Recherche fondamentale

448 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent une à deux chirurgies cérébrales, un isolement de vingt-quatre heures, jusqu'à vingt et une injections, une privation de nourriture et trois tests comportementaux d'anxiété et de dépression, avant d'être tuées pour prélever le cerveau. Le porteur mentionne un "modèle validé" exposant les souris à un médiateur du stress et les rendant résistantes aux antidépresseurs, sans détailler ce qu'elles subissent dans ce modèle. Il affirme qu'étudier des comportements complexes impose de travailler sur un modèle animal.

Objectifs

Avec un taux de 15 à 20 % pour la population générale, la dépression majeure est le trouble psychiatrique le plus fréquent. L’Organisation Mondiale de la Santé prédit que la dépression majeure va devenir la première cause d’handicap d’ici 2030. Cependant, malgré la grande variété de médicaments disponibles pour traiter cette maladie, deux problèmes majeurs restent encore non résolus : un tiers des patients ne répondent à aucun traitement, et il existe un délai de 3-8 semaines avant le début de la réponse thérapeutique. Ces questions mettent l’accent sur la nécessité d’intensifier les recherches afin de développer des traitements plus efficaces et d’accélérer la réponse antidépressive. Un déficit de sérotonine dans le cerveau serait une des causes neurobiologiques de cette maladie psychiatrique. L’objectif principal des traitements actuels est donc de rétablir des taux normaux de sérotonine. Le segment initial de l’axone (AIS) est un élément clé de régulation de l’activité électriques des neurones. Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de l'AIS dans la régulation des neurones qui produisent la sérotonine. Ceci pourrait permettre de découvrir un rôle crucial de l’AIS dans la régulation de l’humeur et ainsi identifier une nouvelle cible pour le développement de stratégies thérapeutiques antidépressives innovantes.

Bénéfices attendus

Ces études devraient permettre de mettre en évidence le rôle du segment initial de l’axone (AIS) dans la régulation d'un neurotransmetteur, la sérotonine et des comportements émotionnels associés. La perspective à plus long terme sera de proposer de nouveaux traitements anxiolytiques et/ou antidépresseurs plus efficaces que ceux actuellement disponibles en agissant sur l’AIS. Enfin, nous croyons que les résultats du présent projet aideront à orienter les recherches futures axées sur les causes de la dépression.

Procédures

1 ou 2 chirurgies sous anesthésie générale d'environ 30 minutes. Isolement de 24 heures suite à une chirurgie. 1 à 21 injections (10-20 secondes). Jeûne de 24 heures avant un test comportemental. Les souris seront exposées à 3 tests comportementaux destinés à évaluer le niveau d'anxiété ou de dépression, espacés d'au moins 24h et durant chacun entre 5 et 10 minutes. Certains animaux recevront des injections quotidiennes pendant 1 à 21 jours qui impliquent une contention d'environ 10 à 20 secondes.

Impact sur les animaux

Les chirurgies impliqueront une anesthésie générale d'environ 30 minutes et pourront être suivies d'une douleur modérée au niveau de l'incision pendant les heures qui suivent le réveil. Une partie des animaux subira une deuxième chirurgie pour l'implantation d'une sonde qui implique les mêmes nuisances. Les injections quotidiennes pendant 1 à 21 jours induisent un stress léger d'environ 10 à 20 secondes. Certains animaux seront exposés à des tests comportementaux pouvant induire un stress léger à modéré pendant 5 à 6 minutes. Certains animaux seront exposés à un test qui nécessite une privation de nourriture de 24h, ce qui peut engendrer du stress modéré.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour récupérer le cerveau afin d’analyser les résultats du traitement.

Remplacement

L’objectif du projet est l’étude de comportements complexes, les symptômes de type anxio-dépressifs, sous tendus par des modifications électrophysiologiques et neurobiochimiques du système sérotonine. Pour cela il est indispensable de travailler sur un modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé sur la base de nos études antérieures et est réduit au minimum nécessaire pour obtenir une puissance suffisante pour les analyses statistiques. Afin de limiter le nombre d'animaux, les comportements seront étudiés sur les mêmes individus en prenant soin de limiter le nombre total de tests à 3. De même, les analyses complémentaires seront réalisées sur les souris utilisées pour l'évaluation comportementale.

Raffinement

Les animaux sont habitués à l'expérimentateur lors de 3 séances de manipulation. Les animaux sont suivis de manière quotidienne par du personnel formé au soin. Si une altération de l'état est observée (isolement, baisse du comportement exploratoire, attitude prostrée, expression faciale modifiée, défense à la manipulation), une grille de scoring est utilisée pour déterminer la conduite à tenir. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale. En cas de signes de douleur dans les heures/jours qui suivent , les animaux sont traités par un analgésique.

Choix des espèces

Les souris génétiquement modifiées sont aujourd’hui le principal modèle animal pour l’étude du rôle de certaines protéines dans différentes fonctions biologiques. Dans ce projet, l’utilisation d’un modèle original de souris présentant une perturbation de l'AIS spécifiquement dans les neurones permettra de déterminer le rôle de cette structure sur le comportement émotionnel. Il n'existe pas d'outil équivalent dans une autre espèce. Ce rôle sera notamment déterminé dans un modèle validé d'exposition à un médiateur du stress. Ce modèle présente la particularité de conduite à une résistance aux traitements antidépresseurs conventionnels. Il s’agit d’un modèle de résistance aux antidépresseurs chez l’adulte. Les expériences débuteront sur des animaux âgés de 8 semaines.

65 pigeons bisets domestiques vont être utilisés comme appâts vivants, dont une quarantaine tués par l'aigle qu'ils servent à capturer et vingt-cinq ensuite adoptés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Chaque pigeon est attaché, exposé à la vue du prédateur jusqu'à trente-six heures et isolé, puis, pour la majorité, subit l'approche et l'attaque de l'aigle avant la mort, d'une durée de trois à dix minutes. Le porteur décrit ces contraintes sans détour et prévoit d'euthanasier les rares individus seulement blessés. Il affirme que la capture de proies mortes ne fonctionne pas pour cette espèce et que seuls des appâts vivants permettent d'attirer l'aigle de Bonelli, au nom de la conservation de l'espèce.

Objectifs

Dans le cadre de la conservation de l’Aigle de Bonelli, espèce classée en danger critique d’extinction dans les régions qu’elle habite en France en raison de son petit effectif, une des actions prioritaires est la définition des domaines vitaux de chacun des couples d’Aigle de Bonelli nicheurs en France (actuellement 47 couples) par le suivi par GPS, ceci dans l’objectif de mieux préserver chacun des territoires de chaque couple connu de l'espèce. La récente colonisation de nouveaux sites de reproduction non connus pour avoir été historiquement occupés par l’espèce nécessite d’améliorer notre compréhension des déterminants des domaines vitaux (sélection de l’habitat, proximité avec des couples nicheurs voisins, taille des domaines vitaux…) afin d’anticiper au mieux la colonisation de nouveaux sites favorables non encore connus, et donc non encore protégés. L'Aigle de Bonelli est un grand rapace prédateur, se nourrissant uniquement de proies vivantes (lapins, perdrix, pigeons). La seule manière de capturer les aigles adultes établis sur un territoire de reproduction est de les attirer à proximité d'un piège à l'aide d'une proie vivante qu'ils ont l'habitude de chasser. Nous utilisons donc des pigeons bisets domestiques d'élevage, vivants, attachés par un harnais au milieu du piège pour attirer les aigles.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet portent intégralement sur l'amélioration de la compréhension de l’utilisation des habitats par l'Aigle de Bonelli, espèce classée en danger d'extinction en France par l’Union Internationale de Conservation de la Nature section France (2016). Le but est d’améliorer notre capacité à conserver l’espèce à l’échelle de chacun des sites qu’elle occupe. Pour ce, il faut capturer les aigles pour les marquer et les suivre à l’aide de balises GPS. Les données GPS permettent de déterminer les domaines vitaux et les habitats fréquentés. Nous devons obtenir une connaissance quasi-exhaustive des domaines vitaux de la population française d’Aigle de Bonelli et son utilisation des habitats, afin de protéger au mieux chaque couple de l’espèce nichant en France. Pour connaitre leurs besoins en termes de domaines vitaux (lieux de chasse, de reproduction), la seule méthode possible est la capture d’au moins un adulte par territoire, et l’équipement à l’aide d’un équipement télémétrique (GPS avec transmission des données en GSM). Le but est de maintenir, voire améliorer, la productivité des couples nicheurs, et leur survie; et à terme l'installation de nouveaux couples. Pour ce, nous devons consolider les connaissances scientifiques sur la taille et le fonctionnement démographique et spatiale de la population nationale. Cela nous permettra d'anticiper de potentielles colonisations de nouveaux sites par des mesures de protection préventives, favorisant l'établissement de nouveaux couples.

Procédures

Les nuisances sont les contraintes imposées aux pigeons domestiques (élevés en captivité) utilisés comme appâts vivants pour la capture des aigles. Ces contraintes sont: 1) le transport de l’élevage à l’hébergement, et de l’hébergement au lieu de capture d’aigle (15min à 1h par trajet ; notons que ce sont des oiseaux d’origine domestique, habitués à la présence humaine, et qui ne présentent pas de symptôme de stress pendant ce transport); 2) la contention par attache, dans une place exposée à la vue des prédateurs (max. 36h, avec alimentation et boisson à volonté) ; pendant cette contention, il s'ajoute une contrainte d’isolement: les pigeons sont des espèces grégaires, mais ils seront isolés pendant toute la procédure (transport, habituation par 'appâtage', et capture d'un aigle). Nous n'envisageons pas d'accroître le nombre de pigeons utilisés dans le seul but de réduire cette contrainte d'isolement ; 3) souffrance pendant l’approche puis l'attaque par leur prédateur avant la mort (durée de 3 à 10 min).

Impact sur les animaux

Les aigles n’attaquent pas systématiquement le pigeon dès sa première mise à disposition sur un site de capture. Il faut donc habituer les aigles à venir se nourrir sur le site de capture. Nous estimons qu’au maximum 25 pigeons (38 %) ne seront exposés qu’aux stress de transport et d’attache sur site pendant la phase d’habituation (avec maximum deux expositions par pigeon). Pour les 40 pigeons (62%) qui seront exposés à une attaque par un aigle, dans 98 % des cas, le pigeon sera tué au cours de l'attaque. Dans les 2% de cas restants où le pigeon survivra (0 à 2 pigeons sur les 5 ans du projet), ses blessures seront importantes et nécessiteront une mise à mort immédiate pour abréger les souffrances et la douleur.

Devenir

Le succès de capture étant incertain, sous l’hypothèse de 10 réalisations du scénario ‘réaliste’ (celui nécessitant 7 pigeons par territoire), sur les 65 pigeons à utiliser, nous prévoyons les devenir suivants: 1) 39 (60%) mourront immédiatement de l'attaque par l'aigle; 2) 0 à 2 (2%) seront seulement blessés par l'aigle, et seront euthanasiés immédiatement après l'immobilisation de l'aigle, 3) 25 (38%) ne seront pas attaqués par un aigle, et seront ramenés au lieu d'hébergement entre les sessions d'utilisation, seront mis au repos pour une durée minimale de 4 jours, et seront réutilisés ultérieurement au maximum 1 fois pour une session d’appâtage (évalué comme ‘gravité modérée’). Leur comportement sera surveillé dans la volière. En cas d’apathie ou de d’absence de nourrissage, ils ne seront pas réutilisés et adoptés. En cas de doute, l’avis du vétérinaire sera demandé. En fin de projet, si ces 25 pigeons sont encore vivants, ils seront intégrés dans des élevages de pigeons domestiques maintenus à titre privé (= adoptions).

Remplacement

La capture d’aigles de Bonelli avec des proies mortes, ou de la viande, a été testée mais ne fonctionne pas pour cette espèce qui n'est pas charognarde. Aussi seule l’utilisation d’appâts vivants permet de les attirer dans un piège. Parmi les proies communes pour cette espèce, le pigeon domestique a été sélectionné car disponible dans des élevages. La stratégie nationale de conservation retenue pour l’espèce nécessitant des suivis télémétriques (GPS) sur tous les territoires de l’espèce, y compris les nouveaux territoires, nous n’avons pas de moyen pour nous passer de la capture d’aigles de Bonelli, à l’âge adulte, sur leur territoire de reproduction. Une alternative serait le marquage de poussins, au nid avant qu’ils ne s’envolent, mais ils ne se cantonnent sur des sites de reproduction que 3 à 5 ans plus tard (maturité), ce qui est incompatible avec la durée de vie des balises GPS existantes (2 à 3 ans). De plus, les taux de survie normaux des jeunes et immatures sont assez faibles (0.49% la 1ere année, 0.57% la 2eme année), ce qui reviendrait à marquer 5 fois plus d’oiseaux que nécessaire. Enfin, cela ne répondrait que partiellement au sujet, une partie des nouveaux reproducteurs provenant de la population sauvage d’Espagne (Catalogne), où ils ne seraient pas marqués au nid avant l’envol.

Réduction

Le nombre de pigeons utilisés au cours des 5 ans du projet sera ≤ à 65 (entre 30 et 65), basé sur l'objectif de capturer 1 aigle sur 10 territoires (soit 10 aigles). Pour 1 tentative de capture sur 1 territoire, nous devons utiliser 3 à 7 pigeons, ce nombre dépendant de la rapidité d’habituation de l’aigle à venir s’alimenter sur les pigeons présentés. Pour réduire le nombre de pigeons stressés lors de « l’appâtage », nous réutilisons les pigeons non-prédatés, 1 fois par pigeon, et après ≥ 7 jours de récupération. Une tentative de capture se décompose en 2 phases : HABITUATION puis CAPTURE. 1) La phase d’habituation a pour but d’habituer l’aigle à consommer cette proie à l’endroit choisi, l’habituation étant considérée acquise une fois que l’aigle à prédaté 2 pigeons sur 1 site. Cette phase dure max. 6 jours consécutifs, avec 1 pigeon déposé tous les 2 jours (un même pigeon est déposé un matin et récupéré le lendemain soir si non-prédaté, soit 36h max., et ramené en volière pour récupération). Si l’habituation échoue sur le 1er site, nous recommençons sur un 2ème site. S’il y a à nouveau échec, nous abandonnons la capture et la réessayons l’année suivante. 2) Une fois l’habituation acquise, la phase de CAPTURE démarre. Nous nous donnons 4 jours consécutifs pour réussir la capture, avec 1 pigeon utilisé comme appât. Un pigeon est utilisé sur 14h max. (du matin au soir), puis il est ramené à l’hébergement. Un nouveau pigeon est utilisé le lendemain. Sur la base de l’expérience passée, nous attendons 3 scénarios : 1) scénario ‘idéal’ pour 3 territoires, avec capture dès le 5ème jour (3 pigeons tués), 2) scénario ‘échec total’ pour 1 territoire (3 pigeons stressés, 0 tué), à refaire l’année suivante, 3) scénario ‘réaliste’, avec habituation sur 2 sites, et capture de l’aigle au bout de 3-4 jours, pour 6 territoires + le territoire avec échec total (4 pigeons tués, 3 pigeons stressés). Le produit de ces effectifs par les probabilités de chaque scénario donne 37 pigeons tués et 21 pigeons stressés à deux reprises = 58 pigeons. Sous l’hypothèse de 10 réalisations du scénario ‘réaliste’ (celui nécessitant le plus de pigeons), l’autorisation est demandée pour 65 individus max., correspondant à 40 pigeons tués et 25 pigeons stressés à deux reprises. En cas de prédation par un mammifère terrestre pendant une phase d’habituation (ce qui est très rare), une clôture électrique sera déployée afin de protéger les pigeons à utiliser ultérieurement sur ce même site.

Raffinement

Nous n'utilisons que des pigeons d'origine domestique captive car cela permet qu'ils soient habitués à la présence et la manipulation par l'humain, ainsi qu'à la contention (hébergement en volière, transport, manipulation). Les séances d’habituation et de capture d'aigle n'ont lieu que dans des conditions favorables pour les pigeons (pas de pluie, t° à découvert inférieure à 30°C, pas de fréquentation humaine, p. ex. pas de chasse). De l’eau et de la nourriture sont mises à leur disposition. Il n'y aura donc pas de séance d'habituation et capture en période estivale (mi-juin à fin septembre). L’état du pigeon sur le site de capture pendant les sessions d’habituation sera suivi à distance à l’aide d’un piège photographique communiquant (1 photo transmise par heure par SMS). En cas de pigeon supportant mal l’attache (immobile, hyperactivité, port de tête ou position anormale), nous irons le récupérer le plus tôt possible. Et si le pigeon est encore vivant au bout de 36h (soir du 2ème jour d’attache), nous irons le rechercher, et le remplacerons par un nouveau pigeon, de manière à ce que les pigeons non-prédatés passent au maximum une nuit à l’attache. Lors d’une session de capture, en cas de pigeon uniquement blessé, encore vivant au moment de l’immobilisation de l’aigle (0 à 2 cas attendu sur 5 ans), nous procèderons dès que possible (dans les 3 à 10 minutes, délai déterminé par le comportement de l’aigle) à son euthanasie afin de minimiser son temps de souffrance.

Choix des espèces

Pour qu'une méthode de capture d'un prédateur à l'aide d'appâts soit efficace, il est indispensable d'utiliser des proies naturellement consommées par le prédateur. Nous avons donc choisi le pigeon biset domestique (Columba livia forma domestica), provenant d’élevages, car cette espèce est la plus proche des proies naturelles caractéristiques de l’Aigle de Bonelli (perdrix, pigeons, lapins); et car l'espèce est facilement disponible dans de nombreux élevages. Ces pigeons sont nés et élevés en volière externe et ont l’habitude de la présence humaine à proximité et de la captivité, ce qui réduit leur stress lié aux manipulations et transports. Nous n'utiliserons que des adultes, les jeunes pigeons apparaissant plus stressés par les manipulations et par l'isolement que les adultes.

2 472 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Les animaux subissent dès l'âge d'une semaine une amputation de phalange sur animal vigile, puis une à deux chirurgies d'une à deux heures et demie, des injections intracérébrales de virus, la pose de cathéters et de sondes et des injections répétées, avant d'être tués pour prélever le cerveau. Le porteur qualifie la phalangectomie de "nuisance" et reconnaît le stress des contentions et des chambres de pléthysmographie, tout en affirmant l'absence d'inflammation liée aux virus. Il indique qu'aucune approche autre que l'expérimentation animale n'est envisageable en l'état, espérant que ces données fonderont de futures études in silico.

Objectifs

La respiration et l'activité du cœur et des vaisseaux sanguins sont contrôlées par des réseaux de neurones situés dans une partie du cerveau nommée tronc cérébral. Ces deux fonctions vitales participent ensemble au renouvellement de l’oxygène (O2) et du dioxyde de carbone (CO2) dans l’organisme. Cependant, nous ne savons toujours pas précisément quels sont les mécanismes nerveux qui permettent à l’activité cardiovasculaire de varier pendant la respiration. L’objectif général du projet est d’identifier les neurones impliqués dans ce processus et d’en expliquer les mécanismes. A l’aide de techniques innovantes basées sur l’utilisation de virus modifiés, nous localiserons d’abord ces neurones avec une grande précision dans le tronc cérébral. Ensuite, il s’agira de stimuler les neurones que nous aurons identifiés afin de mesurer les effets physiologiques provoqués. Dans d’autres expériences basées sur des techniques récentes d’imagerie, l’activité électrique de ces neurones sera enregistrée. Enfin, nous chercherons à savoir comment les paramètres cardiovasculaires et respiratoires contrôlés par ces neurones varient dans le cadre de comportements spécifiques. Les expériences proposées devraient permettre de démontrer que les neurones identifiés participent bien au contrôle cardiovasculaire pendant la respiration, notamment grâce à notre capacité de les activer ou les inactiver. Chez l’homme, ce contrôle nerveux cardiovasculaire que nous étudions est présent chez les individus en bonne santé, tandis qu’il est altéré dans de nombreuses pathologies. Notre projet a donc pour ambition de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans ces processus physiopathologiques dans l’espoir de disposer de nouvelles pistes thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le projet de recherche proposé vise a améliorer nos connaissances sur le contrôle nerveux de deux fonctions vitales que sont la respiration et le système cardiovasculaire. Les résultats obtenus devraient permettre d'élucider les mécanismes neuronaux à l'origine de la genèse du rythme respiratoire et du couplage cardiorespiratoire. Plus précisément, il s'agit d'itentifier les populations de neurones qui contrôlent l’activité respiratoire et qui régulent l’activité cardiovasculaire et ainsi de mieux comprendre l’origine de la synergie entre les activités respiratoire et cardiovasculaire. Ces mécanismes sont d’une importance cruciale tant d’un point de vue fondamental que clinique. En effet, le fonctionnement normal de ces systèmes garantit l'oxygénation optimale de toutes les cellules de l'organisme, tandis que l’altération de ces mécanismes conduit à des pathologies mortelles telles que l’hypertension artérielle ou encore l’insuffisance cardiaque chronique. Les explorations fonctionnelles réalisées dans ce projet permettront pour la première fois d’établir une relation de cause à effet entre l’activité des neurones identifiés et le fonctionnement en synergie des activités respiratoire et cardiovasculaire. Ces découvertes pourraient donc permettre d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles et de lutter plus efficacement contre ces maladies. Nous espérons que les données obtenues dans cette étude permettront également de proposer de nouveaux concepts sur lesquels fonder des études in silico.

Procédures

Une biopsie de la phalange distale sera effectuée sur tous les animaux (rats et souris) âgés d'une semaine. En effet, le jour postnatal 7 (P7) semble être l'âge le plus adéquat pour réaliser cette biopsie. Une seule intervention chirurgicale d'une durée comprise entre 1h30 et 2h30 sera réalisée dans deux procédures chez le rat et/ou la souris. Dans les deux autres procédures, deux interventions chirurgicales d'une durée comprise entre 1h30 et 2h30 seront effectuées chez la souris et/ou le rat. Ces deux interventions seront séparées d'une vingtaine ou d'une quarantaine de jours. Selon les procédures, les animaux seront soumis à différents types d’interventions. Tous les animaux recevront une ou plusieurs micro-injections cérébrales de virus modifiés (une seule fois, durée de l’intervention : 20-30 minutes). Chez certains animaux, une ou deux canules optiques intracérébrales seront fixées à la surface du crâne (une seule fois, durée : 45 minutes environ) et un cathéter sera également inséré dans une artère pour mesurer la pression artérielle (une seule implantation fixe, durée : environ 35 minutes). Dans d’autres cas, une sonde de télémétrie sera implantée en sous-cutané chez les animaux pour mesurer l’activité électrique cardiaque (une seule implantation fixe, durée : environ 40 minutes). Chez d’autres animaux, plusieurs injections de composés pharmacologiques seront réalisées par voie intrapéritonéale (fréquence : 2 injections par jour espacées de 12h, pendant 15 jours ; durée d’une injection sous anesthésie légère: 5 minutes). Enfin, pour mesurer les paramètres respiratoires sur le long terme, certains animaux seront d’abord acclimatés dans un pléthysmographe (1h par jour pendant 10 jours), avant de les placer de nouveau dans cet appareil pour les enregistrements chroniques (1h par jour, pendant 2 semaines environ).

Impact sur les animaux

Les nuisances et les effets indésirables attendus sur les animaux sont inhérents à la mise en œuvre de plusieurs protocoles décrits dans le présent projet. C’est notamment le cas de la phalangectomie sur animal vigile qui représente une nuisance et de l’anesthésie qui en soi génère du stress. Le test de contention utilisé afin de mesurer le niveau de stress des animaux génère également du stress. Le fait de placer les animaux dans une chambre de pléthysmographie de manière répétée ou encore d’effectuer plusieurs fois des injections de composé 21 sous anesthésie induit un stress. Dans tous les protocoles, la douleur, la souffrance et le stress liés aux procédures chirurgicales seront réduits à un niveau minimum grâce à l'emploi d'une anesthésie, d'une antalgie et de soins médicamenteux appropriés. Les responsables de projet ont une grande expérience dans la mise en œuvre des techniques de chirurgie et de la prise en charge ainsi que du suivi post-opératoire des animaux. Une réduction transitoire, plus ou moins marquée de l'activité locomotrice est observée pendant 12 à 24h environ suivant la chirurgie. La cicatrisation complète des plans cutanés suturés est observée dans les 5 à 7 jours qui suivent la chirurgie. Enfin, il n'y aura pas de nuisances ou effets indésirables suite à l'injection intracérébrale des virus utilisés dans ce projet. En effet, il s’agit de virus non-réplicatifs dont le génome a été altéré dans le but de ne produire que certaines protéines essentielles à la fonction virale souhaitée (ciblage et manipulation des neurones d’intérêt). Les données de la littérature et notre propre expérience indiquent que les conditions dans lesquelles ces virus sont injectés (niveau de titre, volumes injectés etc.) n'induisent pas d'inflammation notoire au niveau du site d'injection ou ailleurs dans le cerveau (tissu nerveux sain dans la zone d'injection, cellules aux aspects normaux etc).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure. En effet, dans la plupart des cas le cerveau des animaux devra être prélevé dans le but de localiser les neurones d’intérêt. Dans d’autres cas, le modèle expérimental mis en œuvre nécessitera une euthanasie préalable.

Remplacement

Ce projet a pour but d'élucider les mécanismes de genèse du rythme respiratoire et de couplage entre neurones respiratoires et cardiovasculaires. Pour l’instant, les connaissances incomplètes sur le sujet ne permettent pas d’envisager d’approches autres que l’expérimentation animale pour répondre à ces questions (comme une étude in silico par exemple). En effet, il s'agit de mécanismes physiopathologiques fondamentaux pour lesquels il n'existe que très peu ou pas de résultats antérieurs. Cette absence de connaissances a priori sur ces mécanismes explique donc l'incapacité actuelle à modéliser le fonctionnement des réseaux cardiorespiratoires centraux. Nous espérons que les données obtenues dans cette étude permettront de proposer de nouveaux concepts sur lesquels fonder des études in silico.

Réduction

Le présent projet repose sur l’utilisation de techniques modernes, encore jamais employées pour étudier le contrôle central cardiorespiratoire. L'aspect novateur de l'étude garantit des avancées majeures et indispensables sur la physiopathologie de ces systèmes. En particulier, la technique d’enregistrement des activités cellulaires par imagerie du voltage sur la préparation perfusée in situ nous permettra de répondre à de nombreuses questions grâce à la mise en œuvre de plusieurs protocoles expérimentaux. Cela sert le double objectif d’optimisation des aspects scientifiques et éthiques. De plus, la variabilité interindividuelle sera réduite par l’utilisation de souches murines fixées génétiquement. Enfin, une analyse de puissance statistique sera réalisée systématiquement avant chaque expérimentation afin de déterminer le nombre d’animaux nécessaires pour répondre à la question expérimentale. Une fois les expérimentations réalisées, des tests statistiques appropriés permettront de valider ou non la question initiale posée. Les différentes stratégies expérimentales proposées ici nous permettront de réduire le nombre d’animaux utilisés pour servir les objectifs scientifiques de cette étude en utilisant les outils, approches techniques et modèles murins les plus appropriés à chaque partie de l’étude. En particulier l'usage de souches transgéniques chez la souris et le rat, combiné aux approches opto- ou pharmacogénétiques, permet de cibler beaucoup plus spécifiquement les neurones d'intérêt par rapport aux autres techniques existantes, ce qui contribue à la réduction du nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans une animalerie conventionnelle, dans des pièces où la température est contrôlée et dans des cages avec environnement enrichi. Le nombre limite d’animaux par cage sera respecté et les animaux auront accès à l’eau et la nourriture ad libitum. Les animaux seront anesthésiés pour toutes les procédures expérimentales induisant de la douleur, ici des approches chirurgicales. Cette anesthésie, sous forme gazeuse, suit les protocoles standards, notamment pour ce qui concerne les pourcentages de gaz dans l’air lors des phases d’induction et de maintien. Elle sera accompagnée d’une analgésie et d’un suivi post-opératoire rigoureux en utilisant notamment une fiche individuelle de suivi. Les responsables du projet possèdent une grande expérience dans ce domaine.

Choix des espèces

Dans ce projet, deux espèces d’animaux seront utilisées, souris et rats. L’intérêt général de ces deux modèles repose essentiellement dans leur proximité physiopathologique avec l’Homme (transférabilité des résultats), la reproduction rapide des animaux, et les conditions requises pour leur stabulation qui sont relativement peu contraignantes. Le modèle souris présente l’avantage d’être très permissif à la transgenèse, il existe aujourd’hui une banque importante de souris transgéniques qui nous permettra d'identifier précisément les mécanismes en jeu grâce à la variété de recombinaisons génétiques possibles. Le modèle rat présente l’avantage d’être plus robuste physiologiquement que le modèle souris, notamment en ce qui concerne l’approche in situ (voir procédure 3), permettant d’utiliser moins d’animaux (car moins de perte expérimentale) pour chaque objectif expérimental. Les animaux adultes provenant des établissements éleveurs seront maintenus dans l'établissement utilisateur et les expériences seront effectuées sur la descendance. Une biopsie de phalange distale (phalangectomie) sera d'abord effectuée à l'âge d'une semaine (P7), ce qui permettra de réaliser le génotypage et d’identifier ainsi chaque animal. Pour pouvoir comparer les résultats obtenus dans l'ensemble du projet de recherche, toutes les expérimentations reposeront sur des injections virales effectuées à l'âge de trois semaines (P21). A cet âge, le génotype des animaux sera donc connu. Les expérimentations finales des procédures 1, 2 et 4 seront réalisées chez le rat et/ou la souris à l’âge adulte (2-5 mois), et celles de la procédure 3 sera réalisée chez le rat à un stade juvénile (P30-35). Nous cherchons à déterminer les mécanismes générant le rythme respiratoire et le couplage central cardiorespiratoire dans les conditions les plus physiologiques possibles, chez des organismes pleinement développés et non-sénescents. Ces mécanismes sont pour l’instant mieux connus pour les stades développementaux précoces, notamment grâce aux approches in vitro qui ne fonctionnent qu’à ces âges. La préparation in situ, utilisée en procédure 3, est optimale chez le rat juvénile à condition d'être réalisée à P30-35 maximum. C'est donc cette contrainte temporelle qui justifie d'effectuer les injections virales à P21 (sevrage) pour permettre un temps d’expression suffisant des transgènes.