Recherche fondamentale
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- Biologie du développement
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- Système urogénital
Etude du rôle de différents signaux pro-inflammatoires dans l’accouchement prématuré
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
55 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré, les femelles tuées et les mâles réutilisés. Les femelles gestantes reçoivent une injection de LPS déclenchant un accouchement prématuré, puis sont tuées pour prélever cornes utérines et placenta. Le porteur indique attendre une douleur liée aux spasmes abdominaux, avec des saignements utérins possibles, et administre un antalgique au-delà d'un score clinique. Il affirme avoir déjà travaillé sur cellules et tissus humains in vitro et vouloir confirmer ces résultats sur un modèle vivant, malgré des mécanismes de parturition différents entre l'humain et la souris.
Objectifs
La menace d’accouchement prématuré représente la première cause de mortalité néonatale et d’hospitalisation en cours de grossesse. Les médicaments actuellement utilisés pour éviter un accouchement prématuré présentent une efficacité limitée et de nombreux effets indésirables. Il est donc impératif de développer de nouveaux traitements plus efficaces et moins toxiques. Pour cela, la compréhension des mécanismes impliqués dans la mise en route du travail et l’identification de nouvelles cibles sont indispensables. Il a été démontré que des cytokines pro-inflammatoires sont impliquées dans l’activation du travail. Ces cytokines sont, entre autres, générées par l’intermédiaire de l’inflammasome. Compte tenu du rôle majeur de ces cytokines dans la mise en route du travail, il apparait donc essentiel d’étudier le rôle de l’inflammasome dans ces mécanismes. Notre hypothèse de travail est que la mise en route prématurée du travail est associée à une augmentation, entre autres, de la production d’IL1β consécutive à l’activation de l’inflammasome dans le myomètre. Nos résultats préliminaires in vitro, réalisés sur un modèle validé de stimulation des cellules musculaires utérines au LPS, montrent que la cytokine IL1β est produite en réponse à cette stimulation et est capable d’induire les mécanismes cellulaires associées au travail. Nous avons également pu montrer que l’inhibition de l’inflammasome est associée à une inhibition des mécanismes cellulaires associés au travail. Nos résultats in vitro impliquent donc la cytokine IL1β et l’inflammasome dans différentes étapes de l’accouchement prématuré. Afin d’étudier les mécanismes de l’accouchement prématuré in vivo, nous souhaitons utiliser un modèle d’accouchement prématuré couramment utilisé. Ce projet permettrait alors d’étudier l’effet sur l’accouchement prématuré du blocage de la cytokine IL1β et de l’inhibition de l’inflammasome en utilisant des traitements pharmacologiques. L’ensemble de ces résultats permettrait le développement d’un nouveau traitement de la menace d’accouchement prématuré.
Bénéfices attendus
L’accouchement prématuré est la première cause d’hospitalisation au cours de la grossesse et représente la première cause de mortalité néonatale. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes de mise en route du travail et d’identifier de nouvelles cibles pour le développement de médicaments. Avec ce projet, nous pourrons donc mieux comprendre les mécanismes de mise en route du travail liés à la cytokine IL1-β et à l’inflammasome. Nos travaux pourront ensuite servir à d’autres équipes pour développer de nouvelles molécules qui pourront agir sur les cibles que nous aurons identifiées.
Procédures
Les souris recevront une injection unique de LPS par voie i.p. ou s.c. (selon les données obtenues lors de la procédure 1). Si les scores « analgésie » sont dépassés, les souris recevront une injection unique de buprénorphine en sous-cutanée. Aucun prélèvement ne sera effectué sur animaux vigiles. Les interventions dureront moins d’une minute
Impact sur les animaux
L’injection de LPS va induire une mise en route du travail précoce mimant un accouchement prématuré. D’après nos précédentes études et la littérature, nous nous attendons à ce que les souris traitées au LPS ressentent de la douleur qui pourra se manifester par différents signes cliniques (transpiration, poils hirsutes, prostration, tremblement) liés aux spasmes abdominaux qui s’installent au cours de l’accouchement. Les souris pourront également avoir des saignements utérins.
Devenir
A la fin de la procédure expérimentale, nous souhaitons récolter différents tissus (cornes utérines, placenta) et vérifier l’absence de fœtus resté dans les cornes utérines. Pour cela, toutes les femelles seront mises à mort à la fin de l’étude. Les mâles seront réutilisés dans d’autres études.
Remplacement
Le rôle de l’inflammasome et de l’IL1 dans la menace d’accouchement prématuré a été démontré in vitro en utilisant des cellules primaires humaines et ex vivo sur des explants tissulaires humains. Nos résultats préliminaires, sur les tissus humains, montrent que l’IL1 est produite dans le tissu utérin au cours d’une pathologie inflammatoire (chorioamniotite) ou à la suite d’un traitement par le LPS. In vitro, nous avons montré que la cytokine IL1induit des modifications des cellules myométriales (morphologie, fonction) nécessaires à la mise en route du travail. Enfin, nous avons démontré, dans un modèle in vitro d’accouchement prématuré, que le blocage pharmacologique de l’IL1et l’inhibition pharmacologique de l’inflammasome sont associés à une inhibition des mécanismes cellulaires associés au travail. Ces études in vitro de remplacement nous ont donc permis de mieux connaitre la physiologie et les acteurs impliqués dans la menace d’accouchement prématuré. L’objectif est maintenant de confirmer ces résultats dans un modèle in vivo qui reproduira la physiopathologie de l’accouchement prématuré. Même si les mécanismes de parturition sont différents entre l’Homme et la souris, nous nous plaçons ici dans un cadre pathologique d’inflammation induite avant terme et la chute hormonale observée au cours de la parturition chez les souris n’interviendra pas. Ainsi, nous pourrons extrapoler les résultats obtenus sur la souris à l’Homme. Nous pourrons donc évaluer l’effet du blocage de l’IL1 et l’inhibition de l’inflammasome. Nos résultats permettront donc d’identifier une nouvelle cible thérapeutique, l’inflammasome, dans la menace d’accouchement prématuré. De plus, aucune étude in vivo n’a encore été réalisée avec un inhibiteur de l’inflammasome dans cette pathologie.
Réduction
Afin de réduire les biais expérimentaux, les souris gestantes seront randomisées après l’accouplement. Le travail se fera également en aveugle : une personne induira l’accouchement prématuré par injection de LPS et une seconde suivra le délai entre l’accouchement et l’injection. Les souris non traitées au LPS seront réutilisées pour un second accouplement et un traitement au LPS.
Raffinement
Avant le début de la procédure, les animaux seront entraînés à être manipulés afin de limiter le stress qui pourraient survenir au cours de la procédure expérimentale et qui pourraient fausser les résultats. Afin de réduire au maximum les nuisances causées aux animaux, les souris gestantes seront hébergées deux par deux pour leur permettre d’être au calme et seront pesées tous les 2 jours après accouplement pour suivre la gestation. Du matériel sera également apporté dans les cages pour permettre la construction du nid (une poignée de sizzle-dri lanières de papier kraft et 4 cylindres de coton par femelle) la nourriture non enrichie et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. L’étude préliminaire de la voie d’injection du LPS nous permettra d’envisager une voie d’administration moins douloureuse pour les animaux. Après l’injection de LPS, les souris seront surveillées toutes les deux heures pour vérifier la parturition et contrôler le bon état des souris. Des points limites « analgésie » seront établis en utilisant une grille de score clinique et les souris dépassant ces points limites seront traitées avec un antalgique non stéroïdien en injection sous-cutanée. Les souris ne seront pas pré-médiquées puisque les signes cliniques de mise en route du travail seront un des paramètres étudiés dans ce projet. En dernier recours, si les point limites « mise à mort » sont dépassés, les souris seront mises à mort pour limiter la souffrance.
Choix des espèces
L’étude de l’accouchement prématuré nécessite l’utilisation de mammifères dont la durée de gestation est courte et connue. Le modèle choisi est largement décrit dans la littérature et couramment utilisé dans cette thématique. Nous utiliserons des souris âgées d’environ 8 semaines correspondant à un stade de développement adulte et de maturité sexuelle de l’animal.
Évaluation de l’exposition paternelle chronique à de faibles doses de polluants environnementaux persistants sur le développement embryonnaire chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système urogénital
576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les mâles reçoivent par voie orale de faibles doses de polluants pendant trente-cinq jours, passent un test comportemental, puis sont croisés avec des femelles dont les embryons sont analysés, tous les animaux étant tués pour prélever testicules, cerveau et foie. Le porteur annonce un stress minimal lié à l'administration et surveille le risque de fausse route, avec un point limite de perte de poids de 10 %. Il cherche à évaluer des effets épigénétiques de l'exposition paternelle et affirme que la spermatogenèse et le développement embryonnaire ne sont possibles qu'in vivo.
Objectifs
L'objectif de l'étude est de révéler les effets de l'exposition chronique à faible dose sur le système reproducteur mâle en mettant l'accent sur les mécanismes épigénétiques. 1) Analyser les effets des polluants sur le nombre de spermatozoïdes et la méthylation de l'ADN. 2) Révéler les effets sur la méthylation de l'ADN dans le cerveau, le foie et les testicules embryonnaires. 3) Analyser les modifications du comportement de la descendance des animaux traités.
Bénéfices attendus
Nous répondrons à plusieurs questions. Nous chercherons à savoir si l'exposition à de faibles doses de polluants environnementaux persistants modifie la santé reproductive des souris mâles, le nombre de spermatozoïdes et si elle induit des altérations épigénétiques. Nous nous demanderons si les éventuels effets induits chez les mâles influencent le développement embryonnaire des futurs embryons tels que le cerveau, le foie et les testicules et, enfin, si le comportement des animaux adultes est altéré.
Procédures
Les animaux recoivent, par administration orale (0.1ml), des polluants à faible dose, 1 fois par jour, tous les 2 jours, pendant 35 jours. Cette intervention dure 30 secondes en moyenne. Le test de comportement durera 5 minutes et ne sera pas répété.
Impact sur les animaux
Les concentrations des polluants utilisés sont faibles et les composés seront dissous dans l'eau. Le stress lié à l'administration sera minimal. La fausse-route lors de l'administration est un risque qui sera surveillé. Le test de comportement peut générer une anxiété, un stress qui seront observés mais non répétés.
Devenir
Tous les animuax sont mis à mort à la fin de la procédure: nous analyserons les organes cibles de l'étude (testicules, cerveau et foie).
Remplacement
Le modèle de souris est couramment utilisé dans les études toxicologiques. Nous ne pouvons pas reproduire les effets sur le système reproducteur dans un système in vitro en raison de la complexité de la spermatogenèse et du développement embryonnaire très complexe et qui n’est possible qu’in vivo.
Réduction
Nous réduirons le nombre d'animaux en utilisant, pour les trois groupes de composés téstés, un seul groupe d'animaux contrôles. Cependant, l’utilisation de souches non consanguines nécessite 12 animaux par lot en raison de la forte variation entre les animaux, pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les composés seront administrés par voie orale, par des personnes formées et compétentes pour ce geste technique. Les souris seront traitées seulement tous les deux jours, ce qui aidera à réduire le stress. Les polluants testés sont dissous dans de l'eau. Application de points limites : perte de poids de 10% maximum, les animaux seront pesés 3 fois par semaine. Pour minimiser les effets indésirables, les animaux seront hébergés par lot de 4.
Choix des espèces
La souche Swiss RjOrl, souche non consanguine, est un modèle de choix pour les études. Les souches non consanguines sont utilisées dans de nombreuses études toxicologiques. Pour comprendre comment des facteurs toxiques influencent la gamétogenèse au cours du développement, le modèle de la souris est judicieux car très utilisé dans l’étude du développement chez les mammifères. Nous utiliserons des souris mâles adultes de 5 semaines car les jeunes animaux sont plus sensibles aux effets de la pollution. Nous utiliserons des animaux adultes lorsque la première vague de spermatogenèse sera accomplie et que les animaux seront capables de produire des spermatozoïdes. Lorsque le traitement sera terminé, les animaux auront atteint l'âge de deux mois, de sorte que les mâles seront capables de féconder les femelles. Pour l'étude embryonnaire, nous croiserons ces animaux mâles avec des femelles âgées de 8 semaines (à cet âge les femelles sont fertiles) et les embryons de 15 jours seront analysés.
Rôle de l’inflammation dans l’obtention d’un modèle animal pertinent du Moyamoya, une maladie vasculaire cérébrale
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
1 087 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et sévère. Porteuses de mutations liées à la maladie de Moyamoya, elles reçoivent dès l'âge de huit jours, sur animal vigile, des injections mimant une infection, puis des prélèvements sanguins avant mise à mort et prélèvement des organes. Le porteur décrit un stress de séparation, une douleur transitoire et des tremblements possibles si la maladie se développe, et ajoute vingt souris pour la formation de deux expérimentatrices. Il cherche à obtenir le premier modèle animal de cette maladie et juge l'étude "envisageable qu'in vivo".
Objectifs
L’angiopathie de Moyamoya (MMA) est une maladie rare des vaisseaux du cerveau. Cette maladie se définie par : 1/une diminution progressive du diamètre des gros vaisseaux qui apportent le sang au cerveau (artères localisées à la base du cerveau) qui peut atteindre l’occlusion et qui provoque un manque d’oxygène dans le cerveau, 2/la présence d’un réseau de petits vaisseaux fins et anormaux à la base du cerveau, qui se sont probablement formés pour compenser le manque d’oxygène cérébral entrainé par l’occlusion des artères cérébrales atteintes d’anomalie de MMA. Les patients MMA peuvent avoir des accidents vasculaires cérébraux. Les mécanismes de développement de la maladie sont encore largement inconnus aujourd’hui et aucun modèle animal n’existe. Une vingtaine de gènes ont déjà été identifiés comme responsables du MMA chez l’homme. En parallèle de ces données génétiques, de récentes études suggèrent qu’une infection virale ou bactérienne pourrait être un élément déclencheur du MMA chez les patients. Pour avancer dans la compréhension des mécanismes responsables du développement du MMA, l’obtention d’un modèle animal est cruciale aujourd’hui. L’objectif de ce projet est d’obtenir un modèle de MMA chez des souris qui porteront des mutations dans deux gènes déjà identifiés chez des patients MMA. Une infection bactérienne ou virale sera mimée (pour provoquer une inflammation) chez ces souris mutées pour comprendre si cela déclenche ou non le développement du MMA comme suggéré dans les études cliniques chez l’homme. Ce projet propose de caractériser les vaisseaux cérébraux chez ces souris mutées et soumises à une inflammation à la recherche d'une anomalie des vaisseaux du cerveau qui ressemblerait à celle qui se développe chez les patients atteints de MMA. La définition de ce qui serait alors le premier modèle animal de MMA permettrait de faire avancer la compréhension des mécanismes responsables du développement de cette maladie et d’envisager de nouvelles approches pour stopper l’évolution de la maladie chez l’homme.
Bénéfices attendus
Les mécanismes responsables du développement de la maladie sont largement inconnus aujourd’hui. Il n’existe aucun modèle animal de MMA. L’obtention d’un modèle de MMA chez la souris permettrait : 1-d’étudier comment se développent des lésions MMA au niveau des vaisseaux du cerveau en suivant leur évolution au cours du temps et 2-de mieux comprendre les mécanismes responsables du développement de la maladie. Il est par exemple important de comprendre si l’inflammation provoquée par une infection virale ou bactérienne peut déclencher la maladie. A plus long terme, comprendre comment se développent les lésions des artères du cerveau chez les patients MMA permettra d’envisager des approches médicamenteuses pour limiter voire stopper le développement de la maladie chez les patients.
Procédures
L’ensemble des animaux du projet sera soumis à deux injections en intra-péritonéale (c’est-à-dire dans la cavité abdominale) d’un composant mimant une infection virale ou bactérienne à 8 jours et 15 jours de vie. L’injection est rapide (30 secondes/souriceau) et réalisée sur animal vigile (c’est-à-dire conscient, en éveil) et sans anesthésie. Les animaux analysés au 15ème jour après la naissance seront euthanasiés et le sang et les organes seront prélevés en post-mortem. Les autres animaux seront analysés à 1, 2, 4 et 6 mois. Un à 3 prélèvements sanguins sur animal vigile seront réalisés entre l’âge de 1 et 6 mois, au niveau de la veine faciale (manipulation totale d’1 min/animal). A la fin de l’expérimentation, l’ensemble des animaux sera soumis à une analgésie et à une anesthésie générale. Un petit groupe de souris recevra une injection dans le sinus veineux situé à côté de l’œil, d’un marqueur fluorescent de l’intérieur des vaisseaux après l’anesthésie. Puis, une surdose d’anesthésie sera administrée. Le sang sera récupéré dans la cage thoracique avant de débuter une perfusion intracardiaque de liquide pour éliminer le sang contenu dans les vaisseaux. Les organes seront prélevés post-mortem.
Impact sur les animaux
La séparation des petits de leur mère au 8ème et au 15ème jour après la naissance pour procéder à leur injection peut entrainer un stress transitoire. Les injections réalisées chez ces souriceaux peuvent causer une douleur transitoire et locale. L’inflammation induite peut entraîner une déshydratation transitoire des petits. Si la maladie de moyamoya se développe, les animaux atteints pourraient présenter des tremblements.
Devenir
L’ensemble des animaux est mis à mort à l’issu de la procédure, soit au maximum 1067 animaux. 20 animaux supplémentaires ont été ajoutés pour permettre la formation de deux expérimentatrices au prélèvement sanguins en sous-mandibulaire. Ces 20 animaux seront euthanasiés à l’issu de la réalisation du prélèvement sanguin.
Remplacement
Ce projet consiste à étudier les liens potentiels existants entre la présence de mutations dans certains gènes, l’inflammation et le développement de la maladie cérébro-vasculaire de MMA. Il requiert l’utilisation d’un organisme vivant complet possédant à la fois un système immunitaire et des vaisseaux sanguins dans le cerveau dans un environnement physiologique normal. Pour cela, cette étude n’est envisageable qu’in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux total nécessaire a été prévu pour être limité au maximum. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé par des calculs statistiques appelés tests de puissance, issus des résultats déjà connus d’études précédentes. Deux petits d’intérêt seront obtenus par portée et les autres petits des mêmes portées seront tous considérés comme des animaux contrôles. Afin de pallier l’éventuelle mortalité induite par le protocole d’inflammation chez le souriceau, 10% d’animaux supplémentaires sont ajoutés par groupe. Ce taux ne sera sans doute pas atteint dans ce projet puisque le protocole d’induction d’inflammation est plus modéré et réalisé à un stade de développement plus tardif que ceux utilisés pour calculés ces 10% dans des travaux déjà publiés. La caractérisation des vaisseaux cérébraux et rétiniens sera réalisée en priorité dans les groupes de 1 mois et 6 mois. Si aucune anomalie vasculaire n’est observée à 6 mois, les autres groupes ne seront pas réalisés.
Raffinement
Les mères gestantes sont isolées avant la mise-bas, des mouchoirs en papier sont mis à leur disposition pour la confection du nid. Avant chaque manipulation des petits, la mère est isolée dans une cage le temps strictement nécessaire à la procédure. Les gants des expérimentateurs sont passés dans la litière sale pour atténuer leur odeur avant la manipulation des petits. Le nid confectionné par la mère n’est pas détruit, les petits sont manipulés un par un sont tous redéposés dans le nid avant réintroduction de la mère. Le sevrage est effectué après 21 jours de vie, avec un maximum de 6 animaux du même sexe par cage. L’identification des animaux d’intérêt et des animaux contrôles se fait par la technique de génotypage (technique permettant de déterminer la présence ou l’absence de mutations dans les gènes étudiés) réalisée sur des poils prélevés au moment du sevrage des animaux. L’enrichissement de chaque cage est systématique avec du papier absorbant et la présence de petites maisons. Tous les animaux concernés par les procédures sont observés quotidiennement. Ils feront également l’objet d’un examen détaillé hebdomadaire par une personne responsable du projet. L’aspect général (qualité du pelage, absence de larmoiements des yeux, gonflement de l’abdomen), le comportement de l’animal (déplacement, prostration, agressivité) et le poids seront analysés pour déceler précocement tout signe d’inconfort ou de douleur (suivi définit en fonction de l’âge). En cas de signes de souffrance décelés, un traitement antalgique sera administré. Dans le cas d’une persistance au-delà de 2 jours, l’animal sera mis à mort selon une méthode réglementaire.
Choix des espèces
Les vaisseaux du cerveau chez la souris sont très proches de ceux trouvés dans le cerveau humain. Par ailleurs, différentes lignées de souris mutées dans l’un des gènes responsables du moyamoya chez l’homme sont disponibles. Les animaux seront utilisés à différents âges au 8ème et 15ème jours de vie (pour correspondre au moment de la naissance et au jeune enfant chez l’homme) pour l’induction et la caractérisation de l’inflammation et à 1, 2, 4 et 6 mois pour la caractérisation des vaisseaux cérébraux/rétiniens pour pouvoir suivre le développement au cours du temps des anomalies vasculaires. Les groupes 1 mois et 6 mois seront réalisés en premier. En l’absence d’anomalie des vaisseaux ressemblant aux anomalies vasculaires des patients Moyamoya les autres points ne seront pas réalisés.
Un nouvel outil pour la thrombolyse ciblée de l’AVC ischémique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
459 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance sans réveil et modéré. Elles subissent une chirurgie d'induction d'un accident vasculaire cérébral ischémique, une pose de cathéter et une perfusion de traitement, avec pour une partie une IRM. Le porteur décrit des douleurs postopératoires, une perte de poids et des déficits fonctionnels liés à l'ischémie, et juge qu'il n'est pas éthique de garder ou réutiliser ces animaux, dont les tissus alimentent une biobanque. Il cherche à tester des microbulles censées cibler le caillot et affirme qu'aucun modèle ne peut remplacer l'étude in vivo de l'ischémie.
Objectifs
L’Accident Vasculaire Cérébral (AVC) est la 1ère cause de handicap acquis chez l’adulte, posant un problème majeur tant dans le domaine de la santé publique que sur le plan humain. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (r-tPA) associée ou non à la thrombectomie. Toutefois, seule une faible proportion des patients (< 10%) peut être traitée, du fait des effets secondaires de l’injection de r-tPA (risques d’hémorragie cérébrale et de mort neuronale excitotoxique) et de la relative difficulté d’accès à la thrombectomie. L’investissement de la recherche et la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques semblent indispensables, dans ce cadre où l’AVC représente un enjeu de santé publique avec de forts impacts au niveau des populations, et où trop peu de patients ont accès à un traitement. Lors de la thrombolyse intraveineuse, une dose élevée de r-tPA est injectée dans toute la circulation générale afin de pouvoir thrombolyser le caillot lors de son passage au niveau de l'artère occlue. L'objectif de ce projet est de tester et caractériser différentes techniques de thrombolyse et de mettre en évidence leurs avantages et leurs inconvénients. Ce projet s’axera aussi surtout autour d’un outil prometteur de thrombolyse ciblée associé ou non à une sonothrombolyse (thrombolyse par ultrasons). L’outil de thrombolyse ciblé se présente sous la forme de microbulles de fucoïdane, ayant la particularité d’avoir une affinité naturelle pour la P-sélectine, une protéine d’adhésion exprimée lors d’un processus inflammatoire, comme un AVC. Ces microbulles une fois injectées se fixeraient au niveau du caillot où la cascade d’inflammation se déroule. En les chargeant de r-tPA, il serait alors possible d’acheminer directement le traitement au niveau du caillot, et donc de diviser la quantité totale injectée par 10 (vu in vitro). Cette réduction de la dose administrée permettrait de réduire le risque de survenue d’effets secondaires, afin d’élargir la fenêtre thérapeutique. Les bulles peuvent être éclatées à distance par des ondes ultrasonores, ce qui permettrait possiblement de libérer le r-tPA autour du caillot, et d’aider à la thrombolyse. Elles sont également fluorescentes ce qui permet de suivre leur parcours dans la circulation ainsi que leur recapture par les différents organes en charge de les éliminer.
Bénéfices attendus
L'objectif du projet étant de proposer une nouvelle modalité de traitement thrombolytique ciblé, les bénéfices seraient de pouvoir réduire la dose de r-tPA actuellement administrée en clinique, et d'ainsi réduire le risque de survenue des effets secondaires (transformation hémorragique et mort neuronale excitotoxique) directement liés au r-tPA, et ainsi élargir la fenêtre thérapeutique, ce qui permettrait l'accès à la thrombolyse intraveineuse à plus de patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie comprenant une pose de cathéter (5 minutes) et une induction d'ischémie (20 minutes), à une infusion de traitement par voie intraveineuse (40 minutes), et pour certains à une acquisition en IRM avec ou sans injection intraveineuse d'agent de contraste (8 à 20 minutes).
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables étant susceptibles d'apparaître chez les animaux seraients : Des douleurs post-opératoires après la chirurgie d'induction de l'ischémie ou à la craniotomie, une perte de masse corporelle après l'anesthésie et l'induction de l'ischémie, des déficits fonctionnels à la suite de l'ischémie, une gêne ou une douleur occasionnée par l'injection du traitement (changement de volémie, réaction au traitement), perte de l'intégrité de la Barrière Hémato Encaphalique (BHE) et donc hémorragie liée à la sonothrombolyse, une gêne liée au site d'insertion du cathéter après le réveil.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à l'issue de chaque procédure. Cependant, un degré de sévérité a été fixé pour les procédures 1 à 16, car les animaux seront réveillés en cours de procédure (entre la chirurgie et l'imagerie). Même si l'on observe une bonne récupération chez les souris après l'induction d'une ischémie, et que chaque douleur potentielle est prise en charge avant même sa survenue, il n'est pas jugé éthique de replacer ou faire adopter ces animaux, pour leur bien-être. La réutilisation dans d'autres procédures n'est également pas souhaitée, car ces animaux auront déjà subit une ischémie avant la mise à mort. Enfin, les tissus de chaque animal seront prélevés post-mortem afin d'alimenter une biobanque, et pourront être réutiliser pour des études ultérieure. Cela permet de respecter le principe de réduction et de raffinement des 3R.
Remplacement
Dans ce projet, il n'est pas possible de remplacer le modèle animal. Il s'agit d'étudier un modèle in vivo avec tous les mécanismes vasculaires physiopathologiques associés survenant lors d'une ischémie. Les effets des molécules pharmacologiques sur l'ischémie et sur la lésion associée, ainsi que leur parcours in situ ne peuvent être investigués autrement que via un modèle in vivo.
Réduction
Le nombre d'animaux a été déterminé en reprenant les données antérieures testant des molécules pharmacologiques sur le devenir des lésions ischémiques sur les souris, et ayant montré des effets significatifs en réduisant le plus possible les effectifs. Conformément à la règle des 3R, le nombre d'animaux nécessaires a été réduit au maximum, en se basant sur les études déjà réalisées au sein du laboratoire, dans la littérature, ainsi que sur un calcul de puissance statistique, permettant d'avoir des résultats significatifs avec un minimum d'animaux. En prenant en compte les paramètres physiopathologiques attendus sur la base d'études antérieures et pour un seuil de significativité à 95% et une puissance de 80% (beta = 20%), 31 animaux seraient nécessaires dans chaque groupe, d'autant plus que le nombre de groupes étant élevé, il est nécessaire d'avoir suffisamment d'animaux dans chaque groupe pour espérer voir un effet.
Raffinement
Les souris sont surveillées quotidiennement par du personnel qualifié. Une attention particulière est accordée à l'état général, à l'évolution de la masse corporelle, ainsi qu'au comportement de chaque animal. Les animaux auront le temps de s'acclimater à la nouvelle animalerie après leur réception auprès du fournisseur pendant une semaine, puis seront habitués à la manipulation chaque jour pendant une semaine avant le début du protocole, afin de limiter le stress lié à l'expérimentateur, et apprendre aux souris à coopérer. La grégarité sera respectée en plaçant les souris par groupe de 5 dans des cages enrichies (maisonette, coton, craft, briquette de bois à ronger), avec de l'eau et de la nourriture ad libitum. Durant l'induction de l'ischémie, les souris seront sous anesthésie générale couplée à une analgésie, et sous anesthésie locale, adaptées à l'espèce et à l'intervention réalisée . Du gel ophtalmique sera appliqué sur les yeux de la souris durant chaque anesthésie générale afin d'éviter le dessèchement oculaire et la cécité. La température corporelle des souris sera assurée durant chaque anesthésie générale par un tapis chauffant rétrocontrôlé par sonde rectale, et les règles d'aseptie et d'antisepsie durant les chirurgies seront respectées. Après la chirurgie d'induction de l'ischémie, les souris disposeront de croquettes humides en purée dans une coupelle au sol afin de faciliter la prise de nourriture et l'hydratation. Concernant l'application des points limites, les animaux seront mis à mort en accord avec la réglementation dans les 24 heures suivant l'observation d'un ou de plusieurs des points limites prévus. Si des signes de douleur modérées sont observés, un rappel d'analgésique adapté sera réalisée dépassé 6h de chirurgie. Avant ce délai, il sera observé si les souris s'alimentent et s'abreuvent correctement, et pourront être re placée en enceinte chauffante à 32°C si prostration.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l'espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences, et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L'ensemble des connaissances et des acquis à disposition au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce pertinente pour étudier l'efficacité d'un nouveau traitement dans le cadre de la recherche sur l'AVC ischémique. L'étude se déroulera sur une souche de souris (Swiss), qui est peu coûteuse et dont la maintenance et la manipulation est simple. Les souris utilisées seront de jeunes adultes entre 5 et 8 semaines (5 semaines lors de l'arrivée dans l'animalerie, et 8 semaines lors de la fin du protocole). Le projet est réalisé avec de jeunes adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d'ischémie. De plus, l'étude du développement ou du vieillissement n'est pas l'objet de ce projet.
Effet de la crise de migraine induite par des donneurs de monoxyde d’azote sur la dépression corticale envahissante chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance sans réveil et modéré. Ils reçoivent des injections de donneurs de monoxyde d'azote censés reproduire la migraine, subissent un test comportemental de sensibilité faciale au filament de von Frey, puis des enregistrements électrophysiologiques sous anesthésie profonde sans réveil après application de chlorure de potassium. Le porteur indique comme seul effet attendu une allodynie faciale et reconnaît que le modèle ne reproduit pas tous les aspects de la migraine. Il affirme qu'un "animal entier avec un système nerveux intégré" est un préalable et juge les méthodes in silico "trop primaires".
Objectifs
L’isosorbide dinitrate (ISDN) et la nitroglycérine (NTG), sont des donneurs de monoxyde d’azote (NO). Ils sont utilisés comme modèles de migraine chez les rongeurs en raison de leur capacité à induire des céphalées chez les humains. Cependant, il est important de noter que ces modèles ne reproduisent pas tous les aspects de la migraine, notamment la manifestation d'aura ? De plus, leur utilisation doit être combinée à d'autres modèles pour obtenir une compréhension complète de la pathologie de la migraine. Le chlorure de potassium (KCl) est utilisé comme modèle pré-clinique de dépression corticale envahissante (CSD) dans la migraine avec aura car il est capable de déclencher une décharge électrique similaire à celle qui se produit dans le cerveau lors d'une crise de migraine. En utilisant ce modèle, en combinaison avec l’ISDN ou le NTG, nous pourrons étudier les mécanismes sous-jacents de la CSD et de la migraine, ainsi que tester de nouveaux traitements potentiels. L'objectif est d'évaluer la faculté de deux donneurs de NO à altérer le seuil de déclenchement et le nombre des épisodes de CSD provoqués par application de concentrations croissantes de KCl au niveau cortical chez le rat anesthésié. La CSD est caractéristique des évènements survenant lors du déclenchement des crises de migraine et constitue dans la littérature un outil pour étudier la migraine avec aura.
Bénéfices attendus
A moyen terme, en combinant deux modèles de migraine chez les rongeurs (Isosorbide dinitrate+chlorure de potassium et Nitroglycérine+chlorure de potassium), ce projet a pour but d’améliorer les outils existants dans la recherche pré-clinique pour étudier la physiopathologie de la migraine avec aura. Si nous arrivons à identifier de nouveaux acteurs ainsi que leurs rôles, cela nous permettra de mieux comprendre cette pathologie. A plus long terme, ces études peuvent aider à développer de nouveaux traitements pour soulager les patients souffrant de migraine avec aura.
Procédures
Les interventions dans ce projet sont prévues sur une durée maximale de 2 semaines. 1/ Injections (intra péritonéales i.p.) sur des animaux vigiles (Maximum 4). Chaque animal reçoit au maximum 1 injection i.p. par jour (durée d’intervention : 1min). 2/ Réalisation des enregistrements électrophysiologiques sous anesthésie générale profonde au 5ième jour (protocole ISDN), ou 8ième jour (protocole NTG). 3/ La sensibilité mécanique est mesurée par un test de von Frey qui consiste à appliquer sur la face du rat (zone périorbitaire) une gamme de filaments de von Frey, calibrés pour exercer une force (exprimée en grammes) constante. Les rats sont habitués à ce test durant les 5 jours. Ces mesures sont peu douloureuses (durée de stimulation 3 sec) puisqu’elles consistent en la mesure d’un seuil avec possibilité d’échappement. Tous les jours, les rats seront soumis au test comportemental de von Frey et la force exercée qui entraine le retrait de la tête sera mesurée sur chaque rat, avant et après l’administration de saline, ISDN ou NTG.
Impact sur les animaux
Selon la littérature et notre expérience avec le modèle Isosorbide dinitrate et Nitroglycérine ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux autre que le développement d'une allodynie, surtout à niveau facial. Les rats doivent pouvoir continuer à se mouvoir, se toiletter, exercer leurs gestes habituels comme manger et boire. Aucune nuisance ou effet indésirable est attendu après l’administration de chlorure de potassium car elle aura lieu chez l’animal anesthésié (procédure sans réveil).
Devenir
Impossibilité de récupérer les animaux du fait de la procédure effectuée et des risques irreversibles (infectieux traumatiques) en cas de réveil.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément. Il n'existe pas dans la littérature aucune méthode alternative (in vitro ou in silico) pouvant répondre à l'efficacité d'un produit à potentiel thérapeutique antimigraineux. Un animal entier avec un système nerveux intégré, même sous anesthésie, est un préalable à une étude pertinente dans le domaine de la douleur. Une méthode in vitro ne pourrait rendre compte de la douleur car elle supprimerait de nombreux paramètres (régulations...) et rendrait le résultat réducteur voir inadapté. Des études électrophysiologiques chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence le déclenchement d'évènements de dépression corticale envahissante après l'application de chlorure de potassium. Les études in silico constituent dans le domaine de la migraine encore une étape encore trop primaire aujourd'hui.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum (n=10/groupe/sexe). Un seul groupe témoin sera utilisé (5 injections de saline). Le nombre d'animaux par groupe est défini à partir de notre expérience et des tests statistiques donnant le nombre nécessaire pour la discrimination des effets (http://www.quantativeskills.com/sisa). D’après les données du laboratoire nous prévoyons une perte maximum de 20 % de rats (qui pourront être écartés de l'étude), en raison de l'instabilité ou de la perte en cours de manipulation in vivo des enregistrements électrophysiologiques (baisse très importante de la pression artérielle témoin d'un problème homéostasique, ou perte du signal de courants corticaux).
Raffinement
L’expérience des travaux précédents (Dallel et al., 2017) montre que suite aux injections uniques ou répétées d'ISDN le rat ne présente aucun trouble moteur ou postural affectant ses capacités à se déplacer, à satisfaire ses besoins physiologiques (alimentation hydratation...). L'allodynie ne se traduit pas par une fuite ou une agressivité lors de la manipulation pendant et en dehors des sessions de test de sensibilité mécanique. La prise de poids reste normale. Néanmoins, si au cours de l’expérimentation, nous observons que les animaux ont de grosses difficultés à se mouvoir, se toiletter, se relever pour se nourrir, ou un mauvais état de leur pelage, ils seront euthanasiés par dose létale de pentobarbital (150 mg/kg). Pour l'enregistrement électrophysiologique, les expériences peuvent être interrompues par une mise à mort par overdose de pentobarbital iv, si les conditions physiologiques d'enregistrement ne sont plus assurées, suite à une altération durable et irréversible des paramètres cardiorespiratoires.
Choix des espèces
La souche Sprague Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires . C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Nous utiliserons des animaux entre 8-12 semaines, pour comparer avec les données du laboratoire. Les différents études sur la migraine sont réalisées sur des animaux adultes. Cette pathologie est majoritaire chez les personnes adultes. Chez l'enfant, ses caractéristiques sont un peu différentes de l'adulte.
Prélèvement de tissus pour la caractérisation génétique (génotypage) des modèles animaux génétiquement modifiés.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système nerveux
18 000 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans une procédure impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune subit une biopsie du bout de la queue ou de l'oreille sous simple contention, geste que le porteur décrit comme une douleur légère avec un stress lié à l'immobilisation. Les souris sont gardées vivantes après le prélèvement, leur devenir dépendant ensuite du génotypage, sélection pour d'autres projets, maintien des colonies, ou mise à mort pour prélèvement de tissus ou faute d'usage. Il présente la biopsie comme la méthode la plus performante pour identifier les lignées modifiées et entretenir ces élevages.
Objectifs
Le laboratoire participe à plusieurs projets qui nécessitent le développement et l’utilisation de modèles murins génétiquement modifiés. Ce projet a pour objectif d’identifier et de caractériser génétiquement les animaux. Chaque animal, identifié par tatouage aux doigts ou par injection de nanopuces, sera caractérisé par génotypage sur une biopsie de bout de la queue ou d’oreille. Cette demande d’autorisation de projet de génotypage se justifie par la nécessité de : - sélectionner les animaux d’intérêt pour différents projets de recherche (inclus dans d’autres demandes d’autorisation de projet) menés au laboratoire ; - sélectionner les animaux d'entretien des colonies ; - sélectionner les animaux pour les prélèvements d’organes ou de tissus post mortem pour des études ex vivo (hors champ de demande d’autorisation de projet).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de la procédure de génotypage sont de permettre une sélection des animaux d’intérêt.
Procédures
Une biopsie de la queue ou un bout d’oreille (durée : quelques secondes) est réalisée sur animal vigile puis déposé dans un microtube. Dans la très grande majorité des cas, un seul prélèvement sera réalisé par animal. En cas de problème lié à l’analyse génétique de la biopsie, un deuxième prélèvement pourra être envisagé.
Impact sur les animaux
Les biopsies de queue ou d’oreille sont des gestes qui provoquent une douleur légère. L’animal est maintenu en contention pendant la biopsie ce qui représente une source de stress.
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie à l'issue de cette unique procédure. Leur devenir diffère ensuite selon les résultats du génotypage : a/ ils sont sélectionnés pour un projet de recherche (inclus dans d'autres demandes d’autorisation de projet); b/ ils sont conservés pour l’entretien des colonies ; c/ ils sont euthanasiés pour des prélèvements de tissus post mortem ; d/ ils sont euthanasiés si leurs caractéristiques ne répondent pas aux besoins du projet et si aucune autre utilisation n’est possible.
Remplacement
Il n’existe à ce jour pas de méthodes aussi performantes que la biopsie de queue ou d’oreille pour réaliser le génotypage des souris, qui est nécessaire pour valider les études utilisant des lignées d’animaux génétiquement modifiés, et entretenir ces lignées.
Réduction
A ce jour, nous ne disposons pas d’autres moyens aussi efficaces permettant de caractériser et sélectionner les animaux génétiquement modifiés. Les personnels de l’animalerie établissent, en concertation avec le responsable de la lignée, les plans d’élevage en amont, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux générés et donc d’animaux génotypés.
Raffinement
Les biopsies sont réalisées par un personnel expérimenté. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Elles sont réalisées avec du matériel adapté permettant un geste rapide et précis. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Les cages y sont amenées les unes après les autres afin de réduire autant que possible le stress des animaux. Enfin, dès que la procédure est terminée, les nouveau-nés sont remis en présence de leur mère. Un suivi des animaux est réalisé suite à cette procédure et des points limites adaptés ont été mis en place.
Choix des espèces
Les modèles murins génétiquement modifiés sont très utilisés pour comprendre des pathologies humaines car les outils pour générer ces modèles sont bien connus et très efficaces. Le temps de génération d’une lignée est court (3 mois) et son élevage en laboratoire simple. Les biopsies sont réalisées sur des animaux âgés d’au moins 8 jours. L'essentiel des lignées sont génotypées à cet âge pour permettre d'avoir le résultat de génotypage au sevrage et de sélectionner uniquement les animaux d'intérêt à l’âge adulte.
Dérégulation des phosphoinositides et myopathie
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Sur 224 souris, 72 reçoivent dans un muscle de la patte une injection de notexine, une toxine qui déclenche la régénération du muscle, et sont suivies 3, 12 ou 24 jours, 48 reçoivent dans ce même muscle un virus porteur d'un gène, suivies cinq semaines, et toutes sont marquées par tatouage des phalanges et génotypées par un prélèvement de queue. Le projet étudie deux lignées qui reproduisent un dérèglement de lipides en cause dans la myopathie myotubulaire, où les souris peuvent développer une faiblesse musculaire importante, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées à l'issue pour disséquer leurs muscles. Un lot de souriceaux de deux semaines est en outre exploité pour établir des cultures de cellules musculaires. Le porteur écrit que la toxine "pourrait rarement provoquer une nuisance modérée (irritations et démangeaisons)", et précise dans le même passage que le muscle injecté "retrouve sa fonction normale" au bout d'une vingtaine de jours.
Objectifs
La myopathie myotubulaire est une maladie génétique néonatale très grave caractérisée par une hypotonie et une atrophie musculaire sévère. C’est une maladie incurable qui conduit au décès des patients par détresse respiratoire dès le plus jeune âge. Le gène responsable de cette maladie code la Myotubularine. C'est une enzyme qui régule une classe de lipides appelée phosphoinositides (PIs). Ce projet a pour objectif de caractériser et d’étudier deux modèles de souris qui reproduisent la dérégulation des lipides contrôlés par la Myotubulaine. Notre but est d’identifier les processus cellulaires ciblés par ces lipides dans le tissu musculaire et comment leur dérégulation impacterait l’apparition et la progression de la maladie. Dans ce contexte, des résultats de l’équipe montrent que l’accumulation les lipides régulés par la Myotubularine régulent le systéme de dégradation des protéines. D’autre part, nos expériences dans des modèles cellulaires dépourvus de la Myotubularine montrent que ces cellules manifestent des défauts de différentiation musculaire. Nous proposons ainsi d’étudier les impactes de la dérégulation des lipides régulés par la myotubularine MTM1 dans le modèle murin (in vivo) spécifiquement dans le muscle squelettique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de décortiquer dans un contexte intégré et physiologique les effets musculaires de la dérégulation des lipides régules par la Myotubularine et ainsi apportera une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques mis en jeu dans la myopathie myotubulaire liée à l’X. Il permettrait ainsi de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques pour cette maladie génétique incurable.
Procédures
Injection d'une toxine (Notexin) à faible dose qui induit la régénération du muscle et donc la formation de nouvelle fibres musculaires: Nombre 72, Durée = 3J ou bien 12J ou bien 24J Post injection (en intramusculaire). Injection d'un viris (l'Adeno-associated virus) pour permettre l’acheminement de gène (non oncogène) dans un tissu afin d'étudier en détail la fonction de ce gène d’intérêt : Nombre 48, Durée 5 semaines post injection (en intramusculaire). Tous les animaux utilisés dans ce projet sont identifiés par un tatouage aux phalanges et sont génotypés suite à un prélèvement de queue inférieur à 0,5mm par le service de l’animalerie habilités pour ce geste.
Impact sur les animaux
Les souris concernées dans cette étude peuvent développer une faiblesse musculaire importante. Chez l’homme la pathologie liée à la perte de fonction des gènes étudiées dans ce projet induit une myopathie rare et sévère avec qui entraine le décès chez les nouveau-nés ou à l’enfance. De ce fait on suspecte que les protéines étudiées sont nécessaires au développement du muscle qui démarre pendant la vie fœtale. Afin d’étudier ce process et de s'affranchir de l’analyse des fœtus, on a choisi de reproduire la formation du muscle en injectant une toxine (Notexin) à faible dose qui induit la régénération du muscle et donc la formation de nouvelles fibres musculaires. Cette injection se fait d’une manière localisée (Tibialis de la souris) mais pourrait rarement provoquer une nuisance modérée (irritations et démangeaisons). La formation de nouvelles fibres musculaire dans le modèle murin se fait assez rapidement au bout d’une vingtaine de jours et le muscle retrouve sa fonction normale. De même, afin d'approfondir le lien entre nos gènes d’intérêt et la régénération musculaire, on propose d’utiliser un outil d’acheminement des gènes pour les exprimer dans un tissu : les Adénovirus associés. C’est une approche fréquemment employée dans le muscle et utilisée dans les thérapies géniques chez l’homme. L’injection de ces virus est localisée (Tibialis) et ne provoque pas d’effets nuisibles notables chez les souris (résultats antérieurs publiés par le porteur du projet). Enfin tous les animaux utilisés dans ce projet sont identifiés par un tatouage aux phalanges et sont génotypés suite à un prélèvement de queue inférieur à 0,5mm par le service de l’animalerie habilités pour ce geste.
Devenir
A l'issue des procédures 1 2 et 3, les animaux sont mis à mort et les muscles sont disséqués et analysés. Ces analyses sont indispensables pour comprendre comment l’altération des phosphoinositides impacte des processus importants de la proteostase musculaire dans le contexte de la myopathie myotubulaire.
Remplacement
En dépit de l’exitance de modèles cellulaires (cellules musculaires de souris dépourvus de l’expression de MTM1 et de Fbxw7) développés par le porteur du projet, ces modèles ne traduisent pas la physiopathologie de la maladie. En effet, cette myopathie apparait dès la naissance chez l’homme et s’aggrave progressivement en touchant spécifiquement le muscle (la fibre musculaire formée qui ne peut pas être reproduite en culture cellulaire). Cette particularité rend l’exploration des cellules musculaires en culture très limitante (restreint aux aspects moléculaires et cellulaire de la perte de l’expression de la protéine MTM1) pour étudier la physiologie de la maladie et envisager des solutions thérapeutiques. De même, il n’existe pas à ce jour des systèmes cellulaires plus intégré (type organoïde) pour étudier le muscle qui est un organe complexe soumis à l’innervation et la contraction. En ce qui concerne la régénération musculaire, c’est un processus complexe qui met en œuvre l’ensemble des cellules résidentes dans le muscle (fibres musculaires, cellules immunitaires, cellules de soutiens du stroma, cellules nerveuse…) et de ce fait impossible à reproduire dans un système in vitro/in cellulo ou ex vivo). Ainsi, le recours au modèle murin est irremplaçable pour le déroulement de ce projet.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est 8 animaux pour les lignées sans intervention et 6 animaux pour les mêmes lignées avec intervention. Deux animaux en plus par groupe seront inclus afin d’anticiper des pertes. Ainsi le nombre de souris/groupe est réduit à son maximum en respectant les contraintes statistiques dans les publications scientifiques, sans compromettre les objectifs du projet et pour permettre des analyses statistiques fiables. Le nombre de souris utilisé est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs en tenant compte de la variabilité entre individus et entre groupe experimentaux.
Raffinement
L’effet de la réexpression de MTM1 et de Fbxw7 dans le muscle des deux modèles étudiés par l’outil AAV fera l’objet d’un suivi. Dans les deux cas, afin de restreindre la réexpression de MTM1 et Fbxw7 dans les cellules musculaires et minimiser au maximum des effets indésirables potentiels, les deux gènes seront sous contrôle d’un promoteur musculaire (expression restreinte au muscle squelettique). La procédure de suivi des animaux injectés par la Notexin ou des Adeno associated virus consistera à faire des observations quotidiennes. Tout effet indésirable peu importe son degré fera l'objet d'un suivie. Une observation des animaux en expérimentation est réalisée quotidiennement. L’état général de l’animal est évalué : prise de nourriture, toilette et mouvements habituels sont considérés comme des signes de bonne santé. La douleur est évaluée par les signes de prostration, de perte d’appétit ou de poids et de mouvements pénibles. Le poids qui traduit entre autres la masse musculaire (atteinte musculaire suite à la délétion des gènes d’intérêt) sera mesuré dès la naissance et tous les 3 jours. L’environnement des animaux est enrichi (bandes de papier Sizzle-Nest pour la nidification, cube de bois pour usure des dents, tunnel ou d'igloo). Pour les animaux qui développeront une faiblesse musculaire (myopathie), l'accès à la nourriture et à l'eau sera facilité en plaçant des croquettes humidifiées et de l'hydrogel dans la cage. Des points d'alertes et des points limites sont fixées par le responsable afin d'entreprendre l'action à appliquer pour réduire la souffrance animale.
Choix des espèces
Nous utilisons des souris parce que le modèle animal de la perte fonctionnelle de la Myotubularine reproduit les principales caractéristiques de la maladie humaine et permet ainsi de se rapprocher le plus de la physiopathologie de la maladie. Le modèle Fbxw7 n’est disponible que chez la souris. D’autre part, l’étude de la myogenèse in vivo après la régénération musculaire a été trés bien décrite chez la souris. C’est un processus conservé et de ce fait traduit ce qui se passe chez l’homme. Il n'existe pas de modèles alternatifs et accessibles pour induire et suivre la myogenèse au cours du temps. Les cultures primaires de cellules satellites isolées de souris de 2 semaines présentent l'avantage de reproduire la différenciation musculaire ex vivo et de complémenter les résultats acquis in vivo, permettant ainsi de réduire le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. Les souris sans intervention seront utilisées entre 2 et 20 semaines selon le besoin (survie du phénotype). Un lot de souriceaux âgés de 2 semaines sera utilisé afin d’établir des cellules primaires et compléter l’étude in vivo après régénération (diminuer le nombre de souris). Cet âge est la meilleure fenêtre de prélèvement pour isoler les cellules souches du muscle (cellules satellites).
Etude des effets thérapeutiques lors du traitement par radiothérapie interne via l’utilisation de nanoparticules chargées au Rhénium-188 et d’un bio-implant dans le cas du glioblastome chez le rat (2/2)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection intracérébrale de cellules tumorales, la pose d'un implant biodégradable et selon les groupes une radiothérapie, avec un suivi IRM hebdomadaire et un transport de 95 kilomètres pour l'irradiation externe. Le porteur décrit fatigue, perte de poids et prostration possibles, et fait tuer tous les animaux pour éviter la souffrance liée à la croissance du glioblastome. Il juge le recours à deux modèles de rats "indispensable" pour obtenir des données transférables à la clinique.
Objectifs
Le développement de ce projet chez le rat permettra d'évaluer si l'attraction de cellules cancéreuses résiduelles dans un implant biodégradable en zone confinée (la cavité d'ablation de la tumeur dans le cerveau) apporte un bénéfice préclinique en synergie d'une radiothérapie. Ce projet sera réalisé au sein de deux établissements du fait de l'inclusion d'un acte de radiothérapie externe à distance du site principal.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est une meilleure compréhension des effets d'implants interventionnels au sein des cavité d'éxérèse dans le glioblastome en synergie d'irradiation pour une amélioration de la prise en charge de ces tumeurs ultérieurement chez l'homme.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés et soumis à des actes expérimentaux modérées telles que : - l'injection intracérébrale de cellules tumorales (durée d'environ 30 minutes) - la pose en locorégional d'implants bio-polymère (durée d'environ 1h) - l'injection intracérébrale de cellules tumorales associée à la pose en locorégional d'implants bio-polymère (durée d'environ 1h30) - l'association ou non à des radiothérapies (durée d'environ 30 minutes fractionnée en 2 ou 3 fois selon le type de radiothérapie). En fonction de la procédure concernée un animal peut subir d'un seul acte jusqu'à 3. Pour toutes les procédures, les suivis IRM (durée d'environ 30 minutes) sont réalisés de manière hebdomadaire. L'un des actes (radiothérapie externe) inclue un transport aller-retour d'environ 95 kilomètres (soit environ 1 heure).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus par les procédures chirurgicales peuvent être comportementales et physiques, exemples : fatigue, stress, réponses au stimulus altérés, mauvaise cicatrisation, perte de poids, prostration... Ces effets indésirables peuvent être présents, plus ou moins prononcés ou même absents selon les procédures subies et les animaux eux-mêmes. L'effet attendu de l'implantation des cellules tumorales est le volume de la tumeur qui peut être plus ou moins important selon les traitements appliqués par la suite aux animaux. Pour plus de détails, voir le tableau des points limites adaptés en annexe. En ce qui concerne le transport, celui-ci peut induire une fatigue et un stress nécessitant pour les animaux du repos.
Devenir
Tous les animaux du projet sont mis à mort pour éviter toute souffrance liée à la pousse du glioblastome.
Remplacement
La thématique de recherche de notre équipe concerne le développement d’approches thérapeutiques pour le traitement du glioblastome et l’étude des modalités de mise en place posant à la fois des questions fondamentales et des questions de biotechnologies pour la santé. Le projet ici proposé a pour but l’étude du piégeage tumoral au travers de bio-implants polymères pour l’éradication de tumeurs cérébrales. Sa mise en place nécessite l’utilisation d’animaux dans des modèles dédiés pour valider les étapes de piégeage (au travers d’un leurre environnemental) et celle d’élimination (au travers de l’application d’une procédure de radiothérapie interne vectorisée). L’utilisation de deux modèles pour valider ces procédures et obtenir des données interprétables par la suite valorisables par la publication et transférables à la clinique est indispensable pour répondre aux questions et livrables scientifiques indiqués dans le résumé non technique.
Réduction
En amont de ces expériences chez l'animal, divers essais sur des cellules dissociées ainsi que des sphéroïdes ont été réalisés limitant aux seuls prototypes utiles alors implantés chez l'animal la réalisation de cette étude. Un groupe référence incluant la radiothérapie externe est introduit, toutefois sans modifier le nombre initial d'animaux prévus pour l'étude, tout en devant générer des données statistiquement interprétables.
Raffinement
Les mesures spécifiques pour réduire les nuisances sur le bien-être animal dans les procédures expérimentales incluent : une surveillance accrue, des soins pré et post-opératoires, des mesures de gestion de la douleur, de bonnes conditions d'hébergement, l'enrichissement du milieu.
Choix des espèces
Ce projet sera développé chez le rat, permettant des gradients d’infusion de chimio-attractant et des migrations cellulaires sur des volumes et distances plus importants que chez la souris. La possibilité d’utiliser deux types cellulaires dans deux types de rats est envisagée afin d’investiguer les réponses dans un cadre de xénogreffe d’une part et dans un cadre syngénique d’autre part (permettant d’étudier le rôle de l’immunité). En effet, nous avons validé des cellules humaines modifiées (de niveau sécuritaire 1) sur-exprimant le récepteur CXCR4, jouant un rôle dans les réponses aux radiations, et une protéine de fluorescence ; ce modèle sera utilisé chez le rat nude. Par ailleurs la lignée cellulaire F98 (modèle de GB de rat) sera utilisée chez le rat Fischer pour les études syngéniques. Les rats seront utilisés à 8 semaines car ils seront, à ce stade, de jeunes adultes matures.
Conséquences neurobiologiques et comportementales d’un stress précoce en deux temps chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 224 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré et sévère. Séparées de leur mère trois heures par jour pendant quatorze jours puis soumises à une agression sociale et aspergées d'urine de mâle, elles passent six tests comportementaux, des prises de sang et deux chirurgies d'injection virale et d'implantation de fibre optique. Le porteur reconnaît une gêne durable, anhédonie, anxiété et apathie, "qui ne peut être soulagée", et n'euthanasie qu'au-delà de points limites. Il vise à distinguer souris vulnérables et résilientes et affirme que ces troubles ne peuvent être reproduits sans animaux vivants.
Objectifs
La dépression est une maladie psychiatrique extrêmement répandue et représente la première cause d’invalidité dans le monde. Elle est précipitée par des évènements de vie néfaste, notamment la maltraitance infantile, qui est le plus grand prédicteur pour le développement de dépression et de suicide à l’adolescence et à l’âge adulte. Cette adversité est par ailleurs associée à une forte résistance aux traitements utilisés en clinique. Par ailleurs, la dépression est majoritairement précipitée par l’expèrience de plusieurs évènements stressants qui arrivent à différents moments de la vie. Cependant, les conséquences à long terme de la maltraitance infantile varient d’un individu à l’autre et certains vont présenter la capacité de s’adapter en réponse au stress et éviter ses conséquences néfastes, c’est le concept de résilience au stress précoce. Comprendre les mécanismes neurobiologiques qui contribuent à la résilience est primordiale afin de mettre en évidence des facteurs de protection face au développement de psychopathologies qui serviront de nouvelles cibles thérapeutiques pour ces patients. Le système noradrénergique du locus-coeruleus joue un rôle majeur dans la résilience au stress chez l’adulte. Par ailleurs, si certaines études ont montré une dérégulation de ce système dans des modèles animaux de stress précoce, son rôle dans la résilience au stress précoce n’est pas connu. L’objectif de ce projet est de mettre en place un modèle murin de stress précoce en deux temps chez la souris. Nous associerons un modèle de séparation maternelle avant le sevrage avec un stress juvénile d’agression sociale à l’adolescence afin de dissocier des groupes d’animaux susceptibles vs résilients en fonction de leur phénotype comportemental à l’âge adulte et d’étudier si des altérations différentielles sur le système nerveux apparaissent. Pour cela nous utiliserons une approche comportementale dans le but d’étudier les conséquences du stress précoce sur le développement de comportement anxio-depressif à l’âge adulte ainsi que des techniques d’immunohistochimie, de biologie moléculaire et d’imagerie pour étudier les conséquences du stress précoce en deux temps sur le système noradrénergique en fonction de la susceptibilité au stress. Les résultats de ce projet serviront de base pour développer des modèles de manipulation génétique ou fonctionnelle de ce système dans le but d’enrayer les conséquences à long terme du stress précoce et de promouvoir la résilience.
Bénéfices attendus
L’adversité précoce est sans conteste le premier facteur de vulnérabilité pour les maladies psychiatriques telles que la dépression, les troubles anxieux, le syndrome de stress-posttraumatique, et pour le suicide. Outre la souffrance morale induite par ces pathologies, elles constituent un enjeu majeur de sante publique compte tenu du fardeau socio-économique engendré. Ces pathologies sont difficiles à prendre en charge, avec des traitements qui sont actuellement peu satisfaisants en termes de coût et d’efficacité. Ce projet a un intérêt majeur puisqu'il permettra d'améliorer la compréhension de la neurobiologie de dépression et de la résilience afin de concevoir de nouvelles approches thérapeutiques plus efficaces pour ces patients.
Procédures
- Stress précoce en deux temps : un stress de séparation maternelle de 3h par jour pendant 14 jours et un stress juvénile d’agressions sociale de 5 minutes pendant 2 jours. Au cours du stress d’agressions, les souris seront espergées d’urine de mâles. Les souris seront ensuite testées dans 6 paradigmes comportementaux anxio-depressif de 5 à 10 minutes sur une période de 3 semaines à l'âge adulte. Chaque souris n'est exposé qu'une seule fois à chaque test de comportement. Par la suite, les souris recevront 3 prélèvements de sang sur une période de 3 heures. - 2 procédures chirurgicales : une première procédure d'injection de virus sera réalisée suivie d’une deuxième procédure d'implantation de fibres optique, entre 2 à 3 semaines suite à l'injection de virus. Chaque procédure chirurgicale aura lieu sous anesthésie pour une durée de 1 ou 2 heures chacune.
Impact sur les animaux
La nature de cette expérience aboutira à une gêne (anhédonie, anxiété et apathie). Lors de la procédure de stress juvénile de défaite sociale, les animaux sont mis en contact avec une souris agressives 5 minutes par jour pendant 2 jours. Des blessures ou lésions induites par les agressions physiques lors de cette procédure peuvent être observées. Toutes les attaques sont surveillées et stopées si elles perdurent afin d’éviter la formation de lésions. Les souris agressives seront isolées à leur arrivé à l’animalerie pour éviter les combats entre elles.
Devenir
A l'issue des 4 procédures, les animaux seront mis à mort et les cerveaux utilisés pour des analyses immunohistologiques ou de biologie moléculaire.
Remplacement
L’objectif de ce projet de recherche étant d’étudier l’émergence de troubles psychiatriques en réponse au stress, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Notre projet nécessite l’emploi de plusieurs techniques expérimentales. Compte tenu de la littérature et de notre expérience, nous utiliserons les tests statistiques pour analyser nos données. Ces tests nécessitent d’avoir un nombre minimum d’animaux pour atteindre les seuils statistiques de significativité en fonction des expériences réalisées . D’après notre expèrience, une grande variabilitée individuelle peut être observée lors des enregistrements en imagerie calcique en fonction de l'expression virale et du site d'implantation. Basé sur la littérature des effets comportementaux du stress et des changements neurobiologiques qui y sont associés, un dimorphisme sexuel est suspecté . C’est pourquoi nous utiliserons à la fois des mâles et des femelles en considérant ici le sexe comme une variable d’analyse supplémentaire.
Raffinement
La nature de certaines de nos expériences, en particulier celles dont le but est de déterminer les effets du stress et de la dépression sur le cerveau, aboutira à une gêne (anhédonie, anxiété et apathie) qui ne peut être soulagée. Par contre, si un animal est en souffrance selon les critères définis, alors, il sera euthanasié. Les conditions d’élevage des animaux seront optimisées avec la mise à disposition de plusieurs supports pour la construction des nids (carton, coton). Pour limiter l’angoisse des animaux, ceux-ci seront habitués à l’expérimentateur, au dispositif et à la pièce d’expérimentation pour éviter un stress supplémentaire. Les jeunes seront manipulés avec douceur et par des personnes habituées à manipuler des jeunes souriceaux. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et des protocoles analgésiques seront mis en place pour limiter la douleur des animaux. Des points limites ont été établis pour chaque procédure. Nous incluons ici une procédure pilote sur un petit nombre d’animaux, pouvant donner lieu à un arrêt total des expériences. Cette phase du projet combinant le stress en deux temps et deux procédures de chirurgies sera uniquement lancée si nous n’observons aucune surmortalité des petits par rapport aux conditions sans les chirurgies.
Choix des espèces
La souris est le modèle standard pour l'étude de la fonction des circuits cérébraux dans le cerveau des mammifères : i) l’anatomie et la physiologie de la souris sont suffisamment complexes pour modéliser de nombreux aspects de la biologie humaine ; ii) L'anatomie, la morphologie cellulaire, la biochimie et l'électrophysiologie du cerveau de la souris sont bien caractérisées ; iii) Il existe une vaste littérature sur le comportement de la souris, l'apprentissage et la mémoire. Par ailleurs, il est possible d'utiliser des souris Génétiquement modifiées. L’objectif du projet étant d’étudier les conséquences comportementales et neurobiologiques à long terme du stress précoce tel que la maltraitance infantile, dans notre modèle de stress précoce en deux temps, la séparation maternelle sera réalisée sur des animaux non sevrés et le stress juvénile d’agression sociales 1 semaine après le sevrage . Les tests comportementaux et analyses neurobiologiques seront réalisés à l’âge adulte.
Analyse d‘une protéine d‘intérêt et de ses variants dans la prolifération de l’ovaire et du testicule chez la souris embryonnaire
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
294 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Des femelles gestantes reçoivent une injection intrapéritonéale, précédée pour une partie d'un gavage, puis sont tuées quatre heures plus tard pour prélever les embryons et analyser leurs gonades. Le porteur signale un stress de contention et des altérations possibles au site d'injection, sans autre nuisance déclarée. Il cherche à identifier les gènes de la détermination du sexe et affirme que les cultures cellulaires ou organoïdes ne reproduisent pas le développement dynamique de l'organe, ces modèles n'existant "que chez la souris".
Objectifs
Chez l’homme (et la souris) l’appareil génital comprend différents organes, dont les gonades qui sont les organes producteurs des cellules reproductives ou gamètes. Au cours du développement, les gonades indifférenciées vont se différencier en testicule ou en ovaire selon le sexe de l’embryon grâce au processus de détermination du sexe, initiant ainsi tout le développement sexuel de l’individu. Tandis que le gène SRY, responsable de l'initiation du développement testiculaire, a été identifié il y a plus de 30 ans, le déterminant ovarien reste inconnu. Cela montre notre méconnaissance des mécanismes qui contrôlent la détermination du sexe. Notre objectif est d’avancer dans la compréhension des mécanismes moléculaires de la détermination du sexe. Chez l’homme, les mutations de certains gènes induisent des anomalies du développement de la gonade suggérant qu’ils sont impliqués dans la détermination du sexe. Cependant leur mécanisme d’action reste à élucider. Nous analyserons l’impact des mutations des gènes impliqués dans le déterminisme sexuel sur la prolifération et la différenciation cellulaire des gonades de souris portant les mêmes mutations. Cela va permettre d’approfondir notre connaissance des gènes impliqués dans la détermination du sexe mais aussi d’identifier les causes de certains des nombreux cas de troubles du développement sexuel qui n'ont pas encore trouvé d'explication à ce jour.
Bénéfices attendus
De nombreuses pathologies de la détermination du sexe restent incomprises en raison de notre méconnaissance des réseaux génétiques contrôlant ce processus, et les cliniciens restent souvent sans réponse quant au diagnostic et à la prise en charge de bébés atteints d’anomalies du développement sexuel. Ce travail permettra à terme d'avancer dans la compréhension de ces pathologies et de proposer des solutions thérapeutiques et un suivi appropriés des problèmes d'insuffisances hormonales, d'infertilité (devenue un problème majeur en santé publique) et des prédispositions aux cancers gonadiques des patients.
Procédures
Des femelles gestantes seront injectées une seule fois dans la cavité abdominale avec un produit qui permet de suivre la prolifération cellulaire puis mises à mort 4 heures après l’injection pour prélever les embryons et analyser leurs gonades. Cela concerne 240 souris. Dans d’autres cas les femelles (54) seront d’abord soumises à l’administration d’un produit par gavage oral (pour inactiver des gènes spécifiquement dans les gonades embryonnaires) à deux reprises à 24 heures d’intervalle puis à l’injection du produit qui permet de suivre la prolifération cellulaire avant d'être mises à mort 4 heures après l’injection pour prélever les embryons et analyser leurs gonades. Aussi bien l’injection que le gavage oral sont réalisées en 20 à 30 secondes maximum.
Impact sur les animaux
Le gavage oral nécessite une contention, qui peut induire un stress temporaire. Cette procédure est utilisée en routine au laboratoire, ce qui limite le temps de contention. Les injections par voie intra-péritonéale peuvent entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, ...).
Devenir
Toutes les femelles gestantes traitées seront mises à mort afin de prélever les embryons aux stades embryonnaires précoces nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
Ce projet a été élaboré et sera réalisé dans le respect de la règle des 3R (remplacer, réduire, raffiner) : le recours à l'expérimentation animale est essentiel pour la biologie du développement et l'étiologie de la différenciation sexuelle: en effet, les techniques de culture cellulaire ou organoïdes ne permettent pas d'appréhender le développement dynamique de certains organes qui nécessite vascularisation et contexte tridimensionnel et ont montré leurs limites en aboutissant à des résultats erronés. Cependant si de nouvelles conditions de culture satisfaisantes sont élaborées, nous les utiliserons dans la perspective de remplacer les souris par ces nouvelles technologies.
Réduction
Afin d’obtenir des résultats reproductibles nous estimons que nous aurons besoin de 8 embryons par expérience et par génotype, ce qui correspond à trois réplicats pour l’histologie et cinq réplicats pour les analyses d’expression des gènes. En cas d’imprévus, nous anticipons de collecter 10 embryons par expérience et par génotype. Cependant dès que nous obtiendrons des résultats statistiquement significatifs, nous arrêterons nos expériences.
Raffinement
La qualité de la contention, l’usage d’un matériel autoclavable permet d’assurer une un gavage une injection intra-péritonéale efficaces et rapides, limitant le stress et la douleur imposés à l’animal par la procédure. Le personnel a été formé pour cela. Les solutions pour injection intra-péritonéale et pour gavage sont maintenues à la température corporelle de 37°C pour éviter tout inconfort de la femelle. Ces mesures sont accompagnées de la mise en place d’un protocole d’observation permettant de déceler précocement tout inconfort des animaux durant les expériences. Tout comportement anormal indiquant une souffrance constitue un point limite et entrainera la mise à mort immédiate. Les animaux seront hébergés par deux ou par trois dans des cages comportant différents types d’enrichissement comme des objets à ronger et des igloos pour se faire un nid de façon à garantir leur bien-être et leur permettre d'exercer les activités spécifiques à leur espèce.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Nous avons tous les outils à notre disposition et déjà au point pour pouvoir étudier ces modèles d’ablation/gain-de fonction conditionnelle inductible dans la souris. Ces modéles n’existent que chez la souris. Les femelles gestantes en procédure seront mises à mort à différents moments de la gestation : 10.5 jpc (jours post conception) (début de la différenciation gonadique), 11.5 jpc (détermination du sexe gonadique et début de la différenciation des cellules testiculaires), 12.5 jpc (début de la morphogenèse testiculaire et différenciation des cellules ovariennes), 13.5 jpc (initiation de la méiose chez la femelle). C’est seulement dans les lignées conditionnelles inductibles que nous étudierons la prolifération des cellules germinales à 13.5 jpc (1 stade de plus que dans les autres lignées).
Evaluation de probiotiques pour contribuer à l’établissement approprié du microbiote précoce chez le nouveau-né 2/2
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
539 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Colonisées avec des fèces humaines puis réparties entre régimes riches et pauvres en fibres, elles subissent des gavages répétés et des prélèvements de fèces sur quatre générations, pour tester une souche probiotique. Le porteur les fait tuer parce que leur microbiote fortement modifié les rend inéligibles à d'autres essais. Il affirme que le transfert multigénérationnel du microbiote ne peut pas être simulé in vitro.
Objectifs
L’objectif principal de ce projet est d’évaluer la capacité d’une bactérie à améliorer la récupération du microbiote intestinal altéré par un régime pauvre en fibres sur plusieurs générations. La colonisation microbienne du nouveau-né joue un rôle fondamental en santé humaine car elle est un facteur clé dans la mise en place des systèmes digestif, métabolique et immunitaire. Lorsque ce processus est perturbé, il peut y avoir une prédisposition à développer des maladies dites ‘non transmissibles’ telles que les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI), les allergies et l'obésité plus tard dans la vie. Cette colonisation est fortement influencée par la transmission du microbiote mère-nouveau-né. Les modifications du microbiote accumulées au cours de la vie d'une mère peuvent être transmises à sa progéniture. Une étude récente a montré que des souris ayant reçu un régime pauvre en carbohydrates accessibles au microbiote (microbial accessible carbohydrates, MAC, c’est-à-dire des fibres), une caractéristique des régimes occidentaux, affiche une capacité réduite à transférer les bactéries digérant les MAC d'une génération à l'autre. Ceci entraine un appauvrissement du microbiote intestinal, qui peut alors présenter une fonctionnalité dégradée. Au cours des premières générations, la réintroduction de MAC alimentaires peut restaurer le microbiote ; en revanche, après quatre générations, une telle récupération n'est possible que si ces bactéries manquantes au sein du microbiote sont introduites aux côtés des MAC. Ce projet propose de tester une souche probiotique candidate, isolée de fèces de bébé sain afin d’évaluer sa capacité à limiter ou restaurer l’appauvrissement du microbiote. Pour cela, nous allons coloniser des souris libres de germes en délivrant une solution de fèces humaines provenant de donneurs adultes sains. Les souris seront séparées en 3 groupes : régime riche en fibres, un régime pauvre en fibres et régime pauvre en fibres mais avec un traitement probiotique. Des souris vont être utilisées pour obtenir des portées de souriceaux sevrés sous les régimes respectifs de leurs parents. Cette stratégie d’élevage sera répétée pendant quatre générations. Dans une deuxième partie de projet, le probiotique candidat sera administré à la quatrième génération de souris (ayant consommé un régime pauvre en fibres afin d’évaluer sa capacité à restaurer les bactéries perdues lorsqu’il est réintroduit avec des MAC.
Bénéfices attendus
Le bénéfice du projet est d’évaluer la capacité d’une potentielle souche probiotique à améliorer la résilience du microbiote intestinal altéré par un régime pauvre en fibres sur plusieurs générations, lorsqu’elle est réintroduite en même temps que les MAC. De manière plus générale ce projet nous permettra d’apporter de nouvelles connaissances concernant le processus d’acquisition du microbiote intestinal et sa transmission à travers les générations.
Procédures
Gavages (- de 5 minutes par administration sur animal vigile): - 3 au total par souris sur 5 jours : 92 souris. - 1 jour sur deux pendant 3 semaines (11 au total) : 110 souris - 1 jour sur deux (3 au total) : 22 souris Prélèvement de fèces (environ 5 minutes par prélèvements, sur animal vigile) : - 2 fois par semaine : 4 prélèvements (92 souris) - 1 fois par semaine : 15 prélèvements (92 souris) 16 prélèvements (100 souris) 16 prélèvements (123 souris) 23 prélèvements (66 souris)
Impact sur les animaux
Les administrations intragastriques génèrent une douleur légère brève, pendant quelques secondes. Le transport d’une animalerie à l’autre peut générer un peu de stress pendant le transport (quelques minutes entre les animaleries) et après celui-ci, le temps que les animaux s’acclimatent. Les prélèvements de fèces peuvent causer aussi un peu de stress.
Devenir
Les animaux seront mis à mort car, ayant subi d’importantes modifications du microbiote, ils sont inéligibles pour être inclus dans d’autres essais
Remplacement
Notre projet porte sur la primo colonisation et le transfert multigénérationnel du microbiote intestinal, ceci met en jeu des interactions complexes qui ne peuvent pas être simulées in vitro.
Réduction
Nous utilisons toujours une approche statistique pour déterminer la taille de nos groupes en fonction de l’intensité des effets que nous souhaitons mettre en évidence et des données déjà disponibles. En se basant sur notre paramètre principal, l’alpha-diversité du microbiote, nous voulons mettre en évidence une différence du même ordre de grandeur que celle de l’écart-type. Dans ce cas, les tables pour comparer deux groupes de moyennes pour une variable continue (Snedecor et Cochran 1989) indiquent un besoin de 22 animaux par groupe.
Raffinement
Tout au long des procédures expérimentales, les animaux sont observés quotidiennement. Par ailleurs, les animaux sont hébergés à plusieurs afin de ne pas exposer ces animaux sociaux à un stress lié à l’isolement. Nous incluons des enrichissements dans les cages : cellulose à déchiqueter et permettant la création de nids, bâtons à ronger. Le matériel que nous utilisons (sonde de gavage) est évidemment adapté à nos animaux. Les sondes de gavages sont en plastique souple et fin (diamètre externe voisin du millimètre), à bords arrondis et de taille adaptée (4cm) pour empêcher les blessures et réduire l’inconfort. Des points limites sont définis afin de réduire au maximum la douleur ressentie par les animaux. Le transport des animaux d’une animalerie à l’autre se fait sur un temps de quelques minutes (500m à parcourir). Les animaux seront placés dans des containers opaques contenant un peu de leur litière d’origine et leur nid pendant ce transport afin de limiter le stress occasionné. Les containers sont généralement portés, ce qui génère peu de vibrations. Enfin, toutes les personnes manipulant les animaux sont formées et compétentes pour ce type d’expérimentation.
Choix des espèces
La souris est une espèce de référence en nutrition, toxicologie, cancérologie et immunologie et un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies humaines. Le besoin de travailler en environnement axénique (complètement stérile), principalement en isolateurs, compatibles avec la taille des animaux, constituent des facteurs imposant le choix de cette espèce animale. La lignée de souris utilisée a été sélectionné car elle a de fortes performances de reproduction et a une bonne taille de portée (6.4 nouveaux nés en moyenne). Les animaux libres de germes seront utilisés entre 5-7 semaines quand il s’agit de reproduire les souris àun âge optimal après les changements successifs de régime alimentaire . Les souris seront utilisées du stade du nouveau-né au stade adulte, durant la gestation, le sevrage et l’allaitement quand il s’agit de l’élevage.
Étude fonctionnelle des gènes d’une famille de facteurs de transcription chez le poissons-zèbre pour l’étiopathogénie de la scoliose idiopathique-EU1/2
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
780 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Trois lignées mutantes sont créées par inactivation de gènes, avec un prélèvement de nageoire caudale sous anesthésie et des imageries au micro-scanner à huit, douze et seize semaines, pour chercher si ces mutations reproduisent une scoliose. Le porteur annonce comme phénotype attendu une possible déformation de la colonne sans empêcher la nage ni l'alimentation, et euthanasie les poissons présentant des anomalies handicapantes. Il retient le poisson zèbre pour sa colonne longitudinale autorisant une torsion axiale, absente chez les modèles quadrupèdes.
Objectifs
La scoliose, dite idiopathique, qui touche près de 3 pourcents des sujets selon les régions géographiques, comporte une composante génétique. Cependant, les modalités exactes de transmission ne sont pas clairement établies. L’hypothèse sous-tenant le projet « scoliose et génétique » est que s’il existe des gènes de prédisposition à la scoliose « idiopathique », une analyse génétique poussée de familles scoliotiques présélectionnées par leur arbre généalogique permettra de détecter de nouvelles mutations spécifiquement associées à la pathologie par comparaison entre patients atteints et apparentés « sains ». Cette analyse a permis de découvrir une mutation d’un gène codant une protéine impliquée dans la transcription de l’ADN chez plusieurs personnes atteintes de scoliose idiopathique dans deux familles indépendantes. Chez le poisson-zèbre, il existe trois gènes qui pourraient être l’homologue de ce gène chez l’homme. Nous allons donc inactiver ces trois gènes indépendamment afin de générer trois lignées de mutants poissons-zèbres. Les mutants poissons-zèbres ainsi générés seront par la suite analysés cliniquement par l’imagerie afin de vérifier l’absence ou la présence de scoliose chez ces animaux. De ce fait, nous souhaitons utiliser le poisson-zèbre comme modèle animal pour étudier le rôle fonctionnel de cette protéine, et son implication dans la physiopathologie de la scoliose idiopathique. (ce projet se fera dans 2 établissements utilisateurs)
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu du projet est la validation du gène exploré dans la genèse de la scoliose idiopathique. Cette hypothèse serait renforcée par le développement de scolioses chez les mutants ainsi créés. La validation de ce variant permettrait d’avancer dans la compréhension de la genèse des scolioses idiopathiques (physiopathologie) et éventuellement à long terme d’avancer dans la prédiction de progression des courbures scoliotiques découvertes. En effet, la progression de l’identification des mécanismes génétiques causaux à la scoliose dite « idiopathique » permettrait de pouvoir proposer aux patients chez qui une scoliose est découverte un séquençage génomique précoce de manière à avoir une meilleure connaissance du risque et donc d’adapter le traitement des patients (agressivité du traitement orthopédique par corset, nécessité de chirurgie correctrice).
Procédures
EU1 : Afin d’identifier le type de mutation porté par les poissons, un prélèvement du tissu de la nageoire caudale sera réalisé sous anesthésie générale afin de minimiser la souffrance des animaux. Un seul prélèvement de quelques millimètre sera effectué par animal, la manipulation dure 1-2 minutes. Cette intervention n’entraîne pas de séquelles impactant la nage ou les capacités d’alimentation. EU2 : Les animaux seront transportés de l’animalerie (UE1) jusqu’au laboratoire d’imagerie (EU2) pour la réalisation d’une imagerie micro-scanner à 8,12 et 16 semaines de vie. La durée est de 30 minutes maximum par trajet. L’analyse par imagerie micro-scanner, anesthésie incluse aura une durée totale de 3 à 4 minutes. Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure expérimentale par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Concernant la création d’une lignée mutante, le phénotype (Ensemble des caractères apparents d'un individu) attendu causerait éventuellement une déformation de la colonne vertébrale, il ne devrait pas y avoir d’impact majeur sur la capacité des poissons à se mouvoir ou à s’alimenter (classe légère). L’inactivation d’un gène codant pour une protéine qui est impliquée dans la synthèse des neurotransmetteurs pourrait entrainer des modifications de la physiologie des animaux et potentiellement affecter leur croissance et leur capacité à se reproduire, sans pour autant les empêcher de se nourrir ou de se déplacer, bien qu’ils puissent être de taille plus petite ou avoir un axe corporel incurvé ou déformé. L’effet indésirable prévu chez les animaux suite aux prélèvements de tissu au niveau de la nageoire caudale pour identification génétique est une petite plaie de quelques millimètres suivie ensuite d’un processus cicatriciel, indolore et capable de se regénérer en quelques jours. Le transport jusqu’au lieu du scanner ainsi que la réalisation des imageries peuvent être source de stress ou d’angoisse pour les poissons. Le protocole d’imagerie sera réalisé sous anesthésie générale afin de maintenir les poissons immobiles, ce qui peut entrainer un risque anesthésique. Les animaux sont placés en quarantaine jusqu’à la fin du protocole d’imagerie puis euthanasiés afin d’éviter toute contamination par d’éventuels pathogènes de l’aquarium principal.
Devenir
Nous générons au total 780 animaux, 180 animaux porteurs d’une mutation des gènes cibles seront conservés à l’animalerie. Les autres animaux (soit 600 animaux) seront euthanasiés une fois la génération d’une lignée de mutation de troisième génération, stable sur le plan génétique soit établie. Ces 180 animaux seront euthanasiés après la procédure d’imagerie micro-scanner, un retour de quarantaine au système principal de l'animalerie étant impossible par sécurité sanitaire.
Remplacement
Les études sur lignées cellulaires ne permettent pas d’analyser la colonne vertébrale en entier et de suivre l’apparition de scolioses. Notre projet nécessite donc une approche in vivo sur l’animal. Les poissons-zèbres, du fait de leur forme longitudinale, permettant une torsion axiale de la colonne (contrairement aux quadrupèdes par exemple) sont un modèle de choix pour l’étude des scolioses.
Réduction
Les expériences sont réalisées sur des poissons juvéniles puis adultes. Nous limitons le nombre minimal au maintien d’une lignée, dont 20 poissons par aquarium. Nous avons besoin de 3 générations de 260 individus pour chaque lignée soit au total 780 individus. La population adulte de poissons utilisée pour produire les embryons est ainsi restreinte pour limiter le nombre d’animaux mais suffisamment développée pour assurer des conditions de reproduction efficaces pour les études envisagées. Concernant la réalisation des scanners : Nous limiterons le nombre d’animaux utilisés aux besoins statistiques de nos analyses, soit 120 poissons mutants et 60 contrôles sauvages.
Raffinement
Pour assurer le bien-être des animaux, nous nous appliquerons à réduire la souffrance, la douleur et l’angoisse. L’alimentation sera composée d’aliments secs et de proies vivantes adaptés au stade développemental des poissons-zèbre afin de leur permettre d’exprimer leur comportement naturel de prédateur. Les animaux ne seront jamais hébergés seuls. Dans le cas de l’identification d’un poisson-zèbre exprimant notre mutation d’intérêt, alors nous mettrons en place un enrichissement social en introduisant dans l’aquarium d’autres congénères. Les poissons présentant des anomalies qui les empêcheraient d'appréhender leur milieu normalement seront euthanasiés. De même pour préserver l'ensemble des poissons hébergés et le maintien d'un certain statut sanitaire, une limite d'âge de 18 mois est appliqué pour éviter la propagation d’infections par des animaux vieillissants. Les manipulations nécessitant une immobilisation et les prélèvements de nageoire caudal, seront conduites sur animaux anesthésiés. Nous surveillerons les animaux après le prélèvement de la nageoire caudale pour vérifier qu’il n’y ait pas de saignement et que dans les jours qui suivent la régénération de la plaie se met en place. Dans chaque cas, nous suivrons les signes visibles d’un animal souffrant et procéderons si nécessaire à une interruption de l’expérience ou à une euthanasie (présence de points limites).
Choix des espèces
Le modèle poisson-zèbre partage 71pourcents de son génome avec celui de l’homme et celui-ci est facilement modifiable par des techniques de biologie moléculaire. De plus, son élevage et sa reproduction sont rapides et aisés. Dans le cas de notre étude sur la scoliose qui est une déformation en trois dimensions de la colonne vertébrale, les modèles animaux quadrupèdes sont de mauvais modèles d’étude car la présence d’appui sur les pattes avant leur permet de compenser et d’empêcher l’évolutivité d’une telle déformation. Les poissons-zèbres cependant constituent un bon modèle pour ces déformations vertébrales, leur colonne vertébrale comportant de grandes similarités avec l’espèce humaine : une structure vertébrale longitudinale, constituée d’éléments osseux mobiles et de disques intervertébraux, organisée en 4 segments. L’analyse de la morphologie de la colonne vertébrale par micro-scanner chez le poisson-zèbre a déjà été validée par des études précédentes. Les animaux seront étudiés du point de vue phénotypique (apparition de scoliose) à 3 points cinétiques à 8, 12 et 16 semaines, qui correspondent respectivement à une période de forte croissance, au stade juvénile (parallèle avec l’aggravation pubertaire des scolioses humaines) et une analyse finale au stade adulte. Ceci permettra de suivre l’évolution de la scoliose dans le temps lors de sa phase de constitution puis une analyse finale à l’âge adulte.