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Exposition à la silice et induction d’autoimmunité systémique : modèle de sclérodermie systémique
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Des souris reçoivent à deux reprises dans la gorge de la silice cristalline, qui provoque une fibrose pulmonaire étendue à tout le poumon, ou de la poussière de pierre artificielle, et d'autres subissent jusqu'à dix semaines d'injections dans la peau d'acide hypochloreux, cinq jours par semaine, qui provoquent une fibrose de la peau et des poumons. 350 souris vont être utilisées pour mettre au point une méthode d'induction de sclérodermie systémique et mesurer les effets de cette poussière, à laquelle des travailleurs peuvent être exposés, avec 120 souris en souffrance légère et 230 en souffrance modérée, toutes tuées à l'issue pour prélever sang, poumons, peau, rate, reins et cœur. Le porteur écrit qu'aucun signe "de difficulté ou de souffrances respiratoires" n'a été décrit dans la littérature ni observé dans ses études antérieures avec l'acide et la silice, pour une fibrose qu'il dit étendue "à l'ensemble du parenchyme pulmonaire". Les effectifs annoncés pour chaque procédure, 110, 350 et 50 souris, totalisent 510, sans que le texte dise si certaines passent par plusieurs procédures.
Objectifs
Ce projet a 2 grands objectifs qui sont les suivants: 1) optimiser le modèle de souris sclérodermique, qui à ce jour ne reflète pas entièrement la physiopathologie observée chez l’homme (inflammation, autoimmunité et fibrose cutanée et pulmonaire). Nous évaluerons ces paramètres physiopathologiques dans le nouveau modèle que nous proposons et qui sera induit dans des souris génétiquement susceptibles de développer une autoimmunité en présence de la protéine recombinante contre laquelle les auto-anticorps sont dirigés et de silice cristalline utilisée comme adjuvant pour stimuler la réponse immunitaire. En effet, les modèles murins actuels sont soit génétiques soit induits par injection de substances chimiques tels que l’acide hypochloreux (HOCl) ou la bléomycine (BLM).
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet seront : 1) de disposer d’un nouveau modèle de souris sclérodermiques dans lequel seront retrouvés les grands paramètres qui définissent cette maladie : l'inflammation, l’autoimmunité et fibrose cutanée/pulmonaire ; cela permettra d’une part d’apporter de nouvelles connaissances sur la physiopathologie de cette maladie et d’autres part de disposer d’un modèle pertinent pour tester de nouvelles thérapies; 2) d’évaluer les risques sur la santé d’une exposition à la poussière de pierre reconstituée à laquelle les travailleurs peuvent être exposés dans leur cadre professionnel et d’apporter de nouvelles connaissances sur leurs effets (autoimmunité, inflammation et fibrose). Ces informations pourraient à terme permettre de mieux informer les utilisateurs des risques encourus, de contribuer à mieux protéger les personnes exposées et à limiter l’utilisation de cette pierre artificielle.
Procédures
Des souris (n=110) seront soumises à une injection intra-dermique (5 jours/semaine) de NaCl ou d'HOCl pendant 10 semaines maximum. Des souris (n=350) seront soumises à 2 expositions par voie respiratoire de NaCl ou de SiO2 ou de Pierre artificielle (PA). Des souris (n=50) seront soumises à 5 injections sous-cutanées de NaCl ou de rhuTOPO-1.
Impact sur les animaux
L'injection intra-dermique d'acide hypochloreux (HOCl) peut entrainer une gêne (démangeaisons) dans les 2-3 minutes post-injection et aussi parfois une plaie cutanée (au niveau du bas du dos) qui pourront être apaisées par l'application de Douxocalm. Les souris exposées à l'acide hypochloreux (HOCl) développent une fibrose cutanée au point d'injections (bas du dos) et une fibrose pulmonaire légère à modérée qui se développe à partir de la 3ième semaine. La fibrose induite est localisée dans la région sous-pleurale et s'étend peu à l'ensemble du parenchyme pulmonaire. Les souris exposées par instillations oropharyngées de silice cristalline (SiO2) développent une fibrose pulmonaire modérée qui s'étend à l'ensemble du parenchyme pulmonaire. Il n'a pas été décrit dans la littérature et nous n'avons pas non plus observé dans nos études antérieures de signes de difficulté ou de souffrances respiratoires dans ces deux modèles. Même si nous ne nous attendons pas à avoir d’inconfort ou de souffrance animale avec une exposition à la poussière de pierre artificielle (PA) nécessitant le recourt à des antalgiques, nous serons attentifs sur ce point. D'après la littérature, des injections sous-cutanées répétées à 15 jours d'intervalles n'ont pas non plus montré d'effets indésirables chez les souris.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser des prélèvements de trissus et d'organes (sang, poumons, peau, rate, rein et coeur).
Remplacement
La sclérodermie systémique est une maladie autoimmune (présence d’autoanticorps dans la circulation sanguine), complexe avec des manifestations dans plusieurs organes (peau et poumons majoritairement) qu’il est impossible de reproduire in vitro. Il est important d’avoir un modèle de souris sclérodermique qui se rapproche le plus possible de ce qui est observé chez l’homme (fibrose cutanée et pulmonaire, autoimmunité et inflammation) pour tester de nouvelles molécules thérapeutiques.
Réduction
Le choix des conditions expérimentales est fixé en lien avec les questions scientifiques du projet et les principes de réduction. Les procédures expérimentales sont rigoureusement planifiées afin de n’utiliser que le nombre d’animaux strictement nécessaire mais suffisant pour réaliser des analyses statistiques. Pour atteindre les objectifs scientifiques du projet, un nombre maximum de 350 souris sera utilisé.
Raffinement
Les procédures ont été travaillées pour limiter le stress et la souffrance des animaux. Les souris seront au maximum 5 par cages et les cages seront enrichies. Une observation régulière (entre 3 à 5 jours/semaine selion les procédures) des souris sera réalisée (apparence physique, comportement) et, si des signes de souffrance sont détectés chez les animaux, des sédatifs ou des anti-douleurs adaptés pourront leur être administrés.
Choix des espèces
Parmi les rongeurs, il n'existe pas d'autres modèles de sclérodermie systémique que le modèle murin. Par ailleurs, le modèle murin est indspensable pour suivre les effets systémqiues et en particulier l'autoimmunité caractérisée par la production d'autoanticorps.
Mise au point de la technique d’enregistrement de l’activité cérébrale par photométrie par fibre optique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les 210 rats subissent une chirurgie du cerveau de deux heures sous anesthésie générale pour implanter un dispositif de mesure par fibre optique, et 120 d'entre eux une seconde chirurgie pour poser un cathéter dans une veine, après quoi ils restent seuls dans leur cage jusqu'à la fin du projet. Ces 120 rats s'administrent de la cocaïne pendant 25 sessions quotidiennes de six heures, suivies de deux mois d'abstinence, et tous passent trois séances d'une heure d'enregistrement de leurs neurones, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur cite chez les rats rendus dépendants un poil hérissé, de l'irritabilité et une agressivité envers l'expérimentateur, et annonce des tests comportementaux sans les nommer. Le projet vise d'abord à mettre au point cette technique d'enregistrement, par groupes de trois rats et dix conditions au plus. Tous sont tués à la fin de l'expérience pour analyser leur cerveau.
Objectifs
Le projet présenté ici s’inscrit dans un projet plus large visant à évaluer si le métabolisme du cholestérol cérébral représente une cible thérapeutique potentielle pour prévenir les rechutes et traiter l’addiction. En effet, quelques études ont montré que l’expression de protéines impliquées dans ce métabolisme était modifiée aussi bien chez l’homme, que dans des modèles animaux d’addiction, en réponse à la cocaïne ou à l’alcool. Pour cela, nous avons besoin dans un premier temps de mettre au point une technique d'enregistrement par fibre optique afin de déterminer les conditions optimales d’enregistrement de l'activité des neurones puis de valider ces conditions expérimentales avec l'étude de cette activité chez des rats en situation de rechute après une période d’addiction volontaire à la cocaïne puis une phase d'abstinence.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont la mise au point d’une technique innovante pour mesurer l’activité neuronale chez l’animal vigile. Cette technique, réalisée sur animal vigile, couplée à des mesures comportementales, nous permettra de mieux comprendre les processus neuronaux sous-tendant les phénomènes de rechute afin de mieux les combattre et promouvoir l’abstinence.
Procédures
Tous les rats (210) suivront une chirurgie sous anesthésie générale (durée : 2h00) afin d'implanter un dispositif pour mesurer l'activité neuronale. 120 rats seront soumis à une seconde procédure chirurgicale sous anesthésie générale (durée 15 min) pour implanter un cathéter veineux. Après leur chirurgie et jusqu'à la fin du projet, ces 120 rats seront hébergés seuls dans leur cage. L'auto-administration de drogue se fera avec ces 120 rats pendant 25 sessions, 1 session par jour (durée d'une session : 6 heures) en plaçant les animaux dans des cages spéciales dans lesquelles les animaux sont libres de leur mouvement. Les sessions d'auto-administration sont suivies d'une période d'abstinence d'une durée de 2 mois. Pour mesurer l'activité neuronale, tous les rats vigiles (210) seront placés pendant 1 heure dans une cage spéciale ; dans cette cage les rats sont libres de leur mouvement. Chaque rat aura 3 sessions de mesure de l'activité neuronale (repartis sur 40 jours). Tous les rats (210) seront pesés (2 fois par semaine, 15 semaines maximum, 10 secondes par pesée).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues pour cette procédure sont : -Chirurgies : douleurs soulagées par l'administration d'antalgiques et inconfort transitoire au réveil. - Dispositif de mesure de l'activité cérébrale : gène légère pendant la durée de l’expérience. - Cathéter intraveineux : gène légère pendant la durée de l’expérience. - Auto-administration : La prise de drogue chronique peut causer un stress modéré chez certains individus, ce qui est attendu car, comme chez l’Homme, un état « addict » chez le rat peut être associé à un état émotionnel négatif. Cet état peut se révéler par le poil hérissé, par une certaine irritabilité et agressivité envers l’expérimentateur mais pas envers ses congénères. Dans la plupart des cas, cet état est transitoire et l’état du pelage et les niveaux d’agressivité reviennent à la normale après quelques jours. - Période d’abstinence : peut causer un léger stress. - Isolement : peut causer un stress modéré.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience afin de procéder à des analyses sur le cerveau.
Remplacement
Ce type de recherche, vise à mettre au point une technique d’enregistrement de l’activité des neurones in vivo chez l’animal vigile au cours de tests comportementaux, ce qui implique d’utiliser des animaux vivants. L’étude de ce processus nécessite la présence de réseaux neuronaux intacts et fonctionnels qui sont uniquement accessibles dans des animaux intègres et donc vivants. Après vérification, il n’a pas été trouvé de test in vitro ou in silico permettant d’effectuer cette recherche et il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.
Réduction
Dans la première phase du projet, pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous progresserons pas à pas avec des groupes de 3 animaux. Nous testerons une condition à la fois, jusqu’à l’obtention de résultats satisfaisants. Nous avons fixé une limite maximale de 30 animaux par lot pour trouver les conditions optimales pour la mise au point de la technique d’enregistrement des neurones, soit 10 conditions expérimentales maximum. Dans la seconde phase de mesure de l'activité cérébrale chez les rats addicts, nous estimons à 20 rats par lot le nombre d’animaux nécessaire pour pouvoir faire les analyses statistiques de nos résultats.
Raffinement
Toutes les phases du projet seront réalisées par des personnels expérimentés. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide dans le suivi des points limites et des critères d’intervention et d’arrêt. En effet, ces points limites gradés précis et spécifiques sont définis de façon suffisamment précoces sont définis dans une grille de suivi. Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape, avec un recours à l’anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques ainsi que d’un maintien de la température par un tapis chauffant et d’une hydratation régulière des tissus lors des procédures de chirurgie. Les expérimentateurs sont compétents en chirurgie. A leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger pour assouvir leur besoin naturel de ronger) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum.
Choix des espèces
Le rat est l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux. Les rats ont des réponses aux drogues qui sont similaires à celles de l’Homme et ils s’auto-administrent toutes les drogues abusées par l’Homme de façon spontanée, ce qui n’est pas aussi évident avec une autre espèce, pour laquelle la réalisation de tâches opérantes modélisant l’addiction est plus difficile à obtenir. Nous utiliserons des rats de la lignée « Sprague-Dawley ». Il s’agit de rats « outbred », c’est-à-dire avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus pour un meilleur reflet de ce que l’on trouve chez l’Homme. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet, pour faciliter l’apprentissage et pour pouvoir effectuer des expériences de longue durée sans facteur confondant de déclin cognitif lié au vieillissement.
Complément alimentaire et rétine
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
32 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent des gavages quotidiens pendant cinq jours et un enregistrement de l'activité de la rétine sous anesthésie, avant d'être tuées pour prélever leurs rétines. Le projet cherche à vérifier in vivo l'effet d'un complément alimentaire pour les yeux déjà largement vendu en ophtalmologie. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne peut remplacer cette confirmation dans un "contexte physiologique complexe".
Objectifs
Ce projet a pour objectif de compléter des expérimentation mener in-vitro sur les cellules de Muller et des cellules d'épithélium pigmentaire rétinien (RPE). En effet nous avons pu mettre en évidence que l'apport d'un complément alimentaire à visée oculaire, enrichi en acide gras polyinsaturés, antioxidants et vitamines, induit des modifications du métabolimse glutamatergique et présente un effet protecteur contre le stress oxydant in-vitro en culture de cellules. La question est donc maintenant de savoir si ces effets sont similaires in-vivo.
Bénéfices attendus
Les compléemnts alimentaires à visée oculaire sont largement utilisés en ophtalmologie sans que leurs effets soient clairement identifiés. Par conséquent, ce projet permettra d'éclaircir le mécanisme d'action de ce complément et de mettre en évidence ses éventuelles limites.
Procédures
Les animaux seront soumis à des gavages quotidiens de complément alimentaire ou d'eau pour les animaux contrôles pendant 5 jours. Le gavage est un geste durant moins d'une minute. Les enregistrements électrorétinographiques sur animal anesthésié durent maximum 30 minutes, mise en place comprise.
Impact sur les animaux
Lors du gavage il peut se faire que les animaux bougent et s'irritent au niveau de la trachée ce qui conduirait alors à un défaut d'alimentation et une perte de poids. Toutefois, notre expérience de gavage nous permet de maitriser cet acte de manière à être confiant sur l'absence d'effet indésirable sur les animaux. Toutefois, le comportement des animaux sera évalué quotidiennement et ils seront pesés quotidiennement afin de vérifier une prise de poids adéquate au cours de l'expérimentation.
Devenir
Après les électrorétinogrammes réalisés sous anesthésie, les animaux seront euthanasiés pour prélever les rétines et réaliser des analyses de biologie moléculaire et biochimiques
Remplacement
A ce stade aucune méthode alternative actuelle ne permet de remplacer les protocoles et procédures décrits ci-dessous. En effet, il est nécessaire de confirmer que les observations faites in-vitro sont similaires chez l’animal in vivo dans un contexte physiologique complexe.
Réduction
Les enregistrements électrophysiologiques seront réalisés sur les animaux avant de les euthanasier. Les analyses de biologie moléculaire seront réalisées sur le même échantillons dans la mesure du possible afin de limiter le nombre de souris à euthansier pour le prélèvement des échantillons. Effectuer les enregistrements électro physiologiques et les prélèvements pour analyses sur le même échantillon, dans la mesure du possible, permet de limiter le nombre de souris. Nous travallions avec un nombre d'animaux le plus faible possible mais de manière à ne pas compromettre la pertinence des résultats.
Raffinement
Afin d’assurer le bien-être et le confort des animaux, les souris seront surveillées et manipulées tous les jours par l’expérimentateur et les personnes compétentes. Elles ne seront jamais isolées dans leur cage, et auront un environnement enrichi (des rouleaux en carton et des bandes de papier pour réaliser leur nid) avec accès libre à la nourriture et l’eau. Leur état physique sera évalué avant chaque et après chaque manipulation expérimentale pour détecter toute lésion, signe clinique ou comportemental traduisant l’inconfort, le stress, ou une maladie (liés ou non à l’étude). Un tableau d'évaluation avec les critères suivants permettra d'objectiver la décision : dégradation de l’état physique, manque de toilettage, piloerection, altération de la posture normale (difficulté à se déplacer, se relever ou se nourrir), déshydratation, température corporelle anormale, agressivité (impossibilité pour la manipulation), vocalisations spontanées, maigreur (perte de plus de 15% du poids) ou obésité, et présence de tumeurs et/ou de lésions sur la peau (sur la face, les yeux et/ou la queue). Dans le cas où l’animal montre au moins un de ces signes cliniques, soit il pourra être soigné (administration des antalgiques contre la douleur, désinfection des blessures, réhydratation par administration de saline sous-cutané, etc.) sans compromettre les résultats et il sera gardé dans l'étude, soit il ne peut pas être soigné, alors sa manipulation sera arrêtée et nous procèderons à sa mise à mort. Dans le cas où l’animal présente trois ou plus des signes cliniques nous procèderons à sa mise à mort. Des points limites seront mis en place pour chaque procédure.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet nous utilisons des souris car c'est cette espèce qui a été utilisée pour les cultures primaires de RPE et de cellules de Muller.
Rôle de FAT10/UBD dans la fonction hépatocytaire et la progression de la NASH
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
2 392 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance sans réveil, légers et modérés. Elles subissent une biopsie de la queue, des gavages et des injections, ainsi qu'un régime gras destiné à provoquer une stéato-hépatite, qui peut faire apparaître des nodules du foie évoluant vers un cancer, avant que le foie soit perfusé et prélevé sous anesthésie. L'objectif est d'étudier le rôle de la protéine FAT10 dans cette maladie du foie liée à l'obésité. Le porteur conclut que FAT10 pourrait être une cible thérapeutique, bénéfice renvoyé au conditionnel.
Objectifs
La stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) est la maladie hépatique la plus courante qui affecte 80% de la population obèse. Initiée par une accumulation de graisse dans le foie (stéatose), la NAFLD évolue vers la stéato-hépatite non alcoolique (NASH), facteur de risque de comorbidités mortelles. Actuellement, aucun traitement médicamenteux n’est disponible. Ainsi, il est important de bien caractériser les mécanismes cellulaires impliqués dans cette pathologie afin d'apporter des solutions thérapeutiques. Les résultats préliminaires du laboratoire révèlent une implication de FAT10 dans la progression de la NASH avec une surexpression dans le foie de patients NASH, corrélé à une diminution de l'expression de PPARα, récepteur nucléaire contrôlant le métabolisme lipidique et l'inflammation. De plus, il a été constaté dans le foie de patients atteints de NASH, que l’expression de FAT10 corrèle également positivement avec l’expression des gènes de la sénescence. L'objectif de ce projet est d’étudier si la modulation de l'expression de FAT10 influence la sénescence prématurée et l’activation de PPAR-alpha dans les hépatocytes au cours du développement de la NASH grâce à l’utilisation de modèles murins.
Bénéfices attendus
Ce projet cherche à mettre en évidence le rôle de FAT10 dans le développement des maladies du foie gras non alcoolique et son lien avec l’induction de la senescence de l’hépatocyte et l’activation de PPARa. La compréhension de ces nouveaux mécanismes pourrait permettre demontrer que FAT10 pourrait être une cible thérapeutique intéressante dans l’objectif de soigner la NASH.
Procédures
Les souris seront baguées à l’oreille afin d’être identifiées par la suite et une biopsie de queue (
Impact sur les animaux
La lignée C57BL6/J utilisée dans nos différentes procédures ne présente aucun probléme physique ou physiologique. Ainsi, peu de nuisances ou d’effets indésirables sont attendus dans les procédures qui seront mises en œuvre pour la réalisation de ce projet de recherche. Cependant, l’injection d’Adénovirus ou d’AAV par intra-veineuse permettant la surexpression ou la diminution d’expression de FAT10 sera réalisée et peut conduire à l’apparition d’un stress aigu sur l’animal qui peut se représenter par une douleur d’ordre légere pour l’animal. De plus, la mise en place de ce protocole entraine l’utilisation d’une cage chauffante à 37°C (permettant la dilation des veines pour l’injection en intra-veineuse) provoquant un stress thermique à l’animal. L’utilisation de régime induisant la NASH chez l’animal peut conduire à l’apparition de nodules hépatiques pouvant évoluer vers un carcinome hépatique pouvant causer des douleurs à l’animal au cours du protocole. La mise en place de régimes obésogènes dans un modèle murin peut également entrainer des problèmes de prise alimentaire et donc le développement de faim et de malnutrition de l’animal. L’ensemble des procédures vont également nécessiter la prise des animaux en contention, pouvant provoquer un stress léger à l’animal.
Devenir
A l’issus des différentes procédures mise en place dans ce projet de recherche, l’ensemble des animaux seront mis à mort pour analyses.
Remplacement
Ce projet de recherche est mis en place à partir d’études préliminaires réalisée sur des lignées cellulaires. Ces études ont montré un rôle important de la protéine FAT10 dans les cellules du foie. Cependant, les maladies du foie gras non alcoolique sont des pathologies complexes impliquant de nombreux organes autres que le foie. Ainsi, l’utilisation d’un modèle animal (modèle murin) nous permettra de reproduire au mieux la maladie du foie gras non alcoolique et de mieux comprendre le rôle clé joué par la protéine FAT10 dans le développement et la progression de la maladie.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum, sans toutefois compromettre l’analyse statistique des résultats. De plus, une analyse appronfondie de la littérature permet également d’éviter des répétitions d’expériences inutiles (exemple dose des agonistes de Ppar-alpha à utiliser).
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de maisons. La définition précise des points limites précoces, ainsi qu’une surveillance pendant tout le protocole permet de limiter l’apparition d’une souffrance ou d’une atteinte de l’état général de la souris. En cas d’atteinte de ces points limites, les animaux seront sortis de l’étude et mis à mort.
Choix des espèces
Cette espéce est utilisée car les souris (mus musculus) peuvent être génétiquement modifiées soit par injections virales ou par transgénèse. De plus, de nombreuses données bibliographiques sont disponibles sur cette espèce dans la cadre des études sur les NAFLDs permettant d’affiner au mieux les conditions expérimentales mises en jeu dans le projet. De plus, elle présente de nombreux avantages : facilité d’élevage, possibilités d’utiliser des modéles favorisant la susceptibilité aux régimes spéciaux prédisposant au développement des NAFLDs. Les souris seront utilisées à l’âge adulte de 12 semaines. L’étude de l’implication de FAT10 dans la senescence des hépatocytes lors de la NASH nécessite que certaines expériences soient réalisées comparativement à des souris âgées (60 semaines).
Etude de l’effet du mir155 sur l’intégrité vasculaire
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
41 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections dans l'œil sous anesthésie, avant d'être tuées par dislocation cervicale pour prélever leurs yeux, afin d'étudier le rôle du micro-ARN mir155 dans la formation des vaisseaux de la rétine. Le bénéfice avancé reste conditionnel, un futur médicament qui préserverait l'intégrité des vaisseaux si le mir155 les déstabilise. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'angiogenèse de la rétine et qu'aucune culture 3D n'est envisageable.
Objectifs
L'angiogenèse est un processus biologique qui consiste en la formation de nouveaux capillaires sanguins à partir de vaisseaux préexistants. Ce processus est conduit par les cellules endothéliales. Il est fondamental pour la cicatrisation des tissus et le développement embryonnaire. Cependant, l’angiogenèse aggrave de nombreuses maladies telles que le cancer et les pathologies inflammatoires chroniques. Une dérégulation de ce processus est responsable des rétinopathies. Les micro-ARN (mir) sont des petits acides ribonucléiques produits par la cellule qui ne sont pas traduits en protéines. Leur rôle est de réguler l’expression de gènes en bloquant la traduction des ARN messagers en protéines. Des études chez l’humain ont révélé la présence de plus de 500 mir différents pouvant cibler potentiellement près de 30 % des ARNm humains. Il a été démontré dans des souris nouveaux nés que le Mir155 est un nouveau facteur angiogénique qui génère des vaisseaux anormaux ressemblant à des vaisseaux tumoraux. Il est nécessaire de confirmer ces observations dans des souris adultes (P21) sur des vaisseaux sanguins matures. L’accessibilité du réseau vasculaire à la surface de la rétine permet une quantification précise de différents paramètres comme la fraction de tissu vascularisé, la densité de vaisseaux et le niveau de ramification du réseau vasculaire, et cela sur l’intégralité de la surface de la rétine. Il existe déjà des protocoles standardisés pour la quantification de ces paramètres dans ce modèle. Ceci est réalisable en injectant d’une part, un inhibiteur (anti-miR-155 ou antagoMir) pour évaluer sa capacité à bloquer le processus, et d’autre part en injectant un activateur (miR-155 mimic) pour stimuler le processus. L’analyse des paramètres d’angiogenèse sera effectuée par microscopie confocale après immunofluorescence réalisée sur les rétines entières, à l’aide d’un protocole déjà établi.
Bénéfices attendus
Si le Mir155 déstabilise les vaisseaux sanguins matures, il sera possible d'utiliser un medicament qui l'inhibera pour que les vaisseaux restent intacts (intégrité vasculaire préservée)
Procédures
Nous souhaitons dans un premier temps, administrer localement (injections intraoculaires sous anesthesie générale par inhalation d'isofluorane ) deux doses différentes de ces molécules couplées à un fluorochrome afin d’évaluer la quantité de molécules que nous retrouverons dans les cellules endothéliales de la rétine. Dans un deuxième temps, nous administrerons ces deux molécules non marquées, à la concentration la plus efficace (d’un point de vue de la demi-vie et du ciblage des cellules endothéliales) , afin de déterminer leurs effets sur l’angiogenèse (ce qui nous permettra ensuite de réduire le nombre d’animaux). L'intervention dure 20 min. Le prélèvement de la rétine ne peut se faire sans éviter l'euthanasie de l’animal .
Impact sur les animaux
Dans le cadre de cette étude, les sources de douleur et de stress pourraient provenir de la procédure d’injection intraoculaire. Il n’y pas d’inconfort ou d’effets indésirables connus causés par cette procédure comme déjà décrit dans la bibliographie.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale . Il est impossible d'étudier l'angiogenese de la rétine sans euthanasier l'animal puisque nous devons prélever les yeux pour l'extraire.
Remplacement
A l’heure actuelle, il n’existe aucun modèle in vitro permettant d’étudier la croissance et l’intégrité des vaisseaux sanguins dans un environnement complexe (cultures comprenant les cellules du sang, les péricytes (autres composants cellulaires des vaisseaux sanguins), la matrice extracellulaire, le flux sanguin.....). La mise au point de certains paramètres (dose-réponse, toxicité, demi-vie du composé à injecter…) de l’expérience peut être réalisée sur cellules endothéliales d’origine commerciale mais il est impossible de « mimer » l’angiogenèse de la rétine et d’étudier son intégrité en culture 2D. Aucun protocole de culture 3D n’est envisageable.
Réduction
Basé sur notre expérience du modèle, nous devons prendre en compte que les étapes d’injection et dissection peuvent induire la perte de 10% des échantillons (1 œil) et que le traitement pourrait échouer sur 10% des animaux (1 œil). Par conséquent, nous avons pu réduire le nombre d’animaux à 5 animaux par sous-condition pour que l’analyse soit statistique ceci pour chacun des 3 groupes expérimentaux. D’autre part, l’avantage d’étudier l’œil est que chaque animal constitue son propre contrôle car nous étudierons aussi l’œil non injecté (contralateral) qui constituera un contrôle interne permettant d’évaluer les effets du composé injecté (animaux traités au miR ou antimiR) et également les effets de la procédure d’injection en elle-même (animaux injectés avec la version contrôle du miR ). Ceci permet de réduire le nombre d’animaux en évitant de sacrifier une autre série d’animaux juste pour collecter des yeux sains.
Raffinement
Les souris adultes sont hébergées en groupe sociaux, la plupart du temps entre frères ou entre sœurs dans un environnement approprié (litière, boisson et alimentation, dôme) L’élevage est supervisé par le personnel compètent de l’animalerie conventionnelle Pour limiter une éventuelle douleur liée à l’injection, un anesthésique local en gel ophtalmique sera appliqué sur la paupière avant et après l’injection. De plus, nous délivrerons un anti-inflammatoire non steroidien qui permettra une couverture de la douleur sur 24h, soit jusqu'à l'euthanasie des animaux Nous veillerons à ce que la phase de réveil se fasse dans les meilleurs conditions (surveillance accrue, température de la cage...). Nous veillerons à ce que les animaux s’alimentent et s’hydratent normalement. Nous surveillerons leur comportement et l’apparition d’éventuelles blessures.
Choix des espèces
En se basant sur la bibliographie dans le domaine, il apparait que le modèle de rétine postnatale de souris C57Bl6J est le plus approprié pour l’étude de l’angiogenèse in vivo. Ce modèle présente l’avantage d’être peu invasif . Il a été démontré dans des souris nouveaux nés que le Mir155 est un nouveau facteur angiogénique qui génère des vaisseaux anormaux ressemblant à des vaisseaux tumoraux. Il est nécessaire de confirmer ces observations dans des souris adultes (P21) sur des vaisseaux sanguins matures.
Impact d’un des composants de la matrice extracellulaire sur la progression des hépatopathies métaboliques et leurs complications
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
2 832 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie tuée pour prélèvement de tissus et de sang, une autre conservée pour l'élevage. Chaque animal subit une biopsie de la queue, un régime destiné à provoquer une stéatose du foie avec inflammation et fibrose, et des prélèvements de sang répétés sous anesthésie. Le porteur indique que le régime peut entraîner une prise de poids et que le tamoxifène administré peut provoquer une perte de poids et des atteintes des testicules chez les mâles. L'étude porte sur le rôle d'un composant de la matrice du foie comme cible thérapeutique et biomarqueur de la maladie du foie gras.
Objectifs
Les hépatopathies métaboliques, telles que la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) et le stade avancé stéatohépatite non alcoolique (NASH), sont en forte progression dans les pays développés et atteignent à ce jour 25% de la population mondiale, devenant la première cause de maladie chronique du foie. La surconsommation d'aliments hautement transformés, pauvres en nutriments et riches en graisses et en sucres contribue largement au développement de la NAFLD/NASH. Les complications liées à la NAFLD/NASH comprennent principalement l'inflammation et la fibrose qui peuvent être suivies par le développement d'une cirrhose et/ou d'un carcinome hépatocellulaire (CHC). Cependant, les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables du développement de la NAFLD/NASH et de la progression vers le CHC restent à élucider. À ce jour, il n'existe aucun médicament cliniquement approuvé pour traiter ou limiter la progression de la NAFLD/NASH. Il existe également un besoin non satisfait de développer des tests non invasifs pour le dépistage, le diagnostic, la stadification et le suivi de la réponse thérapeutique à ces maladies. La matrice extracellulaire (MEC) joue un rôle majeur dans la progression de la maladie en étant notamment impliquée dans l'établissement et la chronicité de l'inflammation et la fibrose de divers tissus. Inflammation et fibrose sont deux caractéristiques des hépatopathies métaboliques et sont clairement liées à la progression vers le cancer. Notre laboratoire se focalise principalement sur l’étude d’un des composants spécifiques de la MEC et notre équipe, entre autres, a montré que ce composant favorise l'inflammation et la fibrose dans le cancer et dans d'autres pathologies. Cependant, son rôle dans la progression de la NAFLD/NASH n'est pas encore connu. L'objectif de ce projet est d'étudier le rôle de ce composant spécifique de la MEC dans le développement de la NAFLD/NASH, son utilisation en tant que biomarqueur potentiel et d'évaluer l'effet de nouveaux agents ciblant cette nouvelle cible thérapeutique de la MEC en tant que thérapies potentielles de la NAFLD/NASH.
Bénéfices attendus
En élucidant le rôle d’un composant spécifique de la matrice extracellulaire (MEC) dans les hépatopathies métaboliques à l'aide d'animaux transgéniques, nous espérons pouvoir établir le rôle de cette molécule comme biomarqueur de la maladie pour aider au diagnostic et/ou identifier la progression ainsi que pour le pronostic des patients susceptibles de développer des NAFLD/ NASH. Cette étude établira également si ce composant peut être une cible thérapeutique dans la NAFLD/ NASH et l'utilisation potentielle de nouveaux agents inhibiteurs de cette nouvelle cible thérapeutique comme médicaments anti-fibrotiques.
Procédures
Tous les animaux subiront une biopsie au niveau de leur queue faite sous anesthésie (durée 5 minutes). Un groupe d’animaux éveillés recevra une injection par jour pendant 5 jours consécutifs (30 secondes par injection). Un second groupe d’animaux sera soumis à un régime spécial pendant une durée totale de 4, 8 ou 12 semaines. Les animaux éveillés recevront une injection par jour pendant 5 jours consécutifs (30 secondes par injection). Des échantillons de sang seront prélevés sur les animaux anesthésiés (durée 5 min) une fois toutes les 2 semaines (au total 3, 5 ou 7 fois pour les animaux étudiés pendant 4, 8 ou 12 semaines respectivement). Les animaux anesthésiés seront imagés une fois par semaine (3 fois au total). La durée de l'imagerie est d'environ 5 minutes. Un troisième groupe d’animaux sera soumis à un régime spécial pendant une durée totale de 8 ou 12 semaines. Des échantillons de sang seront prélevés sur des animaux anesthésiés (durée de 5 minutes) une fois toutes les 2 semaines (au total 5 ou 7 fois pour les animaux étudiés pendant 8 ou 12 semaines respectivement). Un quatrième groupe d’animaux sera soumis à un régime spécial pendant une durée totale de 8 ou 12 semaines. En outre, les animaux éveillés recevront une injection par jour pendant 5 jours consécutifs (30 secondes par injection). Le schéma d'injection de 5 jours sera répété à un intervalle de 4 semaines (3 ou 4 séries d'injections au total). Des échantillons de sang seront prélevés sur des animaux anesthésiés (durée 5 min) une fois toutes les 2 semaines (au total 5 ou 7 fois pour les animaux étudiés pendant 8 ou 12 semaines respectivement). Un cinquième groupe d’animaux, éveillés ou anesthésiés, recevront une injection (30 secondes). Des micro-échantillons de sang seront prélevés sur les animaux anesthésiés (durée 5 min) 7 fois sur une durée totale de 48 heures. Les animaux anesthésiés seront imagés (durée 5 min) 4 fois sur une durée totale de 48 heures. Un sixième groupe d’animaux sera soumis à un régime spécial pendant une durée totale de 8 ou 12 semaines. En outre, les animaux éveillés ou anesthésiés recevront une injection une fois par jour tous les deux jours pendant une durée totale de 4 semaines. Des échantillons de sang seront prélevés sur les animaux anesthésiés (durée 5 min) une fois toutes les 2 semaines (au total 5 ou 7 fois pour les animaux étudiés pendant 8 ou 12 semaines respectivement). L’ensemble de ces animaux sera soumis à un jeûne de 5 heures (une fois).
Impact sur les animaux
Les animaux recevront un régime spécial (CDAHFD) pour induire le développement d'une stéatose hépatique avec inflammation et fibrose, des pathologies majoritairement silencieuses – sans symptômes – mais qui pourraient entraîner une prise de poids. Il a été indiqué que l'administration de tamoxifène entraînait une perte de poids. Il a également été rapporté que l'administration de tamoxifène provoque certaines altérations cellulaires dans les testicules des souris mâles pouvant conduire à des péronites, oedèmes du testicule ou hernies. Des prises de sang répétées peuvent dans certains cas entraîner des ecchymoses ou des hémorragies. Il existe également un risque inférieur à 5% d'inflammation et d'infection du site de prélèvement sanguin ou d'injection. Un prélèvement unique effectué au niveau de leur queue (biopsie) pourra entraîner une douleur de courte durée.
Devenir
Une partie des animaux sera euthanasiée pour prélèvement de tissus et de sang et une partie sera conservée pour le maintien de l’élevage.
Remplacement
Des échantillons cliniques provenant de patients atteints de NAFL/ NASH sont très limités notamment ceux provenant des étapes initiales de ces maladies du foie. De plus, la génération d’organoïdes de foie à partir de biopsies de ces patients est un véritable challenge du fait de la capacité très limitée de réplication des cellules de ces tissus. Contrairement aux cellules cancéreuses, les altérations cellulaires dans les tissus affectés par les NAFLD n’amènent pas de bénéfice de réplication des cellules. Il existe aujourd’hui différents organoïdes hépatiques utilisés en recherche. Des organoïdes issus d’hépatocytes de patients atteints de NASH ont permis d’élucider des éléments clés de la biologie de la maladie. Cependant, aucun organoïde à ce jour ne permet de reproduire la progression totale depuis l'établissement de la stéatose jusqu'aux stades de l'inflammation, de la fibrose et du cancer. Seul l’animal dans sa globalité, avec l’ensemble des systèmes impliqués dans la pathologie (cytokines des tissus adipeux et muscles, hormones, cellules immunitaires, molécules de la matrice extracellulaire etc.) peut être utilisé. Le projet est complété au maximum par des études effectuées en parallèle in vitro sur des cultures cellulaires.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux dans l'étude, des échantillons de sang répétés mais de faibles volumes, seront prélevés sur le même animal au cours de la procédure. Les procédures comportant plusieurs points dans le temps seront optimisées pour réduire le nombre d'animaux requis. Le nombre minimal d'animaux pour le projet est calculé en fonction des données de la littérature, et tient compte tenu de la variabilité entre les individus, des groupes expérimentaux et de la complexité de la procédure. Le nombre d'animaux (n) a été évalué en utilisant un test de puissance statistique basé sur des études publiées précédemment et portant sur des questions de recherche similaires. Nous avons également tenu compte de la grande variabilité observée entre les souris mâles et femelles dans maladies hépatiques induites par l'alimentation. Les résultats seront analysés par différents tests statistiques appropriés afin de dégager les résultats significativement différents. Les tissus et coupes histologiques seront également partagés entre les collaborateurs du projet pour ne pas reproduire inutilement les procédures sur les animaux entre les laboratoires.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages avec une surface supérieure à la surface règlementaire minimale, avec de l’enrichissement supplémentaire (maisonnette, tunnel, buchette à ronger, frisure de papier, rouleaux de coton) pour promouvoir l’activité et permettre aux animaux de se cacher, réduisant le stress associé aux procédures. Les animaux sont observés quotidiennement par du personnel formé, weekend et jours fériés inclus, et un suivi plus poussé (poids et alimentation) est réalisé minimum 3 fois par semaine pour détecter au plus tôt tout signe de détresse/ souffrance/ douleur. Lorsqu’elle n’interfère pas avec le protocole expérimental, l’anesthésie est systématiquement utilisée pour réduire au maximum le stress/ douleur des animaux. Les animaux seront habitués à la manipulation par l'expérimentateur une semaine avant les expériences afin de réduire leur stress.
Choix des espèces
La souris reste aujourd’hui le seul animal qui combine la possibilité d’étudier des changements histologiques, biochimiques, morphologiques (animaux génétiquement modifiés) avec un modèle reproductible d’hépatopathie métabolique induite (régime CDAHFD) très proche de la maladie humaine (progression NAFL-NASH-fibrose-cancer hépatique). L’utilisation de la souris est donc indispensable pour décrypter les mécanismes mis en jeu dans ces maladies qui sont aujourd’hui et pour les années à venir, un problème majeur de santé publique. Pour mimer la situation chez l’être humain, les animaux seront utilisés au stade "jeune adulte" (i.e., âgés de 8 à 14 semaines) pour permettre leur suivi longitudinal jusqu'à 3 mois de régime.
Exposition chronique aux additifs et contaminants alimentaires inorganiques de la vie in utero à l’âge adulte: impact d’un stress chimique sur l’homéostasie de la barrière intestinale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
5 928 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Exposées dès la vie in utero à des additifs alimentaires (dioxyde de titane, dioxyde de silice, silicate d'aluminium) et à un pesticide au cuivre, elles subissent des tests de tolérance au glucose avec prélèvements de sang répétés et des mesures de perméabilité intestinale. Le porteur indique un stress et un inconfort liés aux administrations orales et aux prises de sang, atténués par une crème anesthésiante. L'étude doit fournir des données sur les risques de ces substances, utilisables par les instances réglementaires.
Objectifs
L'intestin est la voie principale de passage des additifs alimentaires vers l'organisme et une pertubation de la perméabilité intestinale pourrait être un facteur prépodérant dans l'augmentation de leur concentration circulante dans l'organisme. Une altération de la perméabilité intestinale est retrouvée dans de nombreuses pathologies comme le syndrome de l’intestin irritable (10-15% de la population dans les pays développés) ou encore l'anxiété et la dépression. Le but de ce projet est d'étudier si une augmentation de perméabilité intestinale concécutive à un stress chimique, durant la période critique qu'est la gestation, sera associée à un passage plus important de 3 additifs (dioxyde de titane, dioxyde de silice, silicate d'aluminium) ou contaminants alimentaires de type pesticide (nanopesticide de cuivre) vers le foetus. Les impacts sur la descendance seront évalués par l'analyse du microbiote et des fonctions intestinales et métaboliques.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de mettre en evidence l’impact des 3 additifs et des contaminants de type pesticide consécutive à un stress, sur la réponse la mise en place du microbiote et des fonctions intestinales et métaboliques Ce projet apportera des données utilisables pour l'évaluation des risques pour la santé humaine et animale dans l'utilisation de ces additifs et contaminants. Cet impact pourra être pris en compte par les instances règlementaires afin de réguler l'exposition humaine aux nanoparticules inorganiques des populations à risque.
Procédures
Dans le cadre des mesures d'intolérance au glucose, de la glycémie, de l'insulinémie et de la perméabilité intestinale, les animaux recevront une administration orale de glucose ou d'un marqueur de perméabilité intestinale (geste rapide d'environ 10 secondes) et des prélèvements sanguins seront également réalisés au niveau de la queue (1 prélèvement pour la mesure de perméabilité, 8 prélèvements pour la glycémie-insulinémie), après application d'une crème anesthésiante locale (10 secondes/prélèvement). Des prélèvements de fécès seront aussi effectués deux fois par semaine tout au long de l’expérience. Les souris seront isolées pendant 5 minutes dans des cages sans sciure pour permettre de récolter les fèces.
Impact sur les animaux
La mise en oeuvre de nos procédures pourra générer du stress. Il sera attenué par des manipulations hebdomadaires lors du suivi de poids ou d'observations. Ensuite la réalisation des mesures d'intolérance au glucose ou de mesure de perméabilité seront génératrices d'inconfort notamment lié à l'administration orale de glucose ou du marqueur de perméabilité intestinale et aux prélèvements de sang. Une prise en charge de la douleur liée à aux prélevements sanguins sera réalisée par application d'une crème anesthésiante locale.
Devenir
A l'issue de toutes les procédures, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter les échantillons tissulaires pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique du projet.
Remplacement
Le projet étudie l'impact d'une exposition, dès la période in utero et jusqu'à l'âge adulte, à des nanomatériaux alimentaires et des contaminants de type pesticide (TiO2, Alu, SiO2, Cu(OH)2). L’utilisation du modèle animal est nécessaire afin d’avoir cette exposition chronique dès la vie in utero. De plus, l’étude portera sur les impacts des nanomatériaux et des pesticides sur les axes microbiote-intestin. Aucun modèle alternatif ne permet de recréer tous les dialogues entre organes et entre microbiote et intestin..
Réduction
Nous avons conçu nos expériences pour à la fois répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis pour cibler nos objectifs en fournissant des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux a été déterminé en se basant sur des résultats antérieurs d'études similaires. Chaque groupe expérimental sera donc constitué de 12 souris. Pour les analyses des données récoltées, des tests statistiques adaptés seront réalisés.
Raffinement
Les animaux seront en hébergement collectif (5 ou 3 par cages selon l'expérimentation) dans des cages contenant des abris de type maisonnette en inox. Les femelles gestantes seront isolées une par cage avec un enrichissement des cages (dispositifs de nidification en papier absorbant) afin de réduire l'angoisse des animaux. L'angoisse sera également atténuée par des manipulations hebdomadaires lors du suivi de poids ou d'observations. Les individus présentant une détérioration de l'état général (poil piqué, dos vouté, difficulté de mobilité, agressivité extrême) et/ou une perte de poids supérieure à 10% par rapport à la pesée précédente ou une diminution de la prise alimentaire seront identifiés et écartés de l'étude afin de pratiquer des soins adaptés.
Choix des espèces
La souris est un modèle reconnu en toxicologie, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier le microbiote et l’intestin. Nous travaillerons avec la lignée C57bl/6J car nous avons déjà des résultats préliminaires concernant l’exposition des adultes aux additifs alimentaires. Les souris mâles et femelles seront utilisées à l’âge adulte pour mimer une exposition périnatale et chronique à long terme.
FXR et Tau
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection de vecteurs viraux dans le cerveau, subit une biopsie de la queue et des tests de mémoire en labyrinthe, pour étudier le lien entre un récepteur et les lésions de la maladie d'Alzheimer. Le porteur indique des douleurs liées à la biopsie et aux injections stéréotaxiques et un stress lié aux tests. Il qualifie de "stricte nécessité" le recours à des animaux vivants pour relier comportement cognitif et lésions du cerveau.
Objectifs
L’objectif général de ce projet et de la présente demande vise à mieux comprendre le lien entre le récepteur FXR (et son rôle dans l'insulinosensibilité centrale) et les mécanismes physiopathologiques de la maladie d'Alzheimer et ce, en appréhendant les mécanismes cellulaires et moléculaires contribuant au développement des lésions dans la maladie d'Ahzheimer et les tauopathies (pathologies caractérisée une agrégation intraneurale de la proteine Tau) et pouvant être influencer par le récepteur FXR. Ainsi, notre projet permet non seulement de lever des interrogations fondamentales quant aux processus pathologiques mis en jeu dans la MA pouvant in fine aboutir de nouvelles startégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Notre projet va apporter la preuve de concept selon laquelle le récepteur FXR pourrait influencer la pathlogie Tau physiopathologie de la MA et des tauopathies.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections de vecteurs viraux (voies intracraniale: 1x, moins de 5min,procédure entière moins de 60 min). Nous réaliserons également des tests de comportement afin d’évaluer les performances cognitives des animaux (actimétrie: 1x, 10 min; labyrinthe: 1x, 10min, 130 moin en cage d'hébergement (phase de retention) et 5 min soit 45 min). Les animaux subiront une biopsie de queue (moins de 5 min, 1X).
Impact sur les animaux
Nuisances possibles suite aux différentes manipulations de animaux : -Douleur associé à la biopsie de queue (douleur modéré; 1x) -Stress associé aux investigations comportementales -Douleurs opératoires associées aux injections stéréotaxiquesdouleurs/infections post-opératoires
Devenir
En dehors de la procédure de génération et de génotypage, l'ensemble des animaux sera mis à mort en fonction des objectifs annoncés; à savoir mettre en lien le comportement cognitif et les lésions histopathologiques et l'insulinosensibilité centrale. Ce lien nécessitant l amise à mort de tous les animaux pour pouvoir réaliser des marquages histologiques, immunomarquages et/ou western blot. De ce fait, aucun animal ne sera réutilisé ni adopté.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer différents aspects de la physiopathologie de la MA et des tauopathies, le lien complexe entre neurones et cellules gliales, en lien avec les performances cognitives des animaux. L'utilisation d'animaux vivants revêt donc un caractère de stricte nécessité avec le développement d’approches neurobiologiques intégrées. Ces évaluations ne peuvent pas être réalisées en utilisant des alternatives aux modèles animaux. Le laboratoire est néanmoins conscient de l’aspect nécessaire de recourir à des méthodes alternatives quand cela est possible, ce qui est effectivement fait pour un certain nombre d’études cellulaires et moléculaires ne nécessitant pas de modèles animaux.
Réduction
Le nombre total d’animaux concernant les procédures de l’ensemble des protocoles de ce projet sur les 5 ans à venir est estimé à 360. Cette utilisation maximise les données obtenues de chaque animal, ce qui peut limiter ou éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal. Pour chacun des groupes constitués, le nombre d'animaux a été réduit au maximum tout enpermettant l'obtention de résultats satisfaisant (différences statistiquement observables). Pour limiter le nombred’animaux, lorsque cela sera possible une réutilisation des animaux des animaleries employés pour la formation sera réalisée. Un calcul du nombre d’animaux total nécessaire par groupe a été effectué pour respecter le principe des 3R.
Raffinement
LES ANIMAUX SERONT OBSERVES TOUS LES JOURS, PESES REGULIEREMENT, PAR DU PERSONNEL SPECIALEMENT FORME. DURANT LES DIFFERENTS PROTOCOLES, TOUT SERA MIS EN OEUVRE POUR MINIMISER LE STRESS AUQUEL LES ANIMAUX SONT SOUMIS. LES ANIMAUX SERONT HEBERGES EN GROUPE, ET DES ELEMENTS D'ENRICHISSEMENT DU MILIEU SERONT MIS A DISPOSITION, PAR EXEMPLE COTON POUR LA CONFECTION DE NIDS... LES ANIMAUX SERONT SUIVIS PRECISEMENT POUR CHAQUE PROTOCOLE, POUR LESQUELS DES POINTS LIMITES ADAPTES ONT ETE DEFINIS. TOUTE SOUFFRANCE, ANGOISSE OU COMPORTEMENT INHABITUEL SERA PRIS EN CHARGE PAR DES APPROCHES APPROPRIEES. LES PROCEDURES EXPERIMENTALES DE CHIRURGIES SERONT REALISEES SOUS ANESTHESIE GENERALE PAR VOIE INTRAPERITONEALE. EN CAS DE DOULEUR, UN ANALGESIQUE SERA ADMINISTRE. LES ANIMAUX PRESENTANT UN DES POINTS LIMITES SPECIFIES POUR CHAQUE APPROCHE EXPERIMENTALE SERONT SACRIFIES DANS UNE SALLE DEDIEE; LE TOUT EN LIEN AVEC LE RESPONSABLE DU BIEN ETRE ANIMAL.
Choix des espèces
Dans toutes nos études, nous utilisons des souris, la plupart étant génétiquement modifiées afin de reproduire des caractéristiques pathologiques reproduisant un certain nombre d’altérations retrouvées dans la MA et les tauopathies (pathologie Tau). Le phénotype de ces animaux est modulé par l’expression cérébrale de FXR via l'usage de vecteurs viraux et d’apporter des preuves de concept précliniques importantes pour des approches biomarqueurs et thérapeutiques futures. Dans la plupart des expérimentations, les souris seront utilisées à l’âge adulte : de 4 mois à 12 mois. Nos modèles ne présentent pas de phénotypes dommageables connus à ces âges, si ce n'est une perte de mémoire. Dans la plupart des expérimentations, les souris seront utilisées à l’âge adulte : de 4 mois à 12 mois. Nos modèles ne présentent pas de phénotypes dommageables connus à ces âges, si ce n'est une perte de mémoire.
Impact de l’électrostimulation spinale sur l’inflammation chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
843 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 462 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 381 opérées sans réveil. Selon les groupes, chaque animal subit une chirurgie puis l'injection d'une endotoxine bactérienne ou l'induction d'une arthrite ou d'une atteinte du système nerveux proche de la sclérose en plaques, avant des séances d'électrostimulation. Le porteur reconnaît que ces inductions peuvent provoquer une douleur sévère et que les impulsions électriques peuvent créer un inconfort. L'étude vise à mettre au point un électrostimulateur contre la polyarthrite et la sclérose en plaques, qu'il présente comme un "besoin" faute de traitements curatifs.
Objectifs
La polyarthrite rhumatoïde (PR) et la sclérose en plaque (SEP) sont des maladies inflammatoires, caractérisées par une atteinte articulaire ou nerveuse respectivement évoluant vers la déformation et la destruction des articulations ou du tissu nerveux. La PR et la SEP sont une maladie autoimmune reconnue pour présenter un nombre anormal de cellules immunitaires dans les articulations ou le cerveau respectivement qui produisent des molécules inflammatoires, activant la destruction des tissus. Des études ont montré que le système nerveux pouvait réguler le système immunitaire via la libération des molécules (tels que l’acétylcholine, l’adrénaline ou la noradrénaline) lors de la stimulation de nerfs qui peuvent agir directement sur les cellules du système immunitaire. Dès lors, l’intervention sur l’activité des nerfs dans le but de modifier l’activité du système immunitaire est envisageable. Ainsi, chez l’homme la stimulation de nerfs est déjà utilisée pour le traitement de maladies comme l’épilepsie ou la dépression. De nos jours, plus de 50000 patients dans le monde sont implantés avec des micro-stimulateurs. Les effets de ces électrostimulations sont actuellement recherchés dans des maladies inflammatoires comme la PR. Deux modèles ont été développés chez la souris qui permettent d'induire des pathologies proches de la PR et de la SEP. Le but à long terme de notre projet est de développer un électrostimulateur visant à traiter la PR et la SEP. Dans un premier temps, notre objectif sera d’évaluer l’impact de l’électrostimulation des certaines nerveuses sur un modèle simple d’inflammation afin d’optimiser les paramètre de stimulation électrique. Dans un second temps nous recherchons à évaluer l'effet de l'électrostimulation de ces nerfs sur le développement de la PR et de la SEP dans des modèles murins.
Bénéfices attendus
Les traitements actuels ne permettent pas de lutter efficacement contre l’arthrite rhumatoïde ni la sclérose en plaque. Les traitements les plus efficaces sont des traitements lourds, non curatifs et qui génèrent de nombreux effets secondaires. Par conséquent, le développement de traitements plus efficaces et sans effets secondaires est nécessaire pour lutter contre les maladies auto-immunes.
Procédures
La procédure 1 est une procédure chirurgicale terminale de moins de 3H sous anesthésie à l'isoflurane. Pour la procédure 2 : les animaux subiront une procédure chirurgicale unique de moins de 40mn. Une semaines après cette chirurgie les animaux recevrons une injection intrapéritonéale infra létale d'endotoxine bactérienne puis seront mis à mort 90mn après. Un prélèvement sanguin sous anesthésie est prévu 90mn après injection de LPS en fin de procédure. Pour la procédure 3 et 4 : Les animaux subiront une procédure chirurgicale unique de moins de 40mn chacune. Une semaine après la chirurgie, les animaux seront immunisés par injection d'adjuvant complet de Freund et d'une protéine (soit le collagène pour la procédure 3 soit la myéline pour la procédure 4) par voie sous-cutanée puis électrostimulés (ou non) selon différents protocoles pendant 21 jours au maximum à raison de 12, 6, 3 et 2 sessions d’électrosimulations de 2 mn par jour. Aucun prélèvement n’est prévu durant ces procédures.
Impact sur les animaux
La procédure 1 de ce projet est sans réveil. Les nuisances seront donc inexistantes pour cette procédure sous réserve du respect des bonnes pratiques d'anesthésie. Les autres procédures seront réalisées sur des animaux ayant subi une chirurgie ce qui générera les nuisances suivantes : - Douleur associér à l’injection sous cutanée d’analgésique préopératoire ; - stress lié à la phase d’induction de l’anesthésie (isolement de l’animal dans une boite d’anesthésie) et à la phase post-anesthésique dans la cage de réveil ; - une inflammation au niveau des plaies chirurgicales et de la zone d’implantation ; - perte de poids dans les 2 à 3 jours suivants la chirurgie. Par ailleurs pour les procédures 2, 3 et 4 une douleur sévère pourra être observée soit suite à l'induction d'une inflammation systèmique par injection de molécule bactérienne (procédure 2), soit suite à l'induction d'une inflammation des articulations (procédure 3), soit suite à l'induction d'une inflammation du système nerveux central (procédure 4). Enfin, les impulsions électriques quant à elles pourraient également induire un inconfort transitoire ou des douleurs chez l'animal lors de la procédure.
Devenir
Pour toutes les procédures, tous les animaux seront mis à mort dès la fin de la procédure expérimentale pour des analyses anatomopathologiques et histologiques.
Remplacement
Il n’existe aucune méthode in vitro validée scientifiquement ou test in vitro connu qui offrirait une alternative à l’expérimentation animale pour répondre aux questions posées dans ce projet. Le phénomène d’inflammation par l’arthrite rhumatoïde ou la sclérose en plaque ne peut être étudié correctement in vitro car il s’agit d’un phénomène complexe et ne pouvant être étudié que chez l’animal, en intégrant l'ensemble de la biologie d'un organisme vivant. L’utilisation d’un modèle expérimental in vivo est donc un pré-requis à la phase de développement clinique.
Réduction
Pour la procédure 1, le nombre de paramètre d’électrostimuation possible étant quasiment infini et, afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, nous utiliserons des modèles de régression linéaire. Nous estimons qu’au maximum 381 souris seront nécessaires à cette procédure. Ce nombre total de souris représente un nombre maximum sachant que nous ne pourrons mettre en expérimentation que des lots de 10 animaux étant donné les contraintes spatiales de notre animalerie et que des bilans seront réalisés tous les 20 souris à partir de la 50ième souris. Ainsi, si 10 paramètres électriques satisfaisants sont trouvés (activation des fibres splénique sans modifier la pression artérielle) avant la fin de la procédure, nous interromprons les expérimentations pour le procédure 1 et passerons à la procédure 2 pour tester ces 10 paramètres. Pour les procédures 2, 3 et 4, nous avons déterminé le nombre d’animaux par une approche statistique reconnue. En effet, notre stratégie d’expérimentation reposant sur la comparaison entre scores cliniques des animaux électrostimulé ou non, le test de puissance réalisé avec le logiciel G*power 3.1 nous donne le nombre d’animaux minimal pour obtenir des résultats significatifs en fonction des hypothèses avancées.
Raffinement
Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés dans des cages collectives avec un environnement enrichi (tubes en carton pour se cacher, briques de bois à grignoter). Une période d’acclimatation de 7 jours minimum aura lieu pendant laquelle aucun geste technique lié à la procédure expérimentale ne sera réalisé. Les chirurgies seront réalisées par du personnel ayant les compétences requises et les animaux seront sous anesthésie et analgésie ce qui évitera toute souffrance. Les effets potentiellement douloureux de l'électrostimulation seront évalués pour qu'il soit mis un terme à l'électrostimulation au plus tôt si des signes douloureux apparaissent. Les effets sur la le score clinique seront évalués sur un nombre d'animaux strictement suffisant pour évaluer les effets de l'électrostimulation à long terme (procédure 3 et 4). Enfin, des points limites ont été établis afin d’anticiper toute dégradation de l’état de santé général des animaux anesthésiés ou conscients et, le cas échéant, d’appliquer des protocoles de soins adaptés. Dans le cas où la santé de l’animal serait dégradée, une mise à mort sera réalisée immédiatement sur décision du responsable de l’étude.
Choix des espèces
L’espèce souris sera utilisée en raison des données de la littérature démontrant une implication du système nerveux sympathique sur l’inflammation sur ce modèle. Il est également utilisé car il existe des modèles bien établis des pathologies auto-immunes (arthrite rhumatoïde et encéphalite) induits par immunisation. Utilisation d’animaux adultes car l’objectif est le développement d’un dispositif médical pour les sujets adultes (≥ 10 semaines)
Rôle de modulateurs de l’expression de gènes dans la fibrose hépatique et la cicatrisation du foie
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
2 053 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Selon les groupes, chaque animal reçoit un régime gras, des injections répétées d'un agent qui provoque une fibrose du foie, une ligature chirurgicale de la voie biliaire ou l'ablation des deux tiers du foie. Le porteur indique que ces interventions peuvent causer douleurs post-opératoires, gêne à la mobilité et stress lié aux prélèvements. L'étude cherche des cibles thérapeutiques contre la fibrose du foie, pour laquelle il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la progression de la maladie.
Objectifs
Les maladies chroniques du foie sont en constante augmentation en particulier la maladie du foie gras (encore appelée NASH) , souvent associée au diabète et à l’obésité, consécutive à notre sédentarité et à notre excès d’alimentation en graisses. La fibrose du foie est une cicatrice créée lorsque le foie est attaqué par des agents toxiques comme l’alcool ou la suralimentation en graisses. A terme, la fibrose aboutit à une cirrhose, son stade terminal. La cirrhose touche environ 200 000 personnes en France et ses complications sont sévères (cancer du foie). De plus, elle s’accompagne d’un blocage des capacités régénératives du foie. Il n’existe actuellement aucun traitement connu pour réduire la fibrose en dehors de l’arrêt de l’agent causal. Nous nous intéressons en particulier à l’inflammation qui est un mécanisme essentiel dans la progression de la maladie. Le projet spécifique qui fait l’objet de la présente demande est d’étudier le rôle de certains modulateurs de l’expression des gènes, au cours de la régénération du foie et de la mise en place et de la progression fibrose. Le but est de savoir si ces gènes modulateurs jouent un role sur la fibrose et la régénération. Nous allons tester les conséquences de l’inactivation de ces gènes sur la fibrose chez la souris, soit dans toutes les cellules de l’organisme soit spécifiquement dans certaines cellules du sang. L'objectif de ce projet est de mieux comprendre le développement de la fibrose et de trouver de nouvelles pistes thérapeutiques pour permettre la régénération du foie et la régression de la fibrose.
Bénéfices attendus
Les bénéfices susceptibles de découler de ce projet sont l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques de la fibrose du foie
Procédures
Les interventions visent à induire une cicatrice donc une fibrose ou une régénération du foie. Pour induire une fibrose et étudier sa régression, 3 différentes approches classiques seront entreprises : - régime gras pendant 10 semaines (induction de la fibrose) suivi d’une remise en régime normal pendant 2 semaines (procédure de régression de fibrose) - Injection répétée d’un agent fibrosant dans l’abdomen 2 fois par semaines pendant 6 semaines sur animaux vigiles (induction de la fibrose) suivi d’un arrêt des injections (procédure de régression de fibrose) - Ligature chirurgicale de la voie biliaire principale sous anesthésie générale et euthanasie après 2 semaines. L’intervention dure une dizaine de minutes. Pour induire une régénération hépatique qui est un processus normal, 2 procédures seront menées - injection unique d’un agent pharmacologique dans l’abdomen induisant une prolifération des cellules du foie - intervention chirurgicale sous anesthésie générale enlevant 2/3 (hépatectomie) du foie. Le foie dans ces conditions régénère complètement en une semaine sans jamais perdre sa fonction. L’intervention dure une quinzaine de minutes. Des prélèvements sanguins seront pratiqués soit sous anesthésie générale en fin de procédure, soit sur la queue sur animal vigile par ponction locale sur la veine latérale de la queue ne nécessitant pas d’anesthésie pour recueillir une goutte de sang dans un capillaire.
Impact sur les animaux
- Le régime gras peut induire une prise de poids avec une gene à la mobilité due à l'accumulation de graisse abdominale - Les injections intrapéritonéales peuvent entraîner une douleur au point d'injection - Les interventions chirurgicales peuvent induire une douleur en post-opératoire et une irritation ou une inflammation au niveau de la cicatrice de laparotomie. Celles-ci seront atténuées par injection systématique d’analgésiques pré et post-opératoires. - Les prélèvements de sang répétés peuvent induire un stress - Un des modèles de souris utilisé est connu pour induire une prolifération des cellules sanguines s’apparentant à un cancer du sang qui débute uniquement après 6 mois et pas chez toutes les souris. En conséquence, toutes les procédures prévues interviendront avant l’apparition de la maladie, soit avant 6 mois. Les autres modèles ne sont pas connus pour donner d’effets indésirables particuliers
Devenir
euthanasie par une méthode réglementaire en fin de chaque procédure
Remplacement
La maladie du foie gras (NASH) et la fibrose sont des maladies chroniques du foie induite par une inflammation soutenue et un dialogue entre les différents types de cellules qui composent le foie. Les modèles animaux non vertébrés comme le nématode ou la drosophile ne présentent pas de " foie". Les organoïdes ou les sections de foie, qui représentent la structure miniature hépatique en 3 dimensions, ne modélisent pas la complexité du dialogue entre les différents types cellulaires et ne permettent pas d’étudier la régénération qui impliquent d’une part d’autres organes comme le tissu adipeux, l’intestin et son microbiote et d’autre part les interactions entre les cellules inflammatoires, et les principales cellules fonctionnelles du foie qui sont hétérogènes. Les modèles de culture cellulaire ne peuvent pas reproduire la dynamique de progression de la maladie chronique du foie de la fibrose à la cirrhose, de même que la régénération hépatique qui sont deux processus dynamiques. Enfin, nous disposons de modèles animaux permettant de comprendre le rôle de gènes dans un type cellulaire donné grâce à des invalidations conditionnelles, c’est à dire une inhibition de certains gènes limitée à certains types de cellules.
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables et valorisables ou publiables. Un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Selon notre expérience acquise sur des tests de prédiction antérieurs ainsi que ceux rapportés dans la littérature, 12 souris (expériences à court terme de 2 semaines au maximum) ou 20 souris (expériences de plus de 2 semaines) seront nécessaires par groupe pour obtenir une puissance statistique suffisante. Quand les expériences le permettent les mêmes animaux contrôles seront utilisés pour différentes lignées conditionnelles ou différents protocoles. Un seul prélèvement servira pour l’analyse de plusieurs paramètres (ARNs, protéines, marquages sur coupes de tissu).
Raffinement
Afin de réduire la souffrance, le stress et l’angoisse des animaux, nous avons inclus dans les procédures des grilles d’observations et de score des animaux et de points limites détaillés et adaptés à chaque procédure qui serviront de support décisionnel. En particulier, l'administration d'antalgiques pré et post-opératoires sera systématique en cas d'intervention chirurgicale. Les animaux se réveillent sur une plaque chauffante et sont surveillés 6 heures en post-opératoire puis quotidiennement. Toute chirurgie est pratiquée sous anesthésie générale. Les animaux seront placés dans des cages enrichies en bâtonnets en bois et en coton et seront suivis cliniquement par les expérimentateurs quotidiennement en cas de chirurgie et deux fois par semaine avec pesée des animaux pour les autres procédures. En cas d’obésité, le nombre d’animaux sera diminué par cage (3 animaux maximum au lieu de 5 habituellement). Ils seront également observés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie tout au long de la procédure. En cas d’atteinte d’un point limite, un antalgique sera administré, la surveillance sera quotidienne pour suivre l’évolution clinique, scorés et euthanasiés si le score limite indiqué dans les grilles détaillées est atteint.
Choix des espèces
Nous utilisons la souris comme modèle car nous disposons d’outils permettant de casser un gène spécifiquement dans un type cellulaire donné et lorsqu’on le souhaite (modèle conditionnel). De plus, les outils nécessaires à l’analyse (anticorps, facteurs de croissance… ) adaptés à la souris sont facilement disponibles. Nous travaillerons uniquement sur des souris adultes majoritairement mâles et femelles entre 8 à 24 semaines (fin de procédure), car nous souhaitons mimer la fibrose chez l’homme qui se développe chez l’adulte
Caracterisation pharmacocinetique d’une molecule innovante administree par les voies intraveineuse, intraperitoneale et orale chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
160 souris vont être utilisées, toutes tuées sans réveil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit le composé étudié puis un mélange anesthésiant avant la mise à mort et le prélèvement d'urine, de sang et d'organes, pour décrire le devenir d'un candidat médicament contre le glioblastome dans l'organisme. Le porteur indique un stress et une douleur légère de courte durée lors des administrations. L'étude sert à déterminer la meilleure voie d'administration, l'efficacité antitumorale ayant déjà été testée dans des greffes antérieures.
Objectifs
Depuis plusieurs années, nous développons une molécule innovante pour le traitement d'une forme très agressive et incurable de cancer du cerveau, le glioblastome. Son efficacité anti tumorale a été mise en évidence dans des souris chez lesquelles nous avions greffé des cellules cancéreuses provenant de patients. La demande actuelle a pour objectif d'identifier les caractéristiques pharmacocinétiques de ce candidat médicament dans le modèle murin selon différents modes d'administration.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer la manière dont le candidat médicament se distribue dans l'organisme, la vitesse à laquelle il est éliminé ainsi que le mode d'administration le mieux adapté. Ces caractéristiques sont importantes pour optimiser le traitement contre un type de tumeur cérébrale chez l'humain.
Procédures
Chaque animal subira deux gestes techniques qui conduiront à l'administration du composé étudié puis d'un mélage analgésique et anesthésiant. Ces gestes ne dureront pas plus de quelques dizaine de secondes. La mise à mort sera donnée sans réveil préalable.
Impact sur les animaux
La molécule innovante a fait l'objet d'études préalables de toxicité aïgue et chronique. A la dose utilisée, aucun effet indésirable n'a été observé. Chaque animal aura toutefois à subir un stress et une douleur légère de courte durée lors de l'administration du composé à l'étude et du mélange analgésique et anesthésiant. La mise à mort sera donnée sans réveil préalable.
Devenir
La procédure comporte le prélèvement de l'urine, du sang et des organes. Les animaux seront donc mis à mort.
Remplacement
Au cours du développement du projet, nous avons utilisé des modèles cellulaires in vitro 2D et 3D pour optimiser la concentration efficace et déterminer la gamme de toxicité du principe actif.
Réduction
Le design expérimental en pharmacocinétique est variable. Nous avons choisi de limiter le nombre d'animaux nécessaires à l'étude en adoptant comme comparateur un groupe unique de souris traitées par du sérum physiologique et identifié t=0. Cela a permis de réduire de moitié le nombre d'individus. Les réplicats biologiques pour chaque temps de la cinétique ont été limités à trois individus. Un test de student sera utilisé pour vérifier la réalité statistique dans et entre chaques groupes expérimentaux.
Raffinement
Pendant le temps de la procédure expérimentale, les animaux seront hébergés dans les conditions habituelles d’animalerie avec un environnent enrichi, sans isolement et en accord avec la réglementation en vigueur. Nous apporterons un soin particulier lors de l'acclimentation à habituer les animaux à la présence de l'expérimenteur et à être manipulés (contention). Ainsi le niveau de stress sera diminué lors de la procédure. De plus, la prise en compte de point limite et l'utilisation d'analgésique permettra de prévenir l'appartition de toute souffrance chez les animaux.
Choix des espèces
A ce stade du développement pré-clinique du médicament, la souris est le modèle de référence le plus proche de l'humain pour obtenir les résultats nécessaires. La pathologie visée affecte les adultes. Aussi nous utiliserons des souris adultes (2 mois)
Mise en place d’un modèle murin de lésion cérébrale traumatique et de stimulation du nerf vague à des fins thérapeutiques chez l’Homme
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
84 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie du cerveau provoquant une lésion du cortex moteur, la pose d'une électrode sur le nerf vague et des séances de stimulation et de tests moteurs. Le porteur indique que la lésion peut réduire la préhension de la patte avant droite et que la pose de l'électrode peut gêner la nuque. L'étude vise à savoir si la stimulation du nerf vague améliore la récupération après une lésion cérébrale, en vue d'une transposition "à plus long terme" chez l'humain.
Objectifs
Chaque année en France, environ 150 000 personnes sont victimes d’un traumatisme crânien. Un tier d’entre elles sont hospitalisées pour des lésions cérébrales consécutives à un choc. Par sa position anatomique, le cortex moteur est plus exposé aux lésions traumatiques que d’autres régions corticales. Les dommages dans cette région vont entrainer des déficits moteurs avec une récupération fonctionnelle limitée. Comme nous l’avons montré depuis plusieurs années chez la souris ayant subi une lésion cérébrale traumatique dans le cortex moteur, la transplantation cellulaire est une approche thérapeutique prometteuse. Néanmoins, l’efficacité de la greffe et la survie des neurones greffés nécessitent d’être optimisés. De plus, durant ces 10 dernières années, la stimulation du nerf vague (utilisée depuis plus de 20 ans en tant que traitement de l’épilepsie chez l’Homme) est également apparue comme une thérapeutique prometteuse pour le traumatisme crânien. Elle permet une récupération des fonctions motrices et une modulation bénéfique de molécules de l’inflammation et du stress oxydatif. La question est donc de savoir si une stimulation du nerf vague permet d’améliorer l’efficacité de la thérapie cellulaire dans un modèle de lésion cérébrale afin d’envisager une transposition de cette approche chez l’Homme. . Les objectifs de ce projet sont donc (1) de développer les techniques de lésion cérébrale et stimulation du nerf vague et (2) de tester les effets de la stimulation du nerf vague sur la lésion.
Bénéfices attendus
La mise en place de ces techniques de lésion cérébrale et de stimulation du nerf vague chez le rat permettra de conclure sur les effets de la stimulation du nerf vague après une lésion cérébrale qui est une étape cruciale dans la recherche d’optimisation de la thérapie cellulaire pour la lésion cérébrale. En effet, les effets bénéfiques attendus de la stimulation du nerf vague sur la lésion cérébrale pourront être évalués à court terme dans le cadre de la thérapie cellulaire pour optimiser les conditions de greffe et ainsi mieux prendre en charge la réparation cérébrale après une lésion chez l’animal. Le but à plus long terme étant d’appliquer ces deux approches thérapeutiques (transplantation + stimulation) chez l’Homme ayant subi une lésion cérébrale.
Procédures
Une chirurgie sous anesthésie générale en présence d'antalgiques pour tous les animaux, durée de 10 min pour 84 rats ou 40 min pour 24 rats. Pour tous les animaux: 2 ( 84 rats) ou 3 ( 24 rats) sessions de tests du comportementaux moteur en condition vigile, durée 10 min par session. Pour ces 24 rats: stimulations du nerf vague en condition vigile, durée 30 min: 1 session pour 12 animaux et sessions répétées quotidiennes, 5 jours par semaine pendant 4 semaines pour 12 autres animaux. Pesées en condition vigile: 1 fois par jour en suivi post-chirurgie pour tous les animaux, puis 1 fois par semaine pendant 5 semaines pour 24 animaux.
Impact sur les animaux
L’anesthésie générale pourra entrainer un inconfort transitoire au réveil, et une légère perte de poids ponctuelle pourrait également apparaitre. La lésion du cortex moteur entraine potentiellement une légère diminution de la capacité de préhension de la patte antérieure droite. Le placement de l’électrode pourra entrainer une gêne et un inconfort au niveau de la nuque. Lors des pesées individuelles des animaux, ou des tests de motricité, les animaux seront placés seuls dans ces dispositifs, ce qui pourrait générer un léger stress transitoire pendant maximum 10 minutes. Pour la stimulation du nerf vague les animaux seront placés individuellement dans une boite transparente sans contention dans laquelle ils pourront se retourner ou se mettre sur les pattes-arrières pendant toute la durée de la stimulation (30min) puis ils seront replacés dans sa cage d’hébergement avec leur congénère. La stimulation est indolore. La stimulation aiguë pourra engendrer un léger stress lors du placement de l’animal dans le dispositif. Les animaux stimulés de manière chronique s’habitueront au dispositif, le stress devrait donc diminuer au cours des jours d’expérimentation.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet afin de récupérer le cerveau pour des études neuroanatomiques.
Remplacement
L’objectif du projet est d’analyser les effets in vivo d’une stimulation du nerf vague sur une lésion cérébrale du cortex moteur afin d’optimiser l’efficacité de la thérapie cellulaire dans le cadre de la lésion cérébrale chez l’Homme. Ceci ne peut être actuellement modélisé ni in vitro ou ni in silico. De ce fait, cette étude pourra être réalisée uniquement sur l’animal entier et vivant afin de visualiser l’effet bénéfique de cette approche thérapeutique.
Réduction
Cette étude est une mise au point technique avec une procédure de type go, no go. Elle permet, de fait, la réduction du nombre d’animaux utilisés. Dans un premier temps 3 groupes de 12 animaux seront utilisés et si les résultats sont validés les expériences sur 4 autres groupes de 12 animaux seront menées. Des tests statistiques nous ont permis de déterminer le nombre minimal d'animaux pour avoir des résultats significatifs. De plus, cette étude sera réalisée sur les 2 sexes, les mâles et les femelles car le traumatisme crânien concerne aussi bien les hommes que les femmes, mais nous serons attentifs à l’éventuel impact du sexe sur nos résultats. Les mâles et femelles ne peuvent être hébergés dans la même cage et l’isolement étant un stress pour les rongeurs, nous aurons besoin de 12 animaux (6 mâles et 6 femelles) par groupe, afin que chaque rat ait un congénère dans sa cage. L’ensemble du projet prévoit donc minimum 3 groupes de 12 animaux et maximum 7 groupes de 12 animaux. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques.
Raffinement
Toutes les phases du projet seront réalisées par des personnels expérimentés. Avant l’expérimentation les animaux seront acclimatés à l’animalerie et à l’expérimentateur afin de réduire le stress le jour de l’expérimentation. En effet, les animaux seront placés dans leur cage d’hébergement par 2 de même sexe, 10 jours avant les expérimentations. L’expérimentateur manipulera les animaux les jours précédant l’expérimentation. Puis, durant toute l’expérimentation, le bien-être des animaux sera respecté en réduisant au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou le stress. Les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (hébergement en groupe de 2 dans des locaux adaptés avec enrichissement du milieu adapté à l'espèce : stick de bois à ronger et tunnel). Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale avec analgésie et monitoring de la température corporelle et utilisation d’un coussin chauffant. De plus, les chirurgies seront réalisées par des expérimentateurs compétents et expérimentés à la fois pour la lésion et la stimulation afin que les gestes soient précis et efficaces permettant une chirurgie dans les meilleures conditions possibles pour l’animal. Un traitement antalgique sera poursuivi en post-opératoire. Durant toute la procédure, le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière selon une grille de score (évaluation journalière durant les 7 jours post-chirurgie, évaluation hebdomadaire en pré-chirurgie et 7 jours après la chirurgie) qui permet le suivi des points limites gradés, stricts et précis et qui définit également des critères d’intervention et d’arrêt suffisamment précoces. Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention sera pris en charge sans délai.
Choix des espèces
Le rat est le meilleur modèle de rongeurs pour l’implantation d’une électrode de stimulation dans le nerf vague. En effet, la plupart des études de stimulation du nerf vague ont été réalisées chez cette espèce pour des raisons techniques de localisation et d’isolement du nerf vague (. De part sa taille et sa stabilité cardiovasculaire plus importante par rapport à la souris, les résultats obtenus varient peu d’un individu à l’autre, ce qui permet de réduire le nombre d’individus à utiliser pour les études statistiques. Les animaux utilisés seront des rats adultes de souche non-consanguine Sprague-Dawley (âgées de 8 semaines) car l’intérêt scientifique concerne la lésion corticale traumatique chez l’adulte. A 8 semaines la différence de poids entre mâle (320-380g) et femelle (210-260g) est importante mais ne gênera pas l’expérimentation, nous utiliserons donc des rats mâles et femelles agés de minimum 8 semaines (adultes) car le traumatisme crânien est aussi fréquent chez les femmes que les hommes.