Recherche fondamentale

816 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation du gène Kcnq2 reproduisant une épilepsie infantile, elles reçoivent jusqu'à vingt molécules candidates par gavage, injection ou alimentation, certaines étant implantées d'une puce sous anesthésie, et le porteur indique que des crises spontanées peuvent provoquer leur mort. Le système nerveux central est prélevé en fin de procédure. Le porteur revendique un modèle "premier et seul" disponible pour tester des traitements sur "organisme entier", les bénéfices pour les enfants restant renvoyés à une éventuelle demande d'essai clinique.

Objectifs

Des variants pathogènes dans le gène KCNQ2 provoquent une épilepsie dans l'espèce humaine. Cette épilepsie se manifeste par de fréquentes crises survenant durant les tous premiers mois de vie (avant l'âge de 3 mois). Cette activité épileptique est accompagnée d'une détérioration des fonctions cognitives et motrices. Il n'existe pas de traitement et les anti-épileptiques classiques sont inefficaces. Nous étudions une souris modèle knock-in porteuse d'un variant récurrent du gène KCNQ2 (T274M). La souris hétérozygote pour ce variant reproduit les caractéristiques principales de la maladie humaine. Ce modèle permet de mieux comprendre la pathophysiologie de la maladie et de tester de nouvelles approches thérapeutiques. Ce modèle est le premier (et le seul pour le moment) qui puisse permettre de tester des approches thérapeutiques sur organisme entier dans un contexte valide par rapport à la pathologie humaine. Le projet comporte la stabulation d'animaux à phénotype dommageable, leur traitement par des candidats médicaments et l'évaluation de leur phénotype sur le plan des crises d'épilepsie et des capacités cognitives. A l'heure actuelle, il existe des molécules qui vont atténuer les crises d'épilepsie chez les enfants présentant une épilepsie liée au gène KCNQ2 (par exemple la carbamazépine). La multiplicité des traitements subis par ces enfants et leur hétérogénéité (clinique et génétique) ne permet cependant pas d'établir clairement si les traitements efficaces sur les crises le sont aussi sur le développement neurologique. Il s'agit pourtant d'une question essentielle. Pour l'ensemble de ce projet, nous envisageons de tester 20 molécules. Nous avons pour objectif d'identifier des molécules qui apporteront un bénéfice en terme de neurodéveloppement. Si le traitement est efficace, nos souris modèle devront présenter moins de crise mais aussi avoir un neurodéveloppement le plus normal possible.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d'évaluer l'efficacité de candidats médicaments dans un modèle unique d'encéphalopathie épileptique. Si un candidat médicament s'avère efficace pour diminuer les crises d'épilepsie et pour améliorer les déficits cognitifs dans le modèle, les résultats serviront de base à une demande d'essai clinique dans l'espèce humaine.

Procédures

Traitements pharmacologiques par l'alimentation, par gavage ou injection intrapéritonéale en fonction des candidats médicaments. Traitements aigus (1 à 3 jours) ou chroniques (entre P25 et P90) en fonction de la pharmacocinétique des composés testés. Les animaux qui passent dans le test LMT seront anesthésiés et implantés avec une puce RFID. Prélèvements sanguins en fin de protocole pour estimer la biodisponibilité des composés ou de leurs métabolites et confirmer l'exposition.

Impact sur les animaux

Etant donné que les molécules administrées sont censées avoir un effet antiépileptique, nous attendons une amélioration du phénoptype des animaux (moins de crises, meilleures capacités d'apprentissage). Aucun effet indésirable particulier n'est attendu. Dans le pire des cas, les candidats médicaments n'auront pas d'efficacité. S'ils aggravent le phénotype (voir suivi des animaux ci-dessous), les traitements seront alors immédiatement interrompus. Dans ce modèle, il est également possible que les animaux présentent une crise spontannée conduisant à la mort de l'animal.

Devenir

Les animaux sont conservés pendant la durée de la procédure (traitement, évaluation des améliorations phénotypiques, prélèvement sanguin) puis euthanasiés en fin de procédure afin de prélever le système nerveux central pour réaliser des analyses histologiques, transcriptomiques et protéomiques.

Remplacement

Les épilepsies sont provoquées par des décharges inadaptées de cellules excitables en réseau. Les crises ainsi générées se traduisent, le plus souvent, par des mouvements anormaux. Pour étudier la pathologie dans toutes ses dimensions et espérer pouvoir produire des résultats qui seront transférables à l'espèce humaine, il est nécessaire d'avoir recours à un modèle animal car les cellules isolées ne récapitulent pas ce qui se passe dans un cerveau entier. Le gène Kcnq2 est très conservé entre la souris et l'Homme. Les tests phénotypiques sont bien développés dans cette espèce. Le modèle que nous utilisons est le premier et le seul disponible pour le moment pour cette pathologie. Avant que le modèle vivant ne soit utilisé, les médicaments candidats ont été testés sur des modèles cellulaires in vitro et dans des neurones dérivés de modèles iPS avant d'en préciser les caractères de d'efficacité et de toxicité éventuelle. L'étude des capacités d'apprentissage et de mémorisation ne peut être effectuée que sur l'animal vivant.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé sera optimisé et calculé de façon à ce que les effets attendus puissent être détectés avec un niveau de significativité suffisant tout en garantissant la sécurité des résultats s'ils doivent être utilisés ultérieurement pour justifier un essai clinique pédiatrique.

Raffinement

L'hébergement est adapté aux besoins physiologiques des animaux et permet l'expression de leur gamme normale de comportements. Les souris sont hébergées dans des cages de 530cm2 (5 souris maximum), avec 2 enrichissement différents (dôme et bandelettes de cartons), eau et nourriture ad libitum. La méthode d'administration des traitements la moins contraignante possible sera utilisée (dans les croquettes servant d'alimentation à chaque fois que cela est possible). Nous réalisons une anesthésie profonde des animaux avant l'implantation des puces RFID. Des points limite clairs sont définis et les animaux seront euthanasiés lorsqu'ils atteindront les critères d'interruption.

Choix des espèces

Les souris génétiquement modifiées sont un modèle qui permet de modéliser une pathologie humaine car il s'agit de mammifères disposant d'un répertoire génétique très similaire à celui de l'espèce humaine. La technologie de recombinaison homologue utilisée pour générer le modèle utilisé est parfaitement au point dans cette espèce et a permis de générer des centaines de modèles pertinents pour étudier les maladies humaines et pour développer des traitements spécifiques. Les souris seront traitées au moment où apparaissent les crises d'épilepsie spontanées dans ce modèle et uniquement chez des animaux sevrés (entre P25 et P30). La suppression des crises d'épilepsie est le premier critère de jugement d'efficacité de la molécule testée. Le traitement pourra se poursuivre quotidiennement jusqu'à P90 où l'évaluation finale de leur comportement sera effectuée (tests d'apprentissage et mémorisation). Dans l'espèce humaine, la maladie est sporadique (sans histoire familiale) et n'est donc détectée chez un nourrisson qu'au moment où les premières crises apparaissent. Nous nous placerons donc dans ce même cas de figure avec les animaux modèles étudiés ici, traités au moment où leur pathologie se manifeste.

114 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur colorectale leur est greffée sous la peau, puis elles reçoivent un anticorps et une sonde radioactive par voie intraveineuse, suivis de séances d'imagerie sous anesthésie. Le projet teste une radiothérapie interne visant à irradier sélectivement la tumeur. Le porteur fixe des points limites, une perte de poids de plus de 20 % ou une tumeur de plus de 1 500 mm3 déclenchant la mise à mort.

Objectifs

L’objectif de ce projet de recherche est d’évaluer une approche thérapeutique du cancer colorectal. Cette approche repose sur le principe de la radiothérapie interne, visant à sélectivement irradier les tumeurs afin de les détruire. Une stratégie consiste à injecter au patient un anticorps ciblant la tumeur, et sur lequel a été greffé un atome radioactif dont l’énergie du rayonnement est suffisante pour causer des dommages importants aux cellules cancéreuses. Cependant, cette stratégie peut engendrer une toxicité au niveau d’autres tissus de l’organisme, car les anticorps restent longtemps dans la circulation sanguine. Aussi, l’approche thérapeutique que nous souhaitons évaluer ici consiste à séparer l’injection de l’anticorps (ciblage de la tumeur) de celle de la radioactivité (action thérapeutique). Dans ce contexte, l’anticorps est dans un premier temps administré et va se fixer au niveau de la tumeur (préciblage de la tumeur). Dans un second temps, une sonde radioactive est administrée et va spécifiquement reconnaître l’anticorps fixé sur la tumeur et ainsi, délivrer son énergie à cette dernière (action radiothérapeutique). Cela permet d’irradier sélectivement les tumeurs tout en limitant la toxicité périphérique. Malgré les excellents résultats observés au niveau préclinique, il n’existe à ce jour aucun essai clinique de cette approche en raison d’une ingénierie difficile. Pour remédier à ces verrous scientifiques, nous proposons d’évaluer de nouveaux outils (optimisation des temps entre l’injection de l’anticorps et l’injection de la radioactivité et amélioration de la reconnaissance entre l’anticorps et la sonde radioactive grâce à la synthèse de nouvelles molécules) dans un modèle préclinique de cancer colorectal.

Bénéfices attendus

L’ensemble de ces travaux nous permettra d’évaluer l’intérêt de l’optimisation d’une approche par radiothérapie interne dans la prise en charge des cancers colorectaux avec pour objectif à plus long terme d’améliorer la prise en charge clinique de cette pathologie, en augmentant l’eefficacité de la radiothérapie. Par ailleurs, cette approche sera extrapolable à d’autres type de cancer.

Procédures

Les animaux subiront deux types d'intervention: - inoculation de cellules tumorales par voie sous-cutanée, sous anesthésie générale. Chaque souris ne subira cette intervention qu'une fois. La croissance tumorale sera alors suivie, avec une mesure du volume tumoral 2 fois par semaines pendant 3 semaines, toujours sous anesthésie générale afin de réduire l'angoisse de la manipulation. - injection intraveineuse sur animal vigile placé dans un système de contention: au maximum, une souris subira cette intervention 2 fois, 1 fois pour l'injection de l'anticorps, 1 seconde pour l'injection de la sonde radioactive. Ces 2 injections seront espacées d'au moins 24 heures. Ces injections seront réalisées par du personnel compétent et ne dureront que quelques minutes. Suite à l'injection de molécules radioactives, les animaux seront placés sous anesthésie générale pour l'évaluation de la distribution de ces molécules par imagerie. L'acquisition des images sous anesthésie durera au maximum 45 minutes et sera répétée au maximum 3 fois, à 24 heures d'intervalle, pour l'évaluation de la pharmacocinétique des anticorps.

Impact sur les animaux

Les nuisances potentielles sont le stress dû aux manipulations et la douleur engendrée par les procédures, principalement les injections (réduites à quelques dizaines de secondes car réalisées par un expérimentateur expert). Aucune nuisance liée à l’imagerie in vivo ou aux anesthésies n’est attendue. Pour les animaux porteurs de tumeur, les nuisances peuvent être relatives à une gêne fonctionnelle liée à la présence de la tumeur ou encore une nécrose précoce de la tumeur. Dans tous les cas, un suivi régulier des animaux permettra de réagir rapidement en cas d’apparition d’une souffrance pour l’animal. L’arbre décisionnel viendra orienter les actions à mener jusqu’à l’atteinte de points limites. Des méthodes de raffinements sont utilisées afin d'augmenter au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet. Pour cela les conditions d'hébergement seront optimales (hébergement en groupe, portoirs ventilés, température, hygrométrie, luminosité, enrichissement de milieu, surveillance quotidienne).

Devenir

Tous les animaux seront porteurs de tumeurs sous-cutanées et ne pourront être réutilisés. Aussi, tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure

Remplacement

Plusieurs sondes radioactives seront évaluées au cours de ce projet. Ces sondes ont été testées dans un premier temps in vitro afin de sélectionner les plus adaptées. La culture cellulaire ne permet pas de mimer la distribution et le métabolisme des molécules étudiées. A ce stade, le passage sur un modèle préclinique est donc inévitable pour juger de façon optimale l’effet des molécules étudiées.

Réduction

Les molécules évaluées ont dans un premier temps été caractérisées et sélectionnées par des méthodes in vitro afin de réduire le nombre de groupe d’animaux requis pour le projet. Le nombre d’animaux dans chaque groupe a été défini de façon à utiliser le minimum d’animaux tout en étant certain d’obtenir le matériel tumoral suffisant pour réaliser des études de caractérisation du modèle et atteindre une validité statistique. Sur ce plan, nous utiliserons des groupes de 6 souris.

Raffinement

Des méthodes de raffinements sont utilisées afin d'augmenter au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet. Pour cela les conditions d'hébergement seront optimales (hébergement en groupe, portoirs ventilés, température, hygrométrie, luminosité, densité animale, enrichissement de milieu, surveillance quotidienne). Lors des procédures expérimentales (inoculation des cellules et imagerie), les souris seront placées sous anesthésie générale gazeuse afin d’éliminer toute douleur potentielle et de réduire l’angoisse générée par la manipulation. De plus, des injections d’antalgiques pourront être appliqués si besoin. Une surveillance régulière des animaux consistera à observer et évaluer la présence de certains critères signes d’une dégradation de l’état général : prostration, œil clos, diarrhées, nécrose, infection au niveau de la tumeur…. Le poids sera régulièrement suivi ainsi que le volume tumoral. Une perte de poids supérieure à 20 % du poids maximal ainsi qu’un volume tumoral supérieur à 1500 mm3 sont deux signes cliniques imposant la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Les rongeurs sont classiquement utilisés en expérimentation animale en imagerie préclinique comme en cancérologie. En ce qui concerne le modèle tumoral, les études préliminaires réalisées ont pu mettre en évidence une croissance plus homogène chez les souris balb/c nude, décrite dans la littérature pour ce modèle. Les animaux utilisés seront des souris adultes de 5 semaines, pesant environ 20 g ayant atteint leur maturité sexuelle afin d'éviter l'influence des variations hormonales liée à la puberté. Le développement des xénogreffes que nous comptons utiliser est relativement rapide (environ 3 semaines), ce qui implique que les animaux seront inclus dans les procédures d’imagerie à l’âge de 7-8 semaines (20-25g).

88 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles suivent un régime riche en graisses et en sucres pendant douze semaines, avec des gavages de sucre et d'huile, des prélèvements de sang répétés et une prise de poids réduisant leur mobilité, avant d'être tuées pour prélever leurs tissus. Le projet cherche à montrer un effet protecteur de lipides végétaux contre l'obésité. Le porteur présente le résultat comme une "preuve de concept" pour de futures études chez l'humain.

Objectifs

La transition nutritionnelle vers des systèmes alimentaires sains et plus durables est en faveur de la végétalisation des régimes alimentaires. Il est devenu important de mieux comprendre le rôle et les mécanismes d’action des nutriments d’origine végétale d’un point de vue de la santé métabolique. Si les protéines végétales ont suscité un vif intérêt ces dernières années, certains lipides spécifiques des végétaux verts restent encore méconnus et peu exploités. Leur absorption et métabolisme in vivo sont jusqu’ici peu décrits. Des travaux préliminaires suggèrent néanmoins des effets anti-inflammatoires, des effets de réduction des lipides sanguins circulants, ainsi qu’une potentielle utilisation par les bactéries intestinales. Les lipides végétaux naturellement présents dans différents aliments végétaux pourraient donc constituer de potentiels prébiotiques (susbtrats pour les bactéries intestinales) avec des bénéfices importants pour la santé, et avoir ainsi un rôle à jouer dans le cadre de stratégies nutritionnelles préventives dans la lutte contre l’obésité. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est de mettre en évidence les potentiels effets protecteurs des lipides végétaux sur la mise en place de l’obésité chez la souris. Pour cela, nous étudierons leurs effets sur : le métabolisme des lipides et des glucides, la santé intestinale (absorption, fonction barrière, bactéries) et l’inflammation.

Bénéfices attendus

Cette étude animale devrait permettre de montrer pour la première fois que la consommation de certains lipides végétaux peut éviter une altération du métabolisme, un déséquilibre des bactéries intestinales et une augmentation de l’inflammation. Les résultats de cette approche pourront alors constituer une preuve de concept pour de futures études cliniques d’intervention nutritionnelle chez l’Homme, notamment chez des personnes souffrant d’obésité.

Procédures

- Alimentation riche en graisses et en sucres pour 3 groupes de 12 souris pendant 12 semaines ; alimentation d’entretien pour 1 groupe contrôle de 8 souris pendant 12 semaines. - Mesure de la composition corporelle sur toutes les souris vigiles, contention dans un tube, moins de 2 minutes par souris, deux fois par souris à 12 semaines d’écart. - Collecte de crottes de toutes les souris vigiles, 30 minutes dans une cage individuelle, deux fois par souris à 12 semaines d’écart. - Mise à jeun (6h ou 12h) des animaux avant les gavages de toutes les souris, deux fois à 1 semaine d’écart. - Un gavage avec du sucre pour tester le métabolisme des glucides sur toutes les souris vigiles : la contention et le gavage durent moins de 1 min par souris (1 gavage de sucre/souris sur les 12 semaines d’étude). - Un gavage avec de l’huile pour tester le métabolisme des lipides sur toutes les souris vigiles : la contention et le gavage durent moins de 1 min par souris (1 gavage d’huile/souris sur les 12 semaines d’étude). - Les deux gavages seront espacés d’une semaine. - Prélèvements de sang à la queue avant (T0) et suite au gavage avec du sucre (15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes) sur toutes les souris vigiles lors de la 10ème semaine d’étude. Ces prélèvements durent chacun quelques secondes par souris. - Prélèvements de sang à la queue avant (T0) et suite au gavage avec de l’huile (1, 2 et 4heures) sur toutes les souris vigiles lors de la 11ème semaine d’étude. Ces prélèvements durent chacun environ 30 secondes par souris. - Une injection dans l’abdomen des anesthésiques (1 seule fois durant les 12 semaines d’étude) ; durée : quelques secondes. - Un prélèvement de sang sous anesthésie profonde sur toutes les souris (1 seule fois durant les 12 semaines d’étude) ; durée : 30 secondes.

Impact sur les animaux

Une prise de poids est attendue chez les souris suivant une alimentation riche en graisses et en sucres. Cette prise de poids pourra entraîner une diminution de la mobilité des animaux concernés. Un isolement court (30 min) sera nécessaire pour la récupération des fécès et pourra induire un léger stress aux animaux. La mise à jeun (12h ou 6h avant gavage d’huile ou sucre) peut également induire un stress chez les animaux. Lors des deux gavages, léger stress dû à la contention de l’animal et gêne/irritation potentielle de l’œsophage liée au passage de la sonde. Les prélèvements sanguins réalisés après les gavages pourront induire un stress chez les animaux. Pour la mesure de composition corporelle, les souris sont introduites dans un tube cylindrique (espace réduit) pendant moins de 2 minutes, ce qui peut induire un léger stress aux animaux. L’injection dans l’abdomen des anesthésiants (avant le prélèvement terminal) peut induire une douleur transitoire.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort à l’issue du dernier prélèvement sanguin afin de collecter les tissus d’intérêt pour répondre aux questions scientifiques.

Remplacement

Le but de ce projet est d’étudier les effets des lipides végétaux sur le métabolisme de différents organes et l’inter-communication entre tous ces organes. Il est à l’heure actuelle impossible de reproduire dans des modèles de culture cellulaire les mécanismes métaboliques et inflammatoires en lien avec la modification des bactéries intestinales, et l’implication de toutes les voies de régulation au centre de la communication entre les différents organes. Par conséquent, le modèle animal ne peut pas être remplacé pour répondre à notre question scientifique. De plus, une étude clinique chez l’Homme ne peut pas être envisagée directement à ce stade car les comités d’évaluation des études cliniques demandent des résultats préliminiares précliniques (à l’échelle d’un organisme entier) pour démarrer une étude chez l’Homme.

Réduction

A notre connaissance, aucune étude sur la souris n’a encore été réalisée pour évaluer les effets de lipides spécifiques des végétaux verts dans un contexte d’obésité induit par une alimentation riche en graisses et en sucres. Nous ne disposons donc pas de données de la littérature pour réaliser un calcul d’effectif. S’agissant d’une étude pilote et exploratoire, une dizaine de souris par groupe semble nécessaire et suffisante (8 souris pour le groupe contrôle et 12 souris pour chacun des groupes avec alimentation riche en graisses et en sucres). De plus, l’étude sera lancée tout d’abord sur des souris mâles, et si les résultats sont significatifs chez les mâles alors la même étude sera réalisée sur des souris femelles (n=44) pour extrapoler ou non les résultats aux deux sexes

Raffinement

Plusieurs mesures seront mises en place pour veiller au bien-être des animaux et réduire au minimum toutes les nuisances potentielles : 1/ Ajout des lipides végétaux à l’alimentation des animaux pour éviter manipulation et contention quotidiennes des souris (contrairement à une supplémentation par gavage quotidien). 2/ Avoir le même expérimentateur (maximum 2) tout au long de l’étude et habituer les animaux à sa/leur présence (odeurs, voix, etc) pour diminuer leur stress face aux humains. 3/ Avoir du personnel expérimenté et formé aux gestes techniques des différentes procédures (tests métaboliques, mise à mort), et à l’observation de comportements « normaux » des animaux. 4/ Surveillance étroite des animaux 2 fois par semaine (apparence physique, comportement, poids, prise alimentaire), 5/concernant les gavages : - l’administration par voie orale est une méthode moins invasive que l’injection par voie intraveineuse ; - pour limiter la potentielle irritation de l’œsophage des animaux lors des gavages une sonde de gavage coudée au bout arrondi sera utilisée par un personnel expérimenté - les volumes de gavage seront réduits au minimum pour éviter tout incomfort aux animaux. - une surveillance étroite du comportement des animaux sera réalisée suite aux gavages, - les gavages seront espacés d’une semaine afin de réduire le stress des animaux, 6/ Les contentions prévues lors des pesées, gavages ou lors de la mesure de la composition corporelle seront toujours effectuées de manière brève par un expérimentateur formé, 7/ En fin d’étude, les animaux seront anesthésiés pour éviter toute douleur au moment du dernier prélèvement sanguin, 8/ Mise en place de points limites précoces permettant, si l’un est atteint, d’éviter toute souffrance des animaux.

Choix des espèces

En raison de la grande similitude de régulation du métabolisme entre la souris et l’Homme, la souris est un modèle de choix pour étudier et caractériser les effets santé des lipides végétaux en situation d’obésité. Les souris débuteront l'étude à 8 semaines de vie après une semaine d’acclimatation. Le passage à une alimentation riche en graisses et en sucres à cet âge est très bien toléré par les animaux, et les perturbations du métabolisme attendues les semaines suivantes sont bien décrites et maîtrisées.

1 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections directement dans le cerveau sous anesthésie et des prélèvements de sang, avant d'être tuées pour prélever leurs organes, afin de valider des vecteurs censés faire passer des médicaments vers le système nerveux. Une lignée de souris est génétiquement humanisée pour le récepteur ciblé. Le porteur, une société, met en avant un "gain de temps considérable" et "donc économique", à côté de l'argument scientifique.

Objectifs

-Introduction : Les maladies neurodégénératives (pathologies affectant les neurones), et maladies rares font partie des causes majeures de handicaps sévères dans le monde. A l’heure actuelle, les besoins médicaux restent malheureusement sans solutions, traitements curatifs, ou palliatifs (qualité de vie). Ainsi, ces neuropathies sont de très bons exemples d’enjeux de santé publiques. C’est dans ce contexte scientifique que notre société a développé un savoir-faire qui consiste à attacher des protéines ou peptides avec un fragment d’anticorps (aussi appelé VHH), l’ensemble couplé à un médicament afin de passer plus efficacement les barrières physiologies, notamment la Barrière Hémato-Encéphalique du cerveau (BHE). Ces molécules ou vecteurs, appelés VHH pourront ainsi atteindre le tissu cible du système nerveux central et traiter les cellules malades. Pour l’instant, la plupart des médicaments utilisés en thérapie restent inefficaces par manque de passage de ces barrières sélectives et donc d’accès aux tissus à traiter. Concept général : L’objectif principal de notre société sera donc de proposer de nouvelles formulations capables de reconnaître spécifiquement leurs partenaires naturellement exprimés (endogènes), au niveau des barrières cellulaires de l’organisme et d’utiliser leurs mécanismes naturels de passage pour ainsi, délivrer les médicaments au niveau central (cérébral). Par cette technique du cheval de Troie, nous faciliterons le passage de médicaments du sang vers le système nerveux central (SNC). -Objectif du projet : Les études pharmacologiques passent par différentes étapes de validation avant tout développement pré-clinique, elles utiliseront des voies d’administrations simplifiées pour qu’elles puissent être facilement applicables à grandes échelles et moins contraignantes pour les patients. Ces traitements sont généralement administrés par voie périphérique, sous-cutanée, intra-veineuse ou par voie orale. L’optimisation de nos vecteurs (VHH) devra avant tout développement périphérique passer par une étape de validation et confirmation de l'efficacité au niveau central. A travers cette demande de projet et la réalisation d’injections intra-cérébrales, nous tenterons d’améliorer l'action de nos molécules VHH-médicaments sur souris consanguines, dites « standards », puis, de le confirmer ces résultats sur ce même fond, humanisé pour le récepteur cible.

Bénéfices attendus

-Validation de l'efficacité pharmacologique de nos molécules VHH pour améliorer les traitements actuels et apporter des solutions thérapeutiques contre les pathologies à enjeux de santé publique. Ce nouvel axe de recherche pré-clinique pourrait ainsi servir de levier dans le traitement des maladies du système nerveux, au même titre que les derniers vaccins innovants développés pour la lutte contre la COVID-19. -Choix d’une lignée de souris humanisée pour le récepteur ciblé : La transposition de nos recherches sur un modèle murin pour lequel nous avons humanisé le récepteur cible permet, non seulement d’appréhender les futurs développements pré-cliniques de nos vecteurs (VHH), mais aussi d’anticiper les possibles effets secondaires ou toxicités associées. Son utilisation assure de développer au maximum les études sur le modèle murin (souris) avant d’engager la phase préclinique et la transposition à l’homme, lesquelles auraient certainement nécessité des séries de tests supplémentaires sur divers modèles animaux de plus grandes tailles. De plus, cela constitue un excellent outil stratégique et scientifique, permettant in fine, une réduction importante du nombre d’animaux au sein des cohortes, sans parler du gain de temps considérable pour la société, et donc économique.

Procédures

Au cours de cette procédure, nous allons avoir une étape d'anesthésie et analgésie pour réaliser les administrations centrales : -Analgésie : Anti-douleur administré 30 minutes avant le début de l’anesthésie (durée 1h) -Anesthésie générale : Anesthésie gazeuse (voie aérienne) par induction en chambre (5 minutes), puis relais au masque (durée 15-20 minutes maximum) pour réaliser les administrations. Puis, au cours de la cinétique, nous aurons trois étapes de prélèvements : -Un premier prélèvement de sang sur des temps intermédiaires en cours de cinétique (maximum X3 espacés de minimum 24h). Réalisés sur animal éveillé et immobilisé dans une contention spécialisée (durée 2 minutes), par une micro incision de l'extrémité de la queue. Cette étape très rapide et peu invasive se fait sans trop de contraintes, ni stress pour l’animal. Le saignement est ensuite stoppé par un point de pression à l’aide d’un papier absorbant stérile pour une cicatrisation rapide. -Un deuxième avec le prélèvement sanguin en point final en toute fin de cinétique (durée 3 minutes), en post-mortem. -La troisième étape consiste à récupérer les organes et tissus d’intérêts, toujours en post-mortem (durée 5 à 10 minutes en fonctions de la quantité de tissus à prélever pour les tests post-expérimentaux) .

Impact sur les animaux

Dans ce projet nous chercherons à limiter au maximum le stress induit aux animaux. Les possibles sources de stress, angoisse et/ou douleurs sont ici listées avec une description des principaux actes engagés afin d’éviter leurs apparitions qui seront détaillés ci-après dans la partie procédure correspondante. -Transport et adaptation : Arrivée des animaux et stabulation qui peuvent engendrer du stress et un impact sur l’alimentation et le comportement -Tonte avant chirurgie et constitution des groupes : manipulation qui pourrait générer une source de stress -Chirurgie et injection (infusion lente) : Pas de risques notables avec une bonne maîtrise des antalgiques et anesthésiques. -La pose de points et période de cicatrisation : Pas de risques par une bonne réalisation de points individuels. -Effets secondaires toxiques et immunogènes des composés en suivi post-administration : Pas de risques majeurs pour les animaux (et études) car ces paramètres sont anticipés. -Nettoyage et traitement des plaies à la vétédine savon : Source de stress. -Prélèvements sanguins intermédiaires sur animaux éveillés : Source de stress, qui sera considérablement réduite par le geste expert du manipulateur. -sacrifice par injection létale : Source de stress au moment de l'injection intrapéritonéale.

Devenir

En fin de procédure, tous les animaux seront mis à mort pour réaliser les prélèvements tissulaires en post-mortem (voir 5.6.1).

Remplacement

Pour mener à bien nos projets, nous réalisons en amont de nos procédures toute une série de tests in vitro. Cette première série de tests permet notamment de vérifier le maintien de la liaison avec le récepteur cellulaire cible, mais en aucun cas de prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques (mécanistiques, immunitaires, métaboliques et d'éliminations) qui conditionnent le succès de nos vecteurs conjugués. Pour faire face à cette sélection physiologique, nous envisagerons donc de réaliser nos expériences sur le petit animal de laboratoire, ici la souris, 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques in vivo. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes les réponses aux problématiques de la pharmacocinétique, ou suffisamment informel tel que les organoïdes (micro-tissus en culture chargés de reproduire le fonctionnement d'un organe). Le modèle vivant, ici la souris, reste pour l'instant le seul système physiologique qui intègre la complexité de l'ensemble des paramètres mécanistiques et homéostasiques précédemment cités, indispensables à l’étude d’une efficacité pharmacologique chez les mammifères. Dans notre cas, le principal désavantage concerne donc le recours à l’utilisation d’animaux. Il s’agit alors de définir à minima et au plus juste le nombre d’individus. L’utilisation de faibles cohortes d'animaux permettra d’aller en ce sens, tout en allant exploiter un maximum de résultats et par l’obtention de données statistiques significatives.

Réduction

L’optimisation de nos molécules et l’injection intra-cérébrale permettent d'envisager une médication optimisée et réduite (dose infime par animal), de limiter les possibles effets secondaires, mais aussi le nombre d’individus au sein de la procédure (Réduction). Le nombre total d’animaux sera réparti sur de petits groupes de n=4 (2 mâles/2 femelles), à raison de maximum 8 groupes par étude et 5 études par an, sur le fond standard et sur la lignée humanisée, nous n’aurons besoin que de 320 animaux par an, soit un total de 1600 souris sur 5 ans. Il est important de noter que ce nombre total d’animaux sera mixte à 50/50 entre mâles et femelles (cages séparées). Pour une analyse statistique, le faible « n » (4 individus), sera suffisant et nous orientera vers des modèles non-paramétriques. Sur de l’expérimentation in vivo, tous les paramètres ne sont pas maîtrisés, et sont basés sur des populations aléatoires de souris ou chaque animal présente des variables individuelles. Nous pourrons réaliser un équivalent du test d’homogénéité entre groupes, ou encore une analyse de variance. En fin de procédure, une liste ciblée de tissus à prélever nous évitera une utilisation abusive et inutile des souris et permettra d’optimiser la procédure sur plusieurs types de post-expérimentations. La réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires en cours de cinétique permet d'obtenir des données de stabilités pharmacologiques supplémentaires, ce qui va également dans le sens d'une optimisation et réduction du nombre d’animaux.

Raffinement

La formation initiale et l’expérience du personnel sont nécessaires pour appréhender les moindres signes et/ou comportements caractéristiques d’une douleur ou gène chez l’animal. Nous porterons une attention particulière à la préparation amont de l’expérimentation. Elle regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux, laquelle sera au minimum de 7 jours (fond standard) voire 14 jours (lignée humanisée) dès réception. 48h à 72h avant les administrations, les souris sont sorties de l’animalerie dans une pièce spécialisée. Elles sont ainsi maintenues dans un contexte familier. Par la suite, les animaux seront tondus (partie supérieure du crâne) la veille des administrations (sous anesthésie gazeuse) pour éviter l’accumulation des anesthésies le jour même (J0) et le stress associé. A J0, les administrations intra-cérébrales seront réalisées sous anesthésie. Les manipulations sur animal éveillé, en cours d’étude, seront précises et rapides (≤ 2min). Une couveuse chauffante (env.37°C) sera utilisée pour assurer le bon réveil lors de la phase post-opératoire et une attention quotidienne (nettoyage vétédine savon) sera portée durant 72h à 1 semaine (fonction avancement cicatrisations) pour assurer une bonne cicatrisation et récupération des animaux. Des points limites seront malgré tout établis en cours de chirurgie, puis lors du réveil et tout au long de la cinétique. Tout comme son contrôle standard, la lignée humanisée utilisée n’a jusqu’alors jamais présenté d’apparitions de phénotypes dommageables.

Choix des espèces

-Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, pratique pour les études de pharmacologies et comportementales, elle est donc idéale pour la mise en place de premières études précliniques. A l’heure actuelle, faute d’alternatives de remplacement, le modèle rongeur, ici la souris, reste le seul modèle accessible de « petit mammifère » dont la physiologie est bien connue et relativement proche de l’homme. Par sa petite taille, Il devient également très intéressant pour la balance pharmacologie/toxicologie (bénéfices/risques) et une diminution des posologies. Notre modèle de transposition sur la lignée humanisée est particulièrement avantageux car il présente une cible endogène humanisée (récepteurs) tout en gardant les avantages cités précédemment. Les données obtenues sur ce modèle permettront notamment une extrapolation plus pertinente au modèle humain, d’envisager un gain de temps dans le développement futur du projet, mais aussi, d’éviter un certain nombre d’études et une utilisation significative d’animaux. Les animaux seront utilisés pour réaliser des validations pharmacologiques centrales et des échantillonnages de sang et tissus. -Pour notre procédure et nos deux lignées utilisées, nous utiliserons des animaux dits « jeunes adultes », ayant une moyenne de 10 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons ainsi les variations inter-individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Cet âge présente un poids moyen de 27-30g environ, ce qui s’avère plus intéressant en termes de posologies (réduction des doses).

224 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un impact crânien est infligé à des souriceaux de 17 jours, suivi de l'implantation d'un mini-microscope par une fenêtre crânienne, puis de tests comportementaux (exploration, coordination motrice, sensibilité tactile, état anxieux) et d'imagerie du cerveau. Le porteur qualifie le traumatisme de "léger" et affirme qu'aucun signe de douleur n'apparaît au réveil. Toutes les souris sont tuées pour des analyses en immunohistochimie et par IRM.

Objectifs

Chaque année 1,5 millions d'européens sont victimes d'un traumatisme crânien le plus souvent subit lors d'un accident de la route, d'une chute ou au cours de pratiques sportives. 70 000 personnes perdent la vie des suites du traumatisme et environ 100 000 ne présentent pas de récupération totale et demeurent handicapées, notamment chez les enfants et les jeunes adultes qui représentent une population particulièrement vulnérable en regard de ce type de traumatisme. Bien qu'au cours des dernières années un raffinement des procédures de prise en charge par les urgences et les hôpitaux a permis de réduire la mortalité des traumatisés crâniens, il est apparu qu'un grand nombre de patients souffrent par la suite de désordres chroniques invalidants tels que : épilepsie, dépression, démence progressive, etc. À ce jour, aucun traitement ne permet d'empêcher la mise en place de tels désordres à la suite d'un traumatisme crânien. Le projet que nous avons développé vise à étudier les changements qui se mettent en place à la suite d'un traumatisme crânien (TC) au sein du cerveau et qui contribuent aux atteintes comportementales à long terme. Nous allons nous focaliser dans ce projet sur les atteintes des vaisseaux sanguins ainsi que sur les processus inflammatoires qui se mettent en place après un TC. Le caractère unique de ce projet est assuré par l’utilisation d’une technique innovante permettant d’imager les cerveaux de souris se comportant grâce à un mini-microscope qui sera implanté sur leur tête.

Bénéfices attendus

Les mécanismes physiopathologiques découlant d’un traumatisme survenant pendant l’enfance sont encore assez peu connus. Ainsi on ne sait pas pourquoi seule une partie des enfants souffrant d’un traumatisme crânien léger vont développer à plus ou moins long terme des symptômes tels que des maux de tête, pertes d’équilibre, problèmes de concentration ou retards d’apprentissage… De plus il n’existe à ce jour aucun traitement efficace pour prévenir les conséquences d’un traumatisme crânien survenant chez l’enfant. Notre étude permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à ces traumatismes et devrait permettre de mieux cerner les conditions propices au développement de symptômes post-trauma (notamment l’influence du sexe de l’individu).

Procédures

1. trauma crânien léger juvénile (TC): 17 jours après leur naissance, les animaux seront anesthésiés pendant 5 min et subiront un impact léger calibré de 200 µs. Animaux contrôles soumis au même geste, sauf impact. Réalisé une seule fois. 2. Implantation des lentilles de miniscope. Réalisé un mois après TC sous anesthésie générale et analgésie adaptée. Réalisation d’une fenêtre crânienne. Le cas échéant injection stéréotaxique de virus. Insertion et fixation du prisme, scellement de la base d’ancrage. Durée de 1h à 1h30, plus 30 min en cas d’injection virale. Réalisé une seule fois. 3. Tests comportementaux et imagerie calcique sur animal vigile. Tous les 3 mois (2 fois pour la moitié des animaux, 4 fois pour l’autre moitié). A. mise en place du miniscope. Contention à la main et positionnement du miniscope à l’aide d’une plateforme aimantée sur la lentille. B. Chaque série comportementale comprendra 1 test d’exploration, 3 tests de coordination motrice, 2 tests de sensibilité tactile, et 1 test d’évaluation de l’état anxieux. Tests de 5 minutes réalisés à raison d’1 test/jour. C. Injection intrapéritonéale unique (environ 3 secondes) lors de la dernière session comportementale (6 mois post TC pour la moitié des animaux, 12 mois pour l’autre moitié), une demi-heure avant le test d’évaluation de l’état anxieux.

Impact sur les animaux

Ce projet repose sur l’utilisation d’un modèle léger de traumatisme crânien chez l’animal juvénile anesthésié. Une fois réveillé l’animal ne montre aucun signe de douleur et reprend immédiatement un comportement normal. Les conséquences incluent des altérations d’apprentissage et une légère altération de la coordination motrice, sans altération de mobilité, d’anxiété ou de douleur. Il n’y a pas de phénotype dommageable. Nous utiliserons des modèles de souris permettant une exploration longitudinale par imagerie calcique parfaitement décrits qui sont très utilisés dans le domaine et très bien décrits dans la littérature. Aucun phénotype dommageable n’a été décrit. La chirurgie envisagée peut entraîner à faible niveau hypothermie, déshydratation, douleur postopératoire et stress. La pose d’un implant tel que la lentille de miniscope s’accompagne de la possibilité de perte de l’implant. Lors de l’imagerie calcique sur animal vigile couplée au comportement, la pose du miniscope sur la lentille entrainera une contention très courte d’environ 20s. Le poids (< 2g) et le câble reliant le miniscope peuvent occasioner une gêne. Chaque série comportementale peut représenter une source de stress pour les animaux. L’injection IP du composé peut entraîner une douleur ou une gêne locales.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de la procédure, soit 224 animaux. Ceci est nécessaire pour les analyses en immunohistochimie et par imagerie IRM qui complèteront et seront essentielles à cette étude.

Remplacement

Le projet vise à caractériser les atteintes du tissu cérébral suite à un TC ainsi qu’à évaluer l’intérêt d’une cible thérapeutique sur la récupération post TC. À ce jour, aucun modèle in vitro ou informatique ne permet de simuler la complexité des interactions cellulaires mise en jeu, tant nos connaissances demeurent encore superficielles en la matière. Notre recherche sur des bases de données scientifiques permet d’affirmer qu’à notre connaissance, il n’existe pas d’autre modèle expérimental que l’animal afin d’étudier ces réactions tissulaires dans leur ensemble. Par conséquent, notre projet ne peut pas se passer de l’expérimentation animale.

Réduction

Les procédures expérimentales ont été spécialement conçues pour réduire le nombre d’animaux utilisés par l’obtention d’un suivi longitudinal non invasif. En effet, l’utilisation de l’imagerie in vivo permet d’enregistrer sur un même animal l’évolution de l’unité neurovasculaire au cours du temps, limitant significativement le nombre d’individus nécessaires à cette étude (par exemple, pour 4 temps d’intérêt un seul groupe d’animaux ne sera nécessaire contre 4 groupes avec des techniques classiques). De même cette technique permet de diviser par 2 le nombre d’individus nécessaires pour une approche pharmacologique, les animaux représentant leurs propres contrôles, et augmentant de fait la significativité des résultats. Pour permettre la réalisation des enregistrements d’imagerie, l’utilisation d’animaux transgéniques à phénotype non-dommageable sera privilégié dans la mesure du possible à l’utilisation d’injection virale. Ceci permettra d’augmenter l’efficacité des techniques d’imagerie et donc réduire le nombre d’animaux utilisés. De plus, pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en conservant une puissance statitistique satisfaisante, nous avons réalisé une étude de la robustesse de notre nombre d’animaux pour déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser.

Raffinement

Le projet permet de raffiner l'expérimentation animale en utilisant un modèle pertinent par rapport à la situation chez l'homme. Il s’appuie sur la mise en place des méthodes d'imagerie les plus sensibles disponibles actuellement. Pour permettre la réalisation des enregistrements d’imagerie, l’utilisation d’animaux transgéniques à phénotype non-dommageable sera privilégié dans la mesure du possible à l’utilisation d’injection virale. Ceci permettra de réduire le temps de chirugie d’environ 30 min et donc favoriser la récupération post-opératoire des animaux. Le projet sera mis en oeuvre par des personnes qualifiées en expérimentation animale. Le bien-être des animaux sera assuré par des protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptés. Le stress des animaux sera limité à son maximum, avec un sevrage mis en place à 25 jours post-natal, et des conditions d'hébergement enrichies (matériels de nidification) et permettant les interactions sociales. La réalisation du projet repose sur l'établissement de points-limites et de pratiques permettant de minimiser au maximum le stress, la détresse et la souffrance des animaux. Une fiche de suivi post-opératoire sera mise en place.

Choix des espèces

Le système nerveux central de la souris est parmi les mieux connus et les plus étudiés. Son organisation est aussi très proche de celle du cerveau humain. Les résultats obtenus permettent ainsi de proposer des hypothèses de dysfonctionnement du cerveau humain suite à un traumatisme crânien et de proposer des pistes thérapeutiques pour leur traitement. De plus, le modèle murin permet l’utilisation de souches génétiquement modifiées. Dans ce projet, les traumatismes crâniens seront réalisés sur des souris juvéniles à 17 jours post natal, ce qui nous permet de modéliser les effets d’un traumatisme crânien en pédiatrie chez des enfants de 4 à 6 ans. Nous conserverons les animaux jusqu’à 12 mois après le traumatisme crânien afin d’évaluer les conséquences à long-terme.

Pour savoir si les lipides de la salive de moustique facilitent l'infection par les flavivirus, 297 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Sous anesthésie, elles reçoivent dans la peau une injection de virus et de lipides, des produits qui peuvent être irritants, puis trois souris sur dix par condition subissent à 24 heures une biopsie de peau et sont tuées par dislocation cervicale sous anesthésie. Les autres sont suivies quinze jours pour mesurer leur survie, avec une prise de sang tous les trois jours, l'infection pouvant causer perte de poids, dépression, excitation ou convulsions. Elles sont tuées plus tôt si elles développent des "signes de souffrance", que le texte ne détaille pas, et sinon à la fin des quinze jours.

Objectifs

L'objectif du projet est de déterminer le rôle des lipides de la salive de moustique dans les infections par les flavivirus pour développer une nouvelle méthode de lutte ciblant les lipides de la salive.

Bénéfices attendus

Les bénéfices à court terme sont : i) Identifier une cible pour bloquer la transmission de tous les flavivirus au niveau de la peau, ii) Comprendre l’effet des lipides de la salive de moustique sur l'infection. A long terme, les résultats permettront le développement d’un médicament préventif ou curatif contre tous les flavivirus, lesquels infectent un demi-milliard de personnes et en tuent 250 000 par an.

Procédures

Dans toutes procédures, nous injecterons les souris avec des produits qui peuvent être irritants, mais cela se fait sous anesthésie. L'injection intradermique se fait en 2- 3 min. Nous collecterons, sur une partie des souris dans toutes les procédures, des biopsies de peau sur des animaux anesthésiés qui seront euthanasiés juste après. L‘autre partie des souris seront suivies pendant 15 jours pour la survie et les signes cliniques suite aux infections et nous réaliserons des prélèvements sanguins tous les 3 jours. Les biopsies et l'examen clinique prennenent environ 3- 5 min/ animal, le prélèvement sanguin prend 2- 3 min. Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure.

Impact sur les animaux

-Douleur passagère dans le site de l’injection lors de l’inoculation des virus avec les lipides. Nuisances suite aux prélèvements sanguins sur la veine mandibulaire qui se traduisent par une lésion et douleur passagères après la ponction. -Perte de poids, mobilité réduite ou inactivité, mauvais état corporel, stress, comportement anormal, troubles neurologiques (dépression, excitation ou convulsions), liés à l’infection par les virus.

Devenir

Dans toutes les procédures, les souris seront euthanasiées sous anesthésie : après la réalisation des biopsies cutanées, si elles développent des signes de souffrance et à la fin des expériences.

Remplacement

Dans notre cas, le modèle animal est incontournable. Aucun model autre que le modèle animal ne permet de tester l’effet des lipides de la salive de moustique sur la transmission des flavivirus. Néanmoins, nous avons générés les données préliminaires nécessaires pour supporter notre hypothèse sur des modèles in vitro. Nous identifierons les lipides impliqués dans l'augmentation de l'infection virale sur des modèles in vitro en utilisant des cellules humaines avant de confirmer l’effet avec le modèle animal.

Réduction

Pour réduire le nombre des souris à utiliser, nous faisons toutes les optimisations sur les modèles in vitro. Nous avons étudié l'effet des lipides sur les différents flavivirus in vitro, et sur les souris nous validerons l’effet observé pour seulement deux espèces de flavivirus pour limiter l'utilisation des souris. De plus, nous testerons différentes doses sur des souris males et puis nous validerons la dose ayant un effet sur des souris femelles. Dans nos expériences, nous utiliserons dans chaque condition le minimum des souris nécessaire pour avoir des données statistiquement analysables (10 souris/ condition dont 3 seront utilisées pour la collecte de la peau à 24h post infection pour étudier la transmission, et le reste des souris seront suivies pour la survie, les signes cliniques et la virémie).

Raffinement

-Les souris seront manipulées de façon à réduire au maximum le stress, la douleur et la souffrance. Elles seront anesthésiées avant l’inoculation intradermique des produits et les biopsies cutanées. Nous utiliserons des coussins chauffants et une lampe chauffante pour maintenir la température des souris anesthésiées. Un contrôle régulier, toutes les 15 min, sera effectué pour déceler toute possible anomalie liée à l'anesthésie : suivi des grandes fonctions et desséchement de la cornée. -Nous ajouterons un gel ophtalmique pour palier au dessèchement de la cornée. En dehors des expériences, le suivi des souris s’effectuera chaque jour. -Les souris infectées seront euthanasiées après la collecte des biopsies cutanées par dislocation cervicale sous anesthésie. -Les souris seront maintenues par 3 à 5 individus/cage avec de la litière et des enrichissements en alternance. Nous changerons la litière tous les 3 jours.

Choix des espèces

Nous allons utiliser dans ce projet des souris immunocompétentes, contrairement aux autres modèles d’infection pour les flavivirus, qui utilisent généralement des souris transgéniques avec une immunité innée déficiente. Notre projet vise à étudier l'effet des lipides salivaires sur la transmission des flavivirus et nécessite un modèle animal avec une immunité fonctionnelle. De plus, nous avons déjà validé et établie les conditions sur les souris. Par ailleurs, les souris sont des animaux de petites tailles, faciles à manipuler. Les constantes physiologiques seront facilement mesurables avec des outils adaptés. Nous allons utiliser des sujets adultes de 5 semaines, qui ont une taille corporelle et un système immunitaire mature permettant une réponse immunitaire adéquate nécessaire pour l'étude de la transmission, l'inoculation en intradermique, et leur manipulation.