Recherche fondamentale

950 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On greffe des cellules de cancer du foie à 770 d'entre elles par chirurgie et à 180 par voie sous-cutanée, avec suivi par imagerie et traitements par injection ou gavage, pour étudier deux protéines impliquées dans les cancers du foie de l'enfant et de l'adulte. Le porteur décrit une douleur liée aux greffes chirurgicales, des dysfonctionnements du foie et le développement de micro-métastases. Il affirme que la culture de cellules ne représente pas la maladie et qu'un "modèle physiologique complet" reste nécessaire.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont d’étudier dans le modèle de la souris les rôles de deux protéines d’intérêt dans le développement des cancers du foie chez l’enfant et chez l’adulte. Nous nous intéressons également au microenvironnement tumoral qui permet l’interaction des systèmes physiologiques avec la tumeur et qui peut être modifié par les cellules cancéreuses. L’immunothérapie est actuellement utilisée pour traiter de nombreux cancers et son principal intérêt est d’activer le système immunitaire pour combattre les cellules cancéreuses. Cependant certains cancers du foie adultes sont résistants à l’immunothérapie et sont caractérisés par une absence de cellules immunitaires au sein de la tumeur. Or des résultats préliminaires montrent que certaines protéines conduisent à un défaut de communication entre cellules tumorales et cellules immunitaires pouvant expliquer cette résistance à l’immunothérapie. Ainsi un des objectifs de ce projet est d’étudier l’impact de l’inhibition d’une de ces protéines en réponse à l’immunothérapie dans les cancers du foie chez l’adulte. Le deuxième objectif concerne une autre protéine et consiste à évaluer l’efficacité d’un de ses inhibiteurs dans le traitement des cancers du foie chez l’enfant. Des résultats préliminaires montrent un effet de cette molécule sur la prolifération, la mort cellulaire ainsi que l’invasion et la migration cellulaires. Pour confirmer l’ensemble des résultats différents types d’implantation de cellules tumorales dans la souris seront effectués et comprennent des expériences pilotes ceci afin d’utiliser un nombre minimum d’animaux.

Bénéfices attendus

Nous aspirons à une meilleure compréhension des cancers du foie et des processus tumorigéniques et métastatiques dans l’optique que ces résultats servent à améliorer les traitements actuels et à développer de futures thérapies cliniques.

Procédures

Une partie des animaux vont subir une greffe orthotopique de cellules tumorale, cette greffe nécessite une procédure chirurgicale de moins de 10min, le nombre d'animaux concernés est de 770. Le reste des animaux eux seront greffés par voie sous-cutanée, intervention de moins de 5 min qui concernera 180 animaux. La croissance tumorale sera suivie par imagerie chez l’ensemble des animaux (950), intervention qui durera environ 15 minutes. Certains animaux recevront des traitements soit par injection intrapéritonéale (240) soit par gavage (240), chacune de ces interventions n’excédant pas une minute.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent : 1/ un stress dû à la contention/préhension des animaux, 2/ une douleur durant et après les injections orthotopiques, 3/ une mineur infection pour les injections orthotopiques, 4/ un inconfort au niveau des sutures dans les heures suivant les injections orthotopiques, 5/ un stress lors des phases d’induction de l’anesthésie (animal placé dans une boîte à induction lors des imageries) et de réveil, 6/ les traitements peuvent également induire une perte de poids et 7/ des dysfonctionnements hépatiques et le développement de micro-métastases.

Devenir

A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Tous les tests cellulaires in vitro réalisés en amont de cette étude montrent les rôles importants de nos 2 protéines d’intérêt dans les cancers du foie. Toutefois la culture de cellules in vitro est loin d’être un modèle représentatif, le microenvironnement tumoral permettant l’interaction des systèmes physiologiques avec la tumeur manque et nous éloigne de résultats pouvant directement être bénéfiques en clinique chez l’homme. Afin de confirmer nos premières observations in vitro nous devons donc avoir recours à un modèle physiologique complet et fonctionnel pour cette dernière étape : le modèle animal

Réduction

Nous combinerons nos lots témoins dans le but de restreindre le nombre d’animaux. La croissance tumorale sera suivie tout au long de l’expérience ce qui nous permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales a été déterminé pour pouvoir réaliser des tests statistiques robustes.

Raffinement

Le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort, les animaux seront hébergés en groupe et l’enrichissement de leur milieu de vie sera systématique. Les animaux recevront des analgésiques et des anesthésiques en pré et/ou postopératoire Les animaux recevront une surveillance quotidienne et des soins adaptés (mesure hebdomadaire du poids des souris, définition de points limites suffisamment précoces et mise en place de critères d’arrêt). La croissance tumorale sera suivie très précisément ce qui nous permettra d’améliorer le bien-être animal par une prise en charge plus rapide.

Choix des espèces

Nous utiliserons deux modèles d'animaux, un qui permettra d’étudier l’infiltration immunitaire dans nos tumeurs et un qui permettra d'étudier la greffe de cellules humaines. Nous utiliserons des souris de 6 à 8 semaines pour avoir une croissance tumorale optimale. En effet, les expériences peuvent s’étaler sur plusieurs mois, donc l’implantation dans de jeunes animaux permet de s’affranchir de l’affaiblissement d’individus plus âgés.

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe des cellules tumorales du sein ou des voies aérodigestives, on leur inflige jusqu'à dix injections dans la tumeur et une irradiation de 2 à 10 Gy, sous anesthésies répétées à l'isoflurane pour lequel le porteur reconnaît une aversion des souris. Il décrit une possible nécrose ou ulcération de la tumeur et une insuffisance respiratoire liée aux métastases. Il conclut qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'ensemble des mécanismes tumoraux, pour tester des peptides combinés à la radiothérapie.

Objectifs

Le cancer, dont les cancers du sein et des voies aérodigestives supérieures (VADS), reste un problème majeur de santé publique. La radiothérapie est actuellement appliquée dans plus de 70% des traitements contre le cancer et fait partie de l’arsenal antitumoral incontournable. Cependant, la radiothérapie possède comme effets secondaires l’augmentation de l’immunosuppression du microenvironnement tumoral, en activant notamment un composant du tissu tumoral ce qui favorise la récidive des tumeurs. Ce composant, une protéine fortement exprimée dans la matrice extracellulaire spécifique des tumeurs, joue un rôle primordial dans la genèse d’un microenvironnement tumoral aux effets immunosuppresseurs promouvant ainsi la progression et la malignité des tumeurs. Cibler les mécanismes par lesquels ce composant agit sur les tumeurs permettrait de réduire à la fois la croissance tumorale et l’apparition de métastases. Notre laboratoire a récemment découvert des petites molécules (peptides MPs) capables d’affecter cette nouvelle cible thérapeutique et ainsi d’inhiber la croissance de cellules tumorales in vitro. Cette étude s’attachera à déterminer la capacité de ces peptides MPs, seuls ou combinés à des traitements de radiothérapie, à inhiber le développement de tumeurs mammaires et des VADS et la formation de métastases dans des modèles expérimentaux murins. Elle s’attachera également à analyser in vivo l’effet anti-tumoral de ces peptides suite à l’inactivation de molécules impliquées dans le phénotype des cellules cancéreuses ou dans la mort cellulaire. L’impact de ces peptides, combinés à la radiothérapie, sur le microenvironnement tumoral et notamment sur les activités immunosuppressives de ce composant du tissu tumoral, une nouvelle cible thérapeutique, sera également étudié aux niveaux cellulaire et moléculaire. Cibler l’aspect immunosuppresseur de cette nouvelle cible thérapeutique devrait permettre d’améliorer la rémission des tumeurs induite par la radiothérapie. Cette étude permettra de mieux comprendre le mode d’action des traitements associés avec la rémission des tumeurs et aidera à en contourner les effets indésirables pour une future application dans des essais cliniques.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de démontrer, grâce à des modèles d’expérimentation in vivo, la capacité de ces peptides MPs à contrecarrer l'effet immunosuppresseur du tissu tumoral, en partie induit par des traitements anticancéreux tels que la radiothérapie, dans différents modèles de cancer. Le but in fine est de déterminer si ces peptides, dont nous avons montré in vitro leur capacité d’inhiber la prolifération de cellules cancéreuses, pourraient être utilisés en santé humaine en complément de tels traitements anti-cancéreux pour cibler l’aspect immunosuppresseur de molécules du microenvironnement tumoral et ainsi conduire à une régression plus efficace des tumeurs.

Procédures

Un groupe d’animaux subira une injection unique (1 minute) en sous-cutané dans l’un de leurs flancs effectuée sous anesthésie générale d’une durée de 5 minutes maximum. Une partie de ces animaux sera soumis à un régime alimentaire puis subira une injection péri-tumorale (30 secondes) effectuée sous anesthésie générale d’une durée de 5 minutes, suivis de 4 traitements d’imagerie in vivo chacun d’une durée de 5 minutes et chacun effectué sous anesthésie générale d’une durée de 15 minutes maximum. Une autre partie recevra en une semaine 3 traitements à la doxycycline dans leur eau de boisson. Un second groupe d’animaux subira une injection unique (1 minute) en sous-cutané au niveau de la nuque effectuée sous anesthésie générale d’une durée de 5 minutes maximum puis sur une période de 3 semaines 10 injections péri-tumorales (30 secondes chacune) et chacune effectuée sous anesthésie générale d’une durée de 5 minutes maximum. Une partie de ces animaux subira également une seule irradiation aux doses de 2 ou 10 Gy (durée de 5 minutes maximum) effectuée sous anesthésie générale d’une durée de 15 minutes maximum. Un troisième groupe d’animaux subira une chirurgie sous anesthésie générale d’une durée de 20 minutes maximum puis 10 injections péri-tumorales (30 secondes chacune) à raison d’une injection tous les 2 jours pendant 3 semaines et chacune effectuée sous anesthésie générale d’une durée de 5 minutes maximum. Une partie de ces animaux subira également une seule irradiation aux doses de 2 ou 10 Gy (durée de 5 minutes maximum) effectuée sous anesthésie générale d’une durée de 15 minutes maximum.

Impact sur les animaux

Les animaux seront amenés à développer des carcinomes des voies aéro-digestives supérieures (VADS) ou des tumeurs mammaires suite à la greffe de cellules cancéreuses dans les glandes mammaires, la nuque ou le flanc des animaux. Les effets indésirables que nous pourrions observer chez ces animaux ayant développé des tumeurs sont : gêne, légère douleur, infection ou inflammation aux sites d’injection de cellules tumorales et de molécules à potentiel anti-cancéreux, nécrose ou ulcération tumorale, perte de poids, limitation à s’alimenter ou à se déplacer due au développement de tumeur, insuffisance respiratoire due à l’apparition de métastases. Les souris montrent une aversion à l’isoflurane gazeux et même si chaque anesthésie ne durera au maximum que 15 minutes, certains animaux subiront plusieurs anesthésies sur une période de 3 semaines. L’irradiation peut induire des érythèmes cutanés et des nécroses suite à l’évolution de la croissance tumorale post-traitement. Bien que non attendus, il n’est pas exclu que les molécules (peptides) à potentiel anti-cancéreux étudiés dans ce projet puissent avoir des effets secondaires indésirables sur l’animal. Cette étude apportera des éclaircissements sur ce point.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue des différentes procédures pour une caractérisation in vitro des tissus tumoraux, métastatiques et divers autres tissus d’intérêt. Ces caractérisations viendront en complément des résultats obtenus in vivo.

Remplacement

Le modèle animal est nécessaire car il n'existe actuellement pas de modèle in vitro capable de reproduire dans sa globalité l’ensemble des mécanismes impliqués dans la croissance tumorale et le développement de métastases, comme l'environnement tumoral, la réaction du système immunitaire, les mécanismes physiologiques impliqués et l'impact sur la survie de l'animal, entre autres exemples. Le modèle animal nous permettra également d’obtenir des échantillons issus de tumeurs traitées ou non par des agents anti-cancéreux qui seront utilisés pour la validation de données obtenues in vitro. Le projet sera complété au maximum par des études effectuées en parallèle sur des cultures cellulaires.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires minimum mais néanmoins suffisant pour pouvoir atteindre les objectifs du projet et réaliser une analyse statistique pertinente a été déterminé grâce à l’utilisation d’un outil de calcul spécifique et grâce à des données de la littérature.

Raffinement

Les animaux seront hébergés à 4-6 souris par cage dans des cages avec une surface supérieure à la surface réglementaire minimale, enrichies de bâtons à ronger pour favoriser leur activité et agrémentées de frisures de papier, tunnel en polycarbonate, dômes et rouleaux de coton pour leur permettre de se cacher. Les animaux seront acclimatés à leur hébergement 15 jours avant de démarrer les procédures expérimentales et habitués quotidiennement à leur manipulation par les expérimentateurs une semaine avant pour réduire leur stress. Chaque protocole expérimental prend en compte un potentiel impact sur la souffrance animale et différents critères ont été établis pour justifier un arrêt de l’expérience en cours. L’anesthésie sera systématiquement utilisée à chaque étape des protocoles expérimentaux pour réduire le stress et la douleur et, si nécessaire, l’animal recevra également des analgésiques pré- et post-opératoires. Les animaux seront placés sur tapis chauffant pour éviter tout risque d’hypothermie et un gel ophtalmique sera utilisé pour protéger leurs yeux. Les animaux seront observés quotidiennement par du personnel formé. Leur état général (poids, alimentation, apparence, comportement) sera évalué quotidiennement durant les 3 premiers jours de l’expérimentation puis au minimum 3 fois par semaine afin de détecter au plus tôt tout signe de stress ou de souffrance. Plusieurs points limites ont été établis afin de soustraire l’animal à la souffrance. En cas de déclin de l’état général, une surveillance quotidienne de l’animal sera mise en place. Si un animal présentait des symptômes de douleur, un analgésique lui sera administré.

Choix des espèces

Nous avons choisi le modèle murin car celui-ci est développé depuis de nombreuses années dans notre laboratoire et possède de multiples avantages : nombreuses lignées génétiquement modifiées disponibles et modèle animal déjà validé dans le laboratoire. De plus, la souris récapitule de manière très similaire à l’homme l'ensemble des mécanismes moléculaires et des paramètres impliqués dans le développement tumoral : microenvironnement, réaction du système immunitaire, dissémination des métastases, mécanismes physiologiques impliqués et/ou associés, impact sur la survie. Une littérature abondante dans notre domaine est également un argument complémentaire en faveur du choix de cette espèce. Les souris seront utilisées adultes à partir de 8 semaines d'âge minimum, ceci afin de mimer la pathologie chez l’être humain adulte. L’utilisation de souris plus jeunes n’est pas pertinente car les mécanismes physiologiques impliqués seraient potentiellement différents, le jeune individu étant encore en cours de développement.

374 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur implante un dispositif hormonal, on leur greffe des cellules de tumeur mammaire, puis on leur injecte des nanoparticules magnétiques activées par un champ magnétique, avec suivi par imagerie, pour tester une délivrance ciblée de médicaments anticancéreux. Le porteur décrit des risques de nécrose de la tumeur, de perte de poids et de douleur aux points d'injection. Il affirme qu'aucun modèle sans animaux ne recrée la tumeur et son environnement et présente la souris comme le modèle de première ligne.

Objectifs

Malgré les avancées notables dans la prévention, le dépistage et la prise en charge du cancer du sein, celui-ci reste un problème de santé publique majeur en raison de ses taux alarmants d’incidence et de mortalité prématurée dans le monde. Le cancer du sein est une maladie très hétérogène. Les cancers mammaires les plus agressifs et les plus résistants aux traitements conventionnels sont appelés triples négatifs. C’est pourquoi développer des nouvelles thérapies capables de cibler spécifiquement ce type de cancer est plus que nécessaire. A ce titre, des anticorps conjugués à des médicaments (ADC) ont été récemment développés et mis sur le marché. Cependant, la production d'ADC est très complexe, longue et surtout coûteuse. Il est donc nécessaire de développer une alternative aux ADCs offrant une nouvelle voie pour le traitement du cancer. Notre projet s’inscrit dans cette logique. Notre objectif est de proposer un nouveau concept de ciblage des tumeurs mammaires en utilisant des nanoparticules magnétiques de polymères emprisonnant des médicaments. La délivrance de ces derniers se fera grâce aux propriétés d’échauffement local des nanoparticules magnétiques sous champ magnétique alternatif (AMF), permettant un contrôle spatio-temporel du relargage du médicament ainsi encapsulés dans le polymère. Ce projet s'effectuera dans deux EU differentes.

Bénéfices attendus

Le projet présente plusieurs bénéfices pour la santé humaine. En effet, ces nanomatériaux, rapides et moins coûteux à synthétiser, présentent de nombreux avantages par rapport aux anticorps conjugués à des médicaments développés récemment. Ils sont faciles et rapides à synthétiser, très peu couteux, présentent une bonne biocompatibilité, sont capables de traverser la membrane cellulaire en absence de toutes réponse immunogène. Cette approche permet de délivrer de façon spatio-temporelle des médicaments anti-cancéreux grâce à ses propriétés de ciblage et de délivrance contrôlée. Ainsi, notre approche transforme potentiellement des agents thérapeutiques non spécifiques avec des effets secondaires prononcés en un système thérapeutique ciblé utile pour la médecine de précision.

Procédures

Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques liés à la mise en place des modèles de cancers mammaires et à leurs traitements. Les différents gestes réalisés sur les souris incluront au maximum les étapes suivantes en fonction des questions scientifiques : i) Pose chirurgicale d’un pellet contenant des hormones en sous-cutanée sous anesthésie et analgésie (1x/animal, 5-10 minutes) ii) Injections unique orthotopiques dans la glande mammaire de cellules tumorales sur animal vigile (15 seconde/animal) iii) Suivi du poids et de la croissance tumorale mesure de la taille de la tumeur 3 fois par semaine (2 minutes/animal) iv) Injection intraveineuse ou intra-tumorale des nanoparticules sur animal vigile (1x/semaine, 2min/animal pendant 28 jours soit 4 injections/animal) v) Imagerie sur animal anesthésié (1x/vie, 30 min) vi) Application d’un champ magnétique alternatif sur animal vigile (4x/vie, 30min-1heure) vii) Euthanasie selon une méthode réglementaire à la fin de la procédure et prélèvements des tumeurs et des organes pour analyse.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables attendus dans ce projet sont : i) le risque infectieux et la sensation de douleur, conséquence potentiel de la pose d’implants d’œstrogènes nécessaire au développement préalable des glandes mammaires avant de pouvoir greffer les cellules cancéreuses. ii) le risque d’une croissance tumorale importante pouvant entrainer dans les cas les plus sérieux : une nécrose des tissus (peu probable d’après notre expérience sur le modèle), des difficultés de mobilité, ou encore une perte de poids. iii) le stress et le risque de lésion au niveau de la queue ou de la tumeur suite aux injections des nanomatériaux par voie intraveineuse ou intra-tumorale. iv) les risques liés aux anesthésies (hypothermie, hypoventilation, arrêt cardio-respiratoire, etc.) v) le stress potentiel pour les animaux lors du transport des animaux sur un autre site en vue de l’imagerie.

Devenir

A la fin des différents actes et de la période de maintien prévu, l’ensemble des animaux (n=374) sont euthanasiés par une méthode réglementaire en vue de réaliser les différents prélèvements. Les tumeurs et les organes seront récupérés et analysés.

Remplacement

Les études in vitro déjà menées ont permis de sélectionner/affiner au mieux les conditions expérimentales du projet afin de réduire au maximum le nombre d’animaux impliqués dans cette étude. En effet, cette étude doit être conduite in vivo car celle-ci prend en considération la tumeur, son environnement ainsi que l’ensemble des interactions mises en jeu. Ainsi, il n’y a pas de modèles alternatifs au modèle animal permettant de recréer l’ensemble des acteurs impliqués dans le développement tumoral et l’action des traitements proposés. Nous avons besoin d’un modèle qui mime ce qui se passe en clinique chez les patients traités. Travailler sur des cellules en culture cellulaire ne permet pas de répondre à ce que sera l’efficacité d’un médicament sur une tumeur en trois dimensions et avec son microenvironnement. C’est pourquoi, le modèle de xénogreffe chez la souris permet de créer un modèle d’étude qui se rapproche de celui observé chez les patients.

Réduction

Le projet impliquera un total de 374 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Notre procédure expérimentale a été affinée pour éviter l'utilisation inutile de souris. Une étude pilote sur 20 animaux permettra d’optimiser les conditions expérimentales en validant le modèle murin ayant le meilleur taux de prise de greffe permettant par la suite de réduire la taille des groupes (moins de variabilité). L’étude de biodistribution sera réalisée sur des groupes de 3 souris maximum. Enfin, chaque groupe de traitement comportera 10 souris au total. Par ailleurs, l'analyse statistique sera réalisée avec les tests adaptés. Pour ce faire, nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.).

Choix des espèces

Justification de l’espèce : La souris est un mammifère comme l’Homme, la souris Nude est l’un des rares modèles permettant de créer des xénogreffes de tumeurs humaines sans qu’il n’y ait de rejet du non-soi (modèle immunodéficient). Enfin, la réglementation demande à ce que tout développement de médicaments soit testé chez deux modèles animaux différents avant toute administration chez l’humain. La souris est le modèle le plus utilisé en première ligne et il permet d’acquérir un grand nombre d’information dans un temps relativement court. Description du ou des modèle(s) : Nous utiliserons des souris Nude qui présentent une mutation de leur système immunitaire. Les souris peuvent ainsi recevoir des cellules d’une autre espèce (l’homme dans le cas présent), et il n’y aura pas de réaction du non-soi, les cellules injectées pourront alors pousser sans être rejetées. Le choix de la souche de souris Nude sera effectué à la suite d’une étude pilote nécessaires pour optimiser les conditions de prise des xénogreffes et donc de réduire le nombre d’animaux nécessaire au projet. Justification du stade de développement : Livraison des animaux âgés de 4 semaines. Début de l’expérimentation après deux semaines d’acclimatation soit à 6 semaines ; ce stade est couramment utilisé dans la littérature ce qui nous permettra de comparer nos résultats avec les données publiées.

420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques humaines ou murines par injection dans le sang ou dans l'œil, une partie étant irradiée aux rayons X, puis subissent jusqu'à sept prélèvements sanguins au niveau de l'œil. Le porteur décrit le développement d'une tumeur chez la plupart des animaux, avec perte d'appétit, de poids et de sociabilité. Il justifie l'usage de la souris par l'absence de culture des cellules de leucémie hors de l'animal et conclut qu'il n'existe aucune alternative.

Objectifs

Les leucémies aiguës lymphoblastiques T (LAL-T) sont des hémopathies malignes induites par la prolifération anormale et incontrôlée de progéniteurs lymphoïdes T. Malgré l’amélioration de la prise en charge des LAL, le devenir des patients atteints de LAL-T reste péjoratif avec environ 30% de rechute dans les deux années qui suivent le diagnostic. Ainsi, les défis auxquels nous sommes confrontés dans le domaine des LAL-T sont de mieux comprendre les processus de leucémogenèse afin d’identifier les circuits moléculaires oncogéniques actifs (avec pour objectif, in fine, de les cibler thérapeutiquement) et d’autre part les mécanismes d’acquisition de la chimiorésistance. L’objectif de ce projet est de transplanter des leucémies T primaires humaines ou murines dans des souris receveuses afin de rendre possible des expériences de recherche fondamentale nécessitant des cellules viables/fraîches. La quantité de cellules leucémiques humaines étant limitée, les xénogreffes (ou PDX = ‘Patient derived xenograft’) permettent de conserver et d’amplifier ces cellules précieuses de LAL-T. De même, la transplantation syngénique de cellules leucémiques murines est un moyen d’amplifier ces cellules et de restreindre le nombre de souris utilisées pour développer les leucémies primaires. De plus, la transplantation syngénique permet d’étudier le rôle du système immunitaire dans la progression tumorale.

Bénéfices attendus

Au cours de ce projet, nous obtiendrons des cellules fraîches de LAL-T qui nous permettront de réaliser diverses études de biologie moléculaire/cellulaire visant à identifier des gènes/circuits moléculaires impliqués dans la leucémogenèse, mais aussi d’étudier l’hétérogénéité intra-tumorale des LAL-T humaines.

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 types d’interventions : injection intraveineuse et prélèvement sanguin. Les injections intraveineuses se feront par voie caudale ou rétro-orbitale, une seule fois dans la vie de l’animal. L’injection rétro-orbitale se fera dans le sinus sous anesthésie courte. Le prélèvement sanguin par voie rétro-orbitale est effectué deux mois après la transplantation des cellules humaines. Il est réalisé sous anesthésie courte. Le nombre de prélèvement sanguin dépend de la LAL-T et de sa capacité à se développer dans la souris immunodéficiente ; selon notre expérience ce nombre est compris entre 1 prélèvement et 7 prélèvements (étalés sur 10 mois). De plus, les animaux transplantés avec un type particulier de LAL-T (LAL-T immatures) subiront une irradiation au préalable via une exposition aux rayons X d'environ 77 secondes.

Impact sur les animaux

La principale nuisance est le développement d’une tumeur chez la plupart des animaux (suite à la transplantation des cellules leucémiques). Le développement tumoral pourra entraîner une perte d’appétit, une perte de poids et une perte de sociabilité de la souris vis-à-vis de ses congénères. Les prises de sang, les anesthésies ainsi que les observations et pesées peuvent représenter une source de stress. De plus, l'irradiation peut entraîner une période de fragilité immunitaire.

Devenir

Les souris greffées seront euthanasiées dès que la prise de greffe est établie.

Remplacement

Les échantillons primaires de patients atteints de LAL-T sont rares et limités (pour certains échantillons nous n’avons qu’une ou deux ampoules de cellules congelées). Or, les cellules de LAL-T (qu’elles soient d’origine humaine ou murine) ne prolifèrent pas ex vivo ; de plus, un protocole de culture dans un système en 3 dimensions, du type organoïde, n’a pas encore été établi pour les LAL-T. Par conséquent, le seul moyen d’amplifier le nombre de cellules est de les transplanter dans un modèle animal. Il est à noter que nous utilisons des techniques novatrices d’analyses moléculaires à l’échelle de la cellule unique qui permettent de diminuer le nombre de cellules nécessaires pour certaines de nos analyses. De plus, nous utilisons des lignées humaines de LAL-T pour tester certaines de nos hypothèses, toutefois les résultats obtenus doivent être validés avec des cellules primaires obtenues grâce à des PDX. Dans la littérature il a été montré que les xénogreffes chez la souris miment la rechute des LAL-T humaines. Outre l’amplification des cellules leucémiques, notre objectif est d’utiliser les PDX afin d’étudier les mécanismes de rechute (les voies dérégulées, l’hétérogénéité intra-tumorale). Ainsi, le modèle animal est crucial pour cette étude et à ce jour, il n’existe aucune alternative.

Réduction

Bien que le recours aux modèles murins soit nécessaire dans notre projet, nous limiterons au maximum le nombre d’animaux. Le nombre minimum d’animaux pour chaque transplantation (5 et 3 souris pour les cellules humaines et murines respectivement) a été défini grâce à la connaissance de nos modèles et notre expérience dans l’approche de transplantation. Ces procédures n’impliquent pas d’étude statistique et donc aucun test statistique n’est utilisé.

Raffinement

Toutes les procédures expérimentales du projet seront réalisées en tenant compte du bien-être animal dans le strict respect des réglementations en vigueur et en étroite collaboration avec la structure du bien-être animal de notre établissement. Une anesthésie générale sera utilisée durant les procédures expérimentales (transplantation et prélèvement sanguin) par du personnel compétent. Durant l’ensemble de l’étude, les souris seront hébergées dans des conditions conformes à la réglementation européenne en vigueur, avec un accès continu à la nourriture et à l’eau. L’hébergement des animaux se fera en confinement adapté pour les lignées murines immunodéprimées (cages ventilées) et maintenu en groupe pour éviter le stress et l’isolement. L’environnement sera enrichi à l’aide de coton, de lanières de papier et éventuellement d’un dôme. L’état de santé des souris sera quotidiennement surveillé par du personnel compétent afin de déceler le plus précocement une altération du bien-être animal. Tout changement dans le comportement ou l’apparition de signes cliniques (perte de poids, posture, isolement, difficulté à se déplacer et à s’alimenter) sera relevé et indexé à la grille d’évaluation de la douleur.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal de choix pour l’étude du système immunitaire et des hémopathies. En effet, des cellules humaines primaires peuvent être transplantées avec succès dans des souris immunodéficientes. Dans ce contexte, la lignée de souris immunodéficiente est le modèle le plus couramment utilisé dans le cadre d’études réalisées à partir de cellules tumorales humaines. Concernant les transplantations murines, nous utiliserons des souris receveuses pour amplifier la tumeur. Le modèle murin est le modèle le plus pertinent pour les expérimentations exposées dans ce projet. Comme nous ne pouvons pas le remplacer, nous réduirons au maximum le nombre de souris utilisées. Nous utiliserons des souris adultes. Le temps nécessaire pour la prise de greffe des cellules leucémiques humaines varie entre 2 mois et ~10 mois ainsi nous privilégierons l’utilisation de souris immunodéficientes âgées entre 4 à 12 semaines. La prise de greffe des leucémies murines est en générale inférieure à 1 mois, donc cette procédure ne nécessite pas d’utiliser des souris jeunes. Les souris pourront être âgées entre 4 semaines et 6 mois. De plus, si cela est possible nous privilégierons l’utilisation de souris ‘replacées’ non utilisées dans les autres projets au sein de notre centre de recherche.

120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur provoque une lésion du muscle par injection de chlorure de baryum et deux prélèvements sanguins au niveau de l'œil, une partie étant des rats porteurs d'une dystrophie musculaire proche de la maladie de Duchenne qui se dégrade jusqu'à la mise à mort. Le porteur indique administrer des analgésiques et présente la thérapie peptidique testée comme dépourvue de toxicité. Il renvoie les bénéfices pour les enfants malades au long terme et affirme que la validation à l'échelle de l'"organisme entier" ne peut se faire in vitro.

Objectifs

La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie rare qui est causée par différentes mutations qui peuvent survenir tout au long du gène de la dystrophine porté par le chromosome X. La myopathie est rapidement invalidante.notamment avec la perte de la marche à un âge médian de 10 ans. L'atteinte des muscles respiratoires et du muscle cardiaque entraine une insuffisance cardiorespiratoire fatale à l'âge médian de 20 ans. Il n'existe à ce jour aucune thérapie curative. Cependant, le traitement par les glucocorticoïdes, largement répandu chez les enfants, permet de retarder significativement la perte de la marche et le décès d'environ 2 à 8 ans, avec le désavantage de provoquer un grand nombre d’effets secondaires qui dégradent la qualité de vie des patients. L'absence de dystrophine dans les cellules cardiaques et les fibres des muscles squelettiques induit une dysfonction et une fragilité puis une rupture des membranes cellulaires, soumises à des forces d'étirement lors des cycles de contraction/relâchement. Il s'ensuit une mort des fibres musculaires à l'origine de la perte de force musculaire et une série de mécanismes secondaires délétères tels que l'inflammation chronique et la fibrose (remplacement du tissu musculaire par du tissu fibreux non contractile). Cette combinaison d’évènements empêche les cellules souches musculaires de réparer durablement le muscle.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet vise à obtenir des données robustes démontrant le bénéfice du traitement avec un peptide candidat sur les capacités régénératives du muscle compromises dans le modèle original du rat DMD. Ce peptide est un nouvel acteur dans la gestion de la progression de la DMD grâce à son nouveau mécanisme d'action. Il permet de rééquilibrer la balance vers la regénération aux dépens de l’inflammation dans les muscles atteints par la maladie. Plus particulièrement, il devrait améliorer la contribution des cellules souches du muscle à la réparation musculaire. Ce traitement devrait donc permettre de bénéficier simultanément de différentes propriétés thérapeutiques sans les effets indésirables des corticoïdes actuellement utilisés dans le traitement de la DMD pour contrer l’inflammation. En cas de bénéfice évident chez les rats, les données précliniques produites seront un argument fort pour accélérer le financement des essais cliniques chez les enfants atteints de DMD. A long terme, le bénéfice attendu est une amélioration de la qualité et de l'espérance de vie des enfants atteints de DMD. La diminution de la dégénérescence musculaire, aussi bien au niveau des muscles squelettiques qu’au niveau du coeur, retarderait la progression de la maladie et pourrait même prévenir la perte de la marche et l'insuffisance respiratoire ou cardiaque fatale. Cette thérapie est conçue en particulier pour remplacer les glucocorticoïdes en récapitulant ou en augmentant leurs effets bénéfiques, tout en annulant leurs effets secondaires. Nous prévoyons également une étude comparative avec les glucocorticoides seuls ou en combinaison avec le peptide étudié afin de vérifier ses effets et de voir un potentiel effet conjugué des deux traitements. Le but est également de permettre d’obtenir un terrain favorable aux thérapies curatives ultérieures.

Procédures

Les animaux seront prélevés au sinus rétro-orbital 2 fois. Chaque prélèvement dure moins de 2 minutes, réalisé par une personne très expérimentée. Avant ce prélèvement, l'animal est anesthésié par voie générale et locale et reçoit en plus un traitement anti-douleur injectable. La procédure d’induction de la blessure du muscle tibial antérieur sera réalisée sous anesthésie générale et induite par l'injection intramusculaire d'un produit chimique après un traitement anti-douleur local. Cet acte nécessitera moins de 5 minutes. Les animaux seront ensuite réveillés et traités avec un anti-douleur injectable toutes les 8h pendant 2 jours au minimum et jusqu’à la mise à mort en cas de signe de douleur après ces deux jours. Il n'y a pas de chirurgie prévue.

Impact sur les animaux

La lésion musculaire induite par le chlorure de baryum provoque la mort des cellules musculaires qui entraine une sensibilité excessive d'origine inflammatoire. Nous connnaissons bien les conséquences de ce processus temporaire et avons anticipé toute forme de ressenti de la douleur par les injections de buprénorphine, très efficace par expérience sur ce type de procédure. Les rats DMD développent spontanément une dystrophie musculaire caractérisée par une perte significative et progressive de masse corporelle à partir de l'âge de 4 semaines. La perte de masse musculaire cause une faiblesse musculaire et une difficulté croissante à se mouvoir. Le fonctionnement du cœur et du diaphragme est également progressivement altéré, ce qui conduit à une déficience cardiorespiratoire progressive. Ces défaillances combinées conduisent à la nécessité d'une mise à mort compassionnelle entre 6 et 13 mois d'âge. Nous connaissons bien cette évolution de la maladie ce qui garantit une surveillance très rigoureuse et rapprochée des animaux. Une zootechnicienne est dédiée à cette surveillance. Les procédures de ce projet n’incluent que des animaux jeunes chez lesquels les nuisances de l'évolution spontanée de la maladie sont faibles et ne semblent pas, en milieu confiné, poser de problèmes particuliers. En ce qui concerne le traitement, il n'est attendu aucun effet indésirable majeur à la suite de l'injection du peptide étudié. En effet, il est reconnu que la thérapie par peptide présente l'intérêt majeur de ne pas produire de toxicité. Pour ce qui est du traitement avec le Déflazacort (anti-inflammatoire), sur la durée de traitement envisagée, nous n’attendons pas d’effet indésirable majeur mais nous serons particulièrement attentifs à la possible perte de poids observée précédemment avec d'autres molécules de la même famille.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires nécessaires.

Remplacement

Le peptide extracellulaire utilisé a été identifié comme une protéine cible de médicaments dans de nombreuses maladies, en particulier dans les troubles associés à l'inflammation. Le tests in vitro ont démontré son efficacité sur la prolifération cellulaire cependant la validation à l'echelle de l'organe ou de l'organisme entier ne peuvent être reproduit in vitro. Le traitement avec une forme ameliorée de cette protéine lors d’une lésion musculaire chez la souris, favorise la guérison du tissu en induisant la prolifération des cellules souches musculaires et en mobilisant les macrophages sans accentuer dramatiquement l'inflammation. Sur la base de ces résultats préliminaires, nous souhaitons avec ce projet valider les effets d’un traitement avec ce peptide chez le rat DMD qui représente une modèle plus robuste de la dystrophie musculaire de Duchenne que le modèle souris mdx couramment utilisé.

Réduction

Le modèle de rats DMD est maintenant bien caractérisé et reproduit de façon très similaire le développement de la pathologie humaine. Les calculs de puissance statistique recommandent d'utiliser 8 rats par groupe, ce qui a été validé avec d'autres projets terminés utilisants des candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). La correction des données avant analyse statistique a été optimisée et adaptée à chaque type de comparaison, selon des critères stricts admis par la communauté scientifique. En raison du nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sauvages (wild type, WT) et DMD traités avec un placebo ou le diluant du produit à tester, nous avons accumulé de nombreuses données qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères sauvages. Il a donc été possible ici de ne pas inclure d'animaux WT, sans perte d'information biologique de référence.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont température et hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la réglementation. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à 7 ou 8 ratons par cage à l'âge d'un mois. L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur arrivée à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice et en cas d'absence de bénéfice (évolution irréversible), nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l'humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de l'homme constitue un modèle apprécié. Les outils récents d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Le modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle emblématique de la souris mdx, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle canin. Pour la procédure de lésion musculaire induite, nous utiliserons des rats sauvages de 10 semaines puisqu'il s'agit ici de tester l'effet du composé sur la régénération musculaire dans un modèle de lésion induite bien calibré dans notre laboratoire. Pours les procédures de traitement avec les corticoides seuls ou en combinaison avec le composé à tester, nous utiliserons des animaux DMD à l'âge de 10 semaines. Notre étude de caractérisation du modèle rat DMD ainsi que les résultats in vitro montrent que la fibrose musculaire (remplacement du tissu musculaire par du tissu fibreux) est significativement augmentée et quantifiable dès l’âge de 3 semaines. Le démarrage du traitement à 10 semaines permettra d’évaluer la capacité du composé testé à réduire l’endommagement musculaire et par conséquent, à différer l’installation progressive de la fibrose et ses conséquences fonctionnelles sur les muscles.

369 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 290 tuées à l'issue et 79 gardées vivantes pour être réutilisées. Elles subissent un décalage horaire imposé pendant trois semaines, des frottis vaginaux répétés jusqu'à treize semaines et jusqu'à neuf microprélèvements de sang par jour à la queue pendant une quinzaine de jours, pour étudier l'effet d'un rythme de travail posté sur la fertilité. Le porteur décrit une irritation vaginale et une douleur modérée liée à l'incision de la queue. Il affirme que l'étude de ces mécanismes exige des "organismes entiers vivants" et ne peut se faire sur des cellules isolées.

Objectifs

La rythmicité journalière est très importante dans la régulation des fonctions biologiques. Cette rythmicité est dépendante d'une horloge endogène principale, essentiellement synchronisée par l'alternance lumière/obscurité. Chez les mammifères femelles, la fonction de reproduction présente des cycles dont la régularité repose sur ce système circadien. Ainsi, le pic préovulatoire de l'hormone lutéinisante (LH), qui déclenche l'ovulation, dépend du signal journalier généré par l’horloge endogène, en plus du rétrocontrôle positif de l’estrogène produit par les follicules ovariens matures, ce qui permet à l'ovulation d'avoir lieu au moment le plus favorable au succès reproducteur. Dans ce contexte, la désynchronisation de l’horloge biologique, induite par des altérations chroniques du cycle lumière/obscurité, a un impact négatif sur la fonction de reproduction. Il a été récemment mis en évidence qu’un protocole de décalage horaire chronique sur plusieurs semaines, mimant les horaires d’une personne en travail posté, conduit à une altération de l’occurrence du pic préovulatoire de LH et à une diminution de la fertilité chez les souris femelles. Ce projet a pour objectif de comprendre comment un décalage horaire chronique comme celui observé chez les femmes en travail posté, perturbe la transmission de l'information journalière de l'horloge principale vers l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique, conduisant alors à une altération de la fonction de reproduction et de la fertilité.

Bénéfices attendus

A court terme, les conclusions de ce projet permettront de mieux comprendre les mécanismes neuroendocriniens impliqués dans la régulation de la fonction de reproduction par le système circadien et comment ils sont altérés par une perturbation du cycle lumière/obscurité chez la souris femelle. A plus long terme, cette étude permettra d'ouvrir la voie à l'élaboration de recommandations pour limiter les effets néfastes de la perturbation du rythme circadien sur la fertilité des femmes dans le cadre du travail posté.

Procédures

Les animaux pourront être soumis à un décalage horaire chronique pendant 3 semaines, à un ou deux frottis vaginaux par jour, d'une durée d'environ 30 secondes chacun, au maximum pendant 13 semaines et à 9 microprélèvements sanguins à la queue par jour, d'une durée d'environ 30 secondes chacun, pendant une quinzaine de jours.

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables pouvant être attendu sur les animaux est un stress dû à la perturbation du cycle lumière/obscurité et donc veille/sommeil induite par des avances et des retards successifs de la phase obscure, ayant pour but de mimer un décalage horaire chronique. Un stress peut aussi être induit par la manipulation des animaux au cours de la réalisation des frottis vaginaux et des microprélèvements sanguins à la queue. L'isolement des femelles gestantes peut également être une source de stress. Une irritation modérée de l'orifice vaginale due au frottis vaginaux répétés, ainsi qu'une douleur modérée due à l'incision de l'extrémité distale de la queue pour réaliser des microprélèvements de sang sont d'autres effets indésirables pouvant être attendus sur les animaux.

Devenir

Pour répondre aux questions scientifiques posées, il est nécessaire de mettre à mort 290 animaux. 79 animaux seront gardés en vie pour être réutilisés dans d'autres procédures expérimentales, sinon ils seront mis à mort.

Remplacement

Ce projet est une étude de physiologie intégrée per se. La régulation de l'activité de reproduction est un mécanisme qui fait intervenir plusieurs structures nerveuses et endocrines. L'étude des relations entre ces différents acteurs nécessite l'utilisation d'organismes entiers vivants et ne peut pas se faire sur des organes ou des cellules isolés.

Réduction

Pour chaque procédure expérimentale, le nombre d'animaux par groupe a été réduit au maximum en tenant compte des variabilités interindividuelles et des règles statistiques en vigueur, nous permettant d'obtenir des résultats fiables et robustes. Ces résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques appropriés. De plus, dès que l'expérience s'y prête, un suivi longitudinal de la variable étudié a été privilégié. C'est-à-dire que le même animal sera suivi pour cette variable sur plusieurs jours voir plusieurs semaines, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux nécessaire.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes sociaux ou seront isolées, en fonction des contraintes des protocoles expérimentaux. Pour limiter le stress des animaux, les cages seront enrichies avec un bâton à ronger, du matériel pour la nidification (morceaux de coton) et un tunnel. Ce même tunnel sera utilisé pour déplacer la souris lors du change ou pour la capturer afin d’éviter la préhension par la queue. Après leur arrivée à l'animalerie, les souris auront une semaine pour s'habituer à leur nouvel environnement, sans manipulation. Puis, elles seront manipulées quotidiennement pendant 2 semaines avant le début des procédures expérimentales. Des points limites ont également été établis pour identifier les animaux en souffrance et pouvoir les soustraire à cette souffrance.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi pour ce projet est la souris car le fonctionnement de son axe reproducteur est bien connu et présente un cycle régulier d’ovulation spontanée comparable à celui de la femme. Pour répondre aux questions scientifiques posées, nous utiliserons des jeunes adultes afin d’étudier le fonctionnement de l'axe reproducteur mature et non sénescent ainsi que des souris nouveau-nées afin d'étudier le développement de l’axe reproducteur et métabolique.