Recherche fondamentale

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie provoquant une hémorragie cérébrale par injection de collagénase, la pose d'un cathéter jugulaire et d'une pompe sous-cutanée, des passages à l'IRM, des tests comportementaux nommés (neuroscore, corner test, score de Bederson) puis une perfusion transcardiaque terminale, pour tester une molécule contre l'AVC hémorragique. Le porteur indique que le modèle reproduit déficits sensorimoteurs, désorientation et perte de poids, ces situations définissant les points limites à ne pas dépasser. Il affirme qu'aucune méthode alternative n'apporterait le même niveau d'information et présente la souris comme le "modèle préférentiel".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de tester une nouvelle molécule dont le mécanisme d’action est susceptible d’agir sur différentes phases de l’AVC hémorragique : la phase aigüe (24h) pour limiter la lésion et la phase inflammatoire qui s’installe les jours suivants. L’objectif de ce projet est de tester une stratégie thérapeutique pharmacologique dont son mécanisme d’action est susceptible d’agir sur différentes phases de l’AVC hémorragique : la phase aigüe (24h) pour limiter la lésion et la phase inflammatoire qui s’installe les jours suivants. L’effet de cette stratégie thérapeutique sera évalué en utilisant un modèle d’hémorragie intracérébrale chez la souris. Nous observerons l’effet de cette stratégie thérapeutique à 3 doses différentes afin de déterminerla dose optimale.

Bénéfices attendus

Chez l’homme, les hémorragies intracérébrales spontanées (HICS), non traumatique, résulte d’une irruption importante de sang dans le parenchyme cérébral, suite à une rupture de micro-vaisseaux. Aujourd’hui, il n’existe aucune stratégie thérapeutique pharmacologique permettant de réduire les effets délétères d’un hématome sur le parenchyme cérébral. Cette étude pourrait mettre en évidence une nouvelle stratégie thérapeutique pharmacologique dans la lutte contre ce type d’AVC hémorragiques, n’ayant aujourd’hui aucun traitement de référence permettant de réduire les effets délétères d’un hématome sur le parenchyme cérébral.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie d'environ 15 minutes au niveau de la tête afin de pouvoir injecter de la collagénase, provoquant ainsi une hémorragie dans le striatum. De plus, la pose d'un cathéter jugulaire et la mise en place d'une pompe en sous cutanée sera réalisée permettant ainsi la micro-perfusion du traitement. La cathétérisation ainsi que la mise en place de la pompe durera environ 15 minutes . Le changement de la pompe aura lieu environ à 24h et 48h post AVC. Ce changement ne prendra pas plus de 5 minutes. A J+1, J+5 et J+14, ces mêmes animaux seront passés à l'IRM sous anesthésie générale pour une durée totale de 14 minutes. Sur ces mêmes jours, ainsi que le jour précédent la chirurgie, les animaux suivront une série de test comportementaux. Nous comptons un total de 10 minutes pour la prise du neuroscore, 15 à 20 minutes pour le corner test, puis 10 minutes pour le score de Bederson. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au coeur. Les animaux subiront une perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant prélèvement. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes minutes pour les différents prélèvements. Les procédures douloureuse (chirurgie, persfusion transcardiaque) seront réalisées sous anesthésie générale associée à une couverture analgésique.

Impact sur les animaux

Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC hémorragique à savoir : déficit sensorimoteur, hémorragies et lésions cérébrales. Cela peut occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire. L'hémorragie cérébrale provoque une désorientation au moment du réveil post-chirurgical. Les fonctions motrices peuvent également être altérées durant les premières heures après l'hémorragie. Nous pouvons nous attendre à déceler sur certains animaux des signes de complications et de détresse postchirurgicales tels qu'une absence de réaction aux stimulis, une inactivité de l'animal dans sa cage ou encore une perte de poids suite à un arrêt de la prise alimentaire. Les situations précédemment citées définissent nos points limite à appliquer pour ce projet. Nous surveillerons à ce qu'ils ne soient pas dépassés. Les tests comportementaux ne sont pas censé induire de stress et de douleur à l’animal. Les animaux seront sous anesthésie générale pour les examens IRM ainsi que la pause de pompe et remplacement, aucune douleur n’est à prévoir. Il en est de même pour la pose d’un cathéter, aucune nuisance n’est attendue.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Ce projet correspond à l’étape de validation in vivo qui fait suite aux nombreuses validations réalisées in vitro, et ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que de tester cette stratégie thérapeutique chez l'animal. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que la souris est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, la souris est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC hémorragique ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de notre stratégie thérapeutique. Cette étude sera réalisée sur 18 animaux par groupe (+ 10%) sauf pour les sham au nombre de 10. Soit un total de 100 souris pour l’étude complète. Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été évalué via un test d’analyse et nos données sur le modèle hémorragique murin.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les souris seront 5 par cage avec plusieurs enrichissements, auront de la nourriture et de l’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. De plus, une coupelle de croquettes humides sera mise dans la cage le jour de la chirurgie afin de faciliter la prise alimentaire et hydrique des animaux post-opératoire. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Pendant les phases chirurgicales, chaque animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique administrée 15 minutes avant incision. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. La température corporelle de l’animal est maintenue grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée. Le site d’incision de peau fait appel à une tonte préalable du pelage, puis à une désinfection et enfin l’application d’une anesthésie locale. Lors de la phase de réveil, le débit d’O2 est élevé pour permettre une meilleure récupération post-opératoire. Les animaux seront placés dans une enceinte chauffée pendant 1 heure avant d’être remis en cage par 5. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si en période postopératoire, nous constaterons un dépassement des points limites précédemment fixés, l’animal sera mis à mort selon la Directive 2010/63/UE. Enfin, une surveillance stricte des souris sera réalisée pendant les jours suivants l’opération : pesée des animaux et contrôle des points limites.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier l’hémorragie intra crânienne. Les animaux utilisés seront âgés de 6-7 semaines et auront un poids de 30 g environ. Nous effectuerons notre modèle sur des jeunes adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC hémorragiques.

1 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par Staphylococcus aureus en intraveineuse, puis reçoivent des composés par voie intrapéritonéale chaque jour pendant cinq jours, avec des prélèvements de sang répétés à la queue sur animal vigile, pour tester de nouvelles molécules antibactériennes. Le porteur suit la survie des animaux et indique que les injections et prélèvements provoquent une douleur légère et un stress lié à la contention. Il justifie le recours à la souris par un nombre croissant de souches résistantes qui font de la recherche de nouvelles molécules un "véritable challenge thérapeutique".

Objectifs

Staphylococcus aureus est une bactérie à la fois commensale et pathogène opportuniste. C’est l’une des bactéries le plus souvent isolée à partir de prélèvements sanguins et d’infections invasives. L’incidence annuelle des bactériémies à Staphylococcus aureus (BSA) dans la population générale est évaluée à 28 pour 100 000 en Europe avec un taux de létalité variant de 22 à 26%, et la BSA est un facteur de mauvais pronostic au cours des pneumonies nosocomiales à Staphylococcus aureus. Également, les infections ostéoarticulaires à Staphylococcus aureus sont caractérisées par un risque élevé d’échec thérapeutique, de séquelles, et de morbidité à long terme. En effet, si un traitement antibiotique existe contre les infections à Staphylococcus aureus, on observe un nombre croissant de souches résistantes (10 à 40 % des cas de BSA) faisant de la recherche de nouvelles molécules actives contre ce type d’infection un véritable challenge thérapeutique. Dans le cadre d’une collaboration, nous avons identifié un certain nombre de nouveaux composés de synthèse ayant une forte activité antibactérienne contre différentes espèces de bactéries parmi lesquelles Staphylococcus aureus. Le but de ce projet est donc de confirmer les résultats obtenus in vitro sur des cultures de Staphylococcus aureus dans un modèle murin d’infection.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est la recherche de nouveaux traitements contre les infections à Staphylococcus aureus. S’il existe un traitement antibiotique de référence contre ce type d’infection, de plus en plus de souches résistantes apparaissent, et la découverte de nouveaux traitements constituerait une avancée significative dans le traitement de ces infections.

Procédures

Les souris seront infectées une fois par voie intraveineuse, puis traitées une fois par jour pendant 5 jours par voie intrapéritonéale avec les composés à tester. Des prises de sang seront effectuées sur les souris vigiles par prélèvement de 5 microlitres dans la veine caudale, 4h, et 1, 2, 3, 5, 7 et 10 jours post infection. Nous utiliserons des doses infectantes déterminées par ailleurs. Les animaux infectés seront traités avec les composés chimiques sélectionnés et la survie des animaux sera suivie au cours du temps et comparée avec des animaux traités avec une solution saline.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront au cours de ce projet une injection intraveineuse et des injections intra péritonéales répétées (une fois par jour pendant 5 jours) ainsi que plusieurs prises de sang par incision de la veine caudale. Tous ces actes entrainent une douleur légère et un stress dû à la contention.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux en fin de procédure. Ces animaux ayant été infectés, il n’est donc pas possible de les réutiliser, de les replacer ou de les adopter.

Remplacement

Les différents composés étudiés ont été testés in vitro sur des cultures de Staphylococcus aureus et les concentrations minimales inhibitrices déterminées pour chaque composé actif contre cette bactérie. Nous devons maintenant vérifier que cet effet observé sur des bactéries en culture se retrouve dans un modèle d’infection in vivo. Dans un souci de remplacement et de raffinement, des tests de toxicité sur cellules nous ont permis de déterminer les doses de chaque composé n'entrainant pas de mort cellulaire. Ce sont ces doses qui seront utilisées dans ce projet.

Réduction

Nous utiliserons un nombre d'animaux le plus restreint possible nous permettant d'obtenir des résultats statistiquement significatifs. Ce nombre sera calculé en tenant compte de nos résultats précédents.

Raffinement

En termes de raffinement, les animaux seront réceptionnés à l’animalerie une semaine avant le début des expériences pour adaptation et hébergés par groupe de 5 dans un environnement enrichi (igloo et baguette en papier). Les animaux seront surveillés quotidiennement et à chaque intervention par les responsables du projet. En cas d’apparition de signes de souffrance et/ou de lésions, la surveillance serait renforcée et les plaies désinfectées. En cas de persistance de l’un ou l’autre de ces signes au-delà de 24h, le ou les animaux concernés serai(en)t immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement décrit dans la littérature comme modèle de l'infection in vivo. De plus, les systèmes de défense contre les bactéries pathogènes sont très conservés de la Drosophile aux Mammifères, et en particulier, les réponses cellulaires de l'hôte vis-à-vis du pathogène sont très similaires entre la souris et l'homme. Nous utiliserons des animaux âgés de 6 à 8 semaines pour être dans les mêmes conditions que nos travaux antérieurs.

10 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit trois neurochirurgies de six à huit heures pour l'injection de protéines et l'implantation d'électrodes intracérébrales, puis des séances de neurostimulation, des injections de scopolamine et des ponctions lombaires répétées. Le projet induit une pathologie proche de la maladie d'Alzheimer pour tester des méthodes de neurostimulation de la mémoire. Le porteur affirme qu'un modèle primate est "indispensable" car le cortex préfrontal dorsolatéral "n'existe que chez le primate".

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans l’objectif général de développer de nouvelles approches de neurostimulation pour les déficits mnésiques, observés en particulier dans la maladie d'Alzheimer. Malgré leur incidence très élevée, il n’existe actuellement pas de traitement pharmacologique adéquat, et la neurostimulation représente une approche alternative qui a déjà fait l’objet de plusieurs études préliminaires. Cependant, les approches testées chez l’humain actuellement produisent des effets variables et insuffisants, et qui ne sont pas statistiquement significatifs. Ces protocoles sont relativement simples car ils ne ciblent qu’une seule aire cérébrale et ce, de manière continue au cours du temps. Nous faisons l’hypothèse qu’une intervention ciblant plusieurs aires cérébrales et modulée au cours du temps mènera à une amélioration plus robuste des performances mnésiques dans un phénotype similaire à celui de la maladie d’Alzheimer. Pour tester cette hypothèse, nous allons implanter chez le primate non-humain des technologies d’électrodes intracrâniennes similaires à celles utilisées chez l’humain, et que nous avons déjà testées dans des modèles imprimés en 3D et chez le cochon. Ces électrodes seront implantées dans des aires critiques pour la mémoire de travail et la mémoire épisodique, dont certaines sont spécifiques aux primates (cortex préfrontal dorsolatéral). Nous allons induire chez 10 macaques cynomolgus une physiopathologie similaire à la maladie d’Alzheimer, ainsi que des déficits cognitifs temporaires, et étudier l’impact de nouvelles méthodes de neurostimulation (ciblant plusieurs aires et adaptées en temps réel en fonction de l’état cérébral) sur cette physiopathologie et sur les performances cognitives de l’animal.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra : (1) d'élucider les mécanismes physiologiques sous-tendant l'apprentissage et la mémoire chez le primate dans des états sains et pathologiques, notamment dans un nouveau modèle physiopathologique de la maladie d’Alzheimer ; (2) de développer une nouvelle catégorie d'interfaces cerveau-machine bidirectionnelles permettant d'enregistrer l'activité neuronale et de la stimuler en temps réel dans plusieurs aires cérébrales différentes, afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour les troubles mnésiques et la maladie d'Alzheimer, qui ne connaît aucun traitement à l'heure actuelle. Le développement et l’amélioration de ces technologies de neurostimulation est en effet en plein essor, en raison de leur potentiel thérapeutique pour plusieurs maladies neurologiques, incluant non seulement la maladie d’Alzheimer, mais également la maladie de Parkinson, la dépression, les troubles obsessionnels compulsifs, etc. Les applications cliniques sur la maladie d’Alzheimer se limitent actuellement à la stimulation d’une aire unique, avec des protocoles relativement simples, et mènent à des effets très limités et variables. Ce projet va au-delà des protocoles utilisés cliniquement car il stimule plusieurs aires simultanément afin de restaurer leur activité naturelle, et les protocoles de stimulation dépendent de l’état du cerveau grâce à des algorithmes dits en boucle fermée. Un tel développement technologique doit se faire sur le gros animal, car les implants utilisés cliniquement (électrodes cérébrales profondes et électrodes sous-durales) et leur technique d’implantation chirurgicale (neuronavigation par IRM) ne peuvent pas être utilisés sur des petits modèles animaux tels que le rongeur. Par ailleurs, nous avons auparavant développé des approches méthodologiques et chirurgicales sur des modèles alternatifs, à savoir des modèles de cerveau imprimés en 3D et des modèles porcins. Pour passer à la phase comportementale, c’est-à-dire tester les effets de ces stimulations sur les processus de mémoire et la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer, il est nécessaire d’utiliser un modèle de gros animal avec une homologie cérébrale similaire à l’être humain. Un modèle primate s’avère dès lors indispensable, notamment en raison du fait que le cortex préfrontal dorsolatéral, une aire fortement impliquée dans la mémoire de travail et la mémoire épisodique, n’existe que chez le primate.

Procédures

Les animaux seront soumis à des tâches comportementales en chaise et en comportement libre avec enregistrements électrophysiologiques et neurostimulation (séances quotidiennes de 1-2h pendant toute la durée du projet), à des imagerie par résonance magnétique sous anesthésie (environ 5 séances de 2-3h maximum), à des tomodensitométries sous anesthésie (2 séances de 30 minutes), à 3 procédures neurochirurgicales de 6-8 heures environ (1 pour l'injection intracérébrale de protéines, et 2 pour l'implantation d'électrodes intracérébrales), à des injections intramusculaires de scopolamine (5-10 séances estimées, avec un effet durant 4h maximum), à des ponctions lombaires (réalisées tous les 6 mois à partir de l'implantation et pendant la durée du projet), et à une euthanasie.

Impact sur les animaux

Ce projet peut avoir les effets indésirables suivants sur les animaux : (1) stress et inconfort dus à la captivité et au conditionnement à une tâche comportementale, (2) douleurs suite à des procédures neurochirurgicales et à l'injection intramusculaire de substances (scopolamine, anesthésiants), (3) potentielles infections liées à la présence d'un système percutané d'électrodes intracérébrales, (4) nuisances liés à la potentielle restriction alimentaire ou hydrique, (5) nuisances liées à l'imagerie, (6) nuisances liées aux transports entre établissements utilisateurs.

Devenir

Les animaux seront eutahanasiés et une analyse histologique du cerveau sera effectuée.

Remplacement

Ce projet vise à étudier les effets de la neurostimulation intracrânienne sur la mémoire lors d’une tâche cognitive. Ceci ne peut être réalisé in vitro. Par ailleurs, les modèles informatiques actuels ne permettent pas de remplacer l’expérimentation animale car les processus mnésiques ne sont pas suffisamment bien compris. Néanmoins, nos travaux de recherche incluent déjà une partie modélisation afin de guider la sélection de certains paramètres de stimulation. Dans le futur, de tels modèles permettraient de réduire le nombre d’animaux utilisés. Par ailleurs, l’expérimentation humaine n’est pas encore possible à ce stade car les méthodes utilisées sont invasives, impliquent une craniotomie, et nécessitent donc une preuve de concept pré-clinique. En termes de modèle pré-clinique, notre développement technologique doit se faire sur le gros animal, car les implants utilisés cliniquement (électrodes cérébrales profondes et électrodes sous-durales) et leur technique d’implantation chirurgicale (neuronavigation par IRM) ne peuvent pas être utilisés sur des petits modèles animaux tels que le rongeur. Par ailleurs, nous avons auparavant développé des approches méthodologiques et chirurgicales sur des modèles alternatifs, à savoir des modèles de cerveau imprimés en 3D et des modèles porcins. Pour passer à la phase comportementale, c’est-à-dire tester les effets de ces stimulations sur les processus de mémoire et la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer, il est nécessaire d’utiliser un modèle de gros animal avec une homologie cérébrale similaire à l’être humain. Un modèle primate s’avère dès lors indispensable, notamment en raison du fait que le cortex préfrontal dorsolatéral, une aire fortement impliquée dans la mémoire de travail et la mémoire épisodique, n’existe que chez le primate.

Réduction

Chaque animal sera son propre contrôle afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. De plus, les mêmes animaux seront réutilisés pour plusieurs interventions (effets de la stimulation dans l'état sain et dans différents états pathologiques, i.e. après injection de scopolamine et dévelopement de la tauopathie). Un nombre de 5 animaux est le minimum pour effectuer des tests statistiques de comparaison entre plusieurs états. Il est également important de noter que les études de neurophysiologie ou de développement de neurotechnologies sur primates non-humains se limitent généralement à un nombre de 3 à 5 animaux, en raison de la complexité technique et expérimentale inhérente à ce domaine. Il s’agit du nombre généralement attendu par les comités de lecture dans le cadre de l’évaluation par les pairs, qui attendent dans ce cas les résultats individuels sur chaque animal. Par ailleurs, ces animaux seront divisés en deux groupes d'âge. Au total, nous planifions donc d'utiliser un maximum de 10 animaux. Enfin, certains des animaux utilisés dans ce projet seront des animaux réutilisés de projets précédents.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes, dans une structure spécialement agréée pour l’hébergement et l’utilisation des primates en recherche, disposant d’équipements et de protocoles adaptés au raffinement du milieu pour cette espèce. Les hébergements seront enrichis par des approches standards (jouets pour animaux, nourriture variée, fonds sonore) ainsi que l’utilisation d’un système d’écran tactile pour primates permettant de délivrer des récompenses alimentaires lors de l’exécution de tâches de pointage ou de mémorisation. L’habituation aux interactions avec l’humain et aux diverses procédures expérimentales se fera progressivement et par renforcement positif, à un rythme adapté à chaque animal et qui s’étendra sur une durée de plusieurs mois. Nous utiliserons des méthodes chirurgicales aseptiques ainsi qu’une anesthésie gazeuse suivant au plus près les standards cliniques. Les procédures chirurgicales seront menées par un neurochirurgien, à l’aide d’un système de neuronavigation fondé sur des imageries non-invasives du cerveau par IRM et de la morphologie crânienne par tomodensitométrie, permettant d’atteindre une précision d’implantation submillimétrique. Nous effectuerons un suivi post-opératoire accru, plusieurs fois par jour, qui sera consigné par le personnel en charge de l’animalerie sur une feuille de suivi post-opératoire suivant une échelle d'évaluation du bien-être adaptée au primate, basée sur des critères tels que la posture, l’activité motrice, les interactions sociales, la nutrition, l’hydratation, etc. Le suivi post-opératoire inclura également des antalgiques pour contrôler la douleur, des antibiotiques pour réduire le risque d’infection, et si nécessaire des corticoïdes afin de contrôler de possibles augmentations de pression intracrânienne. Les cicatrices seront inspectées quotidiennement et désinfectées à la bétadine. Les transports entre différents établissements s’effectueront dans une cage dédiée placée sur un chariot protégé des regards extérieurs par une housse, l’animal étant sédaté, maintenu au chaud sous une couverture, et bordé d’une bouillotte. Les éventuelles restrictions alimentaires ou hydriques seront introduites ou arrêtées de manière progressive, maintenues au niveau minimal efficace, et feront l’objet d’une surveillance et d’une réévaluation régulières. Ces procédures seront régulièrement mises à jour lors des réunions du comité SBEA. Enfin, les procédures seront arrêtées en cas d'atteinte d'un des points limites.

Choix des espèces

Au niveau scientifique, ce projet vise à étudier l’impact de la neurostimulation sur un réseau cérébral à grande échelle constitué notamment de l’hippocampe, du cortex entorhinal et du cortex préfrontal. Il existe une grande homologie de ce réseau entre le macaque et l’humain, mais cette homologie est nettement réduite avec d’autres espèces de vertébrés tels que les rongeurs, chez lesquels la définition du cortex préfrontal fait même débat. De plus, l’entraînement à des tâches cognitives suffisamment élaborées pour avoir un équivalent chez l’humain requiert l’usage de primates. Au niveau technologique, ce projet vise à développer des technologies de neurostimulation qui pourrait par la suite être appliquées à l’humain, ce qui nécessite un modèle anatomique suffisamment proche. Nous utiliserons des animaux à l’âge adulte (i.e. de plus de 5 ans environ). Le premier groupe contiendra des animaux entre 5 et 15 ans environ (âge adule moyen). Le deuxième groupe utilisera des animaux plus âgés (15-30 ans) dans le but d’observer des déficits de mémoire liés au vieillissement cognitif et de les compenser par la neurostimulation.

210 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des lésions du télencéphale, des microinjections d'activateurs ou d'inhibiteurs de l'angiogenèse et des injections intracérébrales, pour étudier la réparation du cerveau après une lésion. Le porteur décrit ces lésions comme "parfaitement maîtrisées" et affirme qu'il est "presque impossible" de distinguer un poisson lésé d'un poisson intact, malgré une gravité classée modérée. Il conclut que la complexité des processus de réparation cérébrale n'est pas modélisable in vitro.

Objectifs

Les accidents vasculaires cérébraux et lésions cérébrales (ex : traumatismes crâniens) se positionnent parmi les premières causes de mortalité et handicap acquis. A l’heure actuelle, il n’existe aucun traitement thérapeutique permettant d’améliorer les mécanismes de récupération cérébrale et ainsi de diminuer la mortalité et le handicap. Ainsi, le projet vise à mieux comprendre les mécanismes de réparation cérébrale à la suite d’un dommage tissulaire (traumatisme crânien, lésion cérébrale, accidents vasculaires cérébraux…) afin de trouver des pistes thérapeutiques à développer à termes chez l’Homme. Le projet a pour but de mieux comprendre les mécanismes de réparation cérébrale et plus spécifiquement les relations entre l'angiogenèse régénérative (formation de nouveaux vaisseaux) et l'activité de création de nouveaux neurones (neurogenèse) à la suite d'une lésion cérébrale en utilisant le modèle poisson zèbre. Les sous-objectifs du projet sont les suivants: (1) étude de la cinétique de création de nouveaux vaisseaux à la suite d'une lésion cérébrale (angiogenèse régénérative), (2) étude du lien entre l'angiogenèse régénérative et la neurogenèse régénérative, (3) compréhension du rôle de l'angiogenèse régénérative sur la neurogenèse en bloquant ou en activant l'angiogenèse, (4) étude du rôle de l'inflammation sur l'angiogenèse, (5) étude d'un facteur clé de l'angiogenèse, le VEGF, sur la neurogenèse constitutive. En résumé, le projet vise à réaliser des lésions du télencéphale (une partie du cerveau) chez le poisson zèbre en perturbant l’angiogenèse régénérative ou non. Ce type de lésion est parfaitement maîtrisée et n’entraine pas de nuisances visibles chez l’animal qui continue à se mouvoir, s’alimenter et se comporter de façon quasi identique à un animal non lésé. L’intérêt du modèle poisson zèbre est qu’il présente un génome proche de l’Homme avec plus de 70% à 85% de gènes en commun impliqués dans les processus physiologiques et pathologiques, respectivement. De plus, le modèle poisson zèbre est doué de mécanismes régénératifs spectaculaires en reconsturisant des parties entières de son cerveau. Le savoir qui en découle pourrait permettre de trouver des voies thérapeutiques pour favoriser la réparation cérébrale chez le mammifère et donc chez l’Homme ayant subi un dommage cérébral lésionnel (traumatismes crâniens/cérébraux, accidents vasculaires cérébraux, neurodégénérescence…)

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes régénératifs au niveau du cerveau. Un fois que nous aurons décrit ces différents processus, nous envisageons ultérieurement le test de traitements thérapeutiques pour favoriser l'angiogenèse et la neurogenèse régénératives. Cela permettra à termes d'envisager le déploiement de modèles précliniques de récupération cérébrale à la suite de lésions cérébrales sur des modèles précliniques d'AVC chez le rongeur avant d’envisager des thérapies chez l’Homme qui pourrait s’appliquer aux traumatismes crâniens, désordres neurodégénératifs, accidents vasculaires cérébraux.

Procédures

Les animaux seront soumis à des lésions cérébrales (100 animaux au total maximum dont 70 animaux pour étude de la cinétique de l’angiogenèse et neurogenèse et 30 animaux pour l’étude du rôle de l’inflammation dans l’angiogenèse régénérative), à des microlésions concomitantes avec des microinjections d'activateur ou inhibiteur de l'angiogenèse (70 animaux maximum) et à des injections intracérébroventriculaires (40 animaux maximum). Parmi les animaux lésés susmentionnés, un traitement avec un anti-inflammatoire dilué dans l'eau des poissons sera effectué sur 15 poissons (15 autres poissons recevront un traitement avec le véhicule. Hormi la cinétique d'étude de l'angiogenèse régénérative, les animaux seront euthanasiés à 3 jours post-lésion. Ce temps de cinétique apparait être un temps important pour l'angiogenèse et la neurogenèse régénérative

Impact sur les animaux

Concrètement, pas ou peu d'effets indésirables/nuisances sont prévus. Les lésions du télencéphale sont rapides (moins de 30s) et parfaitement maitrisées. La mortalité associée est quasi nulle (

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés pour analyse tissulaire par immunohistochimie

Remplacement

La complexité des processus physiologiques se déroulant lors de la réparation cérébrale ne sont pas modélisables par des techniques in vitro. Les processus de réparation impliquent plusieurs types cellulaires: microglies, oligodendrocytes, macrophages, cellules endothéliales, neurones, et cellules souches neurales. De plus, plusieurs processus physiologiques se mettent en place lors de la réparation : hypoxie, inflammation, stress oxydatif, sécrétion de facteurs trophiques et neurotrophiques ainsi qu'endothéliaux. A l'heure actuelle, nous ne pouvons réaliser des procédures in vitro permettant d'intégrer l'ensemble de ces acteurs cellulaires et de signalisation.

Réduction

Chaque expérimentation sera scindée dans la mesure du possible en deux expériences indépendantes. Cela permettra de ne pas utiliser l'ensemble des animaux si nous observons que les résultats obtenus sont suffisamment étayés. De plus, si jamais une souffrance ou une mortalité inattendue venait à apparaitre, cela éviterait de relancer une expérimentation avec le deuxième groupe d'animaux. Les doses d’inhibiteurs d’angiogenèse ont été testées chez des embryons de poissons zèbres afin de ne pas faire ces tests chez l’adulte et ainsi réduire le nombre d’animaux. Notre expérience montre que les doses de traitement chez l’embryon peuvent être transposées chez l’adulte sur les composés que nous avons testés.

Raffinement

Les animaux seront observés de façon continue les 30 premières minutes puis 3 à 6 fois par jour afin de nous assurer du bien être des animaux et de ne pas laisser un animal en souffrance. Peu de nuisance sont attendues. Tout signe de souffrance ou de comportement anormal sera rapporté au vétérinaire référent afin de prendre les mesures adéquates (notamment sédation profonde eutahansie).

Choix des espèces

Le poisson zèbre partage de 70 à 85 % de gènes en commun avec l’espèce humaine, impliqués dans les processus physiologiques et pathophysiologiques, respectivement . C’est également un modèle de réparation cérébrale reconnu avec des processus de réparation similaires à ceux des mammifères Animaux adultes entre 3 mois et 18 mois. A ces stades, les activités neurogéniques sont globalement similaires.

40 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une section chirurgicale du nerf facial suivie de la pose d'un conduit de régénération, ce qui provoque une paralysie faciale durant au moins un mois, avant une seconde anesthésie sans réveil pour prélever le nerf. Le projet évalue la capacité d'un conduit issu du cordon ombilical à réparer le nerf facial. Le porteur indique un risque de douleur, d'inflammation et d'abcès, et présente le rat comme un "modèle privilégié" en raison de sa proximité anatomique avec l'humain.

Objectifs

Le nerf facial (NF) est responsable de la motricité de l’hémiface correspondante. Il joue un rôle majeur fonctionnel dont l’atteinte est responsable d’une paralysie faciale entrainant des séquelles précoces (fonctionnelles et esthétique) et tardives (contractures musculaires, syndromes sécrétoires…). A ce jour, plusieurs techniques chirurgicales de réhabilitation sont utilisées dont le but est la récupération motrice des muscles de la face via une réinnervation après remise en continuité nerveuse. On peut citer les sutures péri nerveuses directes ou l’autogreffe de nerf périphérique. L'objectif est d'évaluer la capacité d'un conduit issu du cordon ombilical à permettre une régénération nerveuse du nerf facial.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus sont une récupération de la fonction faciale la plus optimale, dont l’analyse est basée sur des critères objectifs, grâce à la stimulation de la régénération nerveuse par conduit de régénération nerveuse issu de vaisseaux ombilicaux. L’objectif est d’obtenir des résultats sur le rat avant d’élaborer un programme de recherche clinique sur l’Homme.

Procédures

La procédure prévoit une première intervention de 45 minutes consistant en une section/résection chirurgicale du nerf facial et interposition d'un conduit de régénération nerveuse entre les deux sections de nerfs par suture directe sous anesthésie générale. Les rats seront ensuite réveillés et surveillés quotidiennement à l'animalerie avec accès libre à l'eau et la nourriture pour une durée de 8 semaines pour les 20 premiers et une durée de 16 semaines pour les suivants (nombre calculé sur la base de la 1ère phase d'expérimentation). Une seconde anesthésie générale permettra la réalisation de tests evaluant la récupération de la fonction du nerf facial. Le nerf facial régénéré sera ensuite prélevé pour analyse. Les rats seront ensuite euthanasiés, au cours de la même anesthésie générale.

Impact sur les animaux

- Anesthésie générale d'une durée de 45min nécessaire pour l'exposition du nerf facial, sa section et sa réparation. - Isolement des animaux pendant 3h après l'intervention pendant le temps du réveil et afin d'éviter toute mutilation de la cicatrice avec un congénère avant d'être remis à 2 par cage. - Paralysie faciale du rameau buccal du nerf facial induite par la procédure d'une durée minimale d'un mois, et dont la rapidité de récupération sera évaluée. - En cas de trouble de la cicatrisation de l'incision de la joue, les conséquences pourront être une douleur et un état inflammatoire local (rougeur, oedème, suintement, chaleur local), et pouvant aller jusqu'à l'abcès local.

Devenir

A l'issu de la première intervention, les animaux seront maintenus en vie et hébergés dans l'animalerie avec libre accès à l'eau et la nourriture. Cette période est nécessaire afin d'évaluer la récupération clinique de la fonction faciale au cours du temps par un score de mouvement des vibrisses. A la fin de la procédure, une anesthésie générale sans réveil sera réalisée puisque le prélèvement du nerf est nécessaire aux analyses histologiques.

Remplacement

Le principe de remplacement a été utilisé pour mettre au point la technique opératoire de suture du conduit de régénération sur le nerf facial. Ces conduits ont été utilisés et manipulés au préalable pour vérifier leur capacité de résistance aux fils de suture via des expérimentations préliminaires sur fil de silicone. La composition optimale de l'hydrogel a pu être déterminé au préalable afin d'éviter des échecs au cours des procédures chirurgicales sur les animaux. Afin d'évaluer la régénération nerveuse d'un point de vue fonctionnel clinique (score de mouvement des vibrisses), electrophysiologiques (enregistrement de l'activité nerveuse) et histologique (sur prélèvement complet de nerf), le modèle animal est nécessaire. Le rat est choisi du fait de sa proximité anatomique avec l'Homme concernant le nerf facial.

Réduction

Le principe de réduction est utilisé via la réalisation d'un protocole Go-no Go. En effet, à l'issue du premier "round" de 20 animaux, si une condition est jugée d'emblée innefficace, elle ne sera pas réutilisée lors du second "round", et le nombre de sujets nécessaires aura pu être calculé afin d'utiliser le nombre de rat minimal. Par ailleurs, les deux rameaux buccaux du nerf facial seront utilisés afin de réduire le nombre d'animaux utilisé. Une section et suture directe "enveloppée" par le conduit sera réalisée du côté droit. Une résection de 4mm de nerf facial et suture du conduit aux deux extrémités libres du nerf sera réalisée du côté gauche.

Raffinement

L'expérimentation sera réalisée dans le respects des textes réglementaires relatifs à la protection et à l'utilisation des animaux de laboratoire. Le projet s'inscrit dans une démarche éthique suivant la règle des 3R en optimisant les conditions de vie, d'hébergement et de soins des animaux. En post-opératoire immédiat les animaux seront isolés 3h le temps du réveil et afin d'éviter toute mutilation de la plaie opératoire avec un congénère. Puis, pour leur bien-être, les animaux opérés seront remis à deux par cage. Les soins prodigués aux animaux ainsi que les conditions d'hébergement (température, dimension cage, luminosité, bruit, enrichissement...) seront conformes à l'arrêté du 1er fevrier 2013 fixant les conditions d'hébergement des animaux utilisés à des fins scientifiques. Une évaluation des points limites selon l'échelle validée et transmise au comité éthique sera effectuée à 3h, 12h, 24h, 36h et 48h puis de manière quotidienne durant toute la durée de l'expérimentation. Un score supérieur ou égal à 7 implique la mise à mort de l'animal afin d'éviter toute souffrance inutile. Pour chaque rat, une analgésie locale en sous cutanée sera réalisée durant l'intervention puis en post opératoire toutes les 4h durant 5 jours.

Choix des espèces

L’anatomie du nerf facial du rat est comparable à celle de l’Homme. Par ailleurs, le rat possède un nerf facial de taille relativement importante compte tenu de sa taille, facilitant les procédures chirurgicales. L'accessibilité de ce nerf, chirurgicalement, est aisée puisque la branche buccale est située sous le tissu cutané. La paralysie engendrée par la section de la branche buccale du nerf facial n'empêche pas le rat de se nourir et est facilement évaluable cliniquement par le mouvement des vibrisses. Ce modèle animal en fait un modèle privilégié des travaux de recherche de la régénération nerveuse.

8 macaques rhésus vont être utilisés, réutilisés ou placés en retraite à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit deux neurochirurgies de quatre à six heures avec pose d'implants crâniens, puis des séances d'enregistrement sur animal vigile maintenu en chaise de contention, sous contrôle hydrique. Le projet étudie les réseaux du cortex préfrontal impliqués dans l'adaptation comportementale. Le porteur indique un risque d'infection des implants, une sensation de soif entre les sessions et une possible brûlure superficielle liée aux ultrasons, et affirme que les primates non humains sont "le seul choix possible".

Objectifs

L’adaptation comportementale repose sur plusieurs processus importants: établir la valeur des stimuli de l’environnement, des buts à atteindre et des actions en fonction de l’état interne du sujet, sélectionner un comportement et évaluer ses conséquences. La nécessité d’agir dans un contexte sociale implique la prise en compte d’information relative aux valeurs et intentions d’autres agents biologiques. Notre objectif vise à mieux comprendre les interactions au sein de larges réseaux neuronaux dans la régulation flexible de nos comportements. Ces réseaux sont centrés sur le cortex prefrontal, une region considérée comme une spécificité de l’organisation cérébrale des primates. Pour cela, il est indispensable 1) d’identifier les relations anatomo-fonctionnelles entre les régions du lobe frontal et temporal, 2) d’étudier l’implémentation des mécanismes de l’adaptation comportementale au niveau neuronal et 3) de comprendre le rôle causal de ces différentes structures sur le fonctionnement intégré de ces réseaux. Ceci nécessite une combinaison d’approches d’imagerie et d’électrophysiogie, dont certaines invasives. Les primates non humains sont le seul choix possible de modèle animal, sur la base de critères anatomiques et cognitifs, pour conduire le projet proposé. Ce projet sera réalisé dans 3 étab lissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Une caractéristique de notre survie dans le monde réel est notre capacité à faire preuve d'adaptation comportementale. Les primates en général et les humains en particulier sont très efficaces pour extraire rapidement les signaux informatifs de l'environnement social et non-social, et les intégrer aux conséquences de leurs actions, afin de maintenir ou de modifier si besoin leurs décisions. Ce projet est un projet de recherche fondamentale qui vise à comprendre les mécanismes par lesquels les différentes régions du cortex frontal et temporal interagissent et comment elles contribuent aux comportements adaptifs en contexte social et non social. Le principal bénéfice attendu sera donc l’amélioration des connaissances scientifiques qui découleront de la réalisation des expériences de ce projet. 1. Le projet nous permettra de mieux d’identifier les circuits neuronaux et les mécanismes physiologiques qui supportent l’expression de comportements adaptatifs. 2. Le projet nous permettra de comprendre comment les perturbations de ces interactions préfronto-temporales conduisent à des altérations des processus cognitifs supportant les comportements adaptatifs Des bénéfices secondaires pourraient inclure des hypothèses en recherche clinique dans le domaine de la neuropsychiatrie. 3. Le projet nous permettra de mieux comprendre le couplage neuro-vasculaire Des bénéfices secondaires pourraient inclure une meilleure utilisation translationnelle des données d’électrophysiologie obtenues chez le singe aux données de neuroimagerie obtenues chez l’humain.

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 actes chirurgicaux pour permettre la stimulation transcranienne par ultrasons et la collecte des données d'électrophysiologie et d'imagerie chez l'animal vigile. Les chirurgies seront réalisées après entrainement aux tâches comportementales. Une première chirurgie implantatoire permettra de réaliser les procédures de stimulation transcranienne et d'imagerie par résonance magnétique. Ce type de chirurgie dure en moyenne 4h. La seconde chirurgie sera réalisée à l’issue de la collecte des données d’imagerie fonctionnelle dans ces mêmes tâches. Elle est nécessaire pour la réalisation des procédures d'électrophysiologie et d'imagerie par ultrason. Ce type de chirurgie implantatoire nécessite la réalisation d’une craniotomie et sont plus longues (durée moyenne = 6h). Toutes les actes seront réalisés dans l'EU1, sauf la collecte de données CT préalable aux chirurgies qui sera réalisée dans l'EU3, et les chirurgies qui seront réalisées dans l'EU2.

Impact sur les animaux

Au cours du projet, les animaux auront plusieurs anesthésies générales pour les deux neurochirurgies et au moins un examen en neuroimagerie. Les anesthésies sont réalisées pour les différentes formes d'imagerie cérébrale nécessaires au projet, et pour la chirurgie destinée à l'implantation d’une chambre d'enregistrement. L'anesthésie générale provoquera également en elle-même un inconfort au réveil. La chirurgie pourra susciter un inconfort post-opératoire temporaire, normalement maitrisé par l'administration d'analgésique et un suivi rapproché par les expérimentateurs et les zootechniciens. Les marges des implants constituent des zones d’infection potentielle qui seront maitrisés par une surveillance régulière des implants et par l’administration de soins appropriés. Les singes travailleront dans le cadre traditionnel d'un box expérimental. Ils seront assis, ou en position dite du sphinx dans une chaise à primate, la tête fixée par le plot implanté. Les animaux seront formés à cette procédure par renforcement positif, la procédure étant bien établie et plutôt bien tolérée, mais les animaux éprouveront un léger inconfort lors de l’apprentissage de la procédure. Les singes seront formés dans le cadre d'un protocole de contrôle hydrique. Ce protocole est progressivement mis en œuvre et, dans la grande majorité des cas, les animaux reçoivent leur dose normale de liquide. Cependant il est possible pendant l'adaptation au processus, une certaine sensation de soif puisse se manifester entre les sessions. La stimulation ultrasonore peut induire une sensation de gêne lors de son application. Les animaux seront formés à cette procédure par renforcement positif, la procédure étant bien établie et bien tolérée. La stimulation ultrasonore peut induire une brûlure superficielle de la peau. Une modélisation au préalable des variations thermiques engendrées par la stimulation préviendra de cet effet négatif potentiel.

Devenir

La potentielle réutilisation des animaux en fin de protocole sera prise en accord avec la vétérinaire. Si les animaux ne peuvent pas être utilisés, un placement en retraite sera considéré.

Remplacement

Nous proposons d'étudier le fonctionnement des réseaux neuronaux impliqués dans l’adaptation comportementale. Ces réseaux sont centrés sur le cortex prefrontal, une région cérébrale considérée comme une spécificité de l’organisation cérébrale des primates. Sur la base de critères anatomiques et cognitifs, les primates non humains sont le seul choix possible de modèle animal pour conduire le projet proposé. Il n'existe pas d’alternative qui permette d'obtenir des informations similaires à partir d'expériences n'impliquant pas d'animaux, ou des modèles animaux non-primates.

Réduction

Contrairement à la neuroimagerie chez l’humain qui nécessite un grand nombre de sujet (n>20), les protocoles chez le primate non-humain bénéfient de la possibilité de répéter les sessions chez un même sujet. Chez le singe, 3 est également le nombre minimal d'animaux par étude sur lequel la communauté scientifique s'accorde. Dans le cadre du présent projet, il est important de prendre en compte le facteur social : dominants vs dominés. Nous travaillerons donc sur 2 groupes de 3 sujets. Cependant il arrive parfois que des animaux s’accommodent mal au travail en chaise de contention, ou ne tolèrent pas les implants. Nous envisageons le besoin de 8 animaux mais nous nous arrêterons à 6 si tous les animaux coopèrent, apprennent les tâches comportementales et tolèrent les implants.

Raffinement

Chaque animal reçoit un long pré-entrainement par renforcement positif pour l'habituer à la vie au laboratoire (nettoyage des volières, pesées régulières, etc.). Des protocoles d’enrichissement de l’environnement sont développés pour stimuler l’animal et lui permettre d’exprimer au mieux son répertoire comportemental en dehors des phases de collecte de données. L’utilisation de station de travail mobile permettra de réaliser certaines phases du conditionnement dans les volières des animaux. Un raffinement continu est également pratiqué pour développer des implants moins invasifs et moins sensibles aux infections. L’optimisation des techniques d’enregistrements électrophysiogiques permettra de réduire la phase de collecte des données. Tout sera mis en œuvre pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse de l’animal grâce aux différentes mesures mises en place dans l’animalerie (hébergement en groupe social, enrichissement, etc.) et un suivi médical régulier de l’animal (perte de poids, alopécie), et des implants sera mis en œuvre (signes d’infections). Un suivi medical plus spécifique sera également mis en oeuvre post intervention chirugical.

Choix des espèces

Nous proposons d'étudier le fonctionnement des réseaux neuronaux impliqués dans l’adaptation comportementale. Ces réseaux sont centrés sur le cortex préfrontal. Cette région est considérée comme une specificité de l’organisation cérébrale des primates. Les expériences présentees sont invasives. La combinaison des approches proposées permettront l’obtention d’informations fondamentales impossible à obtenir avec d'autres techniques, et impossible à réaliser chez l’humain. Notre recherche porte sur des animaux post-puberté (>4ans)

1 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes reçoivent une injection de vecteur viral sous anesthésie, 900 subissent une craniotomie avec pose d'une barre de tête et d'une fenêtre crânienne, et une partie est observée éveillée sous contention, pour mettre au point de nouveaux microscopes d'étude des circuits visuels. Le porteur indique que les implants peuvent causer douleur, stress et perte de poids pendant un à trois jours. Il affirme que ces circuits ne sont pas observables in vitro et juge l'usage de l'animal "scientifiquement indispensable".

Objectifs

Ce projet vise à mettre au point des nouvelles technologies d’optique permettant de contrôler avec plus de précision les neurones impliqués dans la vision. L’objectif est de comprendre comment les circuits neuronaux de la vision sont organisés et comment ils traitent les signaux sensoriels pour produire le comportement. Nous concevons et construisons de nouveaux microscopes utilisant des techniques d’optique pour mise en forme de la lumière. Jusqu’à présent, les études n’ont pu être réalisées qu’en surface dans les tissus, ou dans des échantillons transparents. Ces nouveaux microscopes constituent des outils sans précédent pour l’étude en profondeur des circuits visuels. En effet, les nouvelles méthodes d’optique développées permettront d’activer des neurones spécifiques avec la lumière et de décrire l’architecture des connexions neuronales dans une même région du cerveau ou entre deux régions différentes afin de comprendre les dynamiques de la perception sensorielle. Ce travail sera mené essentiellement dans des circuits du cortex cérébral.

Bénéfices attendus

Le projet permettra : 1. Le développement de nouvelles technologies d’optique pour la manipulation et l’enregistrement de l’activité neuronale dans le cerveau. Les nouvelles techniques optiques permettront l’étude des circuits neuronaux avec la lumière de façon plus précise par rapport aux méthodes utilisées jusqu’à présent. 2. Les nouvelles techniques optiques permettront de contrôler l’activité des neurones dans des régions du cerveau en profondeur. 3. Cette étude nous permettra de comprendre les mécanismes de perception sensorielle et la structure des circuits neuronaux impliqués, afin de cibler au mieux les thérapies géniques pour la restauration sensorielle en cas de pathologie (par exemple visuelle).

Procédures

1-L’injection d’un vecteur viral sous anesthésie profonde (durée de la chirurgie : 45 min) sera réalisée sur tous les animaux (1320 souris) et sous conditions stériles. 2-Une craniotomie sera réalisée sur une partie des animaux (900 souris) sous anesthésie profonde ; une barre de tête et une fenêtre seront posées. Durée : 1h. 3-Une partie des animaux observés en microscopie multi-photonique sera sous anesthésie profonde (600 souris) (durée : 1-6h). 4-Une partie des animaux observés en microscopie multi-photonique sera vigile (300 souris) (durée : 1-2h). Les expériences avec animaux vigiles seront précédées d’une habituation de l’animal à l’environnement afin de minimiser le stress de l’animal (durée : quotidiennement de quelques minutes à 1 heure, habituation progressive de plusieurs jours). 5- Un prélèvement caudal sera réalisé sur tous les animaux (1320 souris maximum) pour déterminer le profil génétique (durée : 5 minutes). L’analgésie est toujours utilisée avec l’anesthésie lors des chirurgies. Une euthanasie par une méthode réglementaire est nécessaire en fin de procédure pour les prélèvements et analyses.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons à ce que certaines chirurgies, comme les implants chroniques, puissent causer de la douleur, du stress ou une perte de poids temporaire. Des effets indésirables (stress ou douleur) peuvent durer pour un temps variable d’une journée à 3 jours après l’opération. Une biopsie prélevée au niveau de la queue pour déterminer le profil génétique des animaux peut causer de la douleur. L’adaptation de l’animal à l’environnement expérimental et au microscope d’enregistrement est accompagnée au début d’une détresse de l’animal, qui va diminuer avec l’habituation en quelques jours. Un risque de stress cardio-respiratoire est aussi présent lors de l’anesthésie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet pour prélever le cerveau et vérifier les données obtenues en microscopie multi- photonique.

Remplacement

Une partie des expériences avec les nouvelles protéines sensibles à la lumière et les indicateurs d’activité neuronale seront faites d’abord dans des modèles cellulaires in vitro, pour identifier les plus efficaces avec les systèmes optiques développés. Des simulations par ordinateur, préalables aux expériences, sont utilisées pour obtenir les paramètres optimaux d’illumination des tissus (température, modèles pour l’activation des protéines sensibles à la lumière…). À l’heure actuelle, ce modèle ne peut pas être entièrement remplacé par une approche alternative in vitro car les circuits neuronaux activés par la stimulation sensorielle ne sont pas observables in vitro. L’utilisation de l’animal est donc scientifiquement indispensable à notre étude.

Réduction

L’utilisation d’animaux avec implants permanents nous permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaires à chaque expérience. Cela nous permettra de travailler sur un plus petit nombre d’échantillons sur lesquels nous répéterons les stimulations avec la lumière. Grâce à des schèmes et formules mathématiques développés dans notre laboratoire, capables de définir préalablement des profils de stimulations avec la lumière (nombre de cellules et séquences de stimulation), nous pouvons réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention des données requises pour notre étude. Les schèmes de stimulation nous permettent aussi de réduire la durée des expérimentations. Pour chacune des mesures à réaliser, nous utiliserons des tests statistiques pour l’interprétation des résultats. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance. Au total, et sur 5 ans, nous utiliserons 1320 animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupes de 5 congénères dans des cages ventilées. Ils seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la règlementation (cages de stabulation avec enrichissement, nourriture et boisson à volonté). Les animaux en provenance de l’extérieur observeront une période d'acclimatation de 5 jours minimum avant expérimentation. Une signalétique particulière sera utilisée pour les animaux en expérimentation. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis pour chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. Des critères d’arrêt ou points limites ont été déterminés pour chaque type d’expérimentation. L’utilisation d’une grille d’évaluation permettra de définir les points limites pour chaque acte expérimental, afin d’éviter toute souffrance de l'animal et permettre l’euthanasie lorsque celle-ci ne peut être prise en charge. Les animaux observés éveillés seront soumis à un entrainement avant les observations au microscope, pour les habituer à leur environnement et réduire le stress.

Choix des espèces

Notre modèle animal est la souris adulte car ce modèle, très utilisé par les laboratoires de recherche, permet d’étudier le fonctionnement de circuits neuronaux complexes dans des conditions physiologiques proches de l’Homme. La taille du cerveau de souris est aussi idéale pour les études sous microscope avec haute précision. Le modèle souris permet aussi de disposer d’animaux ayant des particularités génétiques pertinentes pour notre étude. Nous utiliserons des souris âgées entre 28 jours et 1 an avec circuits neuronaux matures.