Recherche fondamentale

12 primates non-humains, six macaques à longue queue et six babouins, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Importés pour une "expérimentation terminale", ils subissent des séances d'imagerie répétées sous anesthésie générale et une chirurgie du cortex visuel avec pose d'électrodes, précédées de mises à jeun. Le porteur indique un caractère répétitif de l'anesthésie et des irritations aux oreilles et à la gorge liées à la contention et à l'intubation. Il affirme que le primate non-humain est "la seule espèce pertinente" et qu'aucun modèle computationnel ne peut le remplacer, l'étude étant présentée comme un "raffinement".

Objectifs

L’activité du cerveau et en particulier des neurones dépends de l’apport énergétique (nutriments + oxygène) qui est régulé par le flux sanguin. Connaître précisément la relation entre l’activité des neurones et l’apport sanguin, un phénomène connu comme « couplage neurovasculaire », permettrait ainsi de détecter un mauvais fonctionnement du cerveau qui est présent dans un grand nombre de maladies neurologiques. Aujourd’hui, aucune mesure non-invasive est capable de mesurer le couplage neurovasculaire chez l’homme ou chez l’animal de laboratoire. L’objectif de ce projet de recherche est de comparer une méthode sans intervention chirurgicale et donc non-invasive (par imagerie par résonance magnétique) avec une méthode invasive standard pour la quantification de l’activité neuronale et métabolique chez le primate non-humain anesthésié. Deux grands principes seront étudiés dans ce projet : le couplage neuro-vasculaire et le couplage « métabo-vasculaire », par l’enregistrement simultané de l’activité électrique neuronale à l’aide d’électrodes et de l’activité vasculaire à l’aide de l’imagerie fonctionnelle ultrasonore, et par l’enregistrement simultané de grandeurs métaboliques (comme la quantité locale de lactate, de glucose ou d’oxygène) et de l’activité vasculaire. Si la méthode non-invasive est validée, cela aura un impact majeur dans les projets de recherche qui font appel à l’animal pour ce type de mesure (raffinement et réduction) et pour l’homme, vu que les séquence d’imagerie RMN (résonnance magnetique nucléaire) peuvent facilement s’implémenter en clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une compréhension plus fine du couplage neurovasculaire dans deux modèles de primates non-humains (chez le babouin et le macaque) afin de mieux comprendre le lien entre activité et le métabolisme neuronale et activité vasculaire qui apporte l’énergie nécessaire à cette activité. La comparaison entre les mesures non-invasives obtenues grâce à l’imagerie RMN et invasives en plaçant des électrodes permettra de valider la mesure par imagerie et remplacer une méthode invasive par une méthode non-invasive. Ceci constitue un raffinement et impacte directement le bien-être des animaux utilisés en recherche et des patients qui pourront bénéficier de cette nouvelle technologie. Il serait ainsi possible d’obtenir des données sur le dysfonctionnement du lien entre la vascularisation et l’activité neuronale chez les patients atteints de maladies neurologiques et utiliser cette mesure comme un biomarqueur pour suivre l’efficacité d’un traitement. De plus, grâce au réseau du don de tissus, les tissus biologiques éventuellement récupérés pourront être utilisés à la réalisation d’autres objectifs scientifiques, différents de ceux prévus dans cette étude.

Procédures

Les animaux seront soumis à un maximum de 6 séances d’imagerie de 3h max sous anesthésie générale non-invasive et pratiqué en routine chez l’animal d'une durée maximale de 7 heures comprenant une chirurgie réalisée en condition d'asepsie au niveau du cortex visuel primaire ainsi que des enregistrements de l'activité vasculaire (par ultrasons fonctionnels), électriques (par électrophysiologie) et métaboliques (avec des électrodes adaptées à ces enregistrements).

Impact sur les animaux

La procédure d’imagerie est non-invasive et indolore. Cependant, le caractère répétitif de l’anesthésie et la mise à jeun la veille de chaque séance d’imagerie sont prises en compte et des point limites sont établis à cet égard. Le risque d’hypothermie est contrôlé par le soutien thermique (couverture chauffante et plaides) pendant les examens d’imagerie et la chirurgie. L’irritation locale au niveau des oreilles pour fixation de la tête dans le cadre stéréotaxique et de la gorge suite à l’intubation sont minimisés grâce à l’utilisation de la lidocaïne en gel et la xylocaïne en spray respectivement comme détaillé dans la procédure expérimentale. Le temps d’acclimatation et le respect de temps de pause entre séances d’imagerie devraient résulter en une nuisance minime pour les animaux. La pesée hebdomadaire permettra de dépister toute altération du poids causée par les mises à jeun répétées et compenser avec un supplément de nourriture comme indiqué dans les points d’alerte avant d’arriver aux points limites.

Devenir

A la fin de l’étude les primates non-humains seront euthanasiés pour valider la sensibilité et la robustesse d’une mesure non-invasive du métabolisme neuronal versus une mesure invasive dans une optique de remplacement technologique. A l'issue de cette dernière, un don de tissus sera effectué dans une optique de réduction de nombre d'animaux utilisés à des fins scientifiques afin de valoriser l'animal.

Remplacement

Le remplacement de l’animal n’est pas envisageable pour atteindre les objectifs fixés dans ce projet, les couplages « neuro-vasculaire » et « métabo-vasculaire » nécessitant un fonctionnement normal du système cardio-vasculaire, il n’est pas possible d’utiliser des systèmes computationnels ou autres dispositifs alternatifs à l’utilisation d’animaux. Le modèle primate non-humain très utilisé pour sa proximité anatomo-fonctionnelle avec le cerveau humain est la seule espèce pertinente pour ce type d’étude.

Réduction

Un total de 12 (2x n=6) primates sera prévu dans ce projet pour s’assurer de la robustesse des mesures IRM (nombre habituel pour obtenir des valeurs moyennes fiables à ~10% chez le rongeur dans l’expérience du laboratoire). Le suivi longitudinal chez le même individu par des méthodes d’évaluation fonctionnelle non-invasives (imagerie) permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour observer un effet significatif. L’utilisation de macaques (le modèle le plus répandu en laboratoire) et babouins (un modèle avec volume et densité neuronale plus proche de l’homme) vise à rajouter de la robustesse et prédictivité des mesures non-invasives chez l’homme

Raffinement

Afin de minimiser le stress et l’angoisse des animaux importés à des fins d’expérimentation terminale, les babouins et les macaques seront importés au moins un mois avant la date de la première séance d’IRM. Le protocole d’anesthésie pour la réalisation d’examens d’imagerie dans le laboratoire comporte des analgésiques pour minimiser les sensations désagréables lors de l’intubation et l’emplacement dans le cadre d’imagerie. Des point limites ont été définis en lien avec une potentielle réaction à l’anesthésie de certains individus qui est très rarement observé dans notre laboratoire. Les primates non-humains seront hébergés en groupes sociaux dans des cages équipées spécifiques de l’espèce. On limitera la durée de l’hébergement individuel lors des mises à jeun pour les séances d’IRM tout en gardant un contact visuel, sonore et olfactif avec les autres primates. Un enrichissement adapté sera mis en place : structurel (balançoire et visuelle, miroir); alimentaire (fruits, graines dans le fourrage); manipulable (jouets); auditif (musique).

Choix des espèces

Les macaques et les babouins possèdent une architecture cérébrale semblable à celle chez l’humain, avec notamment un cortex plissé présentant de nombreux circonvolutions et sillons cérébraux. De plus, le métabolisme des primates non-humains est plus proche du métabolisme humain que ne l’est le métabolisme du rongeur. De plus, le cortex visuel des primates est particulièrement développé et sa structure est stabilisé, donc l’étude vasculaire, électrophysiologique et métabolique chez le primate anesthésié est une expérimentation appropriée pour la compréhension du fonctionnement du système nerveux central chez l’humain. Les animaux seront à un stade adulte (macaque) ou jeune adulte (babouin) pour uniformiser la taille de la tête et donc la sensibilité lors des mesures par RMN notamment.

640 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie tuée pour prélèvement d'organes et les animaux d'élevage gardés vivants pour maintenir la lignée. Génétiquement modifiées, elles portent une mutation qui provoque un déficit immunitaire et une inflammation pulmonaire, et subissent deux prélèvements de tissus sur animal vigile pour génotypage. Le porteur indique que les souris atteignant les points limites sont mises à mort. Il affirme que l'étude des coopérations cellulaires dans un "organisme entier" impose un modèle in vivo et retient la souris.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes d’une mutation génétique impactant les fonctions lymphocytaires ce qui conduit à induire un déficit immunitaire chez les souris. Cette demande concerne le maintien de la lignée de souris transgénique ainsi que son génotypage.

Bénéfices attendus

Les souris porteuse de la mutation étudiée dans ce projet présentent une baisse du taux de lymphocytes (phénotype de déficit immunitaire) et une inflammation pulmonaire, dont nous souhaitons comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires par l’étude des cellules immunitaires des souris, et de leur production d’anticorps. La mutation gain étudiée a été décrite chez des patients atteints d’une maladie inflammatoire appelée SAVI, ainsi les mécanismes qui seront décrits grâce à l’étude des souris mutantes pourront permettre une meilleure compréhension de la maladie et une meilleure prise en charge des patients.

Procédures

Deux prélèvements tissulaires seront réalisés sur chaque animal vigile pour une durée de 2 minutes environ pour chaque geste.

Impact sur les animaux

Les souris portant la mutation génétique étudiée dans ce projet développent un déficit immunitaire.

Devenir

Les animaux ayant atteint les points limites définis seront mis à mort. Les animaux prévus pour expérimentation seront mis à mort pour pouvoir prélever les organes et analyser les cellules immunitaires. Les animaux gardés pour le maintien des lignées et les croisements seront gardés en vie.

Remplacement

La règle du remplacement n'est pas applicable ici : en effet, nous devons avoir recours à un modèle in vivo afin d'étudier les réponses immunes qui mettent en jeu des coopérations cellulaires multiples dans les organes lymphoïdes tels que la moelle osseuse, le thymus et la rate. Pour ces raisons, nous ne pouvons avoir recours à des modèles in vitro. En ce qui concerne les modèles in vivo, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire, car les connaissances chez la souris sont très développées dans le domaine de l'immunité.

Réduction

Le nombre total d‘animaux comprend les animaux pour accouplements et les animaux issus des accouplements et nécessaires pour l’expérimentation pour le projet scientifique associé. La production des animaux sera planifiée afin de limiter le nombre des animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l’élevage. Les croisements seront arrêtés dès l'obtention des lots expérimentaux afin d'éviter la surproduction.

Raffinement

Pour répondre à l'objectif de raffinement, les souris seront hébergées en groupes sociaux, et dans des cages à couvercle filtrants comportant des enrichissements (nids, tunnels), sur des portoirs ventilés. Le phénotype des animaux sera examiné de façon hebdomadaire à l'aide d'une grille de score définissant des points limites, afin de soustraire les animaux à la souffrance. Chaque animal sera mis à mort dès que le score correspondant au point limite est atteint. La production des animaux sera planifiée et suivie par l'expérimentateur et les zootechniciens de l’établissement utilisateur afin de limiter le nombre des animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l’élevage.

Choix des espèces

En ce qui concerne l’espèce choisie, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire impliquant la coopération cellulaire dans un organisme entier. Les connaissances chez la souris étant très développées, en particulier dans le domaine de l'immunité, pour lequel de nombreuses techniques d'analyse et de nombreux réactifs (anticorps, notamment) sont disponibles, en font un modèle approprié pour mener à bien nos différentes analyses et études. Adulte, en âge de procréer (entre 2-3 mois d'âge et 8 mois) pour maintenir l’élevage. Les animaux utilisés pour expérimentations compris entre 2-3 mois (âge moyen d’atteinte d’un système immunitaire mature chez les souris contrôles) et 8 mois.

108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un accident vasculaire cérébral provoqué par photothrombose du cortex, des tests sensori-moteurs de la graine, de la ficelle et du cylindre, puis une chirurgie d'isolement du nerf vague avec pose d'électrodes, avant prélèvement du cerveau. Le porteur indique une plaie au crâne et un affaiblissement musculaire partiel le plus souvent réversible, et présente la lésion comme ciblée et de très petit volume. Il affirme que ce mécanisme physiologique "hautement intégré" ne peut être reproduit in vitro ou in silico.

Objectifs

Les lésions cérébrales résultant d'un accident vasculaire cérébral (AVC) sont la principale cause de handicap neurologique acquis. En dehors de la rééducation physiothérapeutique, il n'existe pas de traitement efficace et standardisé pour amplifier la restitution des circuits neuronaux détruits par la lésion. L'identification de nouvelles stratégies de "neuroréparation" efficaces et cliniquement crédibles constitue un défi majeur. Une solution émergente est la stimulation du nerf vague (SNV). De manière surprenante, l'envoi d'impulsions électriques indolores à travers ce nerf crânien améliore la récupération fonctionnelle des patients sans provoquer d'effets secondaires majeurs. Cependant, le mécanisme par lequel cette méthode améliore la neuroplasticité n'est pas connu. La SNV est donc utilisée de manière empirique, sans standardisation. Pour mieux appréhender son potentiel thérapeutique, il est essentiel de comprendre comment la SNV, appliquée pendant la période critique de la récupération suivant l'AVC, peut améliorer la plasticité cérébrale. Sur la base des concepts récents de plasticité post-AVC, nous suggérons que la SNV normalise l'activité corticale de la région péri-lésionnelle, en périphérie du tissu nécrosé suite à l’AVC. Cette correction permettrait ainsi d'optimiser la plasticité cérébrale afin de reconstruire des réseaux neuronaux fonctionnels, nécessaire au réapprentissage du geste perdu. Nos précédents travaux mettent en évidence un défaut d'activité lié à l'équilibre entre l'excitation et l'inhibition. Ainsi, notre premier objectif sera de caractériser les modulations de l’activité corticale en réponse à un traitement par stimulation du nerf vague aigu chez la souris ischémiée anesthésiée. Ensuite, notre second objectif consistera à tester l'effet de la SNV sur les potentiels évoqués somato-sensoriels (PES) déclenché par une stimulation tactile de la patte avant de la souris. Ces travaux s’inscrivent dans une volonté de caractériser les mécanismes d’action de la SNV afin de raffiner les protocoles actuellement pratiqués en clinique, et dans l’espoir d’en faire la prochaine génération de traitement de réadaptation post-AVC.

Bénéfices attendus

Même si les premiers essais cliniques ont rapporté des résultats encourageants, cette nouvelle thérapie assez surprenante, ne se développera pas sans une compréhension convaincante de son mécanisme d’action de base. Nos hypothèses découlent de plusieurs années de recherche dans le domaine de l’AVC et nos données préliminaires suggèrent que nous sommes sur la bonne voie. Si nos hypothèses sont correctes, le résultat de ce travail viendra guider la pratique clinique. Comprendre dans quelle mesure un traitement de SNV, améliorant la récupération post-AVC chez la plupart des sujets selon la littérature, peut corriger l’activité corticale péri-lésionnelle est essentiel pour comprendre pourquoi ce traitement échoue ou fonctionne chez un patient donné. De plus, l’étude de la coïncidence temporelle entre la SNV et un stimulus tactile sur la correction de l’activité cérébrale permettra notamment de guider sur la temporalité du traitement au cours des séances de réhabilitation, dont le déroulement reste encore très empirique. Nous pensons que notre équipe peut apporter des avancées significatives pour développer cette thérapie.

Procédures

Nous utilisons un modèle de lésion photothrombotique du cortex (à la surface du cerveau), chez la souris pour simuler un AVC. L'induction de l'ischémie photothrombotique chez les souris se fait par injection d'un colorant, le rose bengal (tous les groupes, n = 78), suivie d’une illumination du crâne avec un laser pour créer une lésion ciblée dans le cortex moteur de la patte avant (Groupes 2, 5 et 6) (Durée d’anesthésie : 50 min). Durant toutes les procédures chirurgicales, les souris sont anesthésiées, leur bien-être et leur réaction à l'analgésie sont attentivement surveillés, et une température constante est maintenue pendant toute la procédure. Les souris témoins sham (Groupe 1 et 3) subiront toute la procédure chirurgicale sans illumination par le laser, et donc sans réaction oxydante du rose bengal. Afin d’évaluer un déficit fonctionnel, l’ischémie photothrombotique est précédée si nécessaire (Groupe 3 à 6) d’un apprentissage aux tests sensori-moteurs de la graine, de la ficelle et du cylindre. La performance à ces tests est évaluée à J7 (Groupes 5-6, n = 24) et /ou J14, J21 et J28 (Groupes 3-4, n = 32) pour mesurer le déficit moteur et la récupération fonctionnelle de la patte avant lésée des souris. Ces tests reposent sur la dextérité, la coordination motrice et de la préférence motrice des animaux, altérées après l’AVC. L’activité cérébrale basale et ses modulations en réponse à la stimulation du nerf vague seront évaluées à la surface et en profondeur du cortex, sous anesthésie, selon deux modalités. D’une part, l’activité corticale évoquée par des stimulations vibro-tactile sera évaluée avec et sans SNV à J14 (Groupes 1-2, n = 22). D’autre part, l’activité spontanée du cortex péri-lésionnelle sera mesurée à J7 (Groupes 5-6, n = 24) et /ou J14 et J28 (Groupes 3-4, n = 32). La chirurgie se compose d’une partie active (Isolation du nerf vague, pose de l’électrode de stimulation et insertion de l’électrode d’enregistrement) (Durée : 2h30), suivi d’une partie où l’expérimentateur n’intervient plus, sous anesthésie plus légère (Durée : 1h30). L'efficacité de la SNV est vérifiée en observant une bradycardie transitoire en réponse à chaque stimulation. À la fin de l'expérience, les souris sont profondément anesthésiées et mises à mort. A cela s'ajoute les animaux nécessaires à l'entraînement chirurgicale d’un nouvel opérateur, à la fois pour l’induction de l’ischémie et l’enregistrement électrophysiologique corticale (n = 30)

Impact sur les animaux

Nuisances : - La microchirurgie au niveau du crâne et la suture de la peau le recouvrant entraînera une plaie sur 1,5 cm, qui sera traitée. - La coagulation locale des vaisseaux du cortex moteur primaire droit (par illumination d'une zone de 1mm carré) induira un déficit partiel de la force musculaire du côté opposé à la lésion, le plus souvent réversible au cours des 3 semaines qui suivent. Cette procédure d'ischémie est peu invasive (pas d'ouverture du crâne), et n'est pas connu pour occasionner une douleur autre que celle liée à la suture de la peau du crâne. La lésion étant très focalisée (microlésion uniquement corticale), elle n'occasionnera d'handicap lourd et pas de perte de poids significative. - La pose de l'électrode autour du nerf vague et la suture de la peau à ce niveau (cou) entraînera une plaie sur 1,5 cm. Les muscles et les organes ne seront pas endommagés. Les glandes salivaires seront préservées. Au total, notre expérience de plusieurs années sur des modèle modéré d'AVC montre que les animaux supportent ces procédures sans complication et sans manifester une douleur ou une détresse que nous ne puissions traiter. - La stimulation du nerf vague, à l'intensité choisie, n'entraîne pas d'inconfort, de douleur ou de perturbation métabolique ou physiologique nuisible. Tout au contraire, il s'agit d'une stimulation employée chez l'animal et chez l'homme pour réduire les symptômes de dépression, pour limiter l'épilepsie ou pour inhiber la douleur. Le retour sur les précédant projets autorisés utilisant ces mêmes procédures ont montré que le seuil des points limites n'a jamais été franchi. Nous sommes donc confiant que le présent projet n'occasionnera pas d'effets inattendus.

Devenir

Les animaux devront être mis à mort puisque leur cerveau et leur nerf vague seront prélevés pour des exploitations histologiques (analyses histopathologique et immunohistochimique).

Remplacement

Ce projet permettra d’analyser un mécanisme physiologique hautement intégré qui ne peut pas être reproduit de manière satisfaisante par des expériences in vitro ou in silico. Les paramètres physiologiques concernés n'existent que dans la situation "in vivo''. Les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales.

Réduction

Ce projet s’efforce de réduire le nombre d’animaux au strict nécessaire pour que l’étude soit concluante (78 souris adultes + 30 d’entrainement), en collectant le maximum d’observations au cours d’une même expérience. Le nombre d’animaux nécessaire a été évalué selon la sensibilité et la spécificité des procédures utilisées, en fonction de l’expérience acquise lors de nos précédentes études et de la littérature en vigueur.

Raffinement

Nous avons développé un modèle de lésion photothrombotique, sans craniotomie, générant une lésion corticale (surface du cerveau), ciblée et de très petit volume (~4 mm3, soit ~0,6% du volume cérébral), de manière à préserver au maximum le bien-être de l’animal. Cet effort de raffinement est compatible avec la proposition d’une procédure de classe modérée. En effet, le déficit fonctionnel occasionné n’est détectable que par des analyses cinématique du mouvement. A l'œil, il est généralement impossible de distinguer le comportement d'une souris ischémiée d'une souris non ischémiée (sham). Par ailleurs, les souris seront systématiquement anesthésiées lors des procédures invasives. Seul du personnel qualifié se chargera de réaliser les expériences, en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. Des points limites sont définis au préalable. Tout au long du projet, du personnel qualifié veillera au bien-être des animaux bi-quotidiennement 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuellement en vigueur (Directive 2010/63/UE). Pour limiter le stress des animaux, les cages seront isolées dans une pièce dédiée, à l'abri du bruit extérieur. Les animaux auront accès à l’eau et la nourriture ad libitum et ils seront sous surveillance constante après le déclenchement de l’AVC expérimental. Enfin, le bien-être animal sera au cœur de nos préoccupations. Toute angoisse, douleur ou souffrance animale occasionnées pendant le projet sera prise en charge et réduite autant que possible. De l’acquisition de l’animal jusqu’à sa mort, tout sera mis en œuvre dans l’optique de respecter les principes éthiques et de raffiner nos travaux autant que possible.

Choix des espèces

La souris (mus musculus) est le mammifère non-primate le plus proche (phylogénétiquement) de l’Homme : son degré d’homologie avec l’Homme est donc très élevé, autant sur le plan cellulaire qu’au niveau de la récupération fonctionnelle. De fait, la souris est l’animal le plus couramment utilisé pour modéliser l’ischémie cérébrale. De plus, le niveau de connaissance en physiopathologie est très avancé. L’anatomie du système nerveux central et la physiologie vasculaire assez similaire à celle de l’Homme en font un très bon modèle pour cette pathologie. Réaliser ces expériences chez un animal non-mammifère (autres groupes de vertébrés ou invertébrés) ne permettrait pas d’obtenir des données aussi pertinentes et exploitables par la communauté scientifique et médicale. Les animaux seront âgés de 8-15 semaines en début du protocole, ce qui correspond à la maturité cérébrale adulte. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes pour comparer les données obtenues avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC. De plus, chez l’Homme, les AVC surviennent très majoritairement chez l’adulte.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées, elles reçoivent des injections de cellules cancéreuses humaines puis de lymphocytes modifiés, avec suivi de la croissance tumorale par imagerie sous anesthésie, pour tester des cellules CAR-T contre des tumeurs. Le porteur indique que les tumeurs peuvent provoquer détresse respiratoire ou paralysie des membres postérieurs, les souris concernées étant alors mises à mort. Il affirme que les études précliniques sur l'animal sont "incontournables" et que la souris est un "modèle de référence" en cancérologie.

Objectifs

L’immunothérapie anticancéreuse est une approche dont le succès en clinique a récemment été validé avec l’approbation de stratégies d’immunothérapie visant à traiter des cancers avancés. Ces immunothérapies sont basées sur le transfert adoptif des cellules immunitaires du patient qui ont été modifiées pour reconnaitre la tumeur. Malgré son efficacité dans le traitement de cancers sanguins comme la leucémie, le succès de cette thérapie dans le traitement des tumeurs solides reste encore très limité. Ce projet vise donc à étudier l’efficacité anticancéreuse des cellules immunitaires humaines activées in vitro et injectées dans des souris porteuses de tumeurs humaines. Les résultats obtenus devraient contribuer à améliorer les immunothérapies dans le traitement du cancer.

Bénéfices attendus

La recherche qui est proposée dans ce projet a pour objet d’améliorer les thérapies anticancéreuses de type immunothérapie en ciblant des cancers agressifs. Nos résultats préliminaires in vitro ont d’ores et déjà démontré que les cellules CAR-T diminuent la prolifération de plusieurs cellules cancéreuses (lymphome, cancer du pancréas et cancer du poumon). Les résultats qui découleront de ce projet permettront d'accroitre nos connaissances sur les immunothérapies en cancer et d’améliorer leur efficacité.

Procédures

Aucun prélèvement sera fait et non plus de procédures chirurgicales. Les souris seront soumises à une anesthésie gazeuse pendant 10 minutes maximum et recevront une injection sous-cutanée (s.c) ou intraveineuse (i.v) de cellules cancéreuses à l’aide d’une seringue. Cette injection se réalise en 10 secondes par souris. A ce moment, chaque souris entre dans une phase d’expérimentation de 5 semaines maximum avant la mise à mort. Un suivi de la croissance tumorale et du poids des animaux seront réalisés tous les 2 jours, des mesures qui se font respectivement en 10 et 5 secondes pour chaque animal. Le traitement par injection i.v de lymphocytes humains sera administré dans les mêmes conditions. Chacune de ces administrations se fera en 15 secondes maximum par animal, prise de l’animal par l’expérimentateur comprise. Lors du suivi de croissance tumorale par imagerie, les souris seront sous anesthésie gazeuse et placées sur un tapis chauffant pour maintenir leur température corporelle et surveillées au réveil.

Impact sur les animaux

L’injection des cellules cancéreuses par voie sous-cutanée et intraveineuse peuvent occasionner des dommages dans la queue si les animaux venaient à bouger avec la conséquente angoisse. Les injections se feront donc sous anesthésie à l’isoflurane. D’autres nuisance pourront apparaitre si la taille de la tumeur est très grande (plus de 300 mm2 pour les tumeurs sous cutanées), il y a apparition de détresse respiratoire (pour les tumeurs pulmonaires) ou une paralysie des membres arrière est observée (pour la tumeur Raji). Si ces signes sont observés souris seront mises à mort par dislocation cervicale après anesthésie générale à l’isoflurane.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure. Lorsque l’effet thérapeutique (disparition ou diminution de la tumeur) est observé, ce qui devrait arriver au plus tard à la quatrième semaine, les animaux qui n’auront pas atteint le point limite seront aussi mis à mort sous anesthésie préalable. En effet, compte tenu du fait que les animaux sont porteurs de tumeurs, et même si des régressions tumorales pourront être observées, une reprise de la croissance tumorale après la période d’arrêt des traitements est toujours possible et nécessite la mise à mort de l’ensemble des souris pour se prémunir de la souffrance qui peut en résulter.

Remplacement

Nous avons réalisé des expériences in vitro (remplacement) au préalable qui nous ont permis de déterminer l’efficacité de la thérapie CAR-T dans notre modèle et son potentiel dans l’immunothérapie en cancer. Pour valider nos résultats, nous devons passer dans un modèle de souris afin d’étudier notre hypothèse dans l’environnement tumoral. En effet, les études précliniques avec des animaux sont incontournables pour la finalité de ce projet puisqu’il est nécessaire d’identifier l’efficacité in vivo mais aussi les effets indésirables potentiels des traitements.

Réduction

Les groupes expérimentaux sont constitués de n=6 individus/condition et l’expérience sera réalisée 2 fois ce qui donnera une force statistique fiable. Le fait que ces animaux soient génétiquement les mêmes, permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. L’utilisation des souris de manière indépendante nous permet d’avoir une réelle puissance statistique. Nous avons choisi de mesurer les tumeurs par bioluminescence, ce qui contribue à réduire le nombre d’animaux tout en conservant une puissance statistique suffisante. Les expériences ne seront réalisées que deux fois, les rates et les tumeurs seront analysées sur les mêmes animaux ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux de l’étude.

Raffinement

Les souris disposeront d’une phase d’habituation à être manipulées par les expérimentateurs pour réduire leur appréhension. Les souris chez lesquelles les tumeurs solides et sanguines sont implantées seront examinées tous les deux jours pour surveiller leur inconfort (taille de la tumeur gênant la mobilité, isolement du groupe, absence de toilettage). Par ailleurs, les injections se feront sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane pour limiter le stress. Des analgésiques seront utilisés en cas de douleur (ex : analgésiques locaux type Lidocaïne au point d’injection à la queue ; et/ou antalgiques type AINS). De plus, les animaux seront hébergés à raison de 6-10 souris par cage en présence des éléments nécessaires à la fabrication d’un nid. De la nourriture et de l’eau seront ajoutés à la cage. Également, des points limites spécifiques seront appliqués. Pour le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs (500 mètres environ), nous transporterons à pied les souris dans des cages filtrées et dans l’obscurité pour limiter le stress causé par le transport. A leur arrivée dans l’établissement utilisateur 2/2, les cages des souris seront changées et placées sur portoir ventilé pour protéger les souris immunodéprimées (phénotype dommageable). Les souris ne seront déplacées qu’une seule fois pour limiter le stress du transport. Ces mesures assureront ainsi le raffinement de l’étude.

Choix des espèces

Il est impossible à nos jours de reproduire avec fidélité l’environnement tumoral et sa réponse à l’immunothérapie. Pour prouver les mécanismes immunitaires impliqués dans la maladie et tester l’efficacité de l’approche thérapeutique, nous devons recourir à l’utilisation d’un modèle animal et l’utilisation de la souris nous permet d’avoir accès à des modèles transgéniques et des modèles humanisés. Etant donné que l’objectif à long terme sera d’évaluer l’efficacité des cellules CAR-T en thérapie anticancéreuse, nous devons utiliser une espèce présentant une physiologie proche de l’Homme, telle que la souris, qui est un modèle de référence en cancérologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles.

96 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 81 tués pour prélèvement du cerveau et 15 proposés pour servir à des formations à l'expérimentation animale. Ils sont isolés et soumis pendant 21 semaines à une alcoolisation volontaire, à quatre prélèvements sanguins sous anesthésie et à des sessions où la prise d'alcool est associée à un événement aversif. Le porteur indique que l'isolement et ce modèle augmentent l'anxiété des rats, et reconnaît que 15 d'entre eux ne développeront pas l'appétence pour l'alcool attendue. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux vivants ne permet d'évaluer un comportement d'addiction à l'alcool.

Objectifs

Le métabolisme cérébral est profondément altéré suite à une prise excessive et répétée d'alcool. L'objectif ici est donc de démontrer qu'en corrigeant le métabolisme cérébral en changeant certains apports alimentaires chez le rat, l'on peut modifier des comportements associés à l'addiction à l'alcool.

Bénéfices attendus

Comprendre les altérations métaboliques en lien avec l'addiction à l’alcool et les façons d'intervenir de manière efficace pour les corriger pourraient permettre à terme le développement de stratégies thérapeutiques ciblées et efficaces contre cette maladie psychiatrique.

Procédures

Les animaux suivront une procédure comportementale avec alcoolisation volontaire sur une période de 21 semaines maximum. Au cours de celle-ci, ils auront de manière espacée (deux semaines d'écart minimum), 4 prélèvements sanguins à la queue sous anesthésie générale (durée inférieure à 15 minutes) ; deux fois, espacé de deux semaines, 6 sessions de comportement de 30 minutes/jour avec prise d'alcool associée à un événement aversif modéré (pour reproduire le symptôme pilier de l'addiction qui est de persister dans la recherche et la prise de la drogue en dépit des conséquences négatives) ; ainsi qu'un régime alimentaire modifié et contrôlé pendant un mois. A l’issue de l'étude, les animaux seront mis à mort et leurs cerveaux prélevés pour des analyses biochimiques ultérieures.

Impact sur les animaux

L’effet du modèle de consommation d’alcool que nous allons utiliser et l’isolement des animaux nécessaire pour cette expérimentation ont un impact d’ordre modéré sur l’animal, augmentant son niveau d’anxiété mais n’induisant pas par exemple de symptômes physiques de manque. Des nuisances modérées sont également attendues lors des sessions comportementales associées à un événement aversif. Des nuisances légères sont attendues pour ce qui est des injections sous-cutanées des traitements antalgiques potentiels. Nous n'anticipons pas d'effets indésirables des régimes alimentaires modifiés, sur la base des protocoles et des produits publiés qui vont être utilisés.

Devenir

Les animaux ayant suivi l'ensemble des procédures auxquels ils sont destinés seront tous mis à mort afin de prélever les cerveaux pour analyses biochimiques. Cependant, il est estimé sur la base de protocoles comportementaux similaires que 15 animaux sur le total ne satisferont pas au critère comportemental d'appétence pour l'alcool nécessaire à la poursuite de l'étude. Ceux-ci seront proposés pour être réutilisés dans le cadre de formations à l’expérimentation animale ou autre formation d’enseignement. La décision sera prise en concertation avec le vétérinaire référent et/ou un membre de la Structure chargée du Bien Etre des Animaux.

Remplacement

Il n’existe pas de méthodes alternatives n’impliquant pas d’animaux vivants qui permettront l’évaluation d’un comportement caractéristique de l'addiction à l'alcool.

Réduction

Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe estimé sur la base de procédures similaires réalisées auparavant. Le suivi longitudinal des animaux pendant plusieurs mois permettra également de renforcer l'analyse statistique, et donc de réduire le nombre d'animaux par condition.

Raffinement

Les animaux seront herbergés dans les conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement. Nous serons cependant obligés de les isoler par rapport à l'étude pour suivre leur consommation individuelle d'alcool, mais avec des cages avec grilles en portoirs ouverts, proches les unes des autres, permettant ainsi le maintien d’un certain nombre d’interactions sociales entre les animaux, ce qui limitera toute nuisance associée à un isolement plus strict. Ils seront hebergés pendant une semaine à leur arrivée pendant laquelle ils seront manipulés quotidiennement, avant le début des expérimentations afin d’atténuer le stress pouvant être lié aux contentions et aux manipulations. Pour les prélèvements de sang, les animaux seront anesthésiés avec un anesthésique gazeux. Le suivi et les pesées au quotidien des animaux permettront de veiller à ce qu’ils ne souffrent pas et de mettre en place des stratégies de soins et des points limites adaptés. En cas de signe d’alerte, l’alimentation sera supplémentée par une nourriture hypercalorique et hydratée fournie par l’animalerie. Un antalgique pourra également être injecté en utilisant des aiguilles courtes et fines.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain, ainsi qu'au niveau du métabolisme. Les registres comportementaux explorés (associés à l'alcool) sont également facilement appréhendables dans cette espèce. Au début de l’étude, les rats seront de jeunes adultes (de 10 à 12 semaines, de 220 à 280 g), ce qui permettra de travailler sur un système cérébral stable, mature, tout au long de l'étude qui prendra plusieurs mois.

32 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent l'implantation chirurgicale d'une tumeur colorectale sur le côlon sous anesthésie, puis des séances d'IRM sous anesthésie et des injections répétées de traitement, avant prélèvement des tumeurs. Le porteur indique une douleur post-chirurgicale et une gêne liée à la croissance tumorale, sans présenter les points limites comme systématiquement atteints. Le projet vise à proposer à l'industrie pharmaceutique un service de suivi tumoral par IRM, le porteur invoquant la nécessité d'observer la tumeur dans "l'organisme entier".

Objectifs

Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs. Il vise à démontrer l'intérêt et la valeur ajoutée de l'utilisation de l'imagerie par résonance magnétique (IRM) pour étudier l'efficacité de nouveaux composés en cancérologie sur des souris porteuses de cancer. L'IRM est une technique d'analyse de tumeurs implantées chez l'animal qui est non invasive, précise et utilisée chez le patient. Il est attendu de l'IRM qu'elle permette à terme d'améliorer et d'optimiser les études en cancérologie sur animaux, en travaillant avec des modèles de cancers implantés directement dans l'organe d'origine du cancer pour mimer au plus proche ce qu'il se passe chez le patient. Ce projet porte sur le suivi par IRM d'un modèle de cancer colorectal implanté directement au niveau du colon chez la souris. Ce modèle de cancer présente un intérêt fort pour évaluer l’efficacité thérapeutique de potentiels traitements anticancéreux, mais ne peut pas être étudié avec des techniques de suivi de volumes tumoraux classiques : mesures à la main quand les tumeurs sont implantées directement sous la peau. En effet, après l'implantation de la tumeur directement au niveau du colon, il est impossible de mesurer et de suivre l’évolution de la tumeur celle-ci se développant au niveau de l’organe et donc d’observer l’effet d’un traitement. Ce projet vise donc à créer une expertise en oncologie centrée sur l’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) pour la recherche biomédicale. Cette collaboration permettra d’offrir à l’industrie pharmaceutique le service requis pour l’évaluation in vivo chez l’animal de l’efficacité des molécules anticancéreuses développées avant leurs tests en phases cliniques chez le patient.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à long terme. Ce projet permettra de mettre en place un protocole de suivi tumoral capable d'étudier l’efficacité de potentiels traitements anticancéreux dans des modèles implantés directement dans l'organe, qui sont non mesurables avec les techniques classiques. Ceci permettra de simplifier l’utilisation de ces modèles de cancer qui miment la pathologie chez les patients et donc d’ouvrir potentiellement l’accès à de nouveaux traitements pour ces types de cancer. Il permettra aussi d'obtenir des données scientifiques afin de promouvoir l'utilisation d'une technique non invasive (l'IRM), technique dont la précision permettra à terme de réduire et raffiner nos études utilisant des animaux.

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur : implantation par chirurgie et sous anesthésie de tumeurs au niveau de la couche extérieure du colon, 20 minutes maximum. Dans le second établissement utilisateur : anesthésie fixe durant l’IRM maximum 30 minutes - traitement par voie intrapéritonéale 30 secondes 10 injections pour les animaux traités au composé expérimental et 2 pour les contrôles et ceux traités - traitement par voie intraveineuse 30 secondes durant 6 séances

Impact sur les animaux

Potentielle perte de poids, une douleur sur plusieurs heures liée à l'implantation par chirurgie de tumeurs par ouverture de la cavité abdominale au niveau du côlon, contrôlée par de l'analgésie et réalisée sous anesthésie gazeuse. Une gêne dûe à une croissance de tumeurs au niveau du colon, du stress dû aux contentions pour les traitements, une douleur de quelques secondes dûe à l'aiguille suite aux injections à la seringue en intrapéritonéal pour les traitements, une douleur de quelques secondes dûe à l'aiguille suite à l'injection à la seringue à la queue en intraveineuse pour l'agent de contraste et un stress dûe à l'anesthésie gazeuse pour l'IRM.

Devenir

Suite à la procédure, les animaux seront mis à mort deux semaines après début du traitement pour les prélèvements de tumeurs fraîches.

Remplacement

Les interactions entre le système immunitaire et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes (la rate, les ganglions etc), ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité etc). L’étude par IRM du développement d’une tumeur ne peut se faire qu’au niveau de la tumeur dans son micro-environnement et avec ses interactions avec l’organisme entier.

Réduction

Le projet sera fait sur le nombre d’animaux nécessaires afin de conclure de façon fiable statistiquement avec le test approprié (comparaison de moyennes et analyse de courbes d’espérance de vie) à l’efficacité du traitement tout en ayant une bonne prise tumorale. 32 souris seront utilisées et réparties en quatre groupes de 8 souris. Pour cette étude d’efficacité de nouvelles molécules sur un modèle de cancer colorectal complexe de part son implantation directement au niveau de l'organe, un effectif de 8 souris par groupe sera utilisé afin de pouvoir être capable d'observer une efficacité d'inhibition du volume tumoral de 25% du composé si cela vient à se passer. Pour chaque groupe, les volumes de tumeurs prélevées à la fin de la procédure seront analysées afin de confirmer les données obtenues par IRM et limiter les anomalies d’analyses pour des études futures utilisant l’IRM. Le recours à l’imagerie pour le suivi tumoral évite l’ouverture ou la mise à mort de l’animal pour visualisation direct de la tumeur, et donc une diminution du nombre d’animaux expérimentés.

Raffinement

Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet afin de limiter leur stress. Toutes les précautions seront prises pour détecter et minimiser la souffrance, la douleur et le stress des animaux (observation quotidienne, pesée des animaux, traitement antalgique si besoin). Les animaux auront accès à de la nourriture humide en cas d'amaigrissement. Des prélèvements de tumeurs en point final seront réalisés pour pouvoir obtenir le maximum d’informations des animaux utilisés. Concernant l’acte de chirurgie, les animaux seront traités avec un antidouleur avant la chirurgie qui se fera sous anesthésie gazeuse moins invasif et pour un réveil moins difficile. Le personnel est formé à la chirurgie quant à la mise en place du modèle et notre partenaire quant à la réalisation de l’IRM et l’administration des traitements. Afin d’éviter des transports réguliers tous les deux jours minimum des souris, les animaux seront transportés une fois avoir récupérés de la chirurgie pour une période d’acclimatation.

Choix des espèces

La souris immunocompétente est un modèle de choix pour ce type d’étude car il existe un large panel de tumeurs murines représentatives de différentes indications oncologiques, ce qui n’est pas le cas chez les autres espèces de rongeurs de laboratoire. Les souris seront âgées de 6 semaines, car la prise tumorale est meilleure sur les individus jeunes, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux à utiliser.