Recherche fondamentale

220 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont mises à jeun jusqu'à seize heures, soumises à un gavage oral d'un colorant puis isolées jusqu'à cinq heures, pour mesurer la motricité intestinale et l'effet du fer héminique apporté par la viande rouge. Divers organes sont prélevés après mise à mort. Le porteur indique réutiliser des souris "surnuméraires" issues de l'élevage et affirme que seule une "approche in vivo intégrée" permet de reproduire l'axe intestin-cerveau.

Objectifs

Le syndrome de l’intestin irritable est l’une des pathologies intestinales chroniques très répandue (10-15% de la population), altérant la qualité de vie des patients par l’inconfort digestif et les douleurs abdominales générées. C’est une cause majeure de consultations médicales dans le monde occidental. Son origine est multifactorielle, mais des facteurs nutritionnels contribuent fortement à l’aggravation des symptômes, notamment en raison des ballonnements causés. Bien que non établit encore chez l'Homme, un lien a été mis en évidence chez la souris entre la consommation de fer héminique, à savoir une source de fer principalement apportée par les produits carnés, et une augmentation de la sensibilité abdominale vis-à-vis d'une pression appliquée sur la paroi du côlon. Une étude est prochainement programmée pour répondre à la question de savoir si la consommation maternelle de fer héminique engendre également cette augmentation chez sa descendance. Pour ce type d’étude s’intéressant à la période périnatale, un calcul est réalisé pour ajuster au minimum le nombre de souris mises en reproduction, mais malgré tout, cette phase d’élevage, de par le caractère aléatoire de l’obtention d’une gestation et de taille des portées, génère des variabilités d’effectif et occasionne la survenue d’individus surnuméraires qui ne sont pas requis pour l’étude. N’ayant pas subi antérieurement de procédure dommageable, l’objectif est de les dédier à la mesure de la motricité intestinale (chez la souris adulte à partir des animaux reproducteurs et de sa descendance si l'effectif est conséquent) pour savoir si elle est altérée ou non par la consommation de fer héminique. Cette mesure de motricité est fréquemment décrite dans la littérature, elle comprend l’évaluation du temps de transit et la fréquence de défécation. Nous avons cependant peu de recul au laboratoire sur sa mise en œuvre chez la souris, particulièrement pour la mesure du temps de transit. Dans ce contexte, ce projet a pour objectif (i) d’ajuster les protocoles détaillés dans la littérature pour nous permettre ensuite (ii) de réaliser la mesure de la motricité intestinale chez la souris en fonction de son régime ou du régime maternel en période périnatale.

Bénéfices attendus

Ces études permettront d’améliorer notre connaissance des processus physiologiques associés à notre santé digestive. Plus spécifiquement, elle permettra de savoir si la sensibilité abdominale augmentée par la consommation de fer héminique est liée ou non à des troubles de la motricité intestinale. Sur le plan de la santé publique, cette étude contribue à mieux préciser (i) les bénéfices/risques associés à la surconsommation de ces produits carnés et (ii) les recommandations nutritionnelles en fer à préconiser aussi bien pour les patients atteints du syndrome de l’intestin irritable que pour la population générale.

Procédures

Les souris de cette étude, ayant reçu jusqu'alors uniquement un régime équilibré supplémenté en citrate de fer ou en fer héminique, subiront (i) une période mise à jeun comprise entre 0 et 16h selon les résultats de la première phase de mise au point du protocole définitif, (ii) un gavage oral par une solution semi-liquide contenant un colorant inerte non absorbable dont l'acte ne dépassera pas 10 secondes, (iii) suivi d’un hébergement en cage individuelle qui ne dépassera pas 5h avant un retour en hébergement conventionnel.

Impact sur les animaux

Pour chaque souris, les nuisances attendues sont une éventuelle baisse de la glycémie liée au jeune, associée à un stress transitoire engendré par (i) les 10 secondes de contention et d’inconfort lors de l’introduction de la sonde de gavage dans l’œsophage, suivi (ii) d'un isolement d'une durée maximale de 5 heures le temps d'attendre l'apparition de fèces contenant le colorant.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les souris seront mises à mort et divers prélèvements seront effectués post-mortem pour des analyses histologiques, biochimiques et moléculaires ultérieures.

Remplacement

De par la complexité des interactions de l’axe intestin-cerveau impliqué dans la motricité intestinale, aucun modèle cellulaire ou de substitution ne permet à l’heure actuelle de reproduire ce processus physiologique pour estimer un temps de transit ou une fréquence de défécation. Seule une approche in vivo intégrée est donc envisageable pour nous permettre de prendre également en compte les processus en amont liés à la digestion en fonction du régime alimentaire.

Réduction

Le nombre minimum requis de souris utilisées pour la reproduction afin d'étudier l’impact d’un régime maternel supplémenté en fer héminique ou en citrate de fer sur la santé digestive de la descendance est calculé au plus juste selon une convention établie dans le cadre des études développementales (concept de la DoHAD). Malgré tout, cette phase d’élevage occasionne des individus surnuméraires qui ne sont pas utilisés pour les procédures dédiées à l'étude principale (sensibilité abdominale). Nous prévoyons d’optimiser la présence de ces souris surnuméraires pour les dédier à l’évaluation de la motricité intestinale en fonction du régime déjà reçu, et ainsi éviter le recours à la réception de nouvelles souris. Pour la phase de mise au point de la méthode, aucune statistique n’est requise et nous prévoyons des très petits groupes de 2 à 3 souris. Pour appliquer le protocole finalisé au projet destiné à évaluer l’impact de la surconsommation de fer héminique (exposition chez l’adulte et en période périnatale), un nombre optimal de souris basé sur les données de la littérature (6 souris par groupe) a été retenu.

Raffinement

Pour assurer une fiabilité des résultats tout en limitant le nombre d’animaux utilisés, une attention particulière est accordée au bien-être de l’animal : un hébergement collectif maximisé, un environnement contrôlé, le respect du cycle jour nuit, des manipulations douces d’habituation lors des pesées hebdomadaires. Des buchettes en peuplier disposées sur la litière leur permettront de satisfaire le besoin de ronger. Un abri en aluminium leur permettra de s’y loger. Une observation des souris à l’occasion du nourrissage quotidien permettra de détecter toute anomalie éventuelle, et ainsi minimiser la durée de toute souffrance constatée par des soins appropriés. Plus spécifiquement au cours de la procédure, nous veillerons à minimiser le stress de l’isolement : des cages transparentes de petite taille seront alignées et laissées sans couvercle filtrant pour maximiser les échanges visuels, olfactifs et auditifs. Les buchettes de peuplier à ronger habituellement présentes, l’eau et le régime seront également remis à disposition sur la période d’isolement. Une personne expérimentée réalisera le gavage pour limiter la durée de l’inconfort lié au stress de contention et à l'introduction de la sonde de gavage dans l’œsophage, et prendra soin de surveiller continuellement le comportement de la souris durant les 5 heures suivantes (l’observation étant également requise pour détecter l'apparition de fèces colorés).

Choix des espèces

Les travaux antérieurs de l’équipe avec la lignée de souris choisie permettent d’avoir maintenant une bonne base de connaissance de sa barrière intestinale, son microbiote, son système immunitaire et de sa sensibilité abdominale. Ces souris se distinguent également par leur comportement maternel et le soin qu’elles apportent à leur portée. Pour l’analyse de la motricité intestinale, les animaux seront tous âgés de 9-10 semaines car il est indispensable d'avoir un tractus digestif à pleine maturité physiologique.

2 540 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses par voie sous-cutanée ou, sous anesthésie, directement dans le pancréas, puis jusqu'à 24 injections sur huit semaines, la tumeur pouvant induire "un dysfonctionnement léger de la fonction pancréatique". Même les animaux dont la tumeur ne s'est pas développée sont tués. Le porteur indique avoir déjà obtenu et breveté des résultats in vitro, tout en concluant qu'ils "ne permettent pas de récapituler la complexité d'un organisme vivant complet".

Objectifs

Nous avons identifié une stratégie médicamenteuse qui stimule l'activation de l'immunité, tout en diminuant les toxicités classiquement associées. Nous proposons de prouver la validité de cette stratégie thérapeutique en évaluant sa capacité à induire des réponses anti-cancéreuses et en mesurant les toxicités potentielles associées dans des modèles de cancers réfractaires à l'immunothérapie. Dans ce cadre, nous nous concentrerons sur le cancer du pancréas et le cancer de la peau menant à des métastases, cancers au pronostic sombre pour lequel l'immunothérapie représente un fort espoir thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce programme de recherche vise à approfondir la compréhension d’une stimulation de l'immunité innée au cours d’un traitement par immunothérapie. Nous déterminerons notre combinaison médicamenteuse présente un effet supérieur sur la réponse inflammatoire anti-tumorale en comparaison à l'utilisation des médicaments utilisés seuls. Les résultats de ce programme pourraient avoir un impact significatif sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les cancers réfractaires à l'immunothérapie et ouvrir la voie à des thérapies plus efficaces et mieux tolérées pour les patients.

Procédures

Gestes techniques de cette demande sont les suivants : - injection de cellules cancéreuses en sous-cutanée (10 minutes) - chirurgie/injection de cellules cancéreuses en intra-pancréatique (30 minutes) sous anesthèsie - injection en intrapéritonéal sur animal vigile (20 secondes) = anticorps ou luciférine - injection en péritumoral sous-cutanée sur animal vigile (20 secondes) = anti douleur, anticorps ou traitements pharmacologiques. Au maximum un animal recevra : soit (i) - 1x chirurgie/injection de cellules cancéreuses en intra-pancréatique (20 minutes) sous anesthèsie -2x injection en sous-cutanée sur animal vigile (20 secondes) - 24x injection en intrapéritonéal sur animal vigile (20 secondes) sur une durée de 8 semaines soit (ii)- injection de cellules cancéreuses en sous-cutanée (10 minutes) - 24x injection en péritumoral sous-cutanée sur animal vigile (20 secondes)

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie (injections de cellules en intra-pancréatiques) les animaux pourraient ressentir de la douleur à la zone d'incision et d'injection et avoir un peu de difficulté à accéder à la nourriture. La présence d'une tumeur sur le flanc peut limiter les mouvements de la souris. La présence d'une tumeur en orthotopique (pancréas) peut induire un dysfonctionnement léger de la fonction pancréatique.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés. Les animaux dont la tumeur ne s'est pas développée seront également euthanasiés, en effet ces animaux auront subi des changements dans leur immunité ne permettant pas leur réutilisation.

Remplacement

Dans le cadre du remplacement, visant à réduire l’utilisation de modèles animaux dans les procédures expérimentales, nous avons déjà réalisé des expériences in vitro permettant de mettre en évidence un l'effet synergique entre deux molècules. Ces résultats ont été brevetés par notre équipe. Ces résultats très encourageants obtenus en culture cellulaire ne permettent pas de récapituler la complexité d'un organisme vivant complet.

Réduction

Une étude statistique préalable et un nombre adapté de souris par groupe expérimental nous permettent de réduire le nombre d’animaux utilisé. Ainsi la taille des groupes a été déterminé via lun logiciel statistique et le nombre minimal d’animaux par groupe doit être de 8 à 10 animaux . De plus les études antérieures menées par le groupe, nous permettent également d’estimer d’une moyenne de 10 animaux par groupe expérimental est nécessaire et suffisant pour générer des données statistiquement robustes tout en prenant en compte une éventuelle variation inter-individuelle ou expérimentale. Les prélèvements d’organes qui se feront après euthanasie des animaux.

Raffinement

Toutes les mesures susceptibles de prévenir tout effet impactant le bien être des individus seront mise en oeuvre durant la durée du projet. Les animaux seront sous surveillance quotidienne et pesés une fois par semaine. En préchirurgie les animaux recevront une dose d'antalgique et en post-chirurgie de la nourriture et de l'eau gélifiée seront posés à même le sol afin de leur permettre de se nourrir facilement en post-chirurgie. Les animaux seront placés en cage de minimum 4 individus avec maisonnette plus du coton afin de combler les besoins physiologiques et comportementaux des animaux. Enfin des points limites ont été établis afin de pouvoir surveiller au plus près les altérations dues aux procédures prévues dans le présent projet.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle expérimental de référence pour ce type d'expérience de greffes de cellules cancéreuses. Des souris de 7 à 12 semaines seront utilisées en début de manipulations expérimentales afin d’avoir des animaux adultes (d’âge mûr).

778 souris vont être utilisé·es, la plupart tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau et 90 réutilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent une biopsie de la queue et la pose d'une bague auriculaire sous anesthésie, et 216 passent des tests de motricité et de sociabilité, pour étudier une mutation génétique liée à l'autisme. Les bénéfices annoncés, un diagnostic précoce et une meilleure prise en charge des patients, sont renvoyés au conditionnel et au long terme ("à terme", "pourrait"). Le porteur affirme que l'étude comportementale ne peut être reproduite en culture cellulaire ou en modèle informatique.

Objectifs

De nombreuses études génétiques montrent que la famille de gène à laquelle le gène d'intérêt de ce projet appartient, participe activement au développement embryonnaire ; ils sont pour la plupart impliqués dans des maladies génétiques rares affectant le neurodéveloppement. Au moins 3 d’entre eux sont responsables de troubles du spectre autistique qui souvent sont associés à des troubles moteurs. Le gène d’intérêt que l’on souhaite étudier dans ce projet est l’un des rares à ne pas avoir encore été formellement relié à une maladie génétique et reste à ce jour très peu étudié. Plusieurs études semblent toutefois montrer son implication dans des troubles moteurs et potentiellement dans l’autisme. Dans ce contexte, nous souhaitons caractériser le développement neuronal, le développement moteur et la sociabilité des souris génétiquement modifiées pour ce gène d’intérêt.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre à court terme d’infirmer ou de confirmer l’implication de ce gène dans les troubles du spectre autistique et de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques impliqués dans les troubles sociaux et moteurs engendrés par la mutation du gène d’intérêt. A terme, ce projet pourrait permettre de poser un diagnostic précoce ainsi qu’une meilleure prise en charge à plus long terme des patients.

Procédures

Toutes les souris (778) auront une biospie d’un petit bout de queue pour l'identification génétique des souris et la mise en place d’une bague auriculaire sous anesthésie au moment du sevrage. Sur les 778 souris du projet, 144 auront une prise de sang terminale sous anesthésie générale avec antalgiques (durée de 2 min). 216 souris seront pesées régulèrement (1 pesée par semaine, d’une durée de 10 secondes maximum par pesée, 30 fois maximum). Les 216 souris vigiles seront soumises à des tests de motricité et d'évaluation de leur sociabilité ; à l'âge de 28 jours dans la même journée, les souris auront 2 sessions d'une durée maximale de 30 secondes ; entre l'âge de 45 et de 50 jours puis entre 135 et 150 jours, les souris subiront 4 tests d'une durée maximale de 10 minutes pour les 3 premiers tests et de 35 minutes pour le quatrième test. Les tests seront réalisés sur 4 jours consécutifs avec 1 test par jour.

Impact sur les animaux

(1)Une légère altération de la motricité et la sociabilité ,(2) un stress léger et transitoire lié au réveil suite à l’anesthésie et une légère douleur transitoire suite à la biopsie tissulaire (sous anesthésie). (3) L'ensemble des tests de motricité et d'évaluation de la sociabilité évaluant le développement et la motricité générale pourront engendrer un stress léger et transitoire lié à la manipulation chez les souris.

Devenir

La plupart des animaux seront mis à mort notamment pour des prélèvements du cerveau. 90 seront maintenus en vie et réutilisés dans d'autres projets.

Remplacement

Le projet comporte une étude comportementale (sociale et motrice) qu’il est impossible de reproduire en culture cellulaire ou en modèle informatique dans l’état des connaissances actuelles. Il n’existe pas de modèle in vitro ou in silico pour réaliser ce projet. Ces approches nécessitent la présence du réseau neuronal qui est uniquement accessible dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants.

Réduction

Nous minimiserons le nombre d'animaux utilisés par des méthodes expérimentales validées et reproductibles, en ayant recours à des analyses statistiques pour l’interprétation des résultats obtenus. Le nombre d'animaux par lot a été calculé en tenant compte de la variabilité des résultats dans d'autres modèles animaux d'autisme et de troubles moteurs. De plus nous mettrons en place une stratégie d’accouplement restreinte au juste nécessaire en réalisant les accouplements par étapes successives jusqu’à obtention du nombre d’animaux nécessaires à nos études.

Raffinement

Toutes les phases du projet seront réalisées par des personnels expérimentés. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide dans le suivi des points limites stricts et précis et des critères d’intervention et d’arrêt suffisamment précoces. Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Après leur naissance, les animaux resteront avec leur mère jusqu’au sevrage (J21), hébergés en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) avec un enrichissement dans la cage fournie par l’animalerie (matériel de nidification et des tunnels pour leur permettre de se cacher) avec accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les souris seront observées jusqu’au sevrage, puis seront hébergées par groupe de même sexe de 3 à 5 animaux issus de deux portées par cage. La mise en place de la boucle d'oreille pour identification et la biopsie tissulaire sera réalisé sous anesthésie gazeuse. La prise de sang sera réalisée sous anesthésie avec une couverture antalgique. Les animaux seront placés en habituation dans la pièce de comportement minimum 30 minutes avant le début des tests.

Choix des espèces

Les rongeurs ont un système nerveux moteur proche de l’Homme. Les troubles autistiques peuvent être reproduits chez la souris. Les souris seront incluses dans le projet dès leur naissance et utilisées entre l'âge de 28 jours (correspondant au sevrage) et 150 jours (âge adulte). Nous cherchons à montrer que le gène étudié est impliqué dans une maladie neurodéveloppementale, il est donc nécessaire de réaliser une étude longitudinale (des premières étapes du développement au stade adulte), afin d’objectiver le phénotype ataxique qui pourrait survenir dans un stade de la vie plus tardif. Une étude chez la souris âgée fera l’objet d’un autre projet qui sera entrepris en fonction des données préliminaires obtenues dans cette présente étude.

800 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent de multiples injections, jusqu'à douze prélèvements de sang à la queue et une perfusion intracardiaque décrite comme une "douleur modérée", certaines étant rendues diabétiques, pour étudier la communication entre cellules immunitaires et réseau nerveux des îlots pancréatiques. Les organes sont prélevés après mise à mort. Le porteur indique que ce dialogue "n'a jamais été étudié" et affirme que les modèles animaux sont nécessaires pour analyser plusieurs organes à la fois.

Objectifs

Dans le pancreas, les ilots de Langherans sont centraux dans la régulation du glucose dans le sang. Ces micro-organes produisent les hormones permettant de réguler le taux de glucose. Des cellules immunitaires sont présentes dans les ilots et jouent une rôle important dans leur fonction. Comme tous les tissus, les ilots sont reliés au cerveau par le système nerveux périphériques. Cependant, la communication entre les cellules immunitaires et le réseau nerveux n’a jamais été étudié et son rôle dans la fonction des ilots pancréatiques n’est pas bien connu. Dans ce projet nous proposons d’étudier les mécanismes de communication entre les cellules immunitaires et le réseau nerveux des ilots pancréatiques ainsi que le rôle de ces moyens de communications dans la fonction des ilots en condition normal et diabètique, une maladie caractérisée par une dérégulation du glucose dans le sang.

Bénéfices attendus

Il est aujourd'hui admis que les cellules immunitaires jouent un rôle primordial dans la régulation du taux de glucose sanguin par le gras et le foie. Les cellules immunitaires présentes dans les ilots pancréatiques n'ont elles été décrites que tardivement et les contraintes liées à leurs techniques d'analyse font qu'elles restent encore très peu connues. La communication entre les cellules immunitaires et le système nerveux a été montrée comme primordiale dans la fonction de multiples organes. Cependant, de part la difficulté d'étudier les cellules immunitaires des ilots pancréatiques, ces moyens de communications n'ont pas encore été décrits dans les ilots. Ce projet permettra de mieux comprendre les moyens de communication entre cellules immunitaires et réseau nerveux dans la fonction ilots pancréatiques et leurs implication dans la régulation du taux de glucose sanguin.

Procédures

9 injection intra-péritonéale (20s), 1 injection sous-cutanée, 1 injection intra-veineuse, 12 prélèvement de sang à la queue (3s), 1 anesthésie gazeuse (10min), 1 perfusion intra-cardiaque.

Impact sur les animaux

-Injections intrapéritonéale (ip) : douleur légère due à la piqure. -Injection iv rétro-orbitale (iv) : gêne, douleur légère au point de prélèvement. Les animaux sont sous anesthésie gazeuse au moment du prélèvement. -Injection sous-cutanée (sc) : douleur légère due à la piqure. -Diabète : prise de poids progressive. Les souris peuvent devenir moins actives. Le souris urinent plus souvent. - Perfusion intra-cardiaque : Douleur modérée. Les souris recevront un analgésique opioïde 15min avant la procédure. - Micro-coupure à la queue : douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement des organes d'intérêts.

Remplacement

Cette étude a pour but d'étudier la communication entre les cellules immunitaires et le système nerveux des ilots pancréatiques en condition normale et de dérégulation du taux de glucose sanguin, tels que le diabète. Les ilots pancréatiques répondent à la prise de poids et au dialogue entre différents organes. Cela implique donc d’étudier différents paramètres dans différents organes. Ainsi les modèles animaux sont nécessaires pour mener à bien ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé pour permettre l’analyse des résultats selon des tests statistiques adaptés. Des tests in vitro ont été inclues pour mettre en place des protocole adaptés et réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Dans les cages les souris bénéficient de coton et de « maisons » afin d’augmenter la diversité de leurs activités et qu’elles puissent se construire un nid. Les animaux seront hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum). Lorsque nécessaire, la douleur et la gêne des souris sont réduites à un niveau modéré par l’administration d’anti-douleur et par l’anesthésie. Les souris sont surveillées régulièrement et lors des procédures, les paramètres de santé qui peuvent être affectés sont évalués et notés régulièrement. Les souris diabétiques urinant plus souvent, pour permettre une bonne hygiène des souris les cages seront changées deux fois par semaines.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal de référence dans l'étude de l'obésité. De nombreux outils sont disponibles chez la souris. Les souris sont utilisées entre l’âge de 10 jours et 22 semaines.

640 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules de mélanome, six injections d'immunothérapie et un prélèvement de sang par voie rétro-orbitaire, la tumeur pouvant "gêner le déplacement de l'animal". Les tumeurs sont récupérées après mise à mort. Les retombées annoncées pour les patients, améliorer la prise en charge du mélanome métastatique, restent renvoyées au conditionnel et au long terme, le porteur affirmant que seul un modèle in vivo permet d'étudier la résistance aux traitements et le système immunitaire.

Objectifs

Le mélanome est la forme la plus agressive des cancers de la peau. Malgré les progrès majeurs apportés par l'essor des immunothérapies, près d’un patient sur deux résiste encore aux traitements. Il demeure donc crucial de comprendre les mécanismes de résistance mis en place par les cellules cancéreuses et de proposer de nouvelles combinaisons thérapeutiques. L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet d’une combinaison de traitement par immunothérapie sur 2 modèles murins de mélanome, et d’appréhender les mécanismes d’action de ces anticorps sur le système immunitaire et les cellules tumorales.

Bénéfices attendus

Le mélanome métastatique est le cancer de la peau le plus agressif. Malgré l’essor récent des immunothérapie dans le traitement du mélanome, des problèmes de résistance sont observés. Tester de nouvelles pistes de combinaisons thérapeutiques avec l’immunothérapie permettrait à terme d’améliorer la prise en charge des patients.

Procédures

Dans ce projet, les animaux seront soumis à 1 injection sous-cutané de cellules de mélanome, qui se fera à 2 manipulateurs et durera moins d'une minute. Ils subiront également 6 injections d’immunothérapie, réalisées en intra-péritonéal, à raison de 2 injections tous les 2 jours. L'injection durera environ une dizaine de seconde. Les animaux subiront aussi un prélèvement sanguin par voie rétro-orbitaire. Le prélèvement se fera sous anesthésie et durera moins d'une minute.

Impact sur les animaux

Le traitement par immunothérapie, déjà utilisé dans des précédents protocoles pour d’autres types tumoraux, n'induit pas d'effet secondaire entrainant une dégradation de l'état général de l'animal. Les nuisances attendues sont l'apparition de tumeur localisée sur le flanc droit qui pourra possiblement gêner le déplacement de l'animal. Le prélèvement rétro-orbitaire pourra aussi provoquer une irritation de l'oeil.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les tumeurs pour des analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Seul un modèle in vivo chez l’animal peut permettre d’étudier la capacité tumorigénique et la résistance aux traitements dans une tumeur. En parallèle, des analyses complémentaires seront réalisées in vitro dans des lignées de mélanome, et sur des prélèvements tumoraux de patients, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Cependant, ces modèles ont des limites et ne permettent pas l'étude du système immunitaire. C’est pourquoi le recours aux animaux est nécessaire dans notre projet.

Réduction

Le nombre maximal de souris utilisées dans ce projet a été calculé au minimum pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et reproductibles. Notre projet sera réalisé dans un premier temps sur la moitié de l'effectif prévu, et si les résultats sont satisfaisants, nous poursuivrons sur le reste de l'effectif.

Raffinement

La bonne connaissance des modèles expérimentaux, le suivi adapté des points limites précoces et clairement définis, et la manipulation des animaux par des personnes compétentes en expérimentation animale permettent de limiter au maximum toute douleur ou souffrance des souris. Nous évaluerons l'état de bien-être ou de souffrance des animaux au minimum 2x/semaine. Une anesthésie sera réalisée avant le prélèvement rétro-orbitaire afin de diminuer le stress généré, et des gouttes de Collyr seront appliquées afin de prévenir une irritation de l'oeil.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus pertinente pour l’étude du mélanome. Bien qu'il existe certaines différences entre l'immunologie murine et humaine, d'innombrables découvertes chez la souris sont transposables chez l'homme. Le modèle murin de mélanome que nous utilisons miment bien la pathologie chez l'homme. D'autre part, la richesse des réactifs disponibles (notamment immunothérapie) permet une compréhension très approfondie des phénomènes mis en jeu du niveau moléculaire au niveau de l'organisme, un atout déterminant dans notre projet. Des souris adultes de 6 semaines (âge standard pour ce genre d'étude) seront utilisées.

54 miniporcs vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de la paroi abdominale sous anesthésie générale d'environ 1h30 avec implantation de deux prothèses, un suivi par IRM et des prélèvements de sang à huit reprises sur dix-huit mois. Les prothèses sont explantées après mise à mort pour analyse. Le porteur justifie le cochon par la transposition des techniques chirurgicales à l'Homme et invoque une directive européenne incitant à produire des "preuves in vivo" pour les dispositifs implantables.

Objectifs

Les hernies et des éventrations sont des pathologies les plus fréquentes de la paroi abdominale (PA). La surpression naturelle de la cavité abdominale pousse le péritoine à travers une zone de faiblesse acquise ou congénitale de la PA vers les tissus sous-cutanées pour créer un sac dans lequel une partie des viscères viennent se loger. Le traitement est chirurgical. L'utilisation de prothèse textile de renfort de paroi est largement adoptée dans le monde. Leur utilisation a permis de réduire de 20% le taux de récidives comparé à la technique de réparation par suture direct. Malgré cela, le taux de récidive demeure élévé (10 à 15%) et de nombreuses complications sont encore signalées (douleur chronique, infection, sérôme). La discordance à l'interface biomatériau-tissu hôte est la principale cause de récidives et de complications postopératoires. Parmi les facteurs affectant l'intégration à l'interface de l'implant et le tissu biologique, il y a la réponse inflammatoire exagérée, la mauvaise recolonisation de l'implant par le tissu biologique ou l'absence de ferméture de la couche myofasciale antérieure. La nature de la réaction immunitaire générée par les macrophages par la présence de l'implant (réponse au corps étranger) semble jouer un rôle déterminant, qui régule l’homéostasie du tissu conjonctif pariétal (TCP) et la fonction des cellules musculaires. Lorsque celle-ci est pro-inflammatoire, il y a formation de fibrose persistante autours de l'implant générant un tissu cicatriciel inflammatoire. En revanche, une réaction anti-inflammatoire est pro-régénératrice conduit à un remodelage des tissus et la néo-formation d'un tissu conjonctif sain autours de l'implant. De façon intéressante, il apparait que l'utilisation de prothèses de renfort de paroi à base de matériaux biosynthétiques résorbables présentent une meileure tolérence clinique. Nos données in vitro indiquent que les prothèses résorbables et partiellement résorbables à base du biopolymère résorbable en acide lactique, le PLLA (Poly-L-Lactic Acid) favorisent la réponse anti-inflmmatoire des macrophages. Selon la littérature, le lactate (produit lors de la résorption du PLLA) oriente les macrophages vers un état anti-inflammatoire. Par cette étude préclinique; chez le miniporc, nous souhaitons évaluer les réponse biologiques et biomécaniques ces prothèses en PLLA in vivo implantées dans la région ventro-caudale et notemment de la nature de la réponse inflammatoire du tissu pariétal de l'hôte.

Bénéfices attendus

Les hernies et les éventrations demeurent un problème de santé majeur dans le monde, accentuée par le vieillissement de la population et l'augmentation des facteurs de co-morbidités (diabète, obésité, tagagisme...) qui complique la prise en charge chirurgicale de cette pathologie de la PA. En France, on dénombre plus de 45000 cures de hernies réalisées en 2017, et ce nombre a augmenté de 33% au cours des 5 dernières années. Cette étude préclinique permet d'apporter un regard scientifique sur les différentes prothèses de renfort de paroi afin d'améliorer leur indications en clinique. De plus, par cette approche fondamentale, cette étude permettra d'apporter des élements de preuve in vivo de leur effets sur le plan de la reconstition du tissu biologique pariétal en favorisant la réponse anti-inflammatoire pro-régénératrice. A cela se rajoute l'étude de leur comportement biomécanique permettant de mieux comprendre le fonctionnement de la prothèse textile une fois implantée dans le PA. De plus, l’impact du facteur mécanique dans l’intégration à l’interface est très peu évalué. En effet, il y a un manque de données sur comportement de la prothèse une fois implantée et sur son adéquation avec le comportement biomécanique de la paroi abdominale. Ce qui suggère qu’il est nécessaire de connaître précisément les propriétés de la PA lésées ou après agression chirurgicale (propriétés mécaniques, orientations, hétérogénéités de la zone considérée) en présence de nos prothèses en PLLA. Ces données précliniques vont ainsi alimenter les besoins cliniques dans la cure des hernies abdominales primaires et incisionnelles, en apportant au chirurgien un choix éclairé par des critères rationnels afin de limiter les risques de complications, douleurs chroniques et récidives.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une chirurgie de la paroi abdominale sous anesthésie générale par laparotomie avec l'implantation de prothèses de renfort et de réfection de paroi en position extra-péritonéale (sans rentré dans l'abdomen). La durée moyenne de la chirurgie est estimée à 1h30, de la prémédication et l’anesthésie de l’animal à la fin de la procédure d’implantation. La durée de l’examen d’imagerie médicale IRM est 20 minutes environ. Un seul tube de sang (volume de 5 ml) sera prélevé au niveau de la veine de l’oreille sur tous les animaux à 8 temps différents : 1. lors de l’intervention chirurgicale (préopératoire) 2. 7 jours post-opératoire 3. 15 jours post-opératoire 4. 1 mois post-opératoire - 3 mois post-opératoire -. 6 mois post-opératoire - 12 mois post-opératoire -18 mis post-opératoire. La procédure de prélèvement est la suivante. Après avoir nettoyer le site de prélèvement avec de l'alcool, un garrot à la base de l'oreille est réalisé pour visualiser la veine, en commençant le plus possible au bout de l'oreille. Au total, la réalisation de cette recherche nécessite l'utilisation de 54 miniporcs adultes (50 - 60 kg) sur une durée maximale de 5 ans

Impact sur les animaux

1) Les effets indésirables attendus liés à la chirurgie peuvent être : - douleur postopératoire, - appation d'hématome, - infection du site opératoire - mauvaise cicatrisation de la plaie chirurgicale. - occlusion intestinale avec un risque élevé de péritonite avec un risque faible du fait que les prothèses sont implantées en position extra-péritonéale. 2) Les effets indésirables attendus liés à l'examen d'IRM : des réactions imprévisibles au produit de contraste ne sont pas exclues. Elles sont habituellement passagères et bénignes : - sensation de chaleur dans tout le corps - goût étrange dans la bouche, pendant moins d’une minute ; - nausées durant quelques secondes (voire, plus rarement, vomissements) ; - apparition d’un petit hématome cutané lié à la piqûre (sans gravité, il se résorbe de lui-même en quelques jours) ; - fuite sous-cutanée du produit de contraste, au niveau de la veine, due à la pression durant l’injection.

Devenir

A la fin de chaque protocole, tous les animaux seront euthanasiés pour l'explantation des prothèses afin de réaliser d'une part une analyse moléculaire et histologique des tissus de la paroi abdominale autours de la prothèse (tissu prothétique) et d’autre part, analyse biomécanique de chaque prothèse explantée. En cas de point limite portant atteinte au bien-être de l’animal, celui sera également euthanasié.

Remplacement

La nouvelle directive 93/42/EEC incite les fabricants de dispositifs implantables de plus de 30 jours à collecter des preuves in vivo permettant de démontrer non seulement la sécurité du produit mais aussi son efficacité. Tels sont les objectifs de notre recherche préclinique sur le miniporc, démontrant : 1) l'implantation du prototype (nouveau produit) de prothèse de renfort de paroi 100% résorbable en PLLA présente une sécurité et l'innocuité à long terme sur un modèle animal relevant et proche de l'Homme. 2) les bénéfices sur le plan biologique de l'utilisation de biomatériau résorbable PLLA dans la confection des prothèses partiellement ou totalement résorbables avec à l'appui les mécanismes biochimiques et moléculaires sous-jacents dans un système biologique intégré du tissu pariétal vivant. Ces effets biologiques porteront sur la régulation positive de l'inflammation permettant un remodelage tissulaire des tissus lésés de la PA antérieure pathologique (hernie) en rapport avec la cinétique de résorption du PLLA dans les conditions physiologiques transposables en clinique. 3) le comportement biomécanique des prothèses une fois implantées et incarcérées dans le tissu pariétal.

Réduction

La réalisation des procédures par un chirurgien clinicien rompu à ces manipulations garantit une bonne reproductibilité et permet de limiter le nombre d’animaux à engager dans les protocoles. Par ailleurs, afin de limiter le nombre d’animaux nécessaire, nous envisageons dans cette recherche à implanter deux différentes prothèses dans la paroi abdominale sur un même animal. De plus, la procédure expérimentale est parfaitement maîtrisée permettant une évaluation efficace de l’innocuité d’un candidat-implant et ses fonctions attendues.

Raffinement

La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance de l’animal. Les miniporcs seront hébergés dans un environnement en accord avec la norme européenne 2010/63/UE et donc répondant à leur besoins physiologiques (Température entre 10-21°C, avec un cycle lumière 12h:12h) et éthologiques (taille des boxes, enrichissements...). Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long de l’étude, avec un suivi journalier des miniporcs sur leur hydratation, la prise alimentaire ainsi que leur état générale (agressivité, prostration…). Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale avec l’usage d’analgésie afin de limiter la douleur post-opératoire. Celle-ci est ponctuelle et est réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Les animaux seront particulièrement surveillés après l'implantation des différentes prothèses de renforts pour visualiser tout signe d’intolérance ou de complications post-opératoire imprévues qui nécessiteraient la mise à mort de l’animal. Les équipes impliquées dans le projet sont constituées de spécialistes des approches in vivo, ce qui assure des pratiques expérimentales maitrisées, ainsi qu'un soin et un hébergement des animaux dans des conditions optimales. Médecins chirurgiens, vétérinaires et animaliers spécialisés associeront leurs compétences pour assurer la meilleure prise en charge des animaux après chaque procédure. L’examen rapproché des animaux opérés est réalisé quotidiennement notemment au niveau du site de l’implantation des prothèses, qui permettra de déceler rapidement une complication post-opératoire en lien avec le matériel prothétique.

Choix des espèces

Le modèle animal est souvent utilisé dans les études précliniques des hernies ventrales ou inguinales avec l’utilisation de nouvelles prothèses de renfort de paroi. Les procédures d’implantation sont toutes effectuées en une seule opération. L’espèce animale utilisée pour cette recherche est le miniporc. Celui-ci permet une transposition des techniques chirurgicales utilisées en pratique clinique courante chez l'Homme et de démontrer l’efficacité fonctionnelle de la candidat-prothèse de renfort à traiter la hernie abdominale. En général, des animaux mâles et femelles seront utilisés indifféremment dans ce projet, en adéquation avec l’hétérogénéité de la clinique. De façon exceptionnelle, des femelles seront fortement privilégiées dans les études sur les hernies ombilicales afin de réduire le risque de l'infection de la cicatrice abdominale liée à la chirurgie. Celle-ci est à proximité de l'appareil génitale chez le mâle, qui risque d'être sous les jets d'urine lors de la miction.

24 souris Hairless vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois formulations à principe actif leur sont appliquées quotidiennement sur le dos pendant 14 jours, ce qui "pourrait induire avec le temps le développement de rougeur (érythème) ou de gonflement (œdème)". La peau est prélevée après mise à mort pour évaluer la tolérance cutanée et la biodistribution. Le porteur affirme que le remplacement "n'est pas envisageable", aucun modèle cellulaire ne reproduisant selon lui le microenvironnement cutané sur un temps prolongé.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont d’évaluer chez la souris la tolérance cutanée et la biodistribution dans la peau de 3 formulations différentes appliquées quotidiennement sur le dos des souris pendant 14 jours consécutifs. Chacune des 3 formulations à évaluer possédera un pricincipe actif différent mais avec les mêmes composants permettant une meilleure diffusion et distribution dans le tissu cutané. Pour effectuer l’évaluation de la tolérance de ces 3 formulations, en comparaison avec une formulation neutre dépourvue de principe actif, une observation quotidienne de la zone traitée sera effectuée avec un scorage de différents paramètres. Un suivi pondéral régulier des souris et une observation de leur comportement seront effectués au cours des 14 jours de traitement. A l’issue des 14 jours de traitement, un prélèvement cutané au niveau de la zone d’application des différentes formulations sera effectué afin de réaliser un ensemble d'analyses qui permettront de caractériser la tolérance, par le tissu cutané, des traitements effectués, et la biodistribution dans la peau des produits appliqués. Cette étude permettra ainsi de sélectionner la formulation ayant la meilleure tolérance cutanée et la meilleure biodistribution au niveau du tissu cutané pour la réalisation d’une étude d’efficacité sur un modèle de lésion précancéreuse de la peau (kératose actinique).

Bénéfices attendus

La kératose actinique est une lésion cutanée développée à partir de cellules constituant 90 % de la couche superficielle de la peau (épiderme), est dont les deux facteurs de risque principaux sont l’exposition solaire avec les rayonnements ultraviolets, ainsi qu’une peau sensible, personnes ayant une peau et des yeux clairs. En France, il s’agit d’une des premières causes de consultation chez le Dermatologue et son incidence double tous les 10 ans proportionnellement au vieillissement de la population. Une kératose actinique se traduit par un épaississement de la surface de la peau aux endroits du corps exposés au soleil pendant une période prolongée. Elle est considérée comme précancéreuse et peut évoluer de différentes manières : elle peut se résorber spontanément, persister ou augmenter de volume plus ou moins rapidement. Dans 16 à 20 % des cas, elle peut évoluer vers un cancer cutané. Différents traitements locaux sont possibles en fonction de la localisation, des caractéristiques du patient et de celles de la kératose actinique. Cependant les effets indésirables varient en fonction du type de kératose actinique et de la durée des traitements nécessaires. Il est donc important et nécessaire de développer de nouvelles thérapies permettant de traiter ces lésions précancéreuses avant qu’elles ne se transforment en lésions cancéreuses, avec la meilleure tolérance possible, par des approches simples et sur des modèles expérimentaux représentatifs de la pathologie humaine. Ces nouvelles thérapies pourront ainsi être évaluées par la suite chez l’Homme et elles permettront d’améliorer la prise en charge de personnes atteintes de kératose actinique.

Procédures

Les 24 souris nécessaires à la réalisation de ce projet seront soumises à une application cutanée quotidienne sur le dos pendant 14 jours d’une formulation neutre ou d’1 des 3 formulations contenant chacune un principe actif différent. Ces applications cutanées effectuées sur animal vigile seront effectuées en 1 minute environ chaque jour. Pour chaque souris, la zone d’application des formulations sera observée quotidiennement tout au long de l’expérimentation afin de suivre la tolérance cutanée au cours du temps. Ces observations seront effectuées sur animal vigile, en 1 à 2 minutes environ chaque jour.

Impact sur les animaux

Les applications cutanées quotidiennes des formulations effectuées sur animaux vigiles pourront engendrer un léger stress mais qui devrait s’estomper progressivement au cours des 14 jours de traitement, celles-ci étant réalisées en moins d’une minute par du personnel expérimenté et en limitant le nombre de personnes manipulant les animaux et réalisant les traitements. Ces applications cutanées répétées des formulations à évaluer pourraient induire avec le temps le développement de rougeur sur la peau (érythème) ou de gonflement de la peau (œdème) mais avec une douleur induite très limitée du fait des propriétés anti-inflammatoires des principes actifs qui la composent. Les observations quotidiennes effectuées avant chaque traitement n’engendreront pas de douleur et seront réalisées en un temps très court (1 à 2 minutes environ). Un suivi quotidien du comportement des animaux et régulier de leur évolution pondérale sera effectué tout au long de l’étude mais aucune modification comportementale notoire et aucune perte de poids significative ne sont attendues.

Devenir

Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 24 souris seront toutes euthanasiées après les 14 jours de traitement cutané. Un prélèvement de peau sera effectué au niveau de la zone traitée pour la réalisation d’analyses qui permettront de caractériser la tolérance cutanée et la biodistribution des 3 formulations évaluées.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles cellulaires permettant de caractériser sur un temps prolongé la tolérance cutanée et la biodistribution de formulations (influence du microenvironnement cutané et processus immunitaire), et ses effets éventuels sur le comportement. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. L’utilisation de souris mâles et femelles permettra d’obtenir suffisamment de données et d’échantillons pour la réalisation des analyses envisagées. S’agissant d’une étude observationnelle et le nombre d’animaux étant limité, aucune analyse statistique ne sera effectuée.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux suite à la réalisation des traitements quotidiens. Les animaux et la région d’application des formulations à évaluer seront observés chaque jour tout au long de l’expérimentation. Le poids sera relevé 3 fois par semaine, et si une perte de poids supérieure à 10% entre 2 pesées ou 20% par rapport au poids maximal atteint est observée, ou si des signes d’intolérance cutanée (érythème ou œdème important, ulcération de la peau) ou des modifications du comportement des animaux sont observés (cachexie, prostration, convulsions…), ceux-ci seront mis à mort dans des conditions éthiques. Les souris seront placées par 3 dans des cages de 18.9x29.6x12.8 cm dans une animalerie dédiée au souris immunocompétentes. Elles seront maintenues en cycle de lumière inversé pour observer leur comportement pendant leur phase active et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie), des morceaux de papier absorbants étant placés dans leur cage comme enrichissement pour assurer leur bien-être, remplacés lors de chaque change de litière.

Choix des espèces

La souris et plus particulièrement la souris Hairless, dépourvue de poils, est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet. Elle est très utilisée pour les études dans le domaine de la Dermatologie notamment pour les études de tolérance cutanée et d’efficacité sur différents modèles de pathologies dont la kératose actinique. C’est donc l’espèce animale la plus appropriée pour ce projet afin d’évaluer la tolérance cutanée et la biodistribution de nouvelles formulations. Les animaux seront des souris âgées de 6 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris classiquement décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études de tolérance cutanée et de biodistribution (généralement 6 à 8 semaines).

48 souris vont être utilisé·es, gardées en vie et conservées comme reproductrices dans l'élevage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une douzaine de semaines d'apprentissage par renforcement positif, elles passent des tests comportementaux décrits comme "potentiellement modérément anxiogènes" pour évaluer une méthode de capture moins stressante. Le porteur indique que les animaux sont placés dans des situations qu'ils "éviteraient probablement en conditions naturelles" et que leur "liberté comportementale est donc affectée". Il affirme que le projet reste utile "tant que l'élevage et l'expérimentation sur des rongeurs" existent.

Objectifs

Dans un cadre expérimental, les souris sont généralement attrapées à la main par la queue ou en les incitant à entrer dans un tube de transport. Bien qu'il ait été démontré que ce dernier type de manipulation soit moins stressant, il impose l’ouverture de la cage par l’expérimentateur ce qui est susceptible d'induire un certain stress chez la souris capturée et chez celles qui partagent sa cage. En outre, les difficultés rencontrées pour attraper les souris dans des environnements d'hébergement enrichis et complexes, par la queue ou à l’aide d’un tube de transport, peuvent conduire à freiner l'adoption de ces nouveaux types d'hébergement, qui amélioreraient considérablement le bien-être de ces animaux. En entraînant les animaux à venir volontairement dans une boite de transport, en utilisant un apprentissage par renforcement positif, on réduirait l'anxiété due à l’ouverture de la cage et à la capture, et on autoriserait l'utilisation d'environnements plus complexes sans créer de contraintes supplémentaires pour les expérimentateurs. Le premier objectif de ce projet de recherche est de développer un protocole d’apprentissage basé sur le conditionnement opérant, de sorte que chacune des souris, vivant dans un petit groupe social, apprenne à répondre à un signal sonore, différent pour chacune, en venant dans une boite de transport connectée à leur cage d'origine. L'animal pouvant alors être transporté jusqu'au dispositif expérimental. Notre deuxième objectif est de déterminer si cette procédure permet de réduire l'anxiété des animaux comparativement à une manipulation classique dans un tube de transport.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont l’obtention d’animaux moins stressés lors de la manipulation. Les manipulations des animaux sont nécessaires lorsque les animaux sont placés dans les dispositifs expérimentaux, ou changés de cage. Outre l’intérêt éthique d’éviter le stress, ce stress lié à la manipulation peut notamment affecter les mesures effectuées lors de divers tests comportementaux et affecter la qualité des expériences scientifiques utilisant des animaux de laboratoire. La capture d’animaux dans des environnement complexes (diverses parois, et enrichissements) peut s’avérer encore plus délicate et stressante. Cette procédure permettrait, une fois développée et automatisée, la capture plus aisée des animaux dans ces environnements complexes sans créer un stress supplémentaire ni compliquer le travail des expérimentateurs.

Procédures

Durant une première phase s'étalant sur une douzaine de semaine, les animaux connaitront un apprentissage où les animaux seront récompensés en effectuant certaines tâches. Les animaux seront ensuite soumis à des tests comportementaux non invasifs de brève durée (5 minutes chacun). Les deux premiers sont réalisés l'un à la suite de l'autre. Le second le jour suivant. Ces tests sont réalisés à deux reprises, à une semaine d'intervalle.

Impact sur les animaux

Deux nuisances peuvent résulter du projet. D'une part, les animaux seront soumis à des situations anxiogènes lors des procédures de test, Un certain stress pourra donc en résulter. D'autre part les animaux sont placés activement par l'exprimentateur dans des situations qu'il éviterait probablement en conditions naturelles. Sa liberté comportementale est donc affectée. Les tests comportementaux non invasifs effectués sont communément utilisés pour évaluer l’anxiété des animaux et sont donc potentiellement modérément anxiogènes. Ces tests ne durent que 5 minutes chacun, limitant ainsi la durée de l’exposition des animaux à cette situation anxiogène. Les animaux conservent la possibilité de rester en retrait des zones les plus anxiogènes des dispsitifs de test.

Devenir

A l'issue de la procédure expérimentale, les animaux n'ayant pas été, en apparence, particulièrement perturbés par les tests comportementaux (après avis du vétérinaire et de la personne en charge de la structure bien être animal), sont maintenus dans l'élevage afin de servir de reproducteurs pour la génération suivante d'animaux.

Remplacement

Le projet visant à élaborer une méthode moins stressante de manipulation des souris ne peut se passer de l’expérimentation sur l’animal. Il est en effet nécessaire que les animaux puissent exprimer leur comportement pour évaluer l'efficacité de cette nouvelle méthode sur une base comportementale. Ce projet demeure d'intérêt tant que l'élevage et l'expérimentation sur des rongeurs, impliquant systématiquement une manipulation des animaux existe.

Réduction

Un total de 4 groupes de 12 individus est prévu. Deux groupes (24 individus) ayant appris à répondre à un stimulus sonore. La comparaison de ce 2 groupes a pour objectif d'évaluer chez des individus ayant connu un même apprentissage, les niveaux de stress liés à un accès volontaire (à un signal sonore), ou incité par l'expérimentateur dans la boite de transport (méthode classique). Deux autres groupes (24 individus) ne sont pas soumis à l'apprentissage. Ces deux groupes permettent d'évaluer l'effet de la procédure d'apprentissage sur les niveaux de stress des animaux. Ils permettent d’évaluer cet effet lors d'un accès via la boite de transport connectée au dispositif et lorsque les animaux sont manipulés de manière classique. Des comparaisons statistiques pourront alors être effectuées sur ces 4 groupes de 12. Cet effectif tient compte de la variabilité interindividuelle relativement importante pouvant exister chez cette souche sauvage de souris. En outre, ces mêmes individus seront testés une nouvelle fois une semaine plus tard, où les individus des différents groupes seront alors incités à entrer dans la boite de transport de manière différentes à celle qu'ils ont connu la fois précédente. Nous tentons d'assurer avec cette répétition qui accroît la puissance des tests statistiques que malgré le nombre relativement réduit d'individus par groupe, un effet marquant de l’accès volontaire à la boite de transport sur les niveaux d'anxiété des animaux sera mis en évidence.

Raffinement

Toutes les cages utilisées pour l’hébergement des animaux dépassent largement le minimum requis pour l ‘hébergement de deux individus (31 x 20 x 14 cm) et sont enrichies par deux tubes de carton, du matériel de construction pour faire un nid et des bûchette de bois. Un suivi quotidien des animaux utilisés permet de vérifier que les procédures d’apprentissage employées, les moyens utilisés pour le transport des animaux et les tests comportementaux ne conduisent pas les animaux à adopter des comportements pouvant traduire un stress ou mal-être chronique. Des points limites sont définis en amont et des mesures appropriées seront prises en cas de blessures ou de comportements anormaux.

Choix des espèces

Les souris domestiques sont les animaux les plus utilisés en expérimentation animale, cette espèce est donc celle qui est la plus concernée par les questions relatives aux manipulations par les expérimentateurs. Nous n’utilisons pas une souche de souris particulière, mais des animaux d’origine sauvage élevés en laboratoire depuis de 15 générations dans notre laboratoire en tentant de préserver au mieux une forte diversité génétique. Nous espérons de ce fait que résultats obtenus sur ce modèle seront d’autant plus généralisables aux diverses souches de souris de laboratoire. Tous animaux utilisés sont des adultes (70 à 160 jours). Cette tranche d’âge est communément utilisée dans bon nombre d’études chez la souris, permettant le transfert de nos résultats à ces nombreuses études.

42 macaques à longue queue vont être utilisé·es, 5 tués pour prélèvement d'organes et 37 réutilisés ensuite, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des injections intradermiques, une immunisation, l'injection intraveineuse d'une molécule anti-inflammatoire, jusqu'à 16 prélèvements de sang sur 48 jours dont une anesthésie prolongée de deux heures, ainsi que des ponctions de moelle osseuse et de ganglions. Le porteur décrit le protocole d'anesthésies répétées sur 24 heures comme "inconfortable" et affirme qu'aucune méthode ne peut remplacer un "système immunitaire complet", ce qui rendrait l'animal "indispensable". Il justifie le macaque par sa "proximité phylogénétique" avec l'Homme.

Objectifs

Les traitements anti-inflammatoires actuels visent à éteindre une inflammation chronique préexistante mais cette atténuation de la réponse du système immunitaire n’est souvent que transitoire et s’accompagne très souvent de rechutes. Les études scientifiques visant à déterminer les mécanismes associés à l’inflammation ont mis en lumière un processus actif de l’extinction de l’inflammation s’appelant résolution de l’inflammation Nous avons déjà démontré dans notre laboratoire que le traitement prorésolutif constitué par notre molécule d'intérêt (anticorps monoclonal ciblant un des récepteurs de la résolution exprimé par les neutrophiles et les macrophages) est cliniquement actif chez la souris dans de nombreux modèles inflammatoires. En effet, dans des modèles de colite induite ou spontanée, nous avons pu apprécier un retour plus rapide ou une stabilisation/amélioration de la colite lorsque les animaux ont été injectés avec ce traitement prorésolutif. Par ailleurs nous avons chez l’Homme, observé in vitro un effet de cette même molécule sur les neutrophiles et les macrophages. En outre, dans une précédente étude chez le primate non humain, nous avons pu apprécier la pharmacocinétique ainsi qu’un effet biologique du produit sur un modèle d’inflammation réalisée par l’injection intradermique de bactéries inactivées aux UV. Ce projet sera dans la continuité du précédent pour évaluer les doses minimales et maximales requises pour observer un effet biologique et évaluer la toxicité du produit ainsi qu’identifier des biomarqueurs d’activité permettant de suivre la pharmacodynamique du produit et orienter les analyses chez l’Homme lors d’essai clinique. En outre, l’étude de biodistribution du traitement n’a pas été réalisée et pourra être évaluée dans cette étude, paramètre indispensable pour l’évolution du produit vers la clinique. Enfin, de manière complémentaire, un modèle de vaccination et rechallenge sera évalué pour répondre à la question d’un éventuel impact du traitement sur la vaccination, notamment la réponse humorale liée aux anticorps.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’une part d’évaluer la pharmacocinétique/pharmacodynamique d’un produit destiné à la médicamentation humaine permettant ainsi d’anticiper un schéma d’administration et d’estimer d’éventuels effets secondaires liés à l’injection de ce médicament. En outre, la réalisation en parallèle d’un modèle inflammatoire intradermique permettra d’apprécier un effet biologique de la molécule sur un modèle déjà utilisé dans une phase I lors d’essais cliniques et pour lequel nous avons obtenu des résultats préliminaires encourageants nécessitant d’être confirmés. Enfin, l’étude sur la capacité vaccinale après injection de la molécule permettra de mieux appréhender les mécanismes d’action du médicament et s’assurer que l’administration d’une telle drogue de manière concomitante à une vaccination de trouble pas la réponse immunitaire primaire et/ou secondaire.

Procédures

Certains animaux seront soumis sous anesthésie à l’induction d’une inflammation suite à des injections intradermiques (sur 5 min) sur une seule journée. D’autres animaux seront soumis sous anesthésie à une injection intramusculaire ou sous-cutanée (5 min) d’une protéine immunogène de mollusque puis une injection sous-cutanée de cette même protéine (5 min) à 8 jours d’intervalle. Les animaux seront soumis également, sous anesthésie, après injection intraveineuse de la molécule thérapeutique d’intérêt (30 min), à plusieurs prélèvements sanguins (au maximum 6 dans une même journée, 16 sur la totalité de la procédure expérimentale sur 48 jours), notamment lors d’une anesthésie prolongée de 2h, quelques prélèvements de moelle osseuse (N=3, avant traitement, j10 et j21) et de ganglions (N=3, avant traitement, j7 et j21).

Impact sur les animaux

Les protocoles d’anesthésie répétés sur 24h lors de l’injection de la molécule pour évaluer la pharmacodynamique seront inconfortables et à ce titre, les animaux spécifiquement lors de cette journée seront suivis de manière accrue et l’inconfort le plus adéquatement maîtrisé. Les modèle d’inflammation pourrait créer une démangeaison locale qui sera alors protégée si tel est le cas.

Devenir

Les protocoles utilisés dans cette étude permettent une réutilisation de l'ensemble des animaux utilisés dans ce projet après accord du vétérinaire pour une nouvelle procédure légère ou modérée exceptés ceux utilisés pour évaluer la biodistribution de la molécule qui nécessite un prélèvement de différents organes après euthanasie (N=5 animaux).

Remplacement

A ce jour, aucune méthode ne peut remplacer un système immunitaire complet et donc rend indispensable l’utilisation d’animaux. Des études préliminaires sur des cellules ex vivo ont permis d’identifier une activité biologique du médicament et donc ont orienté les paramètres à évaluer lors de l’étude in vivo de la molécule. Les résultats obtenus lors d’études préliminaires in vivo chez la souris nous permettent maintenant d’étudier la molécule de façon plus précise chez le primate non humain.

Réduction

Ce genre de protocole chez le macaque ne peut être réalisé comme une étude statistique, en effet, dans le respect de la règle des 3R et d’un point de vue éthique, nous limitons le nombre d’animaux au strict minimum, à savoir 3 animaux par groupe, ce qui rend impossible tout test statistique. Cependant, compte tenu de la variabilité individuelle, le nombre de 3 animaux/groupe est essentiel pour obtenir une relevance scientifique quant à l’interprétation des résultats obtenus et l’identification d’un éventuel effet thérapeutique tout en réalisant de manière fiable une étude cinétique dans le sérum de la molécule. De plus, si le modèle d’inflammation cutanée (injection bactéries inactivées) n’a pas d’impact sur la cinétique, l’ensemble des animaux prévus ne sera pas utilisé. D’autre part, de façon à réduire le nombre d’animaux, il s’agit de réutilisation d’animaux dans le cadre strict de la loi après avis vétérinaire.

Raffinement

Toutes les procédures sont réalisées chez le macaques sous anesthésie. La douleur sera dans la mesure du possible évitée par injection d’analgésique qui devra toutefois ne pas être dans la catégorie des anti-inflammatoires pour ne pas perturber ou annihiler l’effet de la molécule thérapeutique injectée et évaluée. Les animaux sont hébergés avant protocole expérimental en volière, de façon à préserver leur de mode vie en communauté. Au cours du protocole expérimental les individus traités sont hébergés dans des cages séparées, mais jointives permettant la vision et la communication entre congénères. Il est en effet fondamental pour ne pas stresser davantage aussi bien l’animal traité que les autres animaux, de pouvoir lui faire facilement (sous anesthésie légère) des injections ou prélèvements qui seraient impossibles dans un environnement commun. Un enrichissement alimentaire (fruits et/ou légumes) est donné quotidiennement, un enrichissement par jeux (différentes activités) est donné en rotation dans les cages selon un programme hebdomadaire. Enfin, un aménagement (perchoirs, cordes…) des cages permet un enrichissement de mouvements.

Choix des espèces

Les primates non humains, et plus précisément les macaques dans cette étude, représentent l’espèce animale de choix comme modèle préclinique étant donné leur morphologie, leur proximité phylogénétique et leur similitude avec le système immunitaire de l’Homme. Différents modèles chez le macaque peuvent être ainsi développés pour mimer des situations cliniques connues, voire des protocoles similaires déjà existants chez l’Homme comme c’est le cas pour cette étude tout en étant moins douloureux, et tester différents protocoles thérapeutiques innovants en conditions précliniques. La constitution du système immunitaire est dépendante de l’âge des animaux donc il s’agira de préférence d’animaux jeunes adultes (3 à 4 kg) dont le système immunitaire est alors mature.