Recherche fondamentale
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Rôles des macrophages périvasculaires dans la physiopathologie des événements hémorragiques dans un modèle d’hyperglycémie
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
272 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une ischémie cérébrale provoquée, une injection dans le cerveau, la pose d'un cathéter, des séances d'IRM sous anesthésie et des prélèvements de sang répétés à la queue, une hyperglycémie étant induite par injections de streptozotocine, pour étudier le rôle de certaines cellules dans les hémorragies cérébrales après un AVC. Le porteur mentionne un déficit moteur ou cognitif possible et un test comportemental dont il ne précise pas la nature. Les retombées pour les patients sont renvoyées à un horizon lointain, et le porteur affirme que les méthodes sans animaux n'apporteraient pas le même niveau d'information.
Objectifs
Les transformations hémorragiques (HT) sont des complications fréquentes chez les patients victimes d'un accident vasculaire cérébral ischémique (AVC). Elles se produisent lorsque le sang traverse la barrière hémato encéphalique (BHE) lésée et pénètre dans le cerveau après un AVC. Une hyperglycémie est présente chez environ 28 à 40 % des patients souffrant d'un AVC. Le plus souvent, cette hyperglycémie est la cause d'un diabète pré-existant chez le patient. Or, l'hyperglycémie augmente le risque de HT ce qui est associé à une aggravation de l'issue de l'AVC et une augmentation de la mortalité. En effet, l'hyperglycémie potentialise l'inflammation, et entraîne une augmentation de la perméabilité de la BHE et donc une augmentation des HT. Les vaisseaux sanguins du cerveau sont entourés d’un compartiment périvasculaire rempli de liquide céphalo-rachidien (LCR) nommé espace périvasculaire. Au sein de cet espace, on retrouve une population cellulaire spécifique : les macrophages périvasculaires (PVM). Les PVM participent à la BHE. De par leur localisation, ces cellules sont à l’interface entre le compartiment vasculaire et le cerveau. Cependant, le rôle des PVM dans les maladies cérébrovasculaires reste à ce jour peu étudié et d'autant plus dans des conditions avec comorbidité. Ce projet vise donc à caractériser le rôle des PVM dans la physiopathologie des HT en présence d'un facteur de comorbidité qu'est l'hyperglycémie. Notre hypothèse, basée sur les études précédentes et sur la localisation privilégiée des PVM à l’interface entre le compartiment vasculaire et le parenchyme cérébral, est que les PVM pourraient jouer un rôle déterminant dans les HT et pourraient être affectés par l'hyperglycémie. Pour ceci, nous disposons au sein du laboratoire d'une technique permettant de dépléter spécifiquement les PVM dans les espaces périvasculaires ce qui permet ainsi d'étudier leurs rôles.
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension de l'implication des macrophages périvasculaires dans les transformations hémorragiques, et notamment dans un contexte de comorbidité, permettra une meilleure compréhension de ce phénomène et à terme, une meilleure prises en charge des patients victimes d'un AVC.
Procédures
#Procédure 1 et 2 : Injection intrapéritonéale (30 sec/injection) sur animaux vigiles en contention de J0 à J5 (males), J0 à J6 (femelles). Procédures chirugicales : Injection intracérébroventriculaire (30 min) à J16 (males), J17 (femelles), modèle d'ischémie thromboembolique cérébrale focale et pose d'un cathéter veineux (40min) à J21 (males), J22 (femelles). Evaluation des transformations hémorragiques à J22 et à J26 (males), J23 et à J27 (femelles) par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) (15 min). Prélèvement d'une goutte de sang au niveau de la queue sur animaux vigiles en contention pour mesure de glycémie aux jours J0, J5, J10, J14, J16, J21 et J26 (males), J0, J6, J11, J15, J17 , J22 et J27 (femelles) (30sec/prélèvement). Test comportemental aux jours J0, J16, J21, J22, J26 (males), J0, J16, J21, J22, J26 (femelles) (1 min). #Procédure 3 et 4 : Injection intrapéritonéale (30 sec/injection) sur animaux vigiles en contention de J0 à J5 (males), J0 à J6 (femelles). Procédures chirugicales : Injection intracérébroventriculaire (30 min) à J16 (males), J17 (femelles), modèle de transformation hémorragiques (35min) à J21 (males), J22 (femelles). Evaluation des transformations hémorragiques à J22 et à J26 (males), J23 et J27 (femelles) par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) (11 min). Prélèvement d'une goutte de sang au niveau de la queue sur animaux vigiles en contention pour mesure de glycémie aux jours J0, J5, J10, J14, J16 , J21 et J26 (males), J0, J6, J11, J15, J17, J22 et J27 (femelles) (30sec/prélèvement). Test comportemental aux jours J0, J16, J21, J22, J26 (males), J0, J16, J21, J22, J26 (femelles) (1 min).
Impact sur les animaux
Les nuissances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont du stress lié à la contention (test fonctionnel, prélèvements sanguins), l'induction et le maintient de l'anesthésie (imagerie IRM, procédures chirurgicales). Des douleurs eventuelles liées à la chirugie (pose de cathéter, injection intracérébroventriculaire, ischémie thromboembolique), un déficit moteur ou cognitif (ischémie thromboembolique). De plus le modèle d'hyperglycémie via injection multiple de streptozotocine peut entrainer de la glucosurie, de la polyurie, de la polydipsie.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de récupérer les tissus pour réaliser des analyses immunohistochimiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est, avec le rat, l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA (activateur tissulaire du plasminogène) au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés, la littérature et un test de puissance statistique. L’utilisation d’outils d’imagerie non invasive (IRM) permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisé.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure chirurgicale. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Une habituation aux gestes et dispositifs de contention sera réalisée au préalable afin de réduire le stress des animaux lors de ces manipulations. Le réveil des animaux post-chirurgie se fera au calme, dans une enceinte chauffée ventillée individuelle avant leur retour dans la cage. Les souris seront pesées et acclimatées pendant une heure dans la pièce expérimentale et placées dans une armoire chauffée ventilée. Un suivi strict et rapproché des animaux, une évaluation de la douleur basée sur le grimace scale, une couverture analgésique suffisante en période pré et post opératoire, un accès facilité à la nourriture sera mis en place. Du fait des effets indésirables induit par l'hyperglycémie, une attention particulière sera portée sur l'hydratation (turgescence cutanée) et l'hygiène de la cage des animaux avec des changements de biberons et de cages plus fréquement.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences vasculaires. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’humain. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont identiques chez l’humain et la souris. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier le rôle des PVM dans les HT dans le cadre d'une hyperglycémie. Les souris Swiss utilisées dans cette étude seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de l'AVC.
Etude de l’oncogenèse des leucémies aiguës lymphoblastiques T (LAL-T)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées légères à modérées. Les souris rendues déficientes pour le gène PTEN développent une leucémie vers onze semaines et sont euthanasiées dès les premiers signes, tandis qu'environ 75 % des animaux générés, dépourvus du génotype recherché, sont tués sans être utilisés. Chaque souris subit une biopsie de la queue et un baguage de l'oreille pour le génotypage, le développement tumoral pouvant entraîner perte d'appétit, de poids et de sociabilité. Le porteur affirme qu'aucune alternative n'existe pour modéliser la leucémogenèse et conclut au caractère "crucial" du modèle murin.
Objectifs
Les leucémies aiguës lymphoblastiques T (LAL-T) sont des hémopathies induites par la prolifération anormale et incontrôlée de cellules lymphoïdes T immatures. Le devenir des patients atteints de LAL-T reste mauvais avec environ 30% de rechute dans les deux ans suivant le diagnostic. Un des défis dans ce domaine est donc d’améliorer la prise en charge thérapeutique de ces patients et cela passe notamment par une recherche fondamentale qui vise à mieux définir les circuits moléculaires oncogéniques responsables de la pathogenèse (avec pour objectif, in fine, de cibler thérapeutiquement ces circuits). Dans ce contexte, le but de ce projet est de mieux comprendre l’oncogenèse des LAL-T en utilisant des modèles murins. Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées permettant de mimer les LAL-T humaines. Nous nous focaliserons sur le gène PTEN qui est déficient dans environ 20% des LAL-T humaines. Ainsi, les objectifs de ce projet seront de 1°) générer des souris PTEN-déficientes (ces souris développent des LAL-T vers l’âge de 11 semaines); 2°) d’analyser par des technologies de biologie cellulaire et moléculaire différents organes des souris PTEN-déficientes tels que le thymus (organe dans lequel la leucémie se développe) et la rate (organe envahi par les cellules leucémiques). Les souris PTEN-déficientes seront disséquées à différents âges (entre 4 et 11 semaines) ce qui nous permettra d’analyser les stades pré-leucémiques (absence de signes cliniques) et d’étudier les étapes de transformation tumorale.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de suivre les processus de leucémogenèse. Nous pourrons analyser des souris aux étapes pré-leucémiques (absence de signes cliniques), ces étapes sont impossibles à étudier avec les échantillons humains. Le modèle murin de LAL-T nous permet également de maîtriser certaines voies telles que la signalisation du récepteur antigénique des cellules T (TCR). Dans ce contexte les souris PTEN-déficientes seront croisées avec des souris exprimant un TCR transgénique d’intérêt. Notre projet contribuera à une meilleure compréhension du processus de leucémogenèse des lymphocytes T et potentiellement il mettra en lumière de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Les souris seront génotypées, pour cela une biopsie de queue sera réalisée ainsi qu'une identification à l'oreille (bague). La durée du prélèvement caudale est de l’ordre de 5 secondes. Le génotypage sera réalisé une fois dans la vie de l'animal à l'âge de trois semaines.
Impact sur les animaux
Toutes les souris seront soumises à une biopsie caudale entrainant une nuisance sur les animaux. De plus, une partie des souris développeront une leucémie T. Dans le cadre du génotypage, toutes les souris subiront une biopsie de queue ainsi qu’un baguage à l’oreille (afin de les identifier). Grâce à ce génotypage nous saurons précisément quelles sont les souris qui seront leucémiques et nous pourrons les surveiller en conséquence. Dès 10-11 semaines, les animaux seront soumis à des observations et pesées à une fréquence adaptée, qui peuvent être source de stress. Le développement tumoral pourra entraîner une perte d’appétit, une perte de poids et une perte de sociabilité vis-à-vis de ses congénères. De manière générale, nous prendrons le soin d’évaluer l’apparition des signes de la douleur des animaux grâce à la grille d’évaluation de la douleur/points limites fournie en annexe 1.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure. En effet, les souris de génotype homozygote (PTEN-déficientes) développeront une tumeur et seront euthanasiées avant ou dès l’observation des premiers signes cliniques afin de leur éviter une souffrance. Notre procédure impose l’utilisation de souris hétérozygotes pour nos accouplements (car les femelles homozygotes tomberaient malade en cours de gestation). Par conséquent la majorité des animaux générés (environ 75%) ne possèdera pas le génotype d’intérêt, ne développera pas de tumeur et ne sera pas utilisés dans notre étude ; donc ces animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Il n’existe à ce jour aucune alternative à l’expérimentation animale lorsqu’il s’agit de modéliser le processus complexe de leucémogénèse. Le modèle murin est donc crucial pour cette étude.
Réduction
Le nombre d’animaux impliqué dans ce projet a été déterminé en fonction du nombre de portées générées. Nous estimons obtenir pour chaque souche 16 portées (d’environ 6 bébés) par an (donc 96 souris). Ainsi 96 souris x 3 souches x 5 ans (durée du projet) généreront au final 1440 souris. De plus, nous limiterons le nombre d'animaux: 1) En réalisant seulement 4 accouplements par an pour chaque souche, ce qui permet d’obtenir un nombre suffisant de souris d’intérêt, car selon la loi Mendélienne, 25% des souris générées posséderont le génotype d’intérêt. 2) En utilisant les deux sexes pour nos expériences de biologie moléculaire et cellulaires. 3) En utilisant les souris ayant un génotype sauvage en tant que contrôles dans nos expériences.
Raffinement
Toutes les procédures expérimentales du projet seront réalisées en tenant compte du bien-être animal dans le strict respect des réglementations en vigueur et en étroite collaboration avec la structure du bien-être animal de notre établissement. L’ensemble de l’étude, les souris seront hébergées dans des conditions conformes à la réglementation européenne en vigueur (environnement contrôlé : température 20-22°C, renouvellement d’air : 15 volumes/heure, éclairage artificiel lumière avec un cycle de 12h), avec un accès continu à la nourriture et à l’eau. Le nombre d’animaux adultes par cage sera au maximum de 5. L’environnement sera enrichi à l’aide de coton, de lanières de papier et éventuellement d’un dôme. L’état de santé des souris sera quotidiennement surveillé par du personnel compétent afin de déceler le plus précocement une altération du bien- être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score spécifique. En fonction des scores obtenus, nous faciliterons l’accès à la nourriture en positionnant les croquettes dans le fond de la cage. De plus, nous avons établi des points limites : si les animaux les atteignent, ils seront euthanasiés ce qui mettra fin à la procédure.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour l’étude du système immunitaire et des hémopathies. Par ailleurs, la communauté scientifique possède un large spectre de souris mutantes que nous pouvons utiliser dans le cadre de notre projet visant à décrypter l’oncogenèse des LAL-T. Dans ce contexte, le modèle murin est le modèle le plus pertinent pour suivre les processus de leucémogenèse. Dans notre projet nous utilisons des souris dans lesquelles le gène PTEN a été inactivé (souris appelées Ptendel dans notre projet). Nous analyserons des souris adultes, âgées entre 1 mois et environ 3 mois, car notre but est d’étudier des souris à différents stades de la leucémogenèse (de pré-leucémique à leucémique).
Thérapie génique innovante pour la gestion de la spasticité après lésion médullaire
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
679 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sévères. Chaque animal subit une section complète de la moelle épinière, chez le nouveau-né comme chez l'adulte, pour induire une spasticité, puis des injections que le porteur pratique sans analgésie au motif que l'animal "ne ressent plus rien" sous la lésion. Il décrit chez les adultes des troubles urinaires persistants imposant une vidange manuelle de la vessie, un risque d'infection et de mutilation, et chez les nouveau-nés un risque de cannibalisme maternel envers les petits blessés. Le porteur affirme que le modèle murin lésé reste "indispensable" faute d'exploration fonctionnelle directe possible chez l'humain.
Objectifs
L'objectif principal de cette étude est de trouver un traitement efficace pour réduire la spasticité. La spasticité est un trouble moteur qui survient tardivement après une lésion de la moelle épinière. Elle se manifeste par une forte résistance musculaire à l’étirement, en raison d'une hyperexcitabilité du réseau de neurones qui connecte le muscle. Elle s’accompagne souvent de spasmes (mouvements involontaires) et d’une hypersensibilité à des stimuli sensoriels normalement bénins. Ce que l'on constate au niveau cellulaire, c'est une excitabilité anormalement élevée des neurones moteurs (MNs). Toutefois, les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables de cela ne sont pas élucidés. Des travaux récents ont montré l'implication d'une famille de protéines présente à la surface des MNs, dans ce phénomène. Leur présence est fortement diminuée après la lésion de la moelle épinière, conduisant à une plus grande excitabilité du neurone et contribuant à l'apparition de la spasticité. En tentant de générer de nouvelles protéines à la surface du neurone grâce à l'outil génétique et en faisant une étude approfondie des mécanismes mis en jeu d'un point de vue fonctionnel et structurel, ce projet a pour but de diminuer la spasticité du réseau neuronal contrôlant la locomotion.
Bénéfices attendus
La complémentarité des procédures employées dans ce projet offrira une meilleure compréhension des mécanismes responsables du déséquilibre entre excitation/inhibition au sein du réseau moteur sous-lésionnel. En ciblant spécifiquement ces protéines par l'outil génétique sur le modèle murin, ces études approfondies fourniront des données solides pouvant être transposées à la recherche clinique. En effet, ce travail proposera des outils thérapeutiques innovants pour répondre précisément aux besoins des patients souffrant de spasticité, car à l'heure actuelle le choix médicamenteux est très restreint avec beaucoup d'effets secondaires indésirables, et avec une efficacité éphémère. Ce projet pourra bénéficier à l'ensemble de la communauté biomédicale travaillant sur la spasticité.
Procédures
Une lésion de la moelle épinière sera réalisée sous anesthésie générale sur l'ensemble des animaux de ce projet (durée intervention 5-8min sur nouveau-né, 30min chez animal adulte) suivie d'une seule injection d'un composé potentiellement thérapeutique dans la patte postérieure gauche et droite de chaque animal (durée de l'intervention 5min). Le mode d'injection intrathécale juste au-dessus de la surface de la moelle épinière est envisagé en alternative de l'injection en intramusculaire chez l'animal adulte (durée de l'intervention 10min sous anesthésie générale). Une implantation d'électrodes sera faite sur les souris adultes sous anesthésie gazeuse (durée de l'intervention 30min). Une fois lésés, les animaux ne ressentent plus la douleur dans leur arrière train donc toute injection dans la cavité du péritoine (durée intervention 1min) se fera sans analgésie préalable aussi bien chez la souris nouveau née que chez la souris adulte. Chez les jeunes souris cette injection sera faite soit une fois par jour sur une période de 7 jours, à partir du sixième jour après la naissance (noté P6), soit 2 jours consécutifs à P6/P7, à P13/P14 et à P20/P21. Ches les souris adultes les injections se feront juste avant les expérimentations. Des enregistrements électromyographiques (EMG) des muscles de la patte postérieure avec l'animal en contention sans analgésie préalable (car l'animal ne ressent plus rien en dessous de la lésion) et des vidéos de l'animal pour observer son comportement seront faits.
Impact sur les animaux
Afin d'induire une hyperexcitabilité de la moelle épinière et des symptômes de spasticité, nous procédons à une lésion complète de la moelle épinière chez les souris, tant néonatale qu'adulte. Suite à cette intervention les symptômes de la spasticité se manifestent quelques jours seulement après la lésion chez les jeunes souris. En revanche, chez les souris adultes, ces symptômes apparaissent après plusieurs semaines. Bien que les souris opérées pendant leur période néonatale retrouvent spontanément une récupération satisfaisante de la vessie, celles opérées à l'âge adulte montrent des troubles de la vessie plus persistants, nécessitant une vidange manuelle jusqu’à la restauration complète de la fonction urinaire (généralement trois semaines après la lésion). Une autre conséquence de la chirurgie peut être l’émergence de la douleur. Suite à l’intervention, une perte de poids (10%) peut être observée. Chez les souris adultes des risques d'infections urinaires sont à prévoir ainsi qu'un risque de mutilation. L'isolement des animaux adultes opérés qui est nécessaire le temps de la cicatrisation du site d'incision, peut induire du stress. Les manipulations et les changements de lieux, des animaux pour les enregistrements electromyographiques et vidéos peuvent également engendrer du stress.
Devenir
Les animaux participant à la procédure 1 (21 souris) seront euthanasiés à la fin de celle-ci, car ils ne pourront pas être réutilisés pour d'autres expériences. Quant aux animaux participant aux procédures 2, 3 et 4 (658 souris), ils seront également euthanasiés et leurs tissus seront prélevés pour une étude approfondie de l'activité et la fonctionnalité des cellules nerveuses mais aussi pour les protéines présentes à leur surface.
Remplacement
Notre projet vise à comprendre et à lutter contre la pathologie du système moteur suite à une lésion de la moelle épinière. Les données préliminaires de ce projet ont été obtenues à partir de lignées cellulaires et de modélisation, ce qui nous a permis de réduire le nombre d'animaux sollicités. Néanmoins, l'expérimentation sur l'animal lésé demeure essentielle, en effet, le modèle de spasticité chez la souris possède les principales caractéristiques de la spasticité chez l'homme. Comme la compréhension de ces mécanismes ne peut être obtenue par une exploration fonctionnelle directe chez l'humain, le modèle murin, reste pour le moment, indispensable. Nous supposons ainsi que l'identification d'un acteur principal dans cette pathologie chez la souris, aurait un potentiel thérapeutique significatif pour l'homme.
Réduction
Ce projet nécessitera un total de 679 animaux lésés. Il s'agit d'une continuation directe des recherches précédemment menées par notre équipe. Cela nous a permis de réduire le nombre d'animaux utilisés. Afin de minimiser davantage ce nombre, les médicaments testés seront administrés en série aux mêmes groupes expérimentaux lors des différentes procédures. À l'exception de la procédure 1, où les animaux seront euthanasiés à la fin, les tissus seront prélevés à la fin des autres procédures pour être utilisés, ce qui permettra de limiter encore le nombre d'animaux. Le nombre de rongeurs par groupe expérimental sera limité à son strict minimum, en tenant compte des contraintes de chaque technique, et les analyses statistiques seront adaptées. L'expérimentateur ne sera pas informé du groupe expérimental afin d'éviter tout biais possible.
Raffinement
Souris nouveau-nées - Les animaux anesthésiés, reçoivent une injection d'analgésique. Une fois opérées, les souris sont maintenues en fratrie et ramenées à la mère. Pour minimiser les épisodes de cannibalisme de la mère envers les nouveau-nés blessés, nous évaluons soigneusement le comportement de la mère en choisissant des femelles plus calmes et sans comportements anxieux. De plus, nous utilisons des friandises autorisées comme récompense pour la mère la semaine précédant la mise bas et la première semaine après la naissance. Nous prenons un soin particulier à enrichir leur cage (rondin de bois,matériel de nidification, tunnel...).Que ce soit pour la chirurgie ou les tests comportementaux, les animaux resteront en contact avec de la litière provenant de leur cage d'origine pour qu'ils soient en présence d'odeurs familières. Tout au long de l’étude, la douleur et/ou la détresse de l’animal seront évaluées 2 à 3 fois par semaine par l’expérimentateur et les zootechniciens, en observant des points limites. Souris adultes - Chez les individus adultes,une injectiond'analgésique sera administrée deux fois dans les 24 heures suivant la lésion de la moelle épinière ou l'implantation des électrodes d'enregistrement. Deux fois par jour, leur vessie sera vidée manuellement jusqu'à la récupération de la fonction urinaire. Leur température et leur hydratation seront également vérifiées, et tout signe clinique de douleur sera surveillé. Une semaine après la lésion, les animaux seront logés par deux par cage, avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures et un accès illimité à la nourriture et à l'eau. De la même manière, l'hébergement sera enrichi à l'aide de rondin de bois et tunnel et de matériel de nidification. Du gel nourrissant sera proposé aux animaux âgés de plus de 15 jours à chaque sortie de leur zone d'hébergement pour les séries d'expérimentation.
Choix des espèces
Le modèle de souris est utilisé dans notre étude car c'est un modèle de spasticité reconnu. Nous supposons que l'identification des mécanismes moléculaires engendrant cette pathologie pourrait avoir un potentiel thérapeutique significatif pour d'autres mammifères, y compris l'homme. La compréhension de ces mécanismes ne peut être obtenue par une exploration fonctionnelle directe chez l'humain, ainsi une grande partie de cette recherche a déjà été menée sur des lignées cellulaires et par modélisation. Néanmoins, l'expérimentation sur l'animal lésé demeure essentielle. Le modèle de spaticité chez la souris juvénile est choisi en première intention car l'apparition de la spasticité est plus rapide (5 à 6 jours) que chez l'adulte (4 semaines). Ce modèle est également compatible avec les investigations fonctionnelle qui font appel à la technique d'électrophysiologie, ce qui n'est pas le cas du modèle de spasticité adulte. Enfin la gestion des animaux opérés est plus simple car c'est essentiellement la mère qui s'en charge. Juste une surveillance accrue des animaux pour déceler une souffrance, ou un comportement anormal relative à la chirurgie est faite par l'expérimentateur et le zootechnicien. Nous avons choisi cette lignée de souris pour les raisons suivantes : (1) les mères de cette souche ont un bon instinct maternel et prennent généralement bien soin des nouveau-nés, y compris ceux qui sont blessés ; (2) les portées sont plus nombreuses que chez les autres souches de souris, avec une moyenne de 12-14 nouveau-nés par portée ; (3) les nouveau-nés sont plus gros à la naissance (poids moyen = 1,6 - 1,8 g), ce qui augmente le taux de survie après une lésion de la moelle épinière. Une partie des animaux sera utilisée à un stade développemental précoce correspondant à la première, deuxième et troisième semaine postnatale. Un autre groupe d’animaux sera étudié à l’âge adulte (procédure 4), afin de valider l'efficacité de cette thérapie génique sur un système mature, mais également pour se rapprocher le plus possible des essais cliniques chez l'homme.
Bases neuronales de l’adaptation comportementale en contexte social et non-social chez le macaque rhésus (EU 1/3)
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
8 macaques rhésus vont être utilisés, dans des procédures classées modérées, avec une réutilisation prévue ou un placement en retraite envisagé selon l'avis vétérinaire. Chaque animal subit deux chirurgies implantatoires, dont une craniotomie de six heures, puis des enregistrements d'électrophysiologie et une stimulation transcrânienne par ultrasons, tête fixée dans une chaise de contention. Le porteur mentionne un protocole de contrôle hydrique pouvant provoquer une sensation de soif et un risque de brûlure superficielle de la peau lié aux ultrasons. Il affirme que les primates non humains sont le "seul choix possible" de modèle, cette recherche fondamentale sur le cortex préfrontal étant présentée comme impossible chez l'humain.
Objectifs
L’adaptation comportementale repose sur plusieurs processus importants: établir la valeur des stimuli de l’environnement, des buts à atteindre et des actions en fonction de l’état interne du sujet, sélectionner un comportement et évaluer ses conséquences. La nécessité d’agir dans un contexte sociale implique la prise en compte d’information relative aux valeurs et intentions d’autres agents biologiques. Notre objectif vise à mieux comprendre les interactions au sein de larges réseaux neuronaux dans la régulation flexible de nos comportements. Ces réseaux sont centrés sur le cortex prefrontal, une region considérée comme une spécificité de l’organisation cérébrale des primates. Pour cela, il est indispensable 1) d’identifier les relations anatomo-fonctionnelles entre les régions du lobe frontal et temporal, 2) d’étudier l’implémentation des mécanismes de l’adaptation comportementale au niveau neuronal et 3) de comprendre le rôle causal de ces différentes structures sur le fonctionnement intégré de ces réseaux. Ceci nécessite une combinaison d’approches d’imagerie et d’électrophysiogie, dont certaines invasives. Les primates non humains sont le seul choix possible de modèle animal, sur la base de critères anatomiques et cognitifs, pour conduire le projet proposé. Ce projet sera réalisé dans 3 étab lissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Une caractéristique de notre survie dans le monde réel est notre capacité à faire preuve d'adaptation comportementale. Les primates en général et les humains en particulier sont très efficaces pour extraire rapidement les signaux informatifs de l'environnement social et non-social, et les intégrer aux conséquences de leurs actions, afin de maintenir ou de modifier si besoin leurs décisions. Ce projet est un projet de recherche fondamentale qui vise à comprendre les mécanismes par lesquels les différentes régions du cortex frontal et temporal interagissent et comment elles contribuent aux comportements adaptifs en contexte social et non social. Le principal bénéfice attendu sera donc l’amélioration des connaissances scientifiques qui découleront de la réalisation des expériences de ce projet. 1. Le projet nous permettra de mieux d’identifier les circuits neuronaux et les mécanismes physiologiques qui supportent l’expression de comportements adaptatifs. 2. Le projet nous permettra de comprendre comment les perturbations de ces interactions préfronto-temporales conduisent à des altérations des processus cognitifs supportant les comportements adaptatifs Des bénéfices secondaires pourraient inclure des hypothèses en recherche clinique dans le domaine de la neuropsychiatrie. 3. Le projet nous permettra de mieux comprendre le couplage neuro-vasculaire Des bénéfices secondaires pourraient inclure une meilleure utilisation translationnelle des données d’électrophysiologie obtenues chez le singe aux données de neuroimagerie obtenues chez l’humain.
Procédures
Les animaux seront soumis à 2 actes chirurgicaux pour permettre la stimulation transcranienne par ultrasons et la collecte des données d'électrophysiologie et d'imagerie chez l'animal vigile. Les chirurgies seront réalisées après entrainement aux tâches comportementales. Une première chirurgie implantatoire permettra de réaliser les procédures de stimulation transcranienne et d'imagerie par résonance magnétique. Ce type de chirurgie dure en moyenne 4h. La seconde chirurgie sera réalisée à l’issue de la collecte des données d’imagerie fonctionnelle dans ces mêmes tâches. Elle est nécessaire pour la réalisation des procédures d'électrophysiologie et d'imagerie par ultrason. Ce type de chirurgie implantatoire nécessite la réalisation d’une craniotomie et sont plus longues (durée moyenne = 6h). Toutes les actes seront réalisés dans l'EU1, sauf la collecte de données CT préalable aux chirurgies qui sera réalisée dans l'EU3, et les chirurgies qui seront réalisées dans l'EU2.
Impact sur les animaux
Au cours du projet, les animaux auront plusieurs anesthésies générales pour les deux neurochirurgies et au moins un examen en neuroimagerie. Les anesthésies sont réalisées pour les différentes formes d'imagerie cérébrale nécessaires au projet, et pour la chirurgie destinée à l'implantation d’une chambre d'enregistrement. L'anesthésie générale provoquera également en elle-même un inconfort au réveil. La chirurgie pourra susciter un inconfort post-opératoire temporaire, normalement maitrisé par l'administration d'analgésique et un suivi rapproché par les expérimentateurs et les zootechniciens. Les marges des implants constituent des zones d’infection potentielle qui seront maitrisés par une surveillance régulière des implants et par l’administration de soins appropriés. Les singes travailleront dans le cadre traditionnel d'un box expérimental. Ils seront assis, ou en position dite du sphinx dans une chaise à primate, la tête fixée par le plot implanté. Les animaux seront formés à cette procédure par renforcement positif, la procédure étant bien établie et plutôt bien tolérée, mais les animaux éprouveront un léger inconfort lors de l’apprentissage de la procédure. Les singes seront formés dans le cadre d'un protocole de contrôle hydrique. Ce protocole est progressivement mis en œuvre et, dans la grande majorité des cas, les animaux reçoivent leur dose normale de liquide. Cependant il est possible pendant l'adaptation au processus, une certaine sensation de soif puisse se manifester entre les sessions. La stimulation ultrasonore peut induire une sensation de gêne lors de son application. Les animaux seront formés à cette procédure par renforcement positif, la procédure étant bien établie et bien tolérée. La stimulation ultrasonore peut induire une brûlure superficielle de la peau. Une modélisation au préalable des variations thermiques engendrées par la stimulation préviendra de cet effet négatif potentiel.
Devenir
La potentielle réutilisation des animaux en fin de protocole sera prise en accord avec la vétérinaire. Si les animaux ne peuvent pas être utilisés, un placement en retraite sera considéré.
Remplacement
Nous proposons d'étudier le fonctionnement des réseaux neuronaux impliqués dans l’adaptation comportementale. Ces réseaux sont centrés sur le cortex prefrontal, une région cérébrale considérée comme une spécificité de l’organisation cérébrale des primates. Sur la base de critères anatomiques et cognitifs, les primates non humains sont le seul choix possible de modèle animal pour conduire le projet proposé. Il n'existe pas d’alternative qui permette d'obtenir des informations similaires à partir d'expériences n'impliquant pas d'animaux, ou des modèles animaux non-primates.
Réduction
Contrairement à la neuroimagerie chez l’humain qui nécessite un grand nombre de sujet (n>20), les protocoles chez le primate non-humain bénéfient de la possibilité de répéter les sessions chez un même sujet. Chez le singe, 3 est également le nombre minimal d'animaux par étude sur lequel la communauté scientifique s'accorde. Dans le cadre du présent projet, il est important de prendre en compte le facteur social : dominants vs dominés. Nous travaillerons donc sur 2 groupes de 3 sujets. Cependant il arrive parfois que des animaux s’accommodent mal au travail en chaise de contention, ou ne tolèrent pas les implants. Nous envisageons le besoin de 8 animaux mais nous nous arrêterons à 6 si tous les animaux coopèrent, apprennent les tâches comportementales et tolèrent les implants.
Raffinement
Chaque animal reçoit un long pré-entrainement par renforcement positif pour l'habituer à la vie au laboratoire (nettoyage des volières, pesées régulières, etc.). Des protocoles d’enrichissement de l’environnement sont développés pour stimuler l’animal et lui permettre d’exprimer au mieux son répertoire comportemental en dehors des phases de collecte de données. L’utilisation de station de travail mobile permettra de réaliser certaines phases du conditionnement dans les volières des animaux. Un raffinement continu est également pratiqué pour développer des implants moins invasifs et moins sensibles aux infections. L’optimisation des techniques d’enregistrements électrophysiogiques permettra de réduire la phase de collecte des données. Tout sera mis en œuvre pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse de l’animal grâce aux différentes mesures mises en place dans l’animalerie (hébergement en groupe social, enrichissement, etc.) et un suivi médical régulier de l’animal (perte de poids, alopécie), et des implants sera mis en œuvre (signes d’infections). Un suivi medical plus spécifique sera également mis en oeuvre post intervention chirugical.
Choix des espèces
Nous proposons d'étudier le fonctionnement des réseaux neuronaux impliqués dans l’adaptation comportementale. Ces réseaux sont centrés sur le cortex préfrontal. Cette région est considérée comme une specificité de l’organisation cérébrale des primates. Les expériences présentees sont invasives. La combinaison des approches proposées permettront l’obtention d’informations fondamentales impossible à obtenir avec d'autres techniques, et impossible à réaliser chez l’humain. Notre recherche porte sur des animaux post-puberté (>4ans)
Etude de l’inflammation via la caractérisation en IRM moléculaire des molécules d’adhésion cellulaire
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sévères. Une inflammation cérébrale leur est induite par injection intracérébrale d'une protéine bactérienne, et un accident vasculaire cérébral par injection de thrombine dans l'artère cérébrale moyenne, suivis de la pose d'un cathéter et d'une imagerie moléculaire, avant mise à mort pour immunohistochimie. Le porteur indique que l'AVC peut entraîner un affaiblissement transitoire de la patte avant et que la pose du cathéter provoque une douleur modérée. Il affirme que la biodistribution des particules d'imagerie doit être étudiée dans un organisme complet et que l'expérience ne peut être totalement remplacée par des études in vitro.
Objectifs
L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une pathologie neurologique d’origine vasculaire. Il s’agit d’un déficit aigu soudain qui survient à la suite de l’occlusion ou de la rupture d’un vaisseau cérébral. Notre étude sera basée sur l’expression de molécules d’adhésions qui sont impliquées dans la migration des cellules immunitaires au sein du parenchyme cérébral. Il a été montré dans la littérature que l’inflammation post-AVC jouait un rôle dans la physiopathologie de la maladie, c’est pourquoi il nous apparait pertinent de caractériser l’expression de ces molécules d’adhésion.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compréhension de l'implication des molécules d'intérêts lors d'une inflammation
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Nous allons injecter une protéine bactérienne inactive dans une région du cerveau spécifique afin d’induire une inflammation du cerveau (durée : inférieure à 30min). Pesée lors des manipulations (durée : inférieure à 5 min) Induction du modèle d'AVC par une injection de thrombine dans l'artère cérébrale moyenne (durée : 1h30) Pose d’un cathéter sous anesthésie profonde (durée : environ 15min) Imagerie moléculaire avec injection de produit de contraste (durée : environ 20min).
Impact sur les animaux
Certains animaux peuvent montrer des signes de douleur dans les premières heures après la chirurgie. De plus, l’injection de LPS en intra-striatale peut induire des effets indésirables sur les animaux. Le LPS est un PAMP, motif moléculaire associé à un agent pathogène, qui active la voie NF-κB par l'intermédiaire du TLR4 et induit l'expression de cytokines pro-inflammatoires telles que TNFα, IL-6 et IL-1β. Enfin, l'injection intraveineuse de traceur IRM nécessite la pose d'un cathéter sur la veine caudale, pouvant occasionner une douleur considérée comme modérée. Des analgésiques sont prévus afin de limiter et minimiser autant que possible la gêne occasionnée. Concernant les souris ayant eu un AVC, il est possible de voir apparaitre un affaiblissement transitoire de la patte avant gauche (correspondant à la zone cérébrale lésée par l’AVC.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses en immunohistochimie
Remplacement
Avant toute étude in vivo nos particules ont été testées in vitro afin de vérifier leur bon fonctionnement et spécificité. Cela nous permet de réduire le nombre d’animaux en ne leur injectant pas de particules inefficaces. Les expériences in vivo ne peuvent être totalement remplacée par des études in vitro car nous avons besoin de mettre en évidence l’affinité de nos particules pour les molécules d’adhésion endothéliales exprimées en conditions inflammatoires dans un organisme complet. En effet ; l’étude de leur bio-distribution in vivo est un point essentiel à notre projet de recherche. Après les expérience d’imagerie, les animaux sont perfusé afin de récupérer les tissus. Des études de microscopie sont réalisées par la suite sur ces tissus afin de confirmer nos observations réalisées in vivo. Cela nous permet également de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et la littérature. L’utilisation d’outils d’imagerie non invasive (IRM) permettent de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cage standards répondant aux normes européennes actuelles (directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les souris seront pesées et acclimatées pendant une heure dans la pièce expérimentale. Un suivi strict et rapproché des animaux, une évaluation de la douleur basée sur la grimace scale, une couverture analgésique suffisante en période pré et post opératoire, un accès facilité à la nourriture seront mis en place. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences vasculaires. L’anatomie et la physiologie de la vascularisation cérébrale de la souris sont bien connus et sont semblables à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont identiques chez l’homme et la souris. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rendent cette espèce particulièrement intéressante pour étudier le rôle des molécules d’adhésion cérébrale. Les souris Swiss utilisées dans cette étude seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de l'AVC.
Création et maintien de lignées de poissons zèbres génétiquement altérées pour l’étude de syndromes neuro-développementaux rares.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
9 550 poissons zèbres vont être utilisés, classés en gravité légère, dans un projet de création et de maintien de lignées génétiquement altérées. Chaque animal subit à quatre mois une amputation d'un morceau de la nageoire caudale sous anesthésie pour le génotypage, geste que le porteur présente comme le plus invasif du projet. Les géniteurs et génitrices retenus sont conservés jusqu'à dix-huit mois, tandis que les autres, porteurs de modifications génétiques et jugés non nécessaires, sont mis à mort. Le porteur affirme que seul un organisme vivant complexe permet d'étudier ces syndromes neuro-développementaux et met en avant la transparence des embryons et les pontes nombreuses pour justifier le choix de l'espèce.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de permettre l'étude d’un ensemble de maladies génétiques rares du neuro-développement caractérisés par une microcéphalie et un nanisme. Actuellement, la prise en charge clinique des patients est strictement symptomatique; aucun traitement curatif n’existe à ce jour. Ces syndromes sont dus à des mutations dans un gène spécifique identifié. Le projet de recherche vise à comprendre les mécanismes qui mènent à ces syndromes et pourquoi des mutations distinctes de ce gène conduisent à des pathologies différentes. Afin de mener ces études à bien, le poisson-zèbre a été choisi comme modèle car il permet de reproduire et ainsi de comprendre ces maladies. Le projet proposé ici vise à établir et maintenir des lignées de poissons-zèbre présentant deux mutations emblématiques de ce gène, ainsi qu’une invalidation fonctionnelle totale de ce gène. Ces lignées permettront de mettre en évidence les particularités propres à chaque type de mutation expliquant la variabilité́ des symptômes observés chez les patients, et ce, tout particulièrement sur le développement cérébral.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans une démarche de recherche fondamentale permettant de mieux comprendre comment les mutations d'un gène sont impliquées dans la survenue de syndromes présentant des pathologies plus ou moins sévères. A court terme, l’établissement de ces lignées permettra d’établir un modèle de référence de la maladie pour l’étude de ces syndromes. A moyen terme, l’analyse de l’expression des gènes dans les premiers stades de développement du poisson-zèbre aidera à mieux comprendre quels sont les gènes impliqués dans la survenue de retard de croissance et de microcéphalies et de mettre en lumière pourquoi ces symptômes sont plus prégnants pour certaines mutations que pour d’autres. A long terme, ces résultats pourront permettre un éclairage sur les mécanismes cellulaires les plus affectés dans ces syndromes. Ces lignées pourront s’avérer être d’une grande aide dans le test de molécules à visée thérapeutique visant à soulager les patients et à améliorer leur vie.
Procédures
La création de lignées de poissons-zèbre implique de pouvoir identifier les animaux porteurs des modifications génétiques d’intérêt. Aussi, un génotypage des individus s’avère obligatoire. La procédure nécessite le prélèvement d’un morceau de tissu de la nageoire caudale du poisson afin d’en extraire l’ADN. Le choix d’un prélèvement de la nageoire caudale tient au fait que celle-ci se régénère très rapidement. Ce prélèvement sera réalisé une seule fois au cours de la vie de l’animal, à 4 mois. Afin de limiter la douleur liée au prélèvement, celui-ci sera effectué sous anesthésie générale brève de l’animal et à l’aide d’un scalpel dont la lame sera préalablement stérilisée à l’alcool et changée à chaque série de prélèvement. Après le prélèvement, le poisson sera immédiatement transféré dans un bac individuel contenant de l’eau sans anesthésique pour permettre son réveil. Le poisson sera surveillé pendant 10mn pour vérifier son état général. Classiquement, cette technique ne génère pas de mortalité.
Impact sur les animaux
La transmission des syndromes, par le biais de mutations est de type « autosomique récessive » indiquant que les parents sont porteurs sains et asymptomatiques. L’ensemble des progéniteurs de nos lignées seront des poissons porteurs des modifications génétiques, sains et asymptomatiques. De même, il est attendu que la génération de ces lignées poissons-zèbres porteurs des modifications génétiques d’intérêt conduise à des individus sains, libre de se mouvoir et ne présentant aucun signe de mal être. Néanmoins un suivi régulier des poissons-zèbre sera réalisé pour s’assurer de leur bien-être. Lors de la création de ces lignées, certains poissons zèbres seront amenés à subir un prélèvement d’un morceau de la nageoire caudale afin de pouvoir identifier les animaux porteurs des modifications génétiques d’intérêt. Il s’agit là du geste le plus invasif qu’auront à subir les poissons zèbres dans ce projet.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux d’intérêt (géniteurs et génitrices en nombre nécessaires) seront conservés jusqu’à leur 18 mois. Les autres seront mis à mort afin de ne pas garder d’animaux, non nécessaires à la conduite de ce projet et porteurs de modifications génétiques, qui ne peuvent pas être replacés.
Remplacement
L’étude du développement neuronal à partir de cellules souches issues de patients et d’un modèle animal, le poisson-zèbre, permet de comprendre les mécanismes de ces maladies. Seul un organisme vivant complexe comme l’animal permet de récapituler l’ensemble des phénomènes physiologiques et de les étudier avec pour objectif une possible application à l’Homme. Le poisson zèbre présente de nombreux avantages, notamment la transparence optique des embryons ce qui permet le suivi, en temps réel, du développement embryonnaire et notamment du système nerveux (deux marqueurs majeurs affectés dans les syndromes étudiés). De précédentes études ont déjà démontré la pertinence du poisson-zèbre comme modèle d’étude car la perte temporaire de la fonction du gène d’intérêt provoque chez cet animal un éventail de symptômes/syndromes spécifiques des maladies humaines, dont une microcéphalie. L’apparition de l’ensemble de ces symptômes/syndromes peut être bloqué par la réexpression de la forme « saine » du gène humain chez le poisson mais pas par les formes « malades », qui portent les mutations identifiées chez l’Homme. Pour poursuivre la caractérisation de ces maladies, l’établissement des lignées poisson-zèbre présentant des mutations stables du gène d’intérêt permettra de disposer de modèles physiologiquement pertinents.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre de poissons de la génération F0 à élever jusque l’âge de 4 mois, une estimation préalable de l’efficacité des systèmes de modification génétique sera réalisée en amont sur des œufs de poisson zèbre de type sauvage à 24-48h heures post fécondation. Le nombre de poissons zèbres ayant à subir un prélèvement de la nageoire caudale sera limité au maximum, en réalisant des prélèvements par groupe de 16 poissons zèbres, afin de ne sélectionner que le nombre minimum de poissons zèbres hétérozygotes nécessaires. Dès lors que le nombre de poissons d’intérêt sera atteint, les prélèvements seront interrompus. Pour le maintien des lignées, seuls les poissons zèbres hétérozygotes nécessaires au maintien de chaque lignée seront conservés, ce qui correspond à une vingtaine de géniteurs mâles et de génitrices femelles par an et par lignée. Dès lors que le nombre d’animaux d’intérêt sera obtenu, les prélèvements de nageoire caudale pour génotypage seront interrompus. Dans le cas de figure où la génération de poissons-zèbre avec une invalidation totale du gène d’intérêt se révélait trop difficile à obtenir, les autres lignées de poissons-zèbre ne seront pas générés.
Raffinement
Seul le strict minimum d’animaux nécessaires à la génération et au maintien des lignées subira le prélèvement d’un morceau de nageoire caudale. Le prélèvement d’un morceau de nageoire caudale se fera uniquement sur des animaux anesthésiés et le temps d’isolement des poissons-zèbres pendant cette phase de caractérisation sera limitée au minimum en maintenant les animaux dans des bacs avec des séparateurs transparents afin qu’ils soient au minimum 2 par 2 le temps de la procédure. Les individus d’intérêt seront ensuite regroupés en fonction de leur génotype. Les poissons-zèbres conservés seront tous hétérozygotes et ne présenteront pas de phénotype dommageable (le syndrome étudié étant récessif). Toutefois, une surveillance hebdomadaire pour détecter tout éventuelle anomalie du comportement des animaux sera réalisée. L’observation de blessures sur l’animal ou d’anomalies de comportement (nage anormale, prostration au fond du bac…) conduira à la mise à mort de l’animal afin de limiter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Avec la grande conservation fonctionnelle de ses gènes avec l’Homme, le poisson zèbre constitue un modèle idéal pour étudier des maladies génétiques dans un contexte physiologique et à l'échelle d’un organisme complexe entier. De plus, ce modèle présente de nombreux avantages avec notamment une fertilisation externe et des pontes supérieures à 100 œufs, permettant ainsi de limiter le nombre de génitrices nécessaires au projet et ainsi de les préserver, tout en obtenant une puissance statistique optimale avec peu de croisements. Enfin, la transparence optique des embryons permet le suivi en temps réel du développement embryonnaire et notamment du système nerveux (deux marqueurs majeurs affectés dans le syndrome étudié). Lors de la création des lignées de poissons-zèbres, les animaux subiront un unique prélèvement de nageoire caudale, à l’âge de 4 mois. Ce prélèvement s’effectue à ce stade car les poissons-zèbres sont suffisamment développés et la quantité de tissu prélevé suffisante pour le génotypage. La cicatrisation et la régénération de la nageoire s’opèrent de manière optimale à ce stade de développement. Par la suite, ces mêmes poissons-zèbres seront les géniteurs et génitrices du projet (à partir de l’âge de 5 à 6 mois).
Modulation cholinergique des neurones épineux moyens du striatum afin d’améliorer les stéréotypies dans un modèle des troubles du spectre de l’autisme chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
332 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées légères à modérées. Elles portent une mutation reproduisant des comportements répétitifs proches de l'autisme et subissent des tests comportementaux d'exploration, des injections, et pour une partie une chirurgie stéréotaxique intracérébrale de trente à quarante minutes sous anesthésie. Le projet teste si des traitements augmentant une substance du striatum réduisent ces stéréotypies. Le porteur affirme que les méthodes in vitro ne peuvent remplacer l'organisme entier et que des souris vivantes sont nécessaires, les tests comportementaux étant décrits comme sans stress ni souffrance.
Objectifs
Les troubles du spectre de l’autisme (TSA) sont diagnostiqués sur la base de troubles du comportement, notamment des déficits de la communication et des interactions sociales, ainsi que des comportements répétitifs (stéréotypies) avec des champs d’intérêts restreints. Les causes des TSA sont encore mal connues, mais plusieurs recherches ont établi que de mutations dans certains gènes sont impliquées. Plusieurs de ces gènes participent, d’ailleurs, au développement et au fonctionnement du cerveau. Nos travaux apportent un faisceau d’arguments convergents, à partir d’études menées chez l’Homme et sur des modèles de souris, en faveur de l’existence d’un lien direct entre des mutations d’un gène et les TSA. En particulier, nos souris avec des mutations de ce gène montrent des comportements répétitifs (stéréotypies) qui miment ceux typiques des TSA. Notre hypothèse, basée aussi sur nos travaux précédents, est que ces comportements répétitifs soient dus à une réduction des niveaux d’une substance chimique sécrétée par les neurones d’une zone du cerveau nommée striatum, comme dans d’autres cas de comportements stéréotypés. A l’heure actuelle il n’existe pas des traitements médicamenteux généralisés pour les TSA, cependant certains des symptômes peuvent être pris en charge spécifiquement. Dans ce contexte, nous proposons d’utiliser nos souris afin tester si leurs comportements répétitifs peuvent être améliorés par un traitement qui vise à augmenter les niveaux de cette substance dans le cerveau. Dans ce cadre, nos objectifs principaux sont : 1. Effectuer des tests comportementaux permettant de mettre en évidence des stéréotypies chez les souris mutantes, par rapport à leurs contrôles. 2. Tester des traitements qui augmentent les niveaux de cette substance sont capables d’améliorer ces déficits comportementaux. Cela pourrait fournir des indications thérapeutiques pour le traitement des comportements stéréotypés, associés ou pas aux TSA.
Bénéfices attendus
Des mutations dans plusieurs gènes sont impliquées dans les troubles du spectre de l’autisme (TSA). Dans ce contexte, ce projet a pour objectif de tester des traitements permettant de corriger des comportements stéréotypés chez la souris modèle des TSA dus à la mutation d’un de ces gènes. Si ces traitements se révèlent efficaces dans cette phase préclinique, ils pourraient être testés en phase clinique afin d’améliorer les comportements stéréotypés chez des patients atteints des TSA. D’ailleurs, un des traitements testés dans ce projet est actuellement utilisé en clinique pour le traitement de certaines formes de TSA et pour la maladie d’Alzheimer.
Procédures
Ce projet comprend 3 types d’intervention : Intervention 1 : Tests comportementaux sur l’ensemble des animaux qui ne comportent pas de souffrances ou stress, afin de détecter des comportements stéréotypés spontanés typiques des modèles murins des TSA. Un test par souris, durée max 30 minutes. Intervention 2 : Injections systémiques i.p. et s.c. sur animal vigile afin d’induire une anesthésie générale et d’administrer les traitements post-opératoires (analgésiques e anti-inflammatoires) et pharmacologiques. Pour les traitements pharmacologiques d’une partie des animaux : deux injections par souris (1 pour l’habituation et 1 pour le traitement), éventuellement des injections quotidiennes sur 5-7 jours si le traitement unique est inefficace. Durée des injections : quelques secondes. Intervention 3 : Injections intracérébrales par chirurgie stéréotaxique sous anesthésie générale gazeuse (isoflurane) pour une partie des animaux. Une chirurgie (bilatérale) par souris. Durée de la chirurgie : 30-40 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à une batterie de tests comportementaux pour évaluer les effets bénéfiques des traitements prévus sur les stéréotypies. Ces tests sont basés sur des comportements spontanés d’exploration et ne comportent pas de stress ni de souffrance des animaux. Une partie des animaux subira des injections i.p. de solution saline ou de produits chimiques qui sont non toxiques et non douloureux ; les injections pourraient engendrer du stress de contention et de la douleur aiguë. Une partie des animaux subira une chirurgie stéréotaxique sous anesthésie générale profonde (classée modérée), pouvant engendrer douleur post-opératoire et stress. Cette chirurgie ne comporte pas de lésions ou d’autres interventions qui peuvent affecter le bien-être animal après l’opération.
Devenir
A la fin des procédures, les souris ne seront pas utilisées pour d’autres expériences dans le cadre de ce projet ou d’autres projets de recherche. Par conséquent, toutes les souris seront mises à mort.
Remplacement
Les méthodes in vitro ne peuvent pas remplacer l’organisme entier en raison de l’isolement des neurones du contexte physiologique. De plus, l’utilisation de souris vivantes est nécessaire pour tester l’efficacité des traitements visant à améliorer les stéréotypies.
Réduction
Nous nous efforçons d’utiliser le moins d’animaux possible (optimisation des conditions d’élevage, des croisements etc.), tout en veillant à ce que le nombre d’animaux utilisé soit représentatif. Ce projet, d'une durée de 5 ans, nécessitera l'utilisation de 332 souris mâles adultes, réparties en plusieurs groupes (n= 12 à 14 par groupe en fonction du type d’expérience). Cela a été estimé sur la base d’expériences antérieures, et grâce à des outils statistiques permettant de calculer le nombre de sujets nécessaires. Cependant, ce nombre prévu pourra être réduit en fonction des résultats obtenus dans les tests comportementaux. Ce projet de recherche devrait permettre une meilleure compréhension de la pathophysiologie du trouble de l’autisme et permettre à terme de développer une approche thérapeutique pour cette maladie.
Raffinement
La chirurgie est optimisée pour réduire la durée de l’opération (environ 30-40 min) et minimiser la souffrance. La souffrance est modérée car la chirurgie est réalisée sous anesthésie générale profonde gazeuse. Les principaux paramètres vitaux sont contrôlés tout au long de la chirurgie. Afin de diminuer la douleur, un analgésique puissant à action prolongée est administré 30 minutes avant la chirurgie. En complément, un analgésique anti-inflammatoire est administré à la fin de l'opération pour anticiper l’apparition d’éventuelles douleurs et hydrater l’animal, puis en postopératoire pendant au moins 3 jours, la durée de traitement dépendant de la réponse observée. Après le réveil de l’anesthésie, les animaux sont surveillés afin de détecter des signes éventuels de souffrance ou de stress, qui seront pris en charge le cas échéant. Personnel animalier et expérimentateurs s’assurent d’une bonne récupération postopératoire des animaux. Des grilles d’évaluation adaptées sont mises en place pour évaluer des signes de souffrance ou mal-être potentiels des animaux. L’analyse comportementale sera réalisée chez les animaux vigiles qui ne doivent pas être stressés pour ne pas compromettre leurs performances. Pour favoriser le bien-être et l’interaction sociale, les souris seront hébergées de deux à quatre par cage avec eau et nourriture à volonté, au sein d’une animalerie exempte de pathogènes et dont les paramètres physiques (température, humidité) et sanitaires, ainsi que le bien-être des animaux, sont strictement contrôlés. Ils auront à leur disposition de la litière foisonnante (diminuant le stress de l’animal et facilitant sa thermorégulation) ainsi qu’un environnement enrichi par des bûchettes en peuplier et des tubes en PVC. Afin de diminuer l’inconfort/stress générés par ce type d’expérimentation comportementale, les souris auront une période d’habituation d’une semaine aux salles d’expérimentions où elles seront manipulées par l’expérimentateur en charge de l’étude.
Choix des espèces
Les troubles du spectre de l’autisme (TSA) ne peuvent être étudiés qu’in vivo, car ils sont définis par des comportements caractéristiques (déficits dans les interactions sociales et mouvements répétitifs ou stéréotypés) qui nécessitent d’animaux vivants pour être mis en évidence. La possibilité d’utiliser des souris génétiquement modifiées est indispensable pour reproduire les symptômes des TSA dus à la délétion d’un gène. Nous utiliserons donc ces souris pour des expériences visant à mettre en évidence des stéréotypies, afin de tester si des traitements qui peuvent restaurer la fonction d’une région du cerveau impliquée dans les TSA peuvent améliorer ces comportements. L’âge des souris utilisées sera de 12 à 14 semaines au début de la procédure : cela a l’avantage d’avoir des animaux adultes capables d’effectuer les tâches comportementales prévues dans la procédure expérimentale, tout en minimisant la durée de leur stabulation.
Etude du système endocannabinoïde dans le syndrôme de Sanfilippo.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
396 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 72 dans des procédures sans réveil et 324 classées légères. Chaque animal reçoit une injection intrapéritonéale tous les trois jours pendant deux semaines, pouvant provoquer stress et douleur, avant d'être disséqué pour prélever le cerveau. Le projet, mené sur des souris génétiquement modifiées reproduisant le syndrome de Sanfilippo, étudie le rôle d'une enzyme dans la neuro-inflammation associée à cette maladie. Le porteur affirme qu'aucune méthode ne remplace un "animal entier" vivant et présente les pistes thérapeutiques comme un objectif du projet.
Objectifs
Les maladies de surcharge lysosomale (MSL) constituent un groupe hétérogène d’environ 70 maladies caractérisées par un dysfonctionnement du lysosome. Ces maladies sont individuellement rares mais touchent globalement plus d’un cas pour 4000 naissances. La maladie de Sanfilippo (MPSIIIB), une maladie des MSL, est caractérisée par une accumulation des Oligosaccharides d’Héparane Sulfate (HSO) dans les tissus y compris dans le système nerveux central (SNC). Cette accumulation progressive induit une série de conséquences pathologiques incluant une neurodégénérescence, une neuro-inflammation et un stress oxydant. La neuro-inflammation très précoce est en grande partie à l’origine des premiers symptômes de la pathologie. Il a été montré, dans des modèles murins de MPSIII, que l’utilisation d’anti-inflammatoires tels que l’aspirine ou la prednisolone permettait de réduire la neuro-inflammation, améliorer les symptômes et entraîner une normalisation de certains marqueurs de la neuropathologie. Les limites de l’utilisation de ce type de molécules sont en grande partie dues à des doses d’efficacité excessives et à un mauvais passage de la barrière hématoencéphalique (BHE). Par conséquent, il est important de développer de nouvelles approches thérapeutiques anti-inflammatoires. Parmi ces nouvelles cibles, des études très récentes soulignent l’intérêt d’une manipulation du système endocannabinoïde (ECS) dans la prise en charge des MSL. Le rôle anti-inflammatoire de l’ECS est aujourd’hui clairement démontré et est, de fait, une nouvelle voie thérapeutique potentielle lors de pathologies neurodégénérescentes. Nous avons récemment découvert au laboratoire une nouvelle enzyme impliquée dans l'ECS et présente dans le SNC. Le but de ce projet est d'étudier le rôle de cette enzyme dans les évènements clés de la neuro-inflammation associée au syndrôme de Sanfilippo.
Bénéfices attendus
La mise en place et le succès de ce projet permettront de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement du syndrome de Sanfilippo et notamment pour le traitement de la neuro-inflammation associée.
Procédures
Les animaux utilisés pour cette étude seront soumis à 1 injection en intra-péritonéal tous les 3 jours pendant 2 semaines (soit maximum 5 injections). Après la mise à mort, les cerveaux seront prélevés.
Impact sur les animaux
Durant l'expérimentation, les animaux seront soumis à 1 injection tous les 3 jours durant 2 semaines en intra-péritonéal pouvant provoquer du stress et/ou de la douleur chez l'animal. L'état général des animaux pourrait être de ce fait altéré.
Devenir
Tous les animaux inclus dans chaque procédure seront mis à mort et disséqués afin de collecter les cerveaux pour les différentes analyses.
Remplacement
Il n'existe pas de méthode alternative pour analyser le rôle du système endocannabinoïde dans la neuro-inflammation lors de pathologies neurodégénérescentes. Cette étude nécessite la présence du réseau neuronal qui est uniquement accessible dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants. Pour cela, il n’est pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.
Réduction
Nous utiliserons des souris C57BL6 sauvages ou génétiquement modifiées. Le nombre de 6 animaux par groupe expérimental avec 3 expériences indépendantes est le minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs adaptés.
Raffinement
Pour cette étude et dans le but d'éviter et d'atténuer toute forme de souffrance des animaux, un contrôle quotidien sera effectué durant toute la durée d'expérimentation. Après une pesée initiale le jour de la première injection des molécules en intra-péritonéal, les animaux seront pesés tous les 2 jours. Durant toute la période d'expérimentation, l'état général et le comportement des animaux seront évalués quotidiennement par le personnel de zootechnie. Un enrichissement du milieu sera ajouté (igloo, carrés de coton) pour permettre aux animaux de faire leur nid. Dans le cas où un animal montrerait une altération de son état général, il sera euthanasié. Tout le personnel de zootechnie et les expérimentateurs sont particulièrement bien formés et attentifs au bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris est le meilleur modèle du fait de la possibilité d'utiliser des animaux génétiquement modifiés. Toutes les lignées murines utilisées sont déjà disponibles au laboratoire et sont adaptées pour examiner la pathophysiologie de la maladie de Sanfilippo ainsi que pour développer des thérapies pour les maladies de surcharge lysosomale. Pour les 2 procédures, les animaux seront utilisés à 1, 2 et 4 mois afin d'étudier les premiers signes et la progression de la neuro-inflammation. Ce choix est en accord avec les précédentes études déjà menées au laboratoire ainsi que la bibliographie.
Neurostimulation pour restaurer la mémoire dans un modèle primate de la maladie d’Alzheimer – 1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
10 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées modérées malgré leur lourdeur. Une pathologie de type Alzheimer et des déficits cognitifs leur sont induits, et chaque animal subit trois neurochirurgies de six à huit heures pour injection intracérébrale et implantation d'électrodes, des IRM et scanners sous anesthésie, des injections de scopolamine, des ponctions lombaires tous les six mois et des tâches en chaise de contention. Le porteur mentionne des restrictions alimentaires ou hydriques, un risque d'infection lié aux électrodes percutanées, puis une euthanasie pour analyse histologique du cerveau. Il affirme que le cortex préfrontal dorsolatéral "n'existe que chez le primate" et conclut au caractère "indispensable" du modèle primate.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans l’objectif général de développer de nouvelles approches de neurostimulation pour les déficits mnésiques, observés en particulier dans la maladie d'Alzheimer. Malgré leur incidence très élevée, il n’existe actuellement pas de traitement pharmacologique adéquat, et la neurostimulation représente une approche alternative qui a déjà fait l’objet de plusieurs études préliminaires. Cependant, les approches testées chez l’humain actuellement produisent des effets variables et insuffisants, et qui ne sont pas statistiquement significatifs. Ces protocoles sont relativement simples car ils ne ciblent qu’une seule aire cérébrale et ce, de manière continue au cours du temps. Nous faisons l’hypothèse qu’une intervention ciblant plusieurs aires cérébrales et modulée au cours du temps mènera à une amélioration plus robuste des performances mnésiques dans un phénotype similaire à celui de la maladie d’Alzheimer. Pour tester cette hypothèse, nous allons implanter chez le primate non-humain des technologies d’électrodes intracrâniennes similaires à celles utilisées chez l’humain, et que nous avons déjà testées dans des modèles imprimés en 3D et chez le cochon. Ces électrodes seront implantées dans des aires critiques pour la mémoire de travail et la mémoire épisodique, dont certaines sont spécifiques aux primates (cortex préfrontal dorsolatéral). Nous allons induire chez 10 macaques cynomolgus une physiopathologie similaire à la maladie d’Alzheimer, ainsi que des déficits cognitifs temporaires, et étudier l’impact de nouvelles méthodes de neurostimulation (ciblant plusieurs aires et adaptées en temps réel en fonction de l’état cérébral) sur cette physiopathologie et sur les performances cognitives de l’animal.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra : (1) d'élucider les mécanismes physiologiques sous-tendant l'apprentissage et la mémoire chez le primate dans des états sains et pathologiques, notamment dans un nouveau modèle physiopathologique de la maladie d’Alzheimer ; (2) de développer une nouvelle catégorie d'interfaces cerveau-machine bidirectionnelles permettant d'enregistrer l'activité neuronale et de la stimuler en temps réel dans plusieurs aires cérébrales différentes, afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour les troubles mnésiques et la maladie d'Alzheimer, qui ne connaît aucun traitement à l'heure actuelle. Le développement et l’amélioration de ces technologies de neurostimulation est en effet en plein essor, en raison de leur potentiel thérapeutique pour plusieurs maladies neurologiques, incluant non seulement la maladie d’Alzheimer, mais également la maladie de Parkinson, la dépression, les troubles obsessionnels compulsifs, etc. Les applications cliniques sur la maladie d’Alzheimer se limitent actuellement à la stimulation d’une aire unique, avec des protocoles relativement simples, et mènent à des effets très limités et variables. Ce projet va au-delà des protocoles utilisés cliniquement car il stimule plusieurs aires simultanément afin de restaurer leur activité naturelle, et les protocoles de stimulation dépendent de l’état du cerveau grâce à des algorithmes dits en boucle fermée. Un tel développement technologique doit se faire sur le gros animal, car les implants utilisés cliniquement (électrodes cérébrales profondes et électrodes sous-durales) et leur technique d’implantation chirurgicale (neuronavigation par IRM) ne peuvent pas être utilisés sur des petits modèles animaux tels que le rongeur. Par ailleurs, nous avons auparavant développé des approches méthodologiques et chirurgicales sur des modèles alternatifs, à savoir des modèles de cerveau imprimés en 3D et des modèles porcins. Pour passer à la phase comportementale, c’est-à-dire tester les effets de ces stimulations sur les processus de mémoire et la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer, il est nécessaire d’utiliser un modèle de gros animal avec une homologie cérébrale similaire à l’être humain. Un modèle primate s’avère dès lors indispensable, notamment en raison du fait que le cortex préfrontal dorsolatéral, une aire fortement impliquée dans la mémoire de travail et la mémoire épisodique, n’existe que chez le primate.
Procédures
Les animaux seront soumis à des tâches comportementales en chaise et en comportement libre avec enregistrements électrophysiologiques et neurostimulation (séances quotidiennes de 1-2h pendant toute la durée du projet), à des imagerie par résonance magnétique sous anesthésie (environ 5 séances de 2-3h maximum), à des tomodensitométries sous anesthésie (2 séances de 30 minutes), à 3 procédures neurochirurgicales de 6-8 heures environ (1 pour l'injection intracérébrale de protéines, et 2 pour l'implantation d'électrodes intracérébrales), à des injections intramusculaires de scopolamine (5-10 séances estimées, avec un effet durant 4h maximum), à des ponctions lombaires (réalisées tous les 6 mois à partir de l'implantation et pendant la durée du projet), et à une euthanasie.
Impact sur les animaux
Ce projet peut avoir les effets indésirables suivants sur les animaux : (1) stress et inconfort dus à la captivité et au conditionnement à une tâche comportementale, (2) douleurs suite à des procédures neurochirurgicales et à l'injection intramusculaire de substances (scopolamine, anesthésiants), (3) potentielles infections liées à la présence d'un système percutané d'électrodes intracérébrales, (4) nuisances liés à la potentielle restriction alimentaire ou hydrique, (5) nuisances liées à l'imagerie, (6) nuisances liées aux transports entre établissements utilisateurs
Devenir
Les animaux seront eutahanasiés et une analyse histologique du cerveau sera effectuée.
Remplacement
Ce projet vise à étudier les effets de la neurostimulation intracrânienne sur la mémoire lors d’une tâche cognitive. Ceci ne peut être réalisé in vitro. Par ailleurs, les modèles informatiques actuels ne permettent pas de remplacer l’expérimentation animale car les processus mnésiques ne sont pas suffisamment bien compris. Néanmoins, nos travaux de recherche incluent déjà une partie modélisation afin de guider la sélection de certains paramètres de stimulation. Dans le futur, de tels modèles permettraient de réduire le nombre d’animaux utilisés. Par ailleurs, l’expérimentation humaine n’est pas encore possible à ce stade car les méthodes utilisées sont invasives, impliquent une craniotomie, et nécessitent donc une preuve de concept pré-clinique. En termes de modèle pré-clinique, notre développement technologique doit se faire sur le gros animal, car les implants utilisés cliniquement (électrodes cérébrales profondes et électrodes sous-durales) et leur technique d’implantation chirurgicale (neuronavigation par IRM) ne peuvent pas être utilisés sur des petits modèles animaux tels que le rongeur. Par ailleurs, nous avons auparavant développé des approches méthodologiques et chirurgicales sur des modèles alternatifs, à savoir des modèles de cerveau imprimés en 3D et des modèles porcins. Pour passer à la phase comportementale, c’est-à-dire tester les effets de ces stimulations sur les processus de mémoire et la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer, il est nécessaire d’utiliser un modèle de gros animal avec une homologie cérébrale similaire à l’être humain. Un modèle primate s’avère dès lors indispensable, notamment en raison du fait que le cortex préfrontal dorsolatéral, une aire fortement impliquée dans la mémoire de travail et la mémoire épisodique, n’existe que chez le primate.
Réduction
Chaque animal sera son propre contrôle afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. De plus, les mêmes animaux seront réutilisés pour plusieurs interventions (effets de la stimulation dans l'état sain et dans différents états pathologiques, i.e. après injection de scopolamine et dévelopement de la tauopathie). Un nombre de 5 animaux est le minimum pour effectuer des tests statistiques de comparaison entre plusieurs états. Il est également important de noter que les études de neurophysiologie ou de développement de neurotechnologies sur primates non-humains se limitent généralement à un nombre de 3 à 5 animaux, en raison de la complexité technique et expérimentale inhérente à ce domaine. Il s’agit du nombre généralement attendu par les comités de lecture dans le cadre de l’évaluation par les pairs, qui attendent dans ce cas les résultats individuels sur chaque animal. Par ailleurs, ces animaux seront divisés en deux groupes d'âge. Au total, nous planifions donc d'utiliser un maximum de 10 animaux. Enfin, certains des animaux utilisés dans ce projet seront des animaux réutilisés de projets précédents.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes, dans une structure spécialement agréée pour l’hébergement et l’utilisation des primates en recherche, disposant d’équipements et de protocoles adaptés au raffinement du milieu pour cette espèce. Les hébergements seront enrichis par des approches standards (jouets pour animaux, nourriture variée, fonds sonore) ainsi que l’utilisation d’un système d’écran tactile pour primates permettant de délivrer des récompenses alimentaires lors de l’exécution de tâches de pointage ou de mémorisation. L’habituation aux interactions avec l’humain et aux diverses procédures expérimentales se fera progressivement et par renforcement positif, à un rythme adapté à chaque animal et qui s’étendra sur une durée de plusieurs mois. Nous utiliserons des méthodes chirurgicales aseptiques ainsi qu’une anesthésie gazeuse suivant au plus près les standards cliniques. Les procédures chirurgicales seront menées par un neurochirurgien, à l’aide d’un système de neuronavigation fondé sur des imageries non-invasives du cerveau par IRM et de la morphologie crânienne par tomodensitométrie, permettant d’atteindre une précision d’implantation submillimétrique. Nous effectuerons un suivi post-opératoire accru, plusieurs fois par jour, qui sera consigné par le personnel en charge de l’animalerie sur une feuille de suivi post-opératoire suivant une échelle d'évaluation du bien-être adaptée au primate, basée sur des critères tels que la posture, l’activité motrice, les interactions sociales, la nutrition, l’hydratation, etc. Le suivi post-opératoire inclura également des antalgiques pour contrôler la douleur, des antibiotiques pour réduire le risque d’infection, et si nécessaire des corticoïdes afin de contrôler de possibles augmentations de pression intracrânienne. Les cicatrices seront inspectées quotidiennement et désinfectées à la bétadine. Les transports entre différents établissements s’effectueront dans une cage dédiée placée sur un chariot protégé des regards extérieurs par une housse, l’animal étant sédaté, maintenu au chaud sous une couverture, et bordé d’une bouillotte. Les éventuelles restrictions alimentaires ou hydriques seront introduites ou arrêtées de manière progressive, maintenues au niveau minimal efficace, et feront l’objet d’une surveillance et d’une réévaluation régulières. Ces procédures seront régulièrement mises à jour lors des réunions du comité SBEA. Enfin, les procédures seront arrêtées en cas d'atteinte d'un des points limites.
Choix des espèces
Au niveau scientifique, ce projet vise à étudier l’impact de la neurostimulation sur un réseau cérébral à grande échelle constitué notamment de l’hippocampe, du cortex entorhinal et du cortex préfrontal. Il existe une grande homologie de ce réseau entre le macaque et l’humain, mais cette homologie est nettement réduite avec d’autres espèces de vertébrés tels que les rongeurs, chez lesquels la définition du cortex préfrontal fait même débat. De plus, l’entraînement à des tâches cognitives suffisamment élaborées pour avoir un équivalent chez l’humain requiert l’usage de primates. Au niveau technologique, ce projet vise à développer des technologies de neurostimulation qui pourrait par la suite être appliquées à l’humain, ce qui nécessite un modèle anatomique suffisamment proche. Nous utiliserons des animaux à l’âge adulte (i.e. de plus de 5 ans environ). Le premier groupe contiendra des animaux entre 5 et 15 ans environ (âge adule moyen). Le deuxième groupe utilisera des animaux plus âgés (15-30 ans) dans le but d’observer des déficits de mémoire liés au vieillissement cognitif et de les compenser par la neurostimulation.
Etude préclinique de reconstruction osseuse par greffe de cellules progénitrices dérivées de la muqueuse orale en chirurgie maxillo-faciale chez le mini-porc.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
10 mini-porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées sévères. Chaque animal subit quatre interventions chirurgicales sous anesthésie générale, dont la création de pertes osseuses de la mâchoire et une greffe de six heures, le porteur comparant la douleur attendue à celle de l'ablation des dents de sagesse chez l'humain et signalant l'impossibilité de s'alimenter pendant 48 heures après chaque opération. Les mâchoires et les plaies sont prélevées après mise à mort pour évaluation histologique. Le porteur revendique l'intérêt de la technique pour réparer les "gueules cassées" et les "accidents de la face", et affirme qu'après des tests in vitro il devient "incontournable" de passer au modèle animal.
Objectifs
Il s’agit de pouvoir réparer les lésions des os de la face et du crâne en implantant des cellules souches là où la matière manque. Pour cela, notre équipe utilise les cellules mésenchymateuses issues de la pulpe dentaire, qui ne présentent pratiquement aucun risque de rejet. En effet, les cellules de la pulpe issues des dents et celles de la plupart des os de la face et du crâne ont une origine embryologique commune, ce qui explique l’intérêt de la pulpe dentaire pour réparer les os crânio-faciaux. A terme, les applications thérapeutiques pourront concerner aussi bien les os que les cartilages ou la dentition, et ainsi bénéficier à des maladies chroniques ou rares (rachitismes génétiques, maladies des os de verre) induisant de grandes pertes osseuses… Cette technique à fort potentiel peut également inspirer des thérapies pour réparer les « gueules cassées », militaires blessés de guerre ou en OPEX, civils accidentés de la route ou des sports à risques…
Bénéfices attendus
Cette nouvelle technique de greffe et particulièrement l’utilisation de cellules dérivées de la muqueuse orale apporte une avancé considérable en chirurgie maxillo-faciale reconstructrice. La perte importante de substance osseuse très fréquente dans les différents « accidents de la face » reste un obstacle majeur lors de ces chirurgies réparatrices. Les cellules issues de la muqueuse buccale ainsi préparées et amplifiées en laboratoire permettent de disposer d’une grande quantité de « biomatériaux » greffable comme substitue osseux. Elles ont le pouvoir de se différencier en ostéoblastes et n’induisent aucun rejet par le système immunitaire. Les premiers tests effectués ont montré une parfaite reconstruction à 2 mois de la greffe. Aujourd’hui il est important de connaitre l’évolution du greffon à long terme.
Procédures
Les animaux subiront 4 interventions chirurgicales sous anesthésie générale: -Prélèvement de tissus cutanés et gingivaux. Création de défaut osseux sur la mâchoire. (4h par animal) -Greffe osseuse au niveau des défauts induits (6h par animal) -Prélèvement des plaies cutanées et gingivales en cicatrisation. (2h par animal)
Impact sur les animaux
Suite au prélèvements du tissu gingival et des plaies palatines les animaux sentiront irritation du palais et une salivation excessive. L’ablation des dents, la réalisation des défauts osseux puis celle des greffes provoqueront une inflammation et une douleur similaire à l’ablation des dents de sagesse chez un humain. Pendant 48h après chaque intervention l’alimentation sous forme de granulés sec ne sera plus possible.
Devenir
La fin de la procédure nécessitera la mis à mort de l'animal car les machoires et les plaies seront prélevées pour une evaluation histologique et protéomique.
Remplacement
De nombreux tests préliminaires in-vitro sur explant ont permis de maitriser les différents paramètres de la greffe, à savoir le support à utiliser le type cellulaire et la stratégie d’analyse des résultats. Au terme de ces tests il devient incontournable de passer sur un modèle animal afin d'évaluer l'efficacité de la greffe dans un milieu complet ou interagissent les cellules greffées et le système immunitaire du receveur. Le mini-porc Aachner présente une mâchoire adulte aux environs de 18 mois et malgré quelques différences morphologiques les caractéristiques sont très proches de l'homme de par son alimentation omnivore. Le mini-pig permet une étude à long terme sans prise de poids qui rendrait la manipulation délicate.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé a été réduit au maximum afin d’offrir des résultats statistiquement fiables. L’évaluation des cicatrisations cutanées gingivales et osseuses sont réalisé sur le même individu afin de diminuer d’autant le nombre d’animaux utilisés. A la fin des procédures, les animaux mis à mort seront prélevés pour l’évaluation de nos tests et les cadavres seront mis à disposition des étudiants vétérinaire pour des cours d’anatomie et d’autopsie. Plusieurs des organes comme les poumons, les reins, le cœur et la moelle osseuse seront donnés au laboratoire de recherches pour des études ex-vivo.
Raffinement
Afin d’éviter tout stress et tout inconfort des animaux, l’ensemble des procédures sera effectués sur des animaux totalement acclimatés. Un hébergement en groupes sociaux de 2 à 4 animaux, dans un milieu enrichi de jouets dédier. Une routine de soins avec un entrainement à la manipulation ce qui permettra une induction directement dans l’espace de vie sans aucune appréhension. Toutes les interventions chirurgicales seront effectuées sous anesthésie générale avec intubation et analgésie morphinique. Les analgésies poste opératoire seront assurées par des patch de fentanyl à diffusion constante ce qui évite tout manque d’antidouleur dans l’organisme et assure une analgésie efficace et constante. Une couverture antibiotique post opératoire évitera tout risques infectieux. Après chaque procédure les animaux auront une nourriture adaptée sous forme de pâté liquide facilitant la mastication. En plus des nombreuses visites des soigneurs en post opératoire la surveillance est renforcé par un système vidéo continu. Les points limites ont aussi bien été établis en amont de l’étude. Les animaux atteignant un des points limites seront prises en charge par le stomatologue qui procédera aux soins adaptés puis les animaux seront vu par notre vétérinaire référent avant d’être envoyé vers un refuge adapté.
Choix des espèces
De nombreux tests préliminaires in-vitro sur explant ont permis de maitriser les différents paramètres de la greffe, à savoir le support à utiliser le type cellulaire et la stratégie d’analyse des résultats. Au terme de ces tests il devient incontournable de passer sur un modèle animal afin d'evaluer l'efficacité de la greffe dans un milieux complet ou inter-agissent les cellules gréffée et le systême immunitaire du receveur. Le mini-porc Aachner présente une machoire adulte au environs de 18 mois et malgrè des différences morphologiques des caractéristique très proches de l'homme de par son alimentation omnivore. les animaux seront agés de 15 à 20 mois qui correspond à l'age adulte et permet d'avoir des animaux avec une dentition définitive.
Modulation du microbiote intestinal par des probiotiques dans un modèle murin de maladie rénale chronique.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
56 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées modérées. Une maladie rénale chronique est induite par un régime enrichi en adénine pendant quatre semaines, suivie de six semaines d'administration de probiotiques dans la joue puis par gavage, avec incisions répétées du bout de la queue, test de tolérance au glucose et passage en cage métabolique. Le porteur reconnaît que les gavages répétés peuvent irriter l'œsophage, tout en indiquant n'avoir observé aucun comportement anormal lors de protocoles similaires. Il affirme qu'aucun modèle mathématique ou cellulaire ne peut répondre à la question et conclut à la nécessité du modèle animal.
Objectifs
La maladie rénale chronique touche 3 millions de français(es). Elle se caractérise par une diminution du fonctionnement des reins et par l’accumulation de déchets, les toxines urémiques, que le rein ne peut plus éliminer. Actuellement, la seule option thérapeutique pour diminuer ces toxines est la dialyse (solution thérapeutique lourde, invasive et réservée aux patients au stade terminal de la maladie). Récemment, le microbiote intestinal a emergé comme un acteur majeur de la production de ces toxines. Ainsi, l’utilisation de probiotiques dans le cadre de la maladie rénale chronique est une stratégie attractive visant à restaurer l’équilibre du microbiote, diminuer les toxines et donc améliorer l’état de santé. Pour rappel, les probiotiques sont des micro-organismes vivants qui excercent un effet positif sur l’organisme qui les ingère. L’objectif de ce projet est de tester le potentiel thérapeutique de 6 probiotiques, sélectionnés selon des critères spécifiques, regroupés en 3 combinaisons différentes chez des souris ayant une maladie rénale chronique. Les paramètres étudiés seront : la production de toxines, la fonction rénale, le métabolisme du glucose et l’équilibre du microbiote intestinal.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet permettra d’identifier un ou plusieurs probiotiques capables de diminuer la production des toxines à l’origine de la progression et des complications associées à la maladie rénale chronique. A moyen terme, ces probiotiques pourront être utilisés dans un essai clinique et ainsi, à plus long terme, être proposés comme solutions thérapeutiques aux patients souffrant d’une maladie rénale chronique. Comme mentionné précédemment, aucune solution n’est disponible pour ces patients.
Procédures
Grâce à une nourriture riche en adénine, la maladie rénale chronique sera induite de manière douce. 48 animaux recevront ce régime pendant 4 semaines (pause dans le régime tous les wek-ends, remise des croquettes contrôles). Les 8 autres souris recevront une alimentation normale pendant ces 4 semaines. Les fécès seront collectées avant le traitement aux probiotiques. Les 56 souris seront placées dans des cages individuelles propres pour collecter leurs fécès pendant 30 minutes. Un prélèvement de sang sera réalisé avant le traitement aux probiotiques et après 3 semaines de traitement pour mesurer l’urée (mesure le degré de fonction rénale). Une incision (- de 1mm) sera réalisée au scalpel sur souris vigiles à l’extrêmité de la queue et 15µL de sang seront recueillies avec un capillaire (propre et stérile). La durée du prélèvement sera inférieure à 1 minute/souris. Les 56 souris recevront les probiotiques (ou la solution contrôle) dans le creux de la joue pendant les 3 premières semaines (5 jours/7). L’administration se fera sur animal vigile et durera, contention comprise, 30 secondes/animal. Pendant les 3 semaines suivantes, les 56 souris recevront les probiotiques (ou la solution contrôle) par gavage dans l’estomac (6 jours/7). Le gavage se fera sur animal vigile et durera, contention comprise, 30 secondes/animal. Les 56 souris subiront un test de tolérance au glucose. Les souris seront mises à jeun le matin à 8h pour 6 heures pour mesurer la glycémie à jeun. Une incision (- de 1 mm) sera réalisée au scalpel à l’extrêmité de la queue et une goutte de sang sera deposée sur la bandelette de l’appareil mesurant la concentration de glucose. Ensuite, une injection de glucose sera réalisée dans l’abdomen puis la glycémie sera mesurée en recueillant au bout de la queue une goutte de sang à différents temps après l’injection (15, 30, 45, 60 et 90 minutes). Au cours de la dernière semaine, les 56 souris seront déplacées pour 24 heures, 2 par 2, dans des cages métaboliques pour collecter leur urine et leur fécès. A l’issue de la procédure, les 56 souris seront profondément anesthésiées par une injection dans l’abdomen (une fois 15 secondes contention comprise/animal) pour effectuer un dernier prélèvement sanguin (20 secondes). Les souris anesthésiées seront mises à mort immédiatement après le prélèvement sanguin (2 secondes).
Impact sur les animaux
Cette prodécure expérimentale devrait entraîner des nuisances modérées. La nourriture riche en adénine induit une diminution de la prise alimentaire et donc un léger ralentissement de la croissance pondérale pendant les 4 semaines d’induction de la maladie rénale chronique. La petite incision au bout de la queue pour récupérer du sang et mesurer l’urée peut générer du stress chez l’animal. Une contention quotidienne est nécessaire pendant 6 semaines pour réaliser l’administration des probiotiques dans le creux de la joue ou par gavage. Cette contention peut générer un stress chez l’animal le temps de la manipulation (moins d’une minute). La répétition des gavages pendant 3 semaines à raison de 6 jours sur 7 peut générer une irritation de l’œsophage et donc un inconfort pour les animaux. Pour le test de tolérance au glucose, l’incision du bout de la queue, le prélèvement d’une goutte de sang à 6 reprises et l’injection de glucose dans l’abdomen peuvent générer un stress et une légère douleur chez les animaux. Le changement d’environnement lors du passage en cages métaboliques peut générer un léger stress. Il est important de noter qu’au cours de protocoles similaires, il n’a pas été observé de comportements anormaux traduisant un stress, une souffrance, une douleur ou une anxiété des animaux.
Devenir
Les 56 animaux de ce projet seront mis à mort à l’issue du prélèvement sanguin terminal afin de collecter les tissus et répondre aux questions scientifiques.
Remplacement
Les mécanismes impliqués dans la production des toxines et dans le développement de la maladie rénale chronique sont multifactoriels et le résultat de la communication entre plusieurs organes (intestins, reins, foie,…). Des modèles mathématiques ou de la culture cellulaire ne permettraient pas de répondre à la question scientifique. Une étude clinique chez l’homme n’est pas envisageable à ce stade car il est impossible d’étudier en profondeur la fonction intestinale, la fonction rénale et le métabolisme de façon non invasive. L’étude de l’impact des probiotiques sur la production des toxines et sur l’évolution de la fonction rénale ne peut donc se faire, à ce jour, sans l’aide d’un modèle animal.
Réduction
Les probiotiques utilisés ici n’ont jamais été testés dans le cadre de la maladie rénale chronique. Les dispositions nécessaires ont été prises pour éviter le double emploi de la procédure. Le nombre de souris par groupe a été calculé à l’aide d’un logiciel et sur la base des données obtenues dans de précédents procotoles utilisant des souris atteintes de maladie rénale chronique. Afin d’obtenir une différence significative entre les groupes expérimentaux un effectif de 12 animaux par groupe est nécessaire. Pour le groupe contrôle (pas de maladie rénale chronique), un effectif de 8 animaux est suffisant pour une obtenir une puissance statistique suffisante. Le nombre maximum d’animaux utilisés dans cette procédure sera de 56. Un maximum de tissus seront récoltés lors de la mise à mort des animaux puis stockés. Ces tissus seront disponibles pour répondre à d’autres questions qui pourront émerger suite à l’obtention des premiers résultats et pourront également être partagés avec d’autres équipes. Cela permettra de ne pas répéter inutilement l’expérience.
Raffinement
L’utilisation du régime riche en adénine évite le récours à la méthode chirurgicale classique (2 interventions). Le régime sera interrompu tous les week-ends afin de limiter la perte de poids. Cette pause permet aux animaux de reprendre le poids perdu tout en ne nuisant pas au développement de la maladie. Les probiotiques seront donnés par gavage seulement pendant la seconde moitié du traitement (3 semaines/6) afin de réduire le stress et les irritations qui pourraient être liés aux gavages. Au cours des 3 premières semaines les administrations se feront dans le creux de la joue. Parmi les probiotiques testés certains sont anaérobies (ils ne doivent pas rentrer en contact avec l’air ambiant) et il a été démontré que l’administration de ces probiotiques par gavages donnaient de meilleurs résultats que l’administration dans le creux de la joue. Par conséquent, la phase de gavages ne peut pas totalement être éliminée du protocole au risque de diminuer fortement ses chances de réussite. Le volume des probiotiques administrés a été réduit au minimum. Les souris seront placées 2 par 2 dans les cages métaboliques pour limiter le stress dû à l’isolement et au changement d’environnement. Une période de 15 minutes d’habituation à ce nouvel environnement aura été réalisée un ou deux jours en amont afin de limiter encore d’avantage le stress des animaux. La concentration de la solution de glucose a été calculée de manière à limiter le volume injecté. Une seule incision au bout de la queue (moins de 1 mm) sera réalisée en début de test pour recueillir la goutte de sang nécessaire à chaque mesure. Les animaux seront maintenus dans leur cage d’origine pour limiter le stress. La glycémie sera surveillée jusqu’à son retour à la valeur basale. Les animaux seront surveillés 3 fois/semaine pendant le régime adénine puis tous les jours par la personne qui réalisera les administrations de probiotiques. Les animaux seront pesés 2 fois/semaine. Les souris seront profondément anesthésiées pour permettre le prélèvement terminal de sang. Les gestes techniques : incisions du bout de la queue, administrations intra-buccales, gavages et injection seront réalisés par une personne expérimentée afin de limiter le stress de l’animal. Des points limites précis, prédictifs et précoces seront définis afin de mettre à mort tout animal le nécessitant. Lors de nos précédents protocoles de ce type aucun mal-être, douleur ou souffrance n’a été observé.
Choix des espèces
La souris, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, reste un bon modèle pour étudier la maladie rénale chronique et les effets bénéfiques pouvant découler de la supplémentation en probiotiques. Cette espèce possède une physiologie proche de celle de l’homme et permet de reproduire les altérations de la fonction rénale observées chez les patients (accumulation des toxines, modifications du microbiote, modification du métabolisme). Des souris âgées de 8 semaines seront utilisées. A cet âge là, le régime riche en adénine est bien toléré par les animaux et on observe le développement d’une maladie rénale chronique modérée.
Remodelage des vaisseaux lymphatiques au cours du lymphœdème visualisé par la microscopie à feuille de lumière ou multiphoton.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées modérées. Chaque animal subit une chirurgie de section cutanée du réseau lymphatique associée à un curage ganglionnaire sous anesthésie générale, précédée d'un gavage au tamoxifène cinq jours de suite, pour mettre au point un modèle de lymphœdème secondaire. Seules des femelles sont utilisées, le modèle reproduisant le lymphœdème du bras après cancer du sein, et les souris sont tuées en fin de projet pour prélever les tissus. Le porteur affirme qu'il n'existe à ce jour ni organoïde ni explant conservant l'intégrité des vaisseaux lymphatiques et conclut à la nécessité du modèle animal.
Objectifs
Le lymphoedème est le résultat d’une obstruction ou d’une perturbation du système lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedème peut être soit primaire ou syndrome de Milroy, qui est une maladie génétique due à une mutation du gène codant pour le récepteur VEFGR3 , soit secondaire, généralement la conséquence d’un curage ganglionnaire chez les patients atteints d’un cancer (prostate, sein, mélanome). Le lymphoedème est une pathologie douloureuse et handicapante, cependant aucune thérapie visant la régulation du dysfonctionnement de ce réseau lymphatique n’est proposée. Pour ce projet, nous allons débuter la mise au point d’un nouveau modèle murin de lymphoedème secondaire induit pas une section cutanée du réseau lymphatique associé à un curage ganglionnaire axillaire et brachial chez les souris transgéniques ou le système lymphatique peut être visualisé grâce à l'expression spécifique d'une proteine fluorescente dans les cellules lymphatiques. Ceci va nous permettre de déterminer quelles sont les conséquences du lymphœdème sur l'ensemble du réseau lymphatique dermal et sous-cutané.
Bénéfices attendus
Nous pourrons établir l'architecture du systeme lymphatique et son organisation avec les différents compartiments du tissu dermal dans un contexte sain et pathologique. A ce jour, seuls les vaisseaux superficiels c'est à dire les capillaires lymphatiques pres du derme sont analysés. Or, un large reseau de vaisseaux pré-collecteurs sous le derme est affecté. Nous espérons pas ce projet déterminer de nouveaux marqueurs des cellules endothéliales lymphatiques nous permettant de transposer nos connaissances sur la pathologie humaine du lymphoedeme, et de mieux comprendre cette pathologie.
Procédures
les animaux subissent une seule procédure chirurgicale sous anesthésie générale. La durée de la procédure est de 20 min approximativement par animal. Les souris seront traitées par gavage oral avec 100ul solution de tamoxifene à 10mg/ml dissous dans de l'huile durant 5 jours consécutifs à l'age adulte (1mg/jour). cette procedure dure moins de 30 sec.
Impact sur les animaux
Les animaux seront observés par le chercheur ou les personnels de l’animalerie tous les jours pendant 1 semaine apres chirurgie et puis 3 fois par semaine pendant le reste de l'expérimentation . Ce suivi post-opératoire aura pour but de détecter une mauvaise cicatrisation, ou le moindre signe de douleur (signes tels que le dos encourbé, poils hérissés, isolement...), la capacité de s'alimenter, de boire, et de se déplacer.
Devenir
Les souris serons mis à mort à la fin du projet afin de prélever les tissus et organes pour des expérimentations en histologie.
Remplacement
A ce jour, il n'existe pas de système 3D, d'organoïdes ou d'explants permettant de garder l'intégrité et la fonctionnalité des vaisseaux lymphatiques et vasculaires. Nous souhaitons apres cette étude transposer nos hypotheses sur l'étude de biopsies de patients ayant subi une lipodermatectomie du à un lymphoedeme secondaire trop important.
Réduction
Seules les souris femelles seront analysées dans cette étude car la chirurgie du lymphoedeme secondaire mime le lymphoedeme secondaire apres un cancer du sein chez la femme. Il existe une variabilité du au modele de chirurgie donc nos lots seront de 8 animaux pour chaque objectif. Les quantifications seront faites à partir de l'analyse des images 3D. Les tests statistiques dépendront des parametres analysés sur chaque image.
Raffinement
Les animaux seront 5 par cage avec l'ajout de tunnels et de cachettes. L'utilisation d'anesthésique et d'analgésiques sera réalisée pour limiter la douleur de l'animal avant et apres opération pour minimiser les effets indésirables sur le bien-être pour les animaux.. Critères d'arrêt par rapport à la souffrance: dans le cas où l’animal ne répond plus à des besoins physiologiques énoncés ci-dessus, l’arrêt de l’expérimentation sera préconisé par l’expérimentateur ou toute personne en charge du suivi des animaux. Les animaux seront observés par le chercheur ou les personnels de l’animalerie tous les jours pendant 1 semaine puis 3 fois par semaine pendant le reste de l’expérimentation. Ce suivi aura pour but de détecter la douleur (signes tels que le dos encourbé, poils hérissés, isolement...), détecter la capacité de s'alimenter, de boire, de se déplacer selon une grille de lecture par score. Dans le cas où l’animal ne répondrait plus à ses besoins physiologiques, l'animal sera anesthésié par anesthésie chimique et apres perte de conscience, les animaux seront euthanasiés. Une observation quotidienne sera réalisée pendant la durée du projet. Dans nos connaissances actuelles, les procédures ne doivent pas changer le comportement des animaux et leur bien-être, même si les animaux sont gardés jusqu’à l’âge adulte.
Choix des espèces
L'étude des souris génétiquement modifiés est largement répandue et partagée dans la communaute scientifique internationale ce qui est un avantage en termes de transmission et de validité de nos résultats et permet une analyse integrée sur plusieurs tissus. Le stade de developpement est adulte. les animaux seront au stade adulte entre 8-10 semaines afin de mimer les conditions de la pathologie humaine.