 1x injection de cellules immunitaires par voie intraveineuse, 1x injection du vecteur médicament AAV après 24 heures (intraveineuse ou intramusculaire), et 1x injection après quelques semaines (voie sous-cutanée ou intradermique). Les prélèvements de sang seront bimensuels pour le 1er mois (2x); ensuite mensuels. Leur nombre total sera défini par le temps de suivi qui sera choisi en fonction des résultats de la partie 1. __Partie 3 Les souris receverons trois injections : 1x Injection de cellules immunitaires au niveau de la veine caudale, 1x injection du vecteur médicament AAV (veine caudale ou voie intramusculaire), 1x Injection de cellules à tolériser au niveau de la veine caudale. Prélèvements de sang hebdomadaires sur 1 mois (4x), puis plus espacées jusqu’à la fin. __Partie 4 Les souris receverons d’abord deux injections : 1x Injection de lymphocytes (intraveineuse), 1x injection du vecteur médicament AAV (intraveineuse ou intramusculaire) Avant ou après l’injection du vecteur, injections répétées par voie intrapéritonéale d’agents immunomodulateurs. Le nombre de ces injections variera en fonction des agents. Par exemple : 3 à 5 fois/ semaine pendant 1 à 3 semaines pour le methotrexate (3 à 15x en tout). Prélèvements de sang mensuels sur 6 mois (6x). __Partie 5 Mêmes interventions que les parties 1 à 4, mais réalisés sur des males.__ Injections intraveineuses (veine caudale), intrapéritonéales et sous-cutanées effectuées sur animal vigile, durée
Impact sur les animaux
Les gestes techniques pratiqués (injections intraveineuse, sous-cutanée, intrapéritonéale, prélèvement de sang) pourraient conduire à de faibles nuisances pour l’animal, tel qu’un stress léger et une douleur aigue de très courte durée. Les administrations intramusculaires et intradermique, sous anesthésie légère, seront sans douleur. Lors de nos études précédentes, aucun effet indésirable ou toxicité n’ont été observés chez les animaux traités par les vecteur-médicaments AAV ou des cellules immunitaires
Devenir
L’étude de la réponse immunitaire passe par l’analyse des populations lymphocytaires dans différents tissus (sang, rate, ganglions, foie…) et l’analyse de l’efficacité du traitement par rAAV (sur les muscles notamment). L’analyse de ces tissus (sauf le sang) ne peut se faire que sur animaux préalablement mis à mort. De ce fait, dans chaque procédure, les animaux seront tous mis à mort.
Remplacement
Les réponses immunes sont la résultante d’interactions complexes impliquant de multiples types cellulaires et se déroulant dans plusieurs organes (rate, ganglions lymphatiques, moelle osseuse, foie, muscle etc…) et avec des cinétiques particulières. Ainsi, seuls les animaux sont capables de mimer la complexité de la réponse immune et il n’existe pour le moment aucune méthode substitutive.
Réduction
(1) Afin d’utiliser un minimum d’animaux nous permettant de répondre à la problématique posée, nous avons utilisé une approche statistique pour calculer le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir un résultat significatif. Ce nombre est respecté pour chaque procédure. (2) Dès que possible, nous effectuerons un suivi longitudinal de la réponse immune par prélèvement de sang sur les mêmes individus. Sur x point de temps, cela réduit le nombre d’animaux utilisés d’un facteur x. (3) De plus, sur les mêmes individus, nous analysons le maximum de tissus des animaux post-mortem afin de collecter le maximum d’informations sur chaque animal. (4) Dans la plupart des procédures, nous avons évité de répliquer les groupes contrôles en testant les vecteur-médicaments AAV deux par deux. Ceci réduit le nombre total de souris contrôles d’un facteur 2. Il n’est pas possible de tester plus de 2 vecteurs à la fois pour des raisons pratiques de lourdeur expérimentale.
Raffinement
De manière générale, les expérimentateurs qui travailleront sur ce projet ont en plus de leurs formations plusieurs années d’expériences quant à la manipulation des souris. Ils sont donc très sensibilisés au bien-être animal, ce qui permet de facto de limiter stress et angoisse des animaux afférents par exemple aux simples gestes de contentions. Durant les expériences, nous utiliserons des méthodes expérimentales adaptées par exemple lors des prélèvements de sang (anesthésie préalable, application éventuelle d’une compresse pour stopper d’éventuels saignements) ou lors de l’administration des produits (administration d’anesthésiques préalable pour les injections intramusculaires et intradermiques, suivi vigilant de l’état des animaux). Il est à noter que ces types d’injection classiques sont pratiquées chez l’homme sans anesthésie, ni administration d’analgésique. L’endormissement plus ou moins profond de l’animal permet la réalisation du geste expérimental sans que celui-ci ne bouge et puisse se blesser. Après toute intervention, les animaux seront quand même observés avec attention de façon quotidienne. Si des signes d‘inconfort ou de douleur venaient à apparaitre, l’animal sera surveillé plus fréquemment et pesé. En absence d’amélioration sur une semaine, ou en cas de perte de poids supérieure à 20% du poids initial, la souris sera euthanasiée.
Choix des espèces
Le système immunitaire de la souris est très proche du système immunitaire humain, faisant du modèle murin le modèle de référence pour les analyses des complexes réponses immunes, se déroulant via de nombreux types cellules et dans divers organes. Il bénéficie en outre de l’existence de nombreuses souches modifiées pour des éléments du système immunitaire, permettant d’en analyser le rôle. Chez la souris, le système immunitaire est considéré comme adulte à partir de 6 semaines d’âge. Nous utiliserons donc majoritairement des souris jeunes adultes de 6-12 semaines pour étudier les réponses immunes d’organismes adultes. Les souris seront analysées et/ou euthanasiées entre 6 semaines et 6 mois afin d’évaluer les réponses immunitaires précoces et tardives, respectivement. Le cas échéant, des évaluations à plus long-terme pourraient être menées.
Étude préclinique de nouvelles thérapies dans les maladies auto-immunes, les maladies rares et en oncologie chez la souris 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Une partie des souris utilisées sont des NSG, dépourvues de système immunitaire fonctionnel, ce que le porteur nomme un "phénotype dommageable". 2 184 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par dislocation cervicale pour prélèvement d'organes. Les interventions déclarées se résument à une ou deux injections, quatre prélèvements sanguins sur animal éveillé et un prélèvement sous anesthésie, réparties entre deux établissements. Le porteur admet que l'une des procédures "peut induire des douleurs non prévues" parce que la toxicité des molécules testées n'est pas connue, sans en dire davantage sur le contenu de ces études d'oncologie et de maladies auto-immunes.
Objectifs
L’objectif de cette étude est de développer de nouvelles molécules innovantes pouvant être utilisées pour le traitement de maladies auto-immunes ou dans le cadre du cancer. L’objectif principal sera donc de réaliser, chez la souris, une analyse toxicologique de ces molécules mais également étudier leurs effets sur le développement de différents types de cancer chez la souris. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs, ; les deux premières procédures, dans le premier établissement utilisateur et les trois dernières dans le deuxième établissement utilisateur.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à déterminer si les molécules innovantes nouvellement identifiées permettent notamment d’inhiber ou de ralentir le développement de différents types de tumeurs chez la souris. L’ensemble des résultats obtenus sera crucial pour envisager l’utilisation de ces molécules en clinique chez l’homme.
Procédures
1 ou 2 injections (
Impact sur les animaux
Les procédures correspondantes au projet peuvent induire du stress et une angoisse liés à la manipulation/ contention des animaux. Les prises de sang effectuées ainsi que les injections de traitements peuvent induire un inconfort, une angoisse et une douleur légère de courte durée chez celles-ci. Une des procédures peut induire des douleurs non prévues, inhérentes au fait que la toxicité des nouvelles molécules n'est pas connue. Les manipulations des souris lors des prises de sang effectuées peuvent induire un inconfort, une angoisse et une douleur de courte durée chez celles-ci. L'utilisation d'un phénotype dommageable, les souris NSG.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale, des prélèvements d'organes sont réalisés sur ces animaux et des analyses ex-vivo sont effectuées sur ces derniers.
Remplacement
L'évaluation préclinique est une étape importante dans le développement d'un médicament avant son utilisation en clinique. Avant l’expérimentation sur animal, les molécules sont testées au préalable sur différents modèles bio-informatiques (modélisation des structures des molécules et d'affinités pour les cibles thérapeutiques choisies) in vitro (lignées de cellules tumorales et cellules non tumorales) afin d’évaluer leur activité. L'utilisation du modèle souris permet l’étude de différentes pathologies in vivo. Afin de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques, il est nécessaire d’avoir recours à des organismes modèles de l’Homme. L’utilisation de modèles de souris permet d’étudier la physiologie de ces pathologies au sein d’un organisme vivant dans tout son ensemble.
Réduction
Le nombre de souris correspond au nombre minimal requis pour avoir une différence significative de réponse biologique entre les différents groupes. Dans les procédures expérimentales définies (études précliniques de pharmacocinétiques, de toxicité et d'efficacité), les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les souris sont hébergées dans un milieu enrichi et amélioré. Des analgésiques peuvent être administrés aux souris. L’utilisation d’une grille unique de score est mise en place ainsi que l'application de points limites stricts et spécifiques au projet. La grille de score est décrite dans chacune des procédures L’aspect général des animaux ainsi que le suivi pondéral seront transcrits dans la grille de score. Le bien-être des animaux est analysé et est pris en compte tout au long des protocoles expérimentaux. Des points limites pour lesquels les animaux seront mise à mort ont été défini. Il n'y a pas d'échanges d'animaux entre les deux établissements utilisateurs, pas de transports d'animaux entre ces deux sites.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal qui permet d’élargir nos connaissances sur le développement, la physiopathologie de différentes pathologies mais aussi tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. Son utilisation permet de connaitre la physiologie in vivo des différentes pathologies chez des modèles de souris. Le choix de l'espèce se porte sur le fait que cette espèce est un modèle de mammifère dont le profil pharmacologique permet une utilisation préclinique. Jeunes adultes entre 5 à 8 semaines pouvant finir leur croissance. Les animaux plus âgés ne sont pas souhaités dans la mesure où la présence de graisse peut entrainer une modification de la biodisponibilité de la molécule.
Développement d’antiviraux virucides à large spectre non toxiques
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Perte de poids, hypothermie, difficultés respiratoires : réunir ces critères déclenche la mise à mort immédiate. 3 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dont 1 800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Toutes sont infectées par instillation intranasale sous anesthésie, par le virus respiratoire syncytial ou la grippe A, puis manipulées chaque jour pour la pesée et la prise de température, traitées par gavage, injection ou instillation, 2 880 passant deux séances d'imagerie. Le porteur reconnaît que l'infection peut aller jusqu'à une atteinte clinique sévère, voire la mort, et présente ces antiviraux comme une "avancée importante en médecine" dont le passage au développement préclinique et clinique reste entièrement à venir.
Objectifs
Ce projet a pour objectif principal l’optimisation et l’évaluation approfondie d’une nouvelle famille d’antiviraux développée conjointement par les différents laboratoires co-porteurs. Cette nouvelle classe d'antiviraux utilise des molécules organiques (bêta-cyclodextrines) mimant les récepteurs cellulaires pour se lier aux virus et détruire physiquement leur structure de façon irréversible et non toxique. Elle constitue donc une forme de nanoparticules antivirales. S’appuyant sur une expertise complémentaire en virologie et en science des matériaux, ces trois équipes ont mis en évidence le fort potentiel thérapeutique de ces molécules. Néanmoins, plusieurs verrous scientifiques majeurs subsistent, que ce projet vise à lever afin d’accélérer le développement de cette famille d’antiviraux. En identifiant des molécules plus puissantes dotées d’une activité à large spectre, nous ambitionnons de renforcer l’efficacité in vivo contre le virus respiratoire syncytial, le virus influenza A et d’autres virus humains d’importance majeure. Cet objectif est particulièrement crucial pour la prise en charge des virus respiratoires circulants chez les populations à risque et constitue un enjeu clé de la préparation pour faire face aux pandémies. Nous étudierons également la possibilité de modifications chimiques visant à conférer une biodisponibilité orale, un critère déterminant pour faciliter l’administration, améliorer l’observance thérapeutique et soutenir de futures études cliniques. Une autre question centrale portera sur la capacité de l’inactivation virale induite par ces molécules à générer des débris viraux immunogènes, susceptibles de stimuler une réponse immunitaire protectrice et une mémoire immunologique. L’objectif est ainsi de développer non seulement un antiviral hautement efficace, mais également une molécule capable de conférer une protection durable contre l’infection. Les résultats attendus permettront d’optimiser davantage la structure de ces antiviraux et de les rapprocher d’un développement clinique, tout en contribuant à l’émergence de nouveaux outils et méthodologies de recherche. Les travaux portant sur les stratégies de conjugaison pour une administration orale et sur la détection in vivo de ces macromolécules complexes apporteront des connaissances essentielles à la synthèse et à la caractérisation de nouveaux matériaux bioactifs ciblant les virus respiratoires.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait constituer une avancée importante en médecine en validant un concept de traitement capable de convertir une simple inactivation virale en une réponse immunitaire protectrice, robuste et durable. L’optimisation de la biodisponibilité orale des composés lèvera un verrou technologique déterminant, ouvrant la voie à leur transfert vers le développement préclinique et clinique.
Procédures
3600 animaux concernés pour l’ensemble des interventions, chaque type d’intervention impliquant une proportion variable : Anesthésie et instillation intranasale : chaque animal recevra une anesthésie chimique unique d’environ 20 minutes (par injection, 30s), nécessaire pour l’administration intranasale. Cette intervention sera réalisée sur tous les 3600 animaux. Manipulation et contention pour le suivi clinique : les animaux vigiles seront manipulés quotidiennement pour la mesure du poids et de la température corporelle, chaque opération durant environ 1 minute par animal. Cette mesure sera effectuée sur l’ensemble des 3600 souris. Traitement des animaux : les souris traitées recevront les solutions de composés par gavage, instillation intra-nasale ou injection, durée de l’administration inférieure à 1 minute. Imagerie: effectuée sous anesthésie gazeuse, à deux reprises espacées de quatre jours, chaque séance (anesthésie incluse) durant moins de 5 minutes. Cette intervention sera réalisée sur 2880 animaux. Imagerie: Les souris recevront une injection sous anesthésie gazeuse (durée de l’injection inférieure à 30 secondes). Prélèvement sanguin : deux échantillons seront prélevés sur chaque animal anesthésié, (1 minute). Cette intervention concernera 10% des effectifs soit 360 animaux. Mesure des paramètres respiratoires : réalisée à deux reprises au cours du protocole sur les animaux vigiles, chaque mesure durant 2 à 3 minutes. Cette intervention sera appliquée à tous les animaux. Ces interventions ont été planifiées pour limiter la durée de manipulation et le stress des animaux tout en garantissant la collecte de données fiables sur l’ensemble du groupe. Génotypage : une petite partie des souris pourra être l’objet d’un prélèvement de 1mm de queue.
Impact sur les animaux
Le protocole implique une manipulation quotidienne des animaux afin d’une part de leur administrer les composés antiviraux, et d’autre part pour évaluer différentes constantes physiologiques (poids, température, etc.). Il faut mentionner que les molécules testées ont une base organique de type sucre et sont très bien tolérées par les animaux. Ces manipulations répétées sont susceptibles d’induire un stress modéré chez les souris, notamment lorsque les traitements nécessitent une injection (IP ou IV). L’infection virale nécessite une anesthésie générale de courte durée (< 1 heure), réalisée par injection parentérale de l’anesthésique, pouvant entraîner une douleur transitoire liée à la piqûre. Une légère perte de poids est parfois observée le lendemain de l’anesthésie. L’infection virale induit une pathologie dont la sévérité dépend du virus et de la dose d’inoculum administrée, pouvant aller jusqu’à une atteinte clinique sévère, voire une mortalité. Une perte de poids et une hypothermie sont notamment observées au cours des infection par le virus influenza. Une gêne respiratoire, objectivée par des mesures de pléthysmographie, est détectable entre J4 et J10 post-infection. Enfin, les sessions de pléthysmographie, bien que de courte durée (environ 3 minutes), peuvent également générer un stress lié à l’isolement temporaire de l’animal durant la phase de monitoring. Enfin, l’éventuel génotypage des souris IFNAR-/- va induire une nuisance liée au prélèvement de 1mm de queue, correspondant principalement à une douleur transitoire au moment du geste, associée à un stress de courte durée lié à la contention et à la manipulation, ainsi qu’à un inconfort local temporaire au site de prélèvement.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d’organes.
Remplacement
Notre thématique de recherche ne peut être mise en œuvre sans recours à des modèles animaux. En effet, l’évaluation de l’efficacité de nos nanoparticules antivirales repose sur l’étude d'interactions biologiques complexes s’exerçant à l’échelle de l’organisme entier. L’établissement d’une réponse immunitaire protectrice, incluant la capture des débris viraux immunogènes et le recrutement de cellules immunocompétentes vers les sites d’infection, nécessite une coordination systémique entre les systèmes lymphatique, vasculaire et les tissus cibles. De plus, les enjeux de biodisponibilité et de pharmacocinétique liés à l’administration orale impliquent des processus de barrières biologiques et de métabolisme qu’aucune approche in vitro ou ex vivo ne peut actuellement reproduire fidèlement. L’étude intégrée de ces mécanismes d'action et de la mémoire immunologique induite nécessite donc impérativement le recours à des modèles animaux diversifiés, conformément aux principes éthiques des 3R.
Réduction
Notre stratégie de réduction est basée sur l’emploi de tests statistiques nous permettant de valider nos hypothèses scientifiques sur la base de résultats obtenus avec le nombre minimal d’animaux en termes d’effectifs. Afin de garantir la robustesse des résultats tout en respectant le principe de Réduction (3R), les effectifs ont été calculés pour détecter une taille d’effet importante de d = 1,4 (différence de Cohen) avec une puissance statistique de 80 % (risque alpha = 5 %). Ce calcul de la taille d’effet s’appuie sur nos données préliminaires ainsi que sur la pertinence biologique attendue. Il vise à identifier uniquement des variations d’une amplitude significative afin d’écarter les différences minimes et dénuées d'intérêt clinique. En fixant l’effectif à n = 10 par groupe, et en prenant en compte ces paramètres statistiques, l'étude devient calibrée pour détecter des tailles d'effet importantes et garantit donc la robustesse et la reproductibilité des conclusions biologiques. Ces paramètres permettent de mettre en évidence des différences biologiquement pertinentes, même en présence d'une variabilité interindividuelle modérée au sein de groupes de 10 animaux. Les analyses statistiques seront réalisées en fonction de la nature des données (sécrétion de cytokines, détresse respiratoire, réplication virale…), avec des tests t de Student ou des tests non paramétriques (Mann-Whitney) pour les comparaisons simples, et des modèles d’ANOVA à deux facteurs pour les analyses intégrant plusieurs facteurs expérimentaux (nanoparticules et voies d’administration). Des corrections pour comparaisons multiples (Benjamini-Hochberg) pourront être appliquées. La taille d’échantillon est définie à partir de la réplication virale qui correspond à la variable biologique principale de réponse, correspondant au critère quantitatif retenu pour évaluer l’effet des conditions expérimentales. En complément, des analyses multivariées de type analyse en composantes principales (ACP) seront réalisées afin de visualiser les structures globales des données et d’identifier d’éventuels regroupements ou tendances au sein des différents paramètres expérimentaux.
Raffinement
Le bien-être animal est un axe central de notre démarche, visant à minimiser le stress et la souffrance tout au long du challenge infectieux. Les souris sont hébergées par groupes de cinq au sein de cages à couvercle filtrant, dans un environnement climatisé avec accès ad libitum à l’eau et à une alimentation standard. Afin de favoriser les comportements naturels et réduire l'anxiété, l'environnement est enrichi par des carrés de coton (type Neslets/Sizzle-nest), des bûchettes de bois à ronger et des abris en carton. Une surveillance quotidienne rigoureuse permet de déceler tout signe clinique précurseur (perte de poids, hypothermie, difficulté respiratoires, diarrhée, poil hérissé, léthargie, yeux clos ou dos courbé). Pour prévenir toute souffrance inutile, des points limites précis ont été établis : tout animal répondant à l'ensemble des critères prédéfinis sera immédiatement euthanasié. Nous veillons à réduire l'impact des manipulations par des techniques de précision : les prélèvements sanguins sont réalisés avec des micro-aiguilles pour minimiser les volumes prélevés et les traumatismes tissulaires. De même, les administrations de composés antiviraux sont effectuées par injections lentes, garantissant une meilleure tolérance et réduisant la variabilité induite par le stress. Bien que la pléthysmographie impose un bref isolement (2 à 3 minutes), la répétition de la procédure permet une habituation rapide des animaux, confirmée par une diminution du temps d'acquisition dès la deuxième mesure. Lors des génotypages des souris IFNAR-/- nécessitant un prélèvement de queue, une application locale de pommade anesthésiante sera réalisée. De plus, une hémostase par pression manuelle sera faite immédiatement après prélèvement et jusqu'à l'arrêt du saignement. Enfin, une surveillance post-prélèvement sera effectuée jusqu’à 24 heures pour s'assurer de la parfaite cicatrisation du site de prélèvement.
Choix des espèces
Le choix de la souris est guidé par la possibilité de disposer de souris génétiquement modifiées (NF-kB luciférase, IFNAR KO) et donc de pouvoir suivre des processus dynamiques sur les mêmes animaux sans avoir à les euthanasier pour réaliser des mesures. De plus, la disponibilité de certaines souris immunodéficientes nous permet d’élargir le panel de virus ciblés (hPIV3). De plus, la souris constitue un modèle pertinent pour étudier les mécanismes pathologiques induits par les infections virales respiratoires ainsi que la mise en place de réponses humorales et cellulaires adaptatives. Souris âgées de 8 semaines car le système immunitaire est mature.
Potentiel d’antidépresseurs à action rapide de nouvelles molécules de synthèse
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Deux chirurgies sous anesthésie générale, la seconde onze jours après la première, puis des séances d'observation comportementale : 376 rats vont être utilisés pour tester douze molécules antidépressives de synthèse, tous tués à l'issue pour que leurs cerveaux soient prélevés. 328 d'entre eux sont déclarés en gravité sévère, 48 en gravité modérée. Le porteur écrit pourtant qu'"aucune nuisance n'a été rapportée" avec la technique d'administration continue, et que les rats opérés "ne présentent aucune altération comportementale caractéristique d'un stress, d'une souffrance ou d'un inconfort particulier". Les deux tests comportementaux sur lesquels repose tout le projet ne sont jamais nommés.
Objectifs
Les molécules actuellement disponibles pour le traitement de la dépression et des troubles de l'humeur sont loin d'être optimales. En effet, seuls 1/3 des patients répondent pleinement aux médicaments, et même dans ce cas, on n'observe une amélioration thérapeutique qu'après plusieurs semaines d'administration continue, un problème qui peut s'avérer crucial, notamment dans les cas de crise suicidaire. Sur la base de travaux menés durant les 20 dernières années, nous avons récemment proposé la création d’une nouvelle classe de molécules antidépressives, susceptibles de présenter à la fois un meilleur taux de réponse et une rapidité d’action 5 à 10 fois plus importante que les molécules classiques. Grâce à une collaboration avec un laboratoire de chimie organique nous avons mis en place un processus de synthèse chimique et obtenu un petit nombre de molécules correspondant au design théorique que nous avions proposé. Les tests de validation in vitro ont montré que ces composés correspondaient au profil ciblé. Suite à ces travaux préliminaires, nous avons lancé un programme de synthèse de molécules plus ambitieux en termes de nombre (12 composés sont planifiés), et plus précis encore dans le ciblage des profils pharmacologiques. Le présent projet vise à valider le potentiel d’antidépresseur rapides de ces nouvelles molécules chez le rongeur. Pour cela, nous confirmerons la non-toxicité de ces médicaments potentiels en suivant en détail l’état de santé d’une petite cohorte d’animaux, puis nous procèderons à deux tests comportementaux. Le premier de ces tests permet de détecter si un composé donné a un potentiel d’antidépresseur, mais il ne donne pas de renseignement sur la vitesse d’apparition d’un éventuel effet. Le second est précisément connu et validé pour permettre de mesurer cette vitesse.
Bénéfices attendus
Le programme auquel se rattachent ces expériences permet d’espérer qu’au moins l’une des molécules obtenues satisfasse aux conditions requises pour entrer dans un programme de développement en phase d’essais cliniques. En cas de réussite, il deviendrait alors possible à terme de proposer la mise sur le marché d’une nouvelle classe de médicaments antidépresseurs, capables d’agir plus rapidement que les molécules actuelles.
Procédures
Pour l’étude-pilote de validation, les animaux seront soumis à une chirurgie de très courte durée (3-5 min), permettant d’administrer le composé en continu. Le premier test comportemental se fait sur deux sessions séparées de 24 h. La première session dure 15 min, il s’agit d’une phase d’habituation. Le lendemain, le composé test est administré en aigu, puis l’animal est replacé dans le même test comportemental pour 5 min. Dans le second test comportemental, les animaux seront soumis à deux chirurgies, sous anesthésie générale: la première nécessaire au test comportemental en lui-même (environ 30 min par animal), la seconde 11 jours plus tard pour permettre d’administrer nos composés en continu, comme décrit ci-dessus. Puis, 3 et 14 jours après cette seconde chirurgie, les animaux seront soumis à deux séances d’observation comportementale, d’une durée de 10 min chacune. Cela revient donc à 4 interventions sur la durée de vie à la mort de l'animal pour ce test.
Impact sur les animaux
Nous surveillerons tout particulièrement les risques d’apparition d’effets secondaires indésirables dus à l’utilisation de nos nouvelles molécules sur les animaux lors de l’étude-pilote. Même si, sur la base de leurs profils pharmacologiques, il semble peu probable que de tels phénomènes se produisent, les fonctions vitales (respiration, rythme cardiaque, réflexes entre autres) seront surveillées de près durant tout le temps d’administration. Cette administration en continu des composés nécessite une chirurgie. Il s’agit d’un geste extrêmement minime effectué sous la peau du dos, qui ne nécessite d’anesthésier l’animal que durant quelques minutes : aucune nuisance n’a été rapportée suite à l’utilisation de cette technique. Le second test repose sur un autre type de chirurgie avant de passer aux expériences comportementales proprement dites. Cette dernière chirurgie provoque des douleurs modérées ; cependant, il a été montré que les rats opérés ne présentent aucune altération comportementale caractéristique d’un stress, d’une souffrance ou d’un inconfort particulier. La surveillance des animaux sera donc celle qui est classiquement mise en œuvre après une chirurgie, les risques de nuisance étant de type post-opératoire : infections, douleurs inflammatoires, réouverture de plaie.
Devenir
A l'issue de l'étude-pilote et des deux tests, tous les animaux seront mis à mort : il sera nécessaire de prélever les cerveaux pour analyser le tissu cérébral en post-mortem.
Remplacement
Dans ce projet, nous souhaitons valider, à l'aide de deux tests comportementaux, le potentiel de nos molécules comme nouveaux antidépresseurs, à action rapide. Par définition, un modèle comportemental ne peut pas s'effectuer autrement que sur le système intégré que représente un animal entier, et vivant.
Réduction
Les expériences de pharmacologie in vitro que nous avons menées en amont de ce projet nos ont permis d’éliminer 15 molécules, qui ne correspondaient pas au profil visé. Ces composés ne seront donc évidemment pas testés in vivo. Seules 12 molécules ont répondu à nos critères, elles seront synthétisées dans les quantités nécessaires pour le présent programme in vivo durant les 5 années prévues pour sa réalisation. Nous utiliserons le nombre minimal d'animaux permettant l'obtention de résultats statistiquement fiables et robustes. Pour cela, nous avons procédé à l'estimation du minimum requis pour chaque lot expérimental, en nous basant sur les acquis de travaux précédents, et sur des calculs statistiques. L’étude-pilote de validation nécessitera d’utiliser 4 animaux par cohorte ; pour ce qui concerne les tests comportementaux, nous avons déterminé qu'il sera nécessaire d'utiliser un effectif compris entre 8 et 10 animaux par lot en fonction de la variabilité propre à l’expérimentation. Nous avons ainsi établi un grand total de 376 rats nécessaires pour réaliser l’ensemble du projet.
Raffinement
En ce qui concerne le suivi des animaux, notre priorité sera de viser à favoriser au maximum leur bien être durant la totalité de l’étude. Un minimum de 14 jours d’adaptation sera appliquée à chaque animal dès leur arrivée à l‘animalerie, où ils seront placés en cages collectives par groupe de 2 individus. Lors de l’étude-pilote, leur état de santé sera examiné en profondeur de manière quotidienne. Si un effet toxique est suspecté suite à l’administration d’une des molécules prévues dans le programme, les expériences seront immédiatement arrêtées, et le produit définitivement écarté de la suite du projet. De même, une pesée et une observation quotidienne seront réalisées durant les périodes post- opératoires afin de s’assurer du bon état des plaies chirurgicales, des sutures et du bien-être général. Pour chaque intervention chirurgicale, les animaux recevront un anti inflammatoire afin de lutter contre l’apparition de toute douleur éventuelle. En outre, nous utiliserons des anesthésiants locaux autour des zones opérées. Des points limites définis préalablement permettront de s’assurer que tous les animaux maintenus dans les procédures expérimentales sont dans les conditions optimales pour limiter stress, souffrance et inconfort. Si l’un ou plusieurs de ces points limites est atteint, des procédures de soin seront mises en place suivant un arbre décisionnel prédéfini, impliquant les expérimentateurs et le vétérinaire de la structure.
Choix des espèces
Le second test, qui nous permet d'évaluer la cinétique d'effet d'un traitement antidépresseur potentiel, a été validé chez le rat et n’est pas transposable à la souris. Les animaux seront utilisés au stade de jeune adulte (entre 7 et 9 semaines), qui correspond à ce qui est classiquement choisi pour le type d’expériences que nous réalisons.
THERMOCREATINE (Modification)
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
Deux à trois semaines à 4-6 °C, vingt-quatre heures sur vingt-quatre, en cage individuelle, avec une prise de température rectale quotidienne : 610 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Pour 94 d'entre eux, le froid arrive après huit semaines passées à 28 °C, transition que le porteur décrit comme "un stress plus important", avec sortie du protocole si la température corporelle reste durablement sous 33,5 °C. L'objectif déclaré est de comprendre comment le tissu adipeux brun produit de la chaleur, piste explorée contre l'obésité. Le rat a été préféré à la souris parce que sa taille fournit davantage de tissu adipeux brun par animal, ce qui permet d'en utiliser moins pour une même expérience.
Objectifs
La progression de l'obésité dans le monde est une préoccupation cruciale de la recherche médicale. L’une des stratégies envisagées pour lutter contre ce fléau consisterait à stimuler la thermogenèse, en particulier par le tissu adipeux brun et beige, qui ont la capacité de produire une grande quantité de chaleur à partir de la graisse qu’ils brûlent. La caractérisation des mécanismes de thermogenèse constitue donc une piste de recherche prometteuse pour la prévention et le traitement des maladies métaboliques. Le projet présenté ici permettra d'identifier précisément le rôle du système Créatine-Kinase / Phosphocréatine, dans le processus de production de chaleur par les tissus adipeux brun / beige et de déterminer si ce système pourrait être une cible thérapeutique potentielle dans la lutte contre l’obésité.
Bénéfices attendus
Le système Créatine-Kinase / Phosphocréatine (système CK / PCr) est connu depuis des années pour jouer un rôle majeur dans le transfert d’énergie (réserve et navette énergétique) au sein des cellules musculaires et nerveuses. Des travaux récents montrent une nouvelle fonction de ce système dans la thermorégulation par le tissu adipeux, et également dans la prévention des maladies métaboliques, Cependant, les mécanismes impliqués restent à être élucidés. Notre projet vise à caractériser pour la première fois le rôle du système CK / PCr dans la bioénergétique des tissus adipeux et de déterminer par quel(s) mécanisme(s) et à quelle ampleur, le système CK / PCr participe à la production de chaleur par les tissus adipeux brun/beige. Cette étude pourrait apporter une connaissance primordiale concernant la bioénergétique des tissus adipeux et conduire à de nouvelles approches thérapeutiques dans la prévention et le traitement des maladies métaboliques associées à l’obésité.
Procédures
Les 3 groupes d’animaux seront exposés aux différentes températures (respectivement à 4-6°C, 22-23°C ou 28°), 24h/24, 7J/7 durant 14 ou 21 jours (selon le protocole choisi lors de la série préliminaire), en armoire ventilée et en cage individuelle. La prise de température corporelle (sonde rectale) sera prise quotidiennement durant toute la période de stabulation (phase d’habituation de 5 jours avant le début de l’exposition aux différentes températures et pendant toute la durée de l’exposition jusqu’au jour de l’euthanasie de l’animal, soit durant 19 ou 26 jours (selon le protocole choisi lors de la série préliminaire). La prise de la température corporelle aura lieu 1 fois par jour pour tous les groupes, à l’exception des 5 premiers jours concernant les animaux du groupe exposé au froid (4-6°C), pour lesquels la température corporelle sera prise 2 fois par jour (début de matinée vers 9h et milieu d’après-midi vers 15h). Cette prise de température, qui nécessite une légère contention, ne dure pas plus d’une minute.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les rats seront hébergés en cage individuelle afin de pouvoir suivre précisément leur prise alimentaire. L'isolement constituera donc un inconfort pour l'ensemble des animaux. La seconde source d'inconfort sera liée à l'exposition au froid (4-6°C), 24h/24, durant 2-3 semaines. Elle concerne 204 animaux. Les études utilisant de tels protocoles d'exposition au froid, ne décrivent ni de chute drastique de la température corporelle, ni d'inconfort majeur. Après quelques jours d'acclimatation, durant lesquels les animaux peuvent frissonner et présenter une légère baisse de leur température corporelle, les animaux retrouvent une activité normale. L'inconfort lié à l'exposition au froid est d'autant moindre que, la température de thermoneutralité des rats étant autour de 28°C, lorsque ces derniers sont hébergés à 22°C, ils présentent déjà une certaine adaptation (présence marquée de tissu adipeux brun interscapulaire). Début de modification [Le protocole pour le lot supplémentaire (exposition des animaux à la neutralité thermique (28°C) pendant 8 semaines avant leur exposition au froid (4-6°C) constituera un stress plus important que le passage de 22°C au froid (94 animaux sont concernés), mais au vu des premiers résultats obtenus avec le protocole initial d'exposition au froid, cela semble nécessaire pour favoriser le brunissement du tissu adipeux blanc inguinal (en plus de l'induction du TAB interscapulaire). Les études utilisant ce type de protocole ne décrivent aucune nuisance majeure sur l’animal. On a pu également observer durant notre protocole initial d’exposition au froid, qu'aucun animal ne s’est retrouvé en difficulté et qu'aucune mesure corrective n'a été nécessaire.] Fin de modification.
Devenir
A l'issue de l'unique procédure 1, tous les animaux seront euthanasiés. Ceux qui auraient éventuellement été exclus de la procédure seront également euthanasiés dès la sortie du protocole. Des tissus pourront éventuellement être prélevés après euthanasie et congelés en vue d’une utilisation ultérieure en TP pour des dosages biochimiques.
Remplacement
Au vu de sa complexité, le phénomène de brunissement induit naturellement en réponse à l'exposition au froid, ne peut pas être entièrement reproduit in vitro. En effet, les tissus adipeux sont constitués de cellules de différents types qui interagissent entre elles et il est difficile de reproduire cette hétérogénéité et ce dialogue in vitro. De plus, l’étude des modifications adaptatives des tissus adipeux en réponse au froid nécessite une approche intégrée à l’échelle de l’organisme, qui préserve la communication nerveuse et hormonale, entre les différents types de tissus adipeux d’une part, et entre ces tissus et les organes impliqués dans le métabolisme, comme le foie et le pancréas, d’autre part. L'exposition au froid de l'animal, constitue donc une approche indispensable à l'étude du phénomène de brunissement et aucun modèle alternatif ne peut remplacer le modèle animal. Cependant, en parallèle de ces travaux à l'échelle de l'animal, l'utilisation de modèles cellulaires issus de tissus adipeux humains permettra de voir si certains mécanismes observés sur les adipocytes de rat acclimatés au froid sont retrouvés/ transposables chez l'Homme.
Réduction
Le choix du modèle animal, le rat plutôt que la souris, permet de limiter le nombre d'animaux à utiliser. En effet, les tissus adipeux brun et beige sont des tissus peu abondants et certains des protocoles de l’étude nécessiteraient, chez la souris, de grouper les TAB provenant de 3 à 4 animaux pour une seule expérimentation. Chez le rat, 2 animaux seulement devraient suffire pour obtenir la même quantité d’informations. Par ailleurs, le choix d'une exposition prolongée au froid (2-3 semaines) afin d'obtenir une adaptation maximale de l’animal, permettra d’atteindre les objectifs de l’étude tout en limitant le nombre d’animaux nécessaire. Grâce à l'utilisation d'appareillage de précision, une précision maximale des mesures pourra être obtenue avec très peu de matériel biologique. Pour finir, le niveau de dispersion des données attendues a été pris en compte, afin de calculer le nombre d'animaux au plus juste sans risquer pour autant de compromettre l'interprétation statistique des résultats. De plus, si les données issues de la série préliminaire pour la condition choisie sont exploitables, elles pourront être intégrées à l'étude principale, ce qui réduira le nombre total d'animaux de 8 individus.
Raffinement
Un suivi attentif des animaux, par un personnel formé, sera opéré chaque jour durant la période de stabulation avant et pendant l'exposition aux températures étudiées, afin d'évaluer l'inconfort subi (isolement, température ambiante) et leurs éventuelles conséquences sur le bien-être animal. Début de modification [Des critères comportementaux visant à évaluer l'état général de l'animal et la mesure de variables physiologiques concrètes (masse corporelle, température rectale) de façon journalière et la prise de nourriture (2 fois par semaine) ont été mis en place et seront également appliqués y compris dans ce nouveau protocole. Les animaux mis en cage individuelle, pourront se voir et se sentir dans les armoires ventilées. Afin de réduire le stress, l'habituation aux conditions de stabulation en armoire ventilée et en cage individuelle se fera en 2 temps. Durant notre protocole initial d’exposition au froid, aucun animal ne s’est retrouvé en difficulté et aucune mesure corrective n'a été nécessaire. Dans ce nouveau protocole, où la transition au froid sera plus marquée, la surveillance rapprochée (2 fois par jour) des animaux sera maintenue. Les points limites déjà définis permettront de mener des actions visant à réduire l'inconfort, pouvant aller jusqu'à la sortie du protocole si les signes de souffrance dépassent certaines limites fixées ou si la température corporelle chute durablement en dessous de 33,5°C.] Fin de modification. En plus des expériences prévues dans le projet ANR (sur les tissus adipeux), il est prévu de prélever d'autres organes (foie, coeur, cerveau, muscle, vaisseaux sanguins) afin de recueillir un maximum de données sur les effets du froid et sur l'impact de la température de stabulation (22-23°C versus 28°C neutralité thermique).
Choix des espèces
La plupart des études sur les mécanismes de thermorégulation ont été menées sur les modèles rat ou souris. Plus récemment, le cycle futile de la créatine a été décrit chez la souris. Le choix de focaliser l'étude sur le modèle rat a été motivé principalement par le fait que la taille de l'animal étant supérieure, la quantité de tissu adipeux brun est considérablement plus importante et que par conséquent le nombre d'animaux nécessaire pour une même expérience pourra être réduit par rapport au modèle souris. Par ailleurs, le rat est considéré comme étant un modèle plus proche de l'humain, ce modèle est couramment utilisé et de nombreuses données existent. Les animaux mâles et femelles seront utilisés à l'âge jeune adulte, environ 8-10 semaines. Début de modification [afin de limiter le développement du TAB avant l'exposition au froid, les animaux seront placés à la neutralité thermique dès l'âge de 4 semainesleur réception Chez l'adulte tous les mécanismes de thermorégulation sont établis et l'influence hormonale est stabilisée.
Corticogénèse cérébrale du primate
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Réutilisées d'une gestation à l'autre, 42 femelles macaques de cette colonie enchaînent jusqu'à six césariennes chacune, à raison d'une tous les onze à quinze mois. 59 macaques à longue queue sont comptabilisés au total, quinze opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, 44 soumis à des procédures d'un niveau de souffrance modéré, deux rendus à l'élevage. Les fœtus, 75 en tout, sont tués pour prélever leur cerveau et étudier la formation du cortex. Ceux de moins de 105 jours de gestation ne sont pas comptés dans les effectifs du projet, ce que le porteur justifie par leur utilisation avant le dernier tiers du développement.
Objectifs
Nous avons pour but de caractériser les mécanismes biologiques qui contrôlent la mise en place les caractéristiques structurelles uniques du cerveau humain. La compréhension de ces processus biologiques fondamentaux est un pré-requis pour progresser dans l'étiologie des pathologies neuro-développementales qui sont à l'origine de troubles invalidants (épilepsie, autisme, schizophrénie, etc). Le matériel histologique humain prénatal est rare et la préservation des tissus souvent non optimale, rendant l'interprétation des résultats difficile. Le singe représente un maillon préclinique incontournable. Des travaux récents ont en effet montré que certains mécanismes gouvernant le développement du cerveau sont communs au singe et à l’homme.
Bénéfices attendus
Le bénéfice est de permettre d’avancer dans la compréhension du développement du cortex cérébral de l’homme. Notre projet constitue une étape incontournable pour faire avancer la recherche clinique sur les pathologies neurodéveloppementales chez l’homme.
Procédures
Les femelles auront plusieurs anesthésies générales pour les échographies et les césariennes. Les femelles participeront à un maximum de 6 césariennes selon l’avis de notre vétérinaire référente. En moyenne une femelle subit une césarienne tous les 11 à 15 mois
Impact sur les animaux
L'anesthésie générale provoquera en elle-même un inconfort au réveil avec d'éventuelles nausées. La césarienne pourra susciter des douleurs post-opératoires pendant le temps de la cicatrisation, normalement maitrisé par l'administration d'analgésique et un suivi rapproché par les expérimentateurs et les zootechniciens.
Devenir
Nous avons une colonie de reproduction de Macaques cynomolgus composée d’environ 44 femelles pubères âgées de 4 à 8 ans et 4 mâles qui nous permettront d'obtenir 75 embryons (mis à mort pour recuperer leur cerveau), 45 (9/an) utilisés pour l'étude des précurseurs de la corticogénèse à différents stades embryonnaires (de E35 à E120) et 30 (6/an) utilisés pour des analyses génétiques (sc RNA-Seq, miRNA-Seq). A la fin de la procédure, les animaux pourront être réutilisés pour d’autres procédures ou placés dans des structures d’accueil appropriées.
Remplacement
Le macaque cynomolgus possède un cortex cérébral gyrencéphalique dont l’organisation anatomique et l’ontogénèse présentent des similitudes importantes avec le cortex humain, contrairement à d’autres espèces de primates (marmoset, microcèbe). Le génome du macaque est bien décrit et des atlas neuroanatomiques et d’expression de gènes sont disponibles pour cette espèce. La corticogénèse du macaque est bien caractérisée et a des caractéristiques communes avec le développement du cortex cérébral humain, notamment en ce qui concerne l’organisation des zones germinales. Le macaque constitue donc un modèle de prédilection pour étudier les mécanismes de spécification des aires corticales et les mécanismes développementaux responsables de la mise en place de la connectivité des aires corticales.
Réduction
Les femelles pourront être utilisées pour des gestations successives sauf avis contraire du vétérinaire. En moyenne une femelle subit une césarienne tous les 11 à 15 mois (estimations statistiques réalisées sur une vingtaine d'années). Nous utilisons des tranches organotypiques de cerveaux embryonnaires que nous maintenons en culture pendant 8 à 15 jours pour des observations de la prolifération et de la migration en cinétique videomicroscopique. Afin de minimiser le nombre d’embryons nous avons fait réaliser sur mesure une platine d'observation du microscope biphotonique nous permettant de doubler le nombre de tranches organotypiques observées (48 tranches) ce qui permet de réduire le nombre d’embryons utilisés d'un tiers. Nous menons en parallèle des recherches sur les capacités de différenciation neuronale des cellules souches pluripotentes (cellules souches embryonnaires et cellules souches pluripotentes induites) de primate ce qui permet d'étudier certains aspects de la différentiation des neurones du cortex de primate, ce qui permet de ne pas avoir recours à des tranches organotypiques issues de fœtus.
Raffinement
Nous entrainons les animaux à coopérer (conditionnement par renforcement positif) pour certaines procédures de manière à diminuer le stress de l’animal (déplacement en cage de transfert pour mise au mâle ou changement de volière) et pour des actes non invasifs et non douloureux comme les échographies de contrôle de manière à éviter le recours à l’anesthésie. Actuellement un tiers des femelles sont suffisamment conditionnées pour réaliser cet acte en vigile. Les femelles subissent une anesthesie générale pour la réalisation des césariennes et une fiche de suivi après la chirurgie nous permet d’évaluer en fonction de critères spécifiques les signes indicateurs de gêne ou de souffrance et d'adapter le traitement antalgique si nécessaire.
Choix des espèces
Nos travaux sur la corticogénèse chez le primate non-humains nécessite un accès à des embryons d'âge précis. Les techniques de substitution (organoïdes cérébraux) ne peuvent remplacer le tissu vivant pour l’analyse des mécanismes cellulaires et moléculaires qui opèrent in vivo. En effet, les organoïdes obtenus in vitro permettent d’obtenir un échantillon de tissu cérébral sans identité régionale particulière, déconnecté de son environnement physiologique (par ex structures sous corticales, tronc cérébral) et maintenu dans des conditions artificielles qui induisent un stress cellulaire important. Ceci conduit à des anomalies de l’identité des progéniteurs corticaux et de leur différenciation dans les organoïdes. De plus, l’expression des gènes dans les organoïdes cérébraux varie en fonction de la composition du milieu et des conditions de culture, conduisant à des résultats qui ne reflètent pas la situation in vivo. Animaux matures: Femelles de plus de 4 ans et mâles de plus de 5 ans. Les mâles sont utilisés uniquement comme reproducteurs lors des reproductions naturelles et ils ne sont pas comptabilisés dans les animaux utilisés. Fœtus âgés de 35 à 130 jours embryonnaires (durée gestation 165 jours). Comme indiqué en 3.4.10, les fœtus âgés de 105 jours et moins (dans les deux premiers tiers de gestation) ne sont pas comptabilisés dans le nombre d'animaux car ils sont utilisés avant le dernier tiers de leur développement. Nous projetons d’étudier 15 fœtus âgés de plus de 105 jours (dans le dernier tiers de gestation) pour les analyses moléculaires in situ.
Exploration fonctionnelle d’un nouveau composé antalgique sur les douleurs neuropathiques périphériques chimio-induites
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Pour tester un composé antalgique contre les douleurs provoquées par la chimiothérapie, 1 380 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Quatre injections leur induisent une neuropathie qui produit pendant une trentaine de jours une sensibilité accrue au toucher et au froid ainsi que des douleurs spontanées, puis elles reçoivent de deux à seize injections du composé à évaluer. Les seuils sont mesurés par le test de Von Frey, par une plaque refroidie à 10 °C et par un enregistrement automatisé du comportement, avant une chirurgie terminale sous anesthésie. Le porteur qualifie ces trois tests de "courts et non invasifs", alors que la totalité des 1 380 souris est déclarée en gravité sévère et que la douleur induite est l'objet même du protocole.
Objectifs
La douleur chronique est un enjeu majeur de santé publique : près d'une personne sur cinq dans le monde en souffre, et les traitements disponibles restent souvent insuffisants ou associés à des effets secondaires importants. Nous cherchons à pallier ce manque en développant de nouveaux médicaments plus efficaces et mieux tolérés. Notre composé est un candidat prometteur pour le traitement de la douleur, qui a déjà montré des résultats encourageants dans des études préliminaires. Avant de pouvoir le proposer aux patients et lancer des essais cliniques chez l'Homme, la réglementation nous impose de démontrer son efficacité et son innocuité dans des modèles animaux. C'est l'objet de ce projet.
Bénéfices attendus
À court terme (1-2 ans), ce projet permettra d'identifier un composé potentiellement efficace contre les neuropathies périphériques chimio-induites, pour lesquelles aucun traitement satisfaisant n'existe actuellement. Les données précliniques générées constitueront la base scientifique nécessaire pour une future demande d'autorisation d'essai clinique chez l'homme. À moyen terme (3-5 ans), si les résultats sont positifs, le composé X pourrait entrer en développement clinique (phases I-II). Un effet thérapeutique confirmé chez l'homme bénéficierait potentiellement aux 60% de patients traités par chimiothérapie qui développent ces neuropathies, soit plusieurs centaines de milliers de patients annuellement à l'échelle mondiale. La disponibilité d'un traitement préventif efficace permettrait de maintenir les doses thérapeutiques optimales de chimiothérapie sans interruption, améliorant ainsi les taux de survie des patients cancéreux. Ce projet contribuera à l'avancement des connaissances en neurobiologie de la douleur et pourra orienter le développement d'autres stratégies thérapeutiques par la communauté scientifique internationale.
Procédures
Les animaux seront régulièrement testés tout au long de l'étude à l'aide de trois tests courts et non invasifs : un test de sensibilité au toucher d'une durée d'une heure pour l'ensemble du groupe d'animaux, mais qui ne représente que quelques secondes de stimulation par animal (chaque filament est appliqué pour un maximum de 3s), un test de sensibilité au froid correspondant à moins de 20 secondes par animal, et un enregistrement automatisé de leur comportement général d'une durée de 10 minutes par animal (5 minutes d'habituation et 5 minutes d'enregistrement). Ils recevront également 4 injections pour reproduire les douleurs liées à la chimiothérapie, et entre 2 et 16 injections pour tester le potentiel de notre composé à soulager ou prévenir les douleurs liées à la chimiothérapie respectivement. Enfin, les animaux seront soumis à une chirurgie terminale sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Les injections peuvent générer un léger stress passager dû à la contention. La molécule utilisée pour induire le modèle de douleur neuropathique périphérique chimio-induite entrainera une sensibilité accrue au toucher et au froid, ainsi que des douleurs spontanées sur une durée de 30 jours environ, conformément à l'objectif du modèle. Le seuil de sensibilité mécanique sera mesuré à l’aide du test de Von Frey. Ce test génère un léger stress. Cependant tout est mis en place pour minimiser au maximum ce stress (phase d’habituation et d’acclimatation). De plus, le seuil de sensibilité au toucher est repéré par l’animal lui-même. En effet, l’application des filaments (maximum 3s) va provoquer un comportement d’évitement ou un retrait de la patte de l’animal. Nous n’utilisons pas de stimuli au-dessus du seuil de la douleur. Le test de sensibilité au froid expose brièvement l'animal à une surface refroidie à 10°C, avec un temps limite strict de 20 secondes pour prévenir toute douleur. De plus, dès l’apparition d’un comportement de réponse au froid (évitement des pattes avant, léchage des pattes ou mouvements répétés de la patte arrière), l’animal est immédiatement retiré de la plaque froide et remis dans sa cage d’hébergement. L'enregistrement du comportement spontané est entièrement non invasif et sans contact. Une phase d’acclimatation est néanmoins prévue pour minimiser le léger stress pouvant être engendré par la découverte d’un nouvel espace. Pris isolément, chaque test comportemental ne génère qu'un inconfort modéré et de très courte durée Cependant, la classification en degré sévère (5.7) ne reflète pas l'intensité de la douleur à un instant donné, mais tient compte de la durée totale du suivi — environ un mois — avec la succession des différents tests (Von Frey, plaque froide, BlackBox) dans un contexte de douleur chronique induite. C'est cette combinaison — durée prolongée, répétition des tests et maintien d'un état d'inconfort chronique — qui justifie la classification sévère. Toutes ces procédures seront réalisées par un personnel qualifié et expérimenté, et tout sera mis en œuvre pour minimiser les nuisances provoquées.
Devenir
Les animaux seront mis à mort après la fin des expériences de comportement car nous devons prélever leurs tissus qui seront par la suite analysés. En effet, l’analyse est indispensable pour comprendre les mécanismes de la douleur et comment agit notre composé.
Remplacement
La thématique principale de notre laboratoire étant de comprendre la physiologie de la douleur, notre projet nécessite l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement par des méthodes in vitro (modèles cellulaires). En effet, la douleur ne peut être dissociée du système physiologique global de l’animal. L’étude comportementale, constituant le point de départ de notre étude, est le résultat d’une intégration complexe de l’information sensorielle de la périphérie vers le cortex somatosensoriel, et d’interactions complexes entre le système nerveux et le système immunitaire. Ainsi, l’expérimentation animale sur des souris est indispensable à l’étude des phénomènes physiologiques et à la réalisation de notre projet. De plus, l'utilisation de la souris en tant que modèle expérimental nous permet d'étudier le rôle de populations neuronales définies dans la physiologie de la douleur.
Réduction
Des stratégies seront mises en place afin d’éviter ou de limiter l’utilisation subséquente d’animaux supplémentaires tout en obtenant suffisamment de données pour répondre aux questions liées à l’étude. Ainsi, l’élaboration précise des protocoles de comportement et le choix pertinent des contrôles sont des éléments déterminants. Nous prenons en considération différents critères (variabilité liée au traitement, variabilité liée aux tests comportementaux, nombre minimum de souris pour obtenir suffisamment de matériel analysable...etc.) nous permettant de déterminer au plus juste le nombre d’animaux dans nos tests de comportement. Par ailleurs, l’utilisation d’outils statistiques nous permet d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaire. Aussi, le contrôle des paramètres environnementaux mais également du statut sanitaire et génétique des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables. Les procédures décrites sont appliquées depuis plusieurs années au sein de notre équipe et sont maitrisées par les expérimentateurs. Nous avons donc l'expérience nécessaire concernant la réalisation des procédures et l’évaluation de l'impact sanitaire sur les animaux.
Raffinement
Les souris utilisées dans ce projet seront élevées en groupes sociaux, dans un environnement enrichi (coton et/ou dôme) pour optimiser les conditions d’hébergement et favoriser un comportement normal afin de diminuer au maximum le stress des animaux. Les élevages sont effectués au sein de notre établissement agréé et 5 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages. De ce fait, l’état sanitaire et environnemental des animaux sont contrôlés tous les jours. L'effectif total résulte de deux choix délibérés visant à protéger chaque animal individuellement. D'une part, les différentes procédures sont réparties entre plusieurs groupes distincts plutôt que d'être toutes appliquées aux mêmes animaux, ce qui réduit le nombre d'interventions par animal au prix d'un effectif global plus élevé. D'autre part, l'inclusion d'un outil d'enregistrement automatisé du comportement naturel spontané nécessite l'ajout de groupes d'animaux ne recevant pas de molécule de chimiothérapie. Ces groupes contrôles permettent à la fois de distinguer les effets propres des médicaments analgésiques testés des potentiels effets antalgiques liés à la douleur, et d'écarter toute modification de comportement due à une simple habituation de l'animal au dispositif d'enregistrement au fil des sessions. Ces groupes contrôles sont indispensables à une interprétation rigoureuse des résultats. Les expérimentateurs ont été formés et maitrisent les méthodes utilisées. De plus, les stratégies d’optimisation suivantes seront mises en place au cours du projet afin de réduire voire de supprimer la souffrance chez l’animal : a) planification des procédures expérimentales (disponibilité des locaux d'expérimentation, du matériel, période d'acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation) permettant de diminuer le stress des animaux et de favoriser la validité des expériences ; b) administration adéquate d'anesthésique/analgésique lors des procédures expérimentales ; c) établissement des points limites les plus précoces possibles en fonction des tests de comportements utilisés. Un examen clinique est effectué quotidiennement afin de vérifier la cicatrisation et l’état général de l’animal. Toutes ces stratégies d’optimisation sont mises en place dans le but de réduire voire supprimer la souffrance chez l’animal.
Choix des espèces
Le niveau de similarité entre la souris et l’Homme justifie l’utilisation de rongeurs. En effet les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires entre la souris et l’Homme. De plus, il est aisé de réaliser les différents tests comportementaux sur ces rongeurs. Il est clairement admis et recommandé par la communauté scientifique que les expériences de comportement doivent être réalisées sur des individus ayant atteint leur maturité sexuelle, soit des individus âgés de 8 semaines. A ce stade du développement, le système sensoriel primaire arrive à maturation avant tous les autres, aussi c'est à ce stade que nous avons choisi de réaliser nos expériences. Ainsi, les animaux auront été commandés à 7 semaines auprès du fournisseur agréé de manière qu'ils s'acclimatent à notre animalerie.