Recherche fondamentale

3 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des injections, des gavages pouvant causer des fausses routes et, pour une partie, une castration chirurgicale, les traitements aux glucocorticoïdes pouvant entraîner une fonte musculaire et une perte de poids de 20 %. Le porteur étudie le rôle controversé des glucocorticoïdes dans le cancer de la prostate résistant à la castration. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les échanges entre cellules tumorales et cellules voisines.

Objectifs

Le cancer de la prostate est le cancer le plus diagnostiqué chez l’homme dans le monde et la seconde cause de mortalité par cancer. Il s’agit d’un cancer dépendant des androgènes, une hormone, qui, en se fixant à son récepteur favorisent la prolifération des cellules cancéreuses prostatiques. Ainsi, les cancers de la prostate localement avancés et métastatiques sont traités par des anti-androgènes aussi appelée castration chimique afin de bloquer toute activation de la voie de signalisation des androgènes. Cependant, bien que ce traitement soit efficace durant les premiers mois, la majorité des patients rechutent et progressent vers un cancer résistant à la castration. Les glucocorticoïdes, une autre hormone qui se lient aux récepteurs des glucocorticoïdes, sont utilisés avec succès en combinaison avec les anti-androgènes depuis de nombreuses années, car ceux-ci atténuent les effets secondaires et potentialisent les traitements anti-androgène. Toutefois, l’utilisation des glucocorticoïdes dans le traitement du cancer de la prostate, est devenu un sujet controversé car le récepteur aux glucocorticoïdes pourrait également jouer un rôle dans la progression de la tumeur. Nos données préliminaires obtenues à l’aide des modèles murins de cancer de la prostate vont dans ce sens et montrent que : - Le récepteur des glucocorticoïdes est présent dans les cellules cancéreuses et les cellules avoisinantes - Le récepteur des glucocorticoïdes est important dans l’initiation du cancer de la prostate. Il devient donc urgent de mieux caractériser le rôle des glucocorticoïdes dans le développement du cancer de la prostate et la résistance à la castration.

Bénéfices attendus

Actuellement, le traitement de référence du cancer de la prostate localement avancé et métastatique consiste à bloquer toute activation de la voie de signalisation du récepteur des androgènes par déprivation androgénique. Cependant, après 12 à 18 mois, la plupart des patients rechutent et développent une résistance à cette thérapie. De plus, des glucocorticoïdes sont administrés aux patients ayant un cancer de la prostate afin d’améliorer leur qualité de vie (contrôle de la douleur / diminution des effets secondaires lors de la déprivation androgénique). Toutefois, de plus en plus de données suggèrent que l’administration de glucocorticoïdes pourrait stimuler la croissance tumorale. Ainsi, il s’avère important de mieux comprendre l’impact des glucocorticoïdes dans le développement du cancer de la prostate et la résistance à la déprivation androgénique. Cette étude est importante afin de définir le rôle favorable ou défavorable d’un traitement aux glucocorticoïdes sur le développement du cancer de la prostate.

Procédures

•Dans un premier temps, 1760 souris seront identifiées (3 minutes par souris) et injectées en intrapéritonéale pendant 5 jours (3 minutes par souris) afin d’inactiver le gène d’intérêt. 1, 3, 6, 9, et 12 mois après l’inactivation du gène, les souris seront traitées avec des glucocorticoïdes, soit en intrapéritonéale (3 minutes par souris) ou per os (4 minutes par souris) (ou placebo respectifs) en fonction de la molécule pendant 14 et 30 jours maximum. Leur mise à mort est directement prévue après ces traitements. •Dans un second temps, 1280 souris seront identifiées (3 minutes par souris) et injectées en intrapéritonéale pendant 5 jours (3 minutes par souris). 640 souris seront castrées chirurgicalement et 640 seront uniquement ouvertes sans castration (groupe contrôle (Sham)) (3 mois ou 9 mois après inactivation du gène d’intérêt). Cette intervention dure environ 10 minutes pour chaque souris.7 jours après opération : les souris castrées ou non seront traitées avec glucocorticoïdes, soit en intrapéritonéale (3 minutes par souris) ou per os (4 minutes par souris) (ou placebo respectifs) en fonction de la molécule pendant 14 et 30 jours maximum. Leur mise à mort est directement prévue après ces traitements.

Impact sur les animaux

Les souris de cette étude sont exposées à des nuisances : lors de leurs gavages, des différentes injections ainsi que lors de la chirurgie et le développement d’une tumeur. En effet, les souris sont sujettes à un stress physique lors de la contention, et des lésions et/ou douleurs lors des différentes procédures. Le grossissement de la tumeur peut également générer un inconfort qui sera contrôler par palpation de la prostate et observation de l’apparence générale de la souris. Des effets indésirables peuvent également être observés lors de ces différentes manipulations : - Le gavage peut conduire à des fausses routes. - La chirurgie peut induire une hémorragie en cas de mauvaise ligature des artères et une infection post opératoire. - Les injections peuvent entrainer une infection. - Les traitements aux glucocorticoïdes peuvent entrainer une fonte musculaire allant jusqu'à une perte de poids de 20%, qui par conséquent pourrait altérer le bien-être des animaux.

Devenir

A l’issue de chaque procédure expérimentale définie dans ce projet, l’ensemble des souris seront euthanasiées selon une cinétique définie que nous utilisons habituellement au laboratoire. La prostate sera alors collectée pour y effectuer l’ensemble des analyses nécessaires à la bonne mise en oeuvre du projet de recherche.

Remplacement

Notre projet de recherche vise à comprendre le rôle des glucocorticoïdes le développement du cancer de la prostate et la résistance aux traitements utilisés actuellement. Les communications entre les cellules avoisinant la tumeur comme par exemple les cellules immunitaires et les cellules cancéreuses prostatiques jouent un rôle crucial dans le développement et la progression du cancer de la prostate. A noter que le récepteur aux glucocorticoïdes est exprimé dans les cellules cancéreuses prostatiques mais également dans les cellules avoisinant la tumeur. Ceci implique donc qu’un traitement aux glucocorticoïdes agit sur les deux compartiments cellulaires. A ce jour, aucun modèle ne permet d’étudier une telle complexité in vitro. C’est pourquoi, notre projet nécessite d’utiliser un modèle in vivo afin que l’ensemble de ces facteurs soient pris en compte.

Réduction

Le nombre de souris nécessaires pour nos expériences a été déterminé de façon à obtenir des résultats publiables et significatifs à l’aide de tests statistiques adaptés en fonction des expériences réalisées. En effet, il n’est pas rare d’observer une forte hétérogénéité entre des souris du même groupe. Par ailleurs une étude pilote sera réalisée afin d’éviter d’utiliser un protocole d’injection de glucocorticoïdes non adapté, et ne nous permettant pas d’apporter de conclusion. Notre expertise en expérimentation animale nous a permis de définir au mieux le nombre d’animaux qui sera utilisé pour cette étude. De plus, de manière à réduire le nombre d’animaux utilisés, lorsque cela sera possible, une même prostate sera utilisée pour plusieurs expériences (par exemple, recherche de différents marqueurs biologiques sur une même prostate).

Raffinement

Durant la durée de l'étude, les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement en animalerie. Pour le bien-être social des animaux, les groupes seront respectés et les animaux seront remis en cage avec leurs partenaires préalables. Aucun animal ne sera laissé isolé dans sa cage. Tous les animaux utilisés pour ces expérimentations seront observés par l'expérimentateur et le personnel de l'animalerie d'hébergement chaque semaine afin de contrôler l’apparence générale de la souris, sa posture et son comportement tout au long de leur vie. Concernant la partie chirurgicale, les souris subiront une anesthésie générale et recevront des médicaments antalgiques afin de prévenir l'apparition de douleurs. Une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d'incision avec surveillance des points de suture, palpation abdominale et inspection à la recherche de signe d'infection locale. Afin d’analyser le bien-être animal, les paramètres utilisés seront le poids, la posture de l’animal, l’état de son pelage, son activité et palpation abdominales. Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si l’un des animaux atteint le point limite, celui-ci sera immédiatement euthanasié.

Choix des espèces

A ce jour, la souris représente un modèle de choix pour notre étude en raison de : -Temps de gestation court, nous permettant d’avoir de larges cohortes contribuant à l’obtention de résultats significatifs. -L’histologie de la prostate murine et humaine est similaire. -Notre modèle de cancer de la prostate chez la souris présente la même cinétique de développement tumoral que celle observée chez l’homme (lésions pré-cancéreuses dont certaines seulement évoluent en adénocarcinomes). -Le système immunitaire chez la souris est proche du système immunitaire chez l’homme, ce qui est crucial pour la mise en oeuvre de notre projet d’étude. -Les voies de signalisation et gènes exprimés dans la prostate sont similaires chez l’homme et chez la souris. Les animaux utilisés seront adultes. Les traitements pour induire la mutation se feront à 8 – 10 semaines d'âge et les animaux seront mis à mort comme indiqué après 1 mois, 3 mois, 6 mois, 9 mois et 12 mois. Cette cinétique est importante pour étudier le rôle des glucocorticoïdes à tous les stades de la maladie. Concernant la partie castration, uniquement deux temps de cinétique ont été choisis, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés (un temps précoce et un temps plus tardif).

1 280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur colorectale en sous-cutané, qui peut réduire leur mobilité et provoquer des nécroses cutanées, puis huit injections de traitement, avant d'être tuées pour prélever tumeurs, rates et ganglions. Le porteur cherche à valider le rôle antitumoral d'une molécule produite par les cellules NK, en s'appuyant sur un modèle transgénique. Il affirme que la complexité du cancer ne peut s'appréhender que dans un organisme vivant.

Objectifs

Ces dix dernières années, l’immunothérapie s’est développée et permet la mise en place d’une réponse puissante et durable chez un nombre limité de patients. Dans le but d’améliorer l’efficacité de l’immunothérapie, de nombreux essais cliniques visent à l’utiliser en combinaison thérapeutique avec d’autres traitements tel que les anti-angiogéniques. L’angiogenèse permet la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants et permet d’apporter de l’oxygène et des nutriments aux tumeurs en expansion. Cibler l’angiogenèse permet d’une part de normaliser les vaisseaux sanguins et d’améliorer l’infiltration en cellules immunitaires des tumeurs, puis également de limiter la croissance tumorale en privant les cellules tumorales de nutriments et d’oxygène. Dans une étude précédente, nous avons montré que cette combinaison thérapeutique ralentit la croissance tumorale dans des modèles de cancer colorectaux chez la souris. Les mécanismes mis en place nous suggèrent que les cellules tueuses naturelles (NK) jouent un rôle anti-tumorale clé en produisant du GM-CSF. Le GM-CSF est une molécule qui a un rôle anti-tumoral et qui stimule le système immunitaire. Afin de valider nos hypothèses, nous souhaitons utiliser un modèle de souris transgénique dans lequel les NK des souris ne produisent pas de GM-CSF. Le but de ce travail est donc de valider nos observations qui sont les suivantes : les NK produisent du GM-CSF qui a un effet anti-tumoral en induisant la maturation et le recrutement d’autres cellules immunitaires.

Bénéfices attendus

Le cancer est aujourd’hui un problème de santé publique majeur et est la seconde cause de mortalité dans le monde. A titre d’exemple, en 2020, 20 millions de personnes ont été diagnostiquées et 10 millions de personnes sont décédées. Au laboratoire, nous travaillons sur le cancer colorectal où les solutions thérapeutiques sont malheureusement insuffisantes. Nous espérons apporter des pistes d’améliorations pour augmenter l’efficacité de l’immunothérapie. De manière plus globale, les connaissances et résultats obtenus permettrons de mieux comprendre le rôle du GM-CSF produit par les NK dans une réponse anti-tumorale induite par un traitement anti-cancéreux. A l’heure actuelle, aucune étude n’a montré ce rôle dans le cancer.

Procédures

Sous anesthésie générale par isoflurane, les animaux subiront 1 injection sous cutanée de 1 minute, 7 jours plus tard, 8 injection Intrapéritonéale (IP) de 10 secondes, réparties sur une semaine et espacées de deux jours.

Impact sur les animaux

L’injection des tumeurs en sous-cutanée pourrait diminuer la mobilité des souris ainsi que leur capacité à se nourrir. Une perte de poids pourrait être observé. En réalisant des injections sous-cutanées, il est possible d’observer la formation de nécroses cutanées. Aucun effet indésirable n’est attendu pour les traitements.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de prélever les tumeurs, rates et ganglions.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d’un organisme. Nous réalisons à ces fins des études sur les modèles d’animaux greffés avec des cellules tumorales. Par la suite, le décryptage des mécanismes moléculaires sera réalisé in vitro.

Réduction

Les groupes expérimentaux seront constitués de n=10 individus afin de générer des cohortes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer les effets anti-tumoraux des traitements tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées afin d’optimiser la reproductibilité. Nous utiliserons toutes les souris disponibles issue des croissements : mâles et femelles. Néanmoins, comme les variations dans les croissances tumorales peuvent être importantes, nous répèterons les expériences 2 fois de manières indépendantes.

Raffinement

Les souris seront élevées dans un milieu enrichi. Chaque animal sera examiné 3 fois par semaine, tout le long de l’expérimentation. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. Les injections de cellules tumorales seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane. Aucune douleur associée à ce geste n’est donc attendue. Les injections de traitements seront réalisées sur des souris vigiles. De plus, leur habituation aux gestes de contention devrait permettre de réduire le stress dû à ces manipulations. Afin de limiter la perte de poids des souris potentiellement due à des problèmes de mobilités induits par les tumeurs, nous allons ajouter des croquettes dans les cages afin que la nourriture leur soit plus accessible. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance. Si nous constatons un problème tel que la perte de poids excessive, une nécrose tumorale, une déshydratation, les souris seront mises à mort.

Choix des espèces

Disponibilité de modèle génétiquement modifié pertinent dans le projet scientifique : aucune autre espèce animale présente la même modification génétique. Les modèles tumoraux syngéniques existant sont utilisables chez cette espèce. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature.

2 100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie avec ouverture de la cage thoracique, des injections répétées et un suivi de la tumeur du foie par imagerie, jusqu'à un point limite au-delà duquel elles peuvent maigrir, s'isoler ou devenir agressives. Le porteur situe les retombées cliniques à long terme et au conditionnel. Il affirme que l'utilisation des souris reste "indispensable" faute de modèle in vitro reproduisant le microenvironnement tumoral.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’étudier des cellules du système immunitaire, les populations lymphoïdes, afin d’identifier celles qui sont impliquées dans le contrôle du développement des cancers du foie. Nous souhaitons également dans ce projet étudier le rôle de deux voies de signalisation cellulaire dans la fonction de ces populations cellulaires. Nous espérons ainsi définir clairement les différentes populations lymphoïdes impliquées dans le développement du cancer du foie et mettre en évidence un rôle déterminant des voies de signalisations dans leurs fonctions au sein de la tumeur. Nous espérons à l’aide de ces premiers résultats, qui seront complétés par des expérimentations in vitro, pouvoir améliorer l’efficacité des cellules lymphoïdes à l’encontre des cellules cancéreuses du foie afin de pouvoir proposer une nouvelle approche thérapeutique pour la prise en charge des patients atteints de cancer du foie.

Bénéfices attendus

Premièrement, ce projet permettra d’améliorer notre compréhension du développement du carcinome hépatocellulaire et du rôle joué par les populations lymphoïdes. Ensuite, ce projet nous permettra également de connaître le rôle de deux voies de signalisation cellulaire majeures dans la fonction des cellules lymphoïdes innées à l’encontre des cellules cancéreuses. Enfin, nous espérons démontrer qu’il est possible d’améliorer la fonctionnalité de ces cellules lymphoïdes innées grâce à la modulation de ces voies de signalisation et ainsi proposer une ou des nouvelles approches thérapeutiques pour la prise en charge des patients atteints de cancer du foie. Les résultats obtenus grâce à ce projet, pourront permettre d’explorer par la suite cette ou ces approches pour une application en clinique en vue d’améliorer la survie et la qualité de vie des patients. Ainsi à long terme, ces expérimentations s’inscrivent dans une recherche visant à améliorer la prise en charge des patients atteints de cancer du foie.

Procédures

Les souris pourront subir une chirurgie avec ouverture de la cage thoracique sur une hauteur de 2cm environ. Cette procédure chirurgicale aura lieu une seule fois et durera environ 30minutes. Les souris pourront recevoir des injections en intrapéritonéale, cette procédure dure quelques secondes et l’animal est contentionné pendant moins d’une minute. Cette procédure sera répétée au maximum une fois par jour durant toute la durée de l’expérimentation. Les souris pourront recevoir des injections en intraveineuse. Pour cela la souris est contentionnée durant 2-3 minutes et l’injection dure quelques secondes. Cette procédure sera répétée au maximum une fois par semaine durant 7 semaines. Un prélèvement sanguin au niveau sub-mandibulaire pourra être réalisé une seule fois. Cette procédure dure moins d’une minute. Le suivi de la pousse tumorale chez les souris sera réalisé par imagerie. Pour cette procédure, les souris devront être immobilisées durant environ 30min et la procédure sera réalisée au maximum 14 fois durant toute la durée de l’expérimentation.

Impact sur les animaux

Les animaux ne présentent habituellement aucun signe de souffrance avant que la tumeur atteigne la taille que nous avons fixé comme point limite. Il est alors possible que les animaux commencent à montrer des signes de stress physique et comportementale. D’un point de vue comportemental, les souris peuvent acquérir un comportement asocial, voir agressif ce qui n’est pas le comportement habituel de l’espèce. Nous pouvons observer aussi un arrêt de la toilette et possiblement une dépilation volontaire signe d’une détresse. D’un point de vue physique, nous pouvons observer un amaigrissement, notamment au niveau du bassin de l’animal, signe d’une perte d’appétit de l’animal lié à une détresse causée par une taille de tumeur importante. L’injection intra-veineuse par la veine caudale d'un grand volume de solution peut entrainer une douleur transitoire. Les autres injections par voie intrapéritonéale ou intraveineuse n’induisent pas de douleur perceptible chez les animaux traités.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront développé une tumeur.

Remplacement

Dans la mesure du possible, les études que nous menons sont réalisées dans des modèles in vitro de cultures cellulaires. Cela nous apporte de nombreux éléments qui nous permettent d’affiner nos hypothèses ou d’en émettre de nouvelles. Cependant, à l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode suffisamment robuste pour reproduire in vitro la complexité du microenvironnement tumoral afin d’étudier les interactions entre le système immunitaire et la tumeur. Ainsi, afin de pouvoir apporter des réponses précises à nos problématiques de recherche, l’utilisation des souris reste indispensable. Une veille scientifique continue sera également effectuée, afin d’éviter toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Réduction

Le nombre de souris à utiliser a été calculé avec l’objectif de réduire leur nombre autant que possible, tout en permettant d’identifier des effets biologiques suffisamment fiable, évalués par des analyses statistiques valides. Nos calculs ont pris en compte la variabilité interindividuelle ainsi que l’effet attendu. Afin d’améliorer la relevance de ces résultats, nous avons décrit trois modèles permettant d’induire un cancer du foie. Ces modèles ne seront pas réalisés de manière concomitante. Ainsi, bien évidemment, si une hypothèse est invalidée dans le premier modèle étudié, elle ne sera pas testée dans les autres modèles afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux sont manipulés sur plusieurs jours avant le début des expériences afin de limiter leur stress au cours de la procédure. Une fiche de suivi sera tenue, de manière journalière la semaine suivant l’induction de la tumeur puis de manière tri-hebdomadaires jusqu’à la fin de la procédure afin de vérifier l’état général des animaux et de prévenir toute souffrance évitable. Les animaux bénéficient des conditions normales d’hébergement et de soins de notre animalerie. Les souris seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit, enrichissement des cages, nourriture à volonté). Toutes les souris en expérimentation possèderont du coton dans les cages en tant qu'enrichissement. De plus, dès que les souris commenceront à présenter une perte de poids détectable, de la nourriture en gel ou des crochets humides seront ajoutées dans leur cage. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation contraignante ou invasive sera réalisée sous anesthésie générale par voie gazeuse et la douleur sera prise en charge par administration d’antalgiques. Lors des chirurgies, le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure en évaluant les réflexes et la respiration. Pour prévenir une potentielle baisse en température, les animaux seront placés sur un coussin chauffant. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours des procédures. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, une mise à mort anticipée de l’animal sera réalisée.

Choix des espèces

Pour le moment, il n’existe pas de méthode suffisamment robuste pour reproduire in vitro la complexité du microenvironnement adéquat pour étudier les interactions entre le système immunitaire et la tumeur. Ainsi, afin de pouvoir apporter des réponses à notre problématique de recherche, l’utilisation des souris reste indispensable. De plus, l’existence de lignées de souris transgéniques permet des études mécanistiques approfondies qui nous permettront de mieux décrypter les voies de signalisation impliquées dans la fonction des cellules lymphoïdes et ainsi dans le contrôle de la progression du cancer du foie. Par ailleurs, il est à noter que le système immunitaire de la souris est proche de celui de l’Homme, au niveau des composants moléculaires et cellulaires, ce qui nous permet d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires impliqués dans le processus tumoral, et d’envisager par la suite un transfert de technologie chez l’homme. Pour ce projet, les procédures seront réalisées sur des animaux adultes de 6 à 12 semaines afin d’être proche de la situation de la pathologie humaine. Les souris présenteront ainsi un système immunitaire pleinement fonctionnel.

12 000 têtards de xénope vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont exposés au métronidazole pendant dix jours puis à des molécules à tester, avec quatre anesthésies et quatre tests comportementaux, pour cribler cinquante molécules candidates contre la sclérose en plaques. Le porteur estime la mortalité prématurée à environ 10 % pour le développement et 10 % pour l'exposition au métronidazole, et certaines doses peuvent être toxiques. Il justifie le recours au têtard par sa transparence et par le grand nombre d'individus que produit l'espèce.

Objectifs

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie neurologique et inflammatoire, c’est la première cause d’handicap chez le jeune adulte, et touche environ 110 000 personnes en France, avec 4 000 à 6 000 nouveaux cas par an. Dans cette maladie, la perte de la gaine de myéline (structure graisseuse qui entoure et protège une partie du neurone, permettant la conduction de l’information nerveuse) peut se traduire par un ralentissement voire une interruption de la conduction du message nerveux. Les personnes atteintes de ce type de désordres sont progressivement ou d’amblée handicapées, sur le plan physique et cognitif. Au cours des 20-25 dernières années, des progrès remarquables ont été réalisés dans la prise en charge des patients par l’introduction de traitements visant la composante inflammatoire de la maladie. Cependant bien que ces traitements diminuent notoirement les symptômes, ils ne semblent pas avoir une forte influence sur l’amélioration du statut clinique ou pour prévenir la progression du handicap, comme évalués par les scores cliniques classiques. Des faisceaux d’arguments (modèles expérimentaux, examens neuropathologiques de cerveaux de SEP, nouvelles méthodes d’imagerie chez les patients SEP) suggèrent que la remyélinisation (régénération de la myéline) est un élément clé dans la restauration des capacités motrices et cognitives. L’effort international actuel est donc d’essayer de développer des molécules favorisant la remyélinisation, pour améliorer la prise en charge de la maladie et donc la qualité de vie des patients. Le but de notre projet est d’étudier des molécules améliorant la remyélinisation dans un modèle animal de sclérose en plaques (Xenopus laevis), en couplant des analyses histologiques et comportementales adaptées aux têtards. A plus grande échelle, si ces molécules présentent un effet bénéfique sur la remyélinisation, elles pourront présenter un espoir thérapeutique pour les maladies démyélinisantes telles que la sclérose en plaques, ou plus largement les maladies affectant la myéline.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier des molécules pouvant favoriser la remyélinisation. Identifier des molécules remyélinisantes permettrait dans le cas de maladies démyélinisantes comme la sclérose en plaques, d’éviter la neurodégénérescence et à terme la dégradation des capacités fonctionnelles. Les molécules pro-remyélinisantes identifiées pourraient ensuite être utilisées comme piste thérapeutiques.

Procédures

Les têtards sont mis en contact avec du métronidazole (molécule permettant de mettre en place le modèle) durant 10 jours, puis avec des molécules à tester pro-myélinisantes pour une durée de 3 jours maximum. Les têtards sont mis en contact avec les molécules dans leur eau de balnéation. Les têtards vont être anesthésiés 4 fois 5 minutes (3 jours minimum entre chaque anesthésie) pendant toute la durée de la procédure. Ils effectueront 4 tests comportementaux de moins de 5 minutes avec un temps de 3 jours minimum entre chaque test.

Impact sur les animaux

L’anesthésie est maintenue durant toute la procédure pour ne pas engendrer de stress chez l’animal, mais peut entrainer des risques cardio-respiratoires, les battements du cœur sont donc fréquemment contrôlés durant l’anesthésie (facilement visible chez les têtards). La capture à l’épuisette, pour les tests comportementaux, peuvent aussi induire un léger stress chez le têtard, sans entrainer de blessures ou de comportements anormaux. Malgré le soin que nous portons au choix de la dose des molécules, d’après la littérature et les tests in vitro, il arrive que certaines de ces concentrations soient toxiques et peuvent entrainer la mort des têtards. Une mort prématurée des têtards est possible pendant le développement, nous estimons cette perte à 10 pour cent, ainsi que suite à l’exposition au métronidazole, que nous estimons à 10 pour cent également.

Devenir

Afin d’étudier les différents mécanismes impliqués suite à l’exposition aux molécules à tester, il est ensuite nécessaire d’euthanasier les têtards pour faire des études immunologiques plus poussées sur leurs tissus.

Remplacement

Le développement de stratégies thérapeutiques visant les maladies démyélinisantes est confronté à la difficulté de suivre les mécanismes pathologiques au sein de la complexité du système nerveux. C’est la raison pour laquelle les modèles de culture cellulaire ne suffisent pas. A l’opposé, le recours à des animaux vertébrés, qui ont un système nerveux organisé avec des couches de myéline, comparable à ce qui est retrouvé chez l’Homme (et donc intéressant pour étudier les maladies qui atteignent cette structure) peut permettre une première démonstration de l’action d’une molécule in vivo. Cette étape permet de choisir plus objectivement les molécules efficaces et de les tester ensuite chez l’homme. Le choix de l’utilisation du modèle Xenopus laevis repose sur les arguments suivants : - Il s’agit d’un modèle animal, donc un modèle intégré contrairement à des modèles ex vivo et in vitro - La transparence du têtard permet de visualiser tout le système nerveux central sans euthanasie, ce qui permet un suivi in vivo et longitudinal - Le Xénope est une espèce qui génère beaucoup de têtards, facilitant les études toxicologiques et pharmacologiques qui nécessitent un grand nombre d’animaux - Le Xenopus laevis est un animal robuste et facile d’élevage en comparaison à d’autres modèles animaux - Enfin, il existe une grande conservation des protéines de la myéline inter-espèces (amphibiens versus mammifères)

Réduction

Dans le souci de respecter la règle des 3R, ce sont les mêmes têtards qui sont utilisés pour compter le nombre de cellules oligodendrocytaires dans le nerf optique qui seront soumis au test visuel. La transparence des têtards de Xénope permet de suivre in vivo la progression des expériences grâce à l’observation des têtards au macroscope, et ainsi d’éviter des suivis histologiques tout au long du protocole nécessitant l’euthanasie des têtards expérimentaux. Nous souhaitons utiliser environ 240 têtards par molécule, en sachant qu’une molécule est testée en triplicat à 7 concentrations différentes, en comparaison avec un groupe contrôle (8 groupes au total), avec 10 têtards par condition (soit 80 têtards en triplicat donc 240 têtards au total). Ces calculs ont été réalisés à la suite de calculs de puissance pour les expériences proposées. Le nombre de 10 têtards par groupe prend en compte la mortalité spontanée au cours du développement pour certains têtards. Chaque molécule nécessitera 240 (80x3) têtards, et nous avons 50 molécules à tester, soit au total environ 12 000 têtards.

Raffinement

Les têtards sont placés dans un bain de 4L d’eau (moitié eau dure, moitié eau osmosée) à une température de 23 degrés avec une pompe pour oxygéner l’eau. L’eau est renouvelée au minimum une fois par semaine avant le commencement du protocole pour maintenir un volume suffisant et réduire l’accumulation des déchets urémiques, et tous les 3 jours suite à l’exposition au métronidazole. Les têtards sont observés quotidiennement, et ceux qui présentent des anomalies (déformations, retard de développement, troubles de la nage…) sont euthanasiés, les cadavres liés aux problèmes de développement et les surplus de nourriture sont aussi retirés de l’eau quotidiennement. De plus, des souches d’arbres flottants en composite plastique sont placées dans les bacs des têtards, qui leurs permettent de se cacher dessous. Des points limites sont définis et respectés pour éviter toute souffrance animale. Si les doses n’ont pas précédemment été déterminées dans d’autres modèles animaux, elles sont adaptées à partir de l’efficacité des molécules in vitro. Par notre expérience, ces doses sont peu ou pas toxiques chez le têtard de Xénope. Suite à l’anesthésie, les animaux sont placés dans un bac avec une oxygénation de l’eau plus importante et avec leurs congénères, et surveillés dans les minutes suivantes jusqu’au réveil, qui a lieu généralement 5 minutes après la fin de l’anesthésie, avec une reprise de la nage normale. Durant l’exposition au métronidazole, les têtards sont placés dans un incubateur opaque. Cette absence de cycle jour et nuit n’impacte pas les têtards car nous n’avons pas observé de stress ou d’augmentation de la mortalité durant les 10 jours d’exposition.

Choix des espèces

La transparence des têtards facilite le suivi in vivo de l’expérimentation (respect du critère réduction car étude longitudinale), de plus la grande homologie des protéines de la myéline des Xénopes avec celle des mammifères justifie l’utilisation de ce modèle. Les têtards sont utilisés entre stade 50 et 55. A cette période de développement, on peut facilement observer la dynamique de la mort et de la réapparition des oligodendrocytes in vivo et sans recours à l’euthanasie des animaux. De plus, le stade 48 correspond au début de la myélinisation dans le système nerveux central, au stade 50-55 la myélinisation est beaucoup plus avancée, donc plus facile à étudier.

386 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une chimiothérapie induisant une thrombopénie, des prélèvements de sang à la queue tous les deux jours et, pour certaines, une chirurgie du crâne permettant d'imager la moelle osseuse, le tout sous anesthésies répétées. Le porteur classe les procédures en modéré surtout à cause du stress lié aux cycles répétés d'anesthésie et de réveil. Il affirme que l'étude de la formation des plaquettes exige un animal adulte vivant et que la souris est la seule solution.

Objectifs

La thrombopénie correspond à une baisse de la numération plaquettaire exposant les patients à des risques hémorragiques. Il s'agit d'un problème clinique courant chez les patients traités par chimiothérapie. Les plaquettes sont produites par les mégacaryocytes (MKs) dans la moelle osseuse. Une étape clé et mal comprise dans leur formation est le passage des MKs au travers de la barrière des vaisseaux (intravasation), ces évènements, très rares, permettent la libération des plaquettes dans la circulation sanguine. Avenant : dosage de la TPO plasmatique dans le sang. La thrombopoïétine (TPO) est une hormone produite en grande partie par le foie qui permet la régulation de la production des plaquettes par les mégacaryocytes dans la moelle osseuse. La concentration en TPO est inversement proportionnelle avec la courbe de la numération plaquettaire avec un décalage dans le cadre d’une thrombopénie. Or, notre modèle de thrombopénie induite par chimiothérapie, nécessite une vision complète des conditions biologiques dont l’évolution de la concentration en TPO endogène au cours des traitements ce qui induit l’utilisation d’animaux vivants. En effet, l’une des perspectives du projet est d’administrer de la Romiplostim, un analogue de la TPO, qui permettrait de limiter/réduire la thrombopénie dans le cadre de la CIT. Cependant, la fenêtre d’administration de cet analogue n’est pas bien définie pour être pleinement efficace. L’objectif de cet avenant et de nous permettre de définir la fenêtre d’administration optimale de la Romiplostim® en fonction de la concentration en TPO endogène. Notre projet concerne la capacité de la moelle et des mégacaryocytes résidents à se remanier et restaurer une numération plaquettaire normale après thrombopénie induite par les agents chimio-thérapeutiques anti-tumoraux (CIT).

Bénéfices attendus

Les retombées de ce projet sont cognitives et cliniques. Sur le plan fondamental, il vise à comprendre le fonctionnement de la PodoPZ dans une étape clé et indispensable de la formation des plaquettes sanguines, l’intravasation des MKs. Sur le plan clinique, nous évaluerons le potentiel thérapeutique de la PodoPZ pour améliorer la prise en charge des CIT, offrant ainsi une méthode alternative de traitement de la thrombopénie par un analogue de la TPO, le Romiplostim.

Procédures

Nous avons précisé « Tous les animaux seront anesthésies quelques minutes au masque pendant les injections des traitements pharmaceutiques (une seule injection au début de l'étude) puis pendant les prélèvements d'un faible volume de sang à la queue tous les 2 jours. La durée moyenne de ces injections est 1 minute. Certains animaux seront soumis en plus à une séance d’imagerie de la moelle d’une durée maximale de 3h, tandis que d’autres seront soumis à un prélèvement sanguin terminal (durée 2 minutes) . Ces gestes seront réalisés sur animal anesthésié.

Impact sur les animaux

En ce qui concerne les traitements de CIT, les souffrances infligées aux animaux sont légères puisqu’il s’agit principalement d’injections et de prélèvements de sang à la queue sur animal anesthésié. Pour l’ensemble des substances injectées aucune souffrance, aucune perte de poids, aucun saignement n’a été observé. En raison de la répétition des cycles d'anesthésie gazeuse et de réveil, nous anticipons un stress supplémentaire des animaux et classons nos procédures en modérées. En ce qui concerne les expériences par microscopie, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées qui n’expriment aucun phénotype dommageable. Ces expériences ont toujours lieu sur des souris profondément anesthésiées, elles subiront une petite chirurgie cutanée sur le sommet du crâne pour laquelle nous anticipons une légère inflammation et surveillons les saignements potentiels. Tous les animaux seront mis à mort avant leur réveil.

Devenir

A l’issu des procédures tous les 386 animaux seront mis à mort pour prélèvements et analyses post-mortem.

Remplacement

Les expériences nécessitent un animal adulte vivant, car elles posent la question du fonctionnement du système hématopoïétique in vivo dans sa totalité, en faisant appel à une multitude de cellules qui interagissent dans toute la complexité du vivant et en particulier la circulation sanguine. En particulier, l’intravasation met en œuvre simultanément des interactions entre MKs, les vaisseaux et la circulation sanguine. Ces évènements sont intégrés et demandent à être étudiés sur l’animal. Nous avons effectué les études préliminaires possibles en culture cellulaire avant de passer sur le modèle animal qui s’avère être la seule solution pour étudier ces phénomènes complexes dans leur intégralité.

Réduction

Les souris issues de la première série d’expériences seront utilisées pour les études de cytométrie. Afin d’éviter des répétitions inutiles, le point « homéostasie » avant traitement sera réalisé une seule fois par traitement médicamenteux. A la fin des observations intravitales, les animaux seront euthanasiés et les moelles osseuses récupérées, fixées et stockées pour des observations ultérieures, limitant ainsi le nombre de souris. Le nombre de souris est déterminé de manière à obtenir des résultats statistiques solides dans les différents génotypes. Enfin, le maximum de prélèvements seront réalisés sur une même souris (sang, fémurs, tibia).

Raffinement

Les moyens de raffinement des expérimentations sont les suivants : - Pendant l’hébergement, les animaux sont élevés en groupe dans un environnement calme et non stressant et privilégié avec un minimum de manipulation. Le milieu est enrichi avec de la frisure de papier, des carrés de cellulose et des bâtonnets de coton afin de permettre aux souris de confectionner leur nid et structurer leur environnement. Des croquettes sont déposées sur le fond de la cage pour favoriser le comportement de fouissage. - Les expériences ont toujours lieu sur des souris profondément anesthésiées - Les prélèvements de sang à la queue seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Nous appliquerons un tampon hémostatique pour arrêter le saignement avant de replacer l'animal dans sa cage.

Choix des espèces

La souris est largement utilisée pour étudier et modéliser la biologie et la physiologie humaine. De nombreux outils ont été développés pour suivre chez cet animal la production des plaquettes sanguines à partir de leur précurseurs MKs (ex : anticorps, souris génétiquement modifiées GFP-myosine permettant de visualiser en temps réel la PodoPZ). La connaissance de la souris et notre expertise d’imagerie adaptés à cette problématique conduisent à choisir cet animal pour l’étude. Par ailleurs la souris est un mammifère qui, par expérience, supporte bien les traitements de CIT (limités à quelques jours et à une seule injection), et présente une thrombopénie proche de celle des patients humains dans les conditions de chimiothérapies. C'est également un animal indiqué pour le suivi des traitements pharmaceutique, qui dans notre cas est le Romiplostim. L’approche d’imagerie intravitale requière des animaux à un stade de développement jeune (de 4 à 8 semaines) car ils ont l’os du crâne suffisamment fin pour laisser passer la lumière. Pour les autres expériences les souris seront utilisées à un âge habituel de souris adulte entre 8-18 semaines afin de standardiser au mieux les différents traitements. Les souris C57/Bl6 sont commandées par notre service selon nos besoin, il nous est donc aisé d'ajuster les âges de nos différents groupes.

168 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection intracérébrale de cellules tumorales à travers un orifice pratiqué dans le crâne, puis une injection de nanoparticules et deux séances d'imagerie sous anesthésie, avant d'être tué. Le porteur décrit surtout les nuisances liées à la chirurgie et prévoit un isolement d'une nuit pour éviter que les animaux ne rongent leurs sutures. Il indique que des tests cellulaires ont présélectionné trois nanoparticules mais que l'évaluation de leur accumulation tumorale n'est "pas remplaçable" sans animaux.

Objectifs

Bien que l'incidence du glioblastome soit faible (~6/100000) la médiane de survie post-diagnostic est de l'ordre de 15 mois malgré un traitement agressif associant une chirurgie et une chimio/radiothérapie. Parmi les améliorations thérapeutiques possibles, l’apport de nanoparticules radio-sensibilisante est envisagée. L'objectif de ce projet de recherche est d'évaluer la distribution de nouveaux agents nanoparticulaires dans un modèle dans un modèle murin de glioblastome.

Bénéfices attendus

Le bénéfice à court terme est de documenter l’accumulation de différents nanovecteurs radiosensibilisants avant de réaliser une étude d’efficacité thérapeutique en utilisant leurs propriétés radiosensibilisantes mais également l’association avec des chimiothérapies.

Procédures

Tous les animaux seront injectés en intracérébral avec des cellules tumorales. La durée totale de la chirurgie est de 15 minutes et est implique une anesthèsie. L'injection unique intraveineuse de thérapie est réalisée en bolus sur une durée de moins de 5 secondes. Deux séances d'imagerie sont planifiées et impliquent une anesthèsie de 10 minutes à 4heures.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont relatives à la chirurgie incluse dans le protocole. En effet, la chirurgie consistera à injecter les cellules tumorales au travers d'un orifice de diamètre inférieur à 1mm dans le crâne du rat après incision cutanée. Enfin, après chaque chirurgie, les animaux seront isolés pendant une nuit afin d’éviter qu’ils ne se rongent mutuellement les sutures. Au moment des sessions imageries, les animaux seront anesthèsies.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Il existe de nombreux tests d’évaluation de toxicité sur des modèles cellulaires. Ces tests ont été réalisés et nous ont permis de présélectionner les 3 types de nanoparticules que nous allons évaluer. Toutefois, pour cette phase d’évaluation de l’accumulation tumorale des nanovecteurs, le recours à des animaux n’est pas remplaçable.

Réduction

Le nombre d'animaux est réduit au minimum tout en maintenant une puissance statistique suffisante. En effet, une simulation en utilisant G-power, montre que pour mettre en évidence une éventuelle différence d’accumulation de nos nanovecteurs supérieure ou égale à 20%, nous groupes doivent être constitués de 12 individus, avec un risque alpha de 0.05 et beta 0.95.

Raffinement

Outre les conditions d'hébergement assurées par la structure (cycle jour/nuit, température, papier pour constitution de nid...) les animaux recevront en per opératoire une injection sous cutanée de buprénorphine et au site d'incision une injection de lidocaïne. Ils seront maintenus en normothermie pendant toutes les procédures chirurgicales ainsi que lors de l’examen IRM - normothermie assurée par une couverture chauffante asservie à la température rectale. Pendant l’examen IRM un suivi du rythme respiratoire sera réalisé afin d’évaluer la qualité de l’anesthésie. Le suivi régulier des animaux sera réalisé afin de s'assurer que les points limites adaptés à l'étude ne sont pas atteints. Un arbre descisionnel est mis en place pour arrêter toute souffrance à laquelle les animaux pourraient être exposés.

Choix des espèces

Le rat est retenu pour cette étude dans la mesure ou le modèle est bien documenté et établi dans notre laboratoire.