Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
OPTIMISATION DE LA SURVIE DU GREFFON CARDIAQUE AVANT TRANSPLANTATION – ÉTUDE CHEZ LE PORC
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
72 porcs vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Chaque animal subit une ouverture du thorax puis un arrêt cardiaque provoqué, le cœur étant prélevé pour tester un dispositif de transport de greffon et une solution de préservation mis au point au laboratoire, protégés par deux brevets. Le porteur décrit une mise à mort sous anesthésie sans réveil et situe le seul stress possible à l'induction de l'anesthésie. Sur le remplacement, il affirme que les essais sur cellules restent "très insuffisants" pour représenter les phénomènes en jeu dans le greffon et retient le porc pour la proximité de son cœur avec celui de l'humain.
Objectifs
CONTEXTE La transplantation cardiaque est face à un problème majeur : la pénurie de greffons. Pour pallier à ce problème, les équipes cliniques envisagent d’utiliser de nouvelles sources de greffons dits à « critères élargis » (provenant de donneurs âgés, pathologiques, en arrêt cardiaque ou encore lointains géographiquement). Afin d'assurer une protection optimale de ces greffons fragiles, nous avons mis au point un nouveau procédé de transport par perfusion hypothermique qui permettrait d’optimiser la protection du cœur. Ce dispositif a fait l’objet de 2 brevets et a été récompensé par le prix de l’innovation. OBJECTIF GÉNÉRAL DU PROJET Notre objectif est d'optimiser la survie du greffon cardiaque grâce à un nouveau dispositif de transport des greffons, associé à une nouvelle solution innovante de préservation du greffon. Le dispositif de transport ainsi que la solution de préservation ont été mis au point dans notre laboratoire. Les études précliniques expérimentales proposées seront menées chez le porc. Ces travaux doivent permettre un passage du procédé en clinique humaine dans les prochaines années. RECHERCHE DE TYPE PRÉCLINIQUE Il s’agit d’une recherche translationnelle avec 3 objectifs opérationnels: 1- Prolonger le temps de préservation du greffon cardiaque. 2- Optimiser les conditions de survie des cœurs prélevés arrêtés. 3-Développer une méthode originale et non invasive d’évaluation de la viabilité du greffon par des analyses en imagerie (IRM et ultrasonore)
Bénéfices attendus
Le projet permettra une meilleure connaissance scientifique des phénomènes de survie des greffons avant transplantation. Les résultats obtenus faciliteront nous l’espérons : (i)les partenariats industriels (en cours), (ii)le transfert des données expérimentales vers la clinique humaine. Concernant les bénéfices cliniques, le nouveau procédé de préservation des greffons permettra d’augmenter le pool de donneurs (près d’1/3 de donneurs supplémentaires), par l’utilisation de greffons géographiquement éloignés et de greffons provenant de patients à critères élargis. Ces nouvelles sources de greffons permettront de pallier, au moins en partie, à la pénurie des greffons, problème crucial de la transplantation cardiaque aujourd’hui.
Procédures
Dans un premier objectif, les animaux sont placés sous anesthésie générale et couverture analgésique adéquates (phase de préparartion de 30 min environ) puis seront soumis à une procédure chirurgicale (ouverture du thorax et cardioplégie) d’une durée de 30 minutes environ. L’animal est mis à mort pendant l’anesthésie générale. Durée totale de la procédure sous anesthésie générale : 60 minutes environ. Dans un premier objectif, les animaux sont placés sous anesthésie générale et couverture analgésique adéquates (phase de préparartion de 30 min environ) puis une injection intraveineuse de molécules anticoagulante, anesthésiante et curarisante induit un arrêt cardiorespiratoire puis la mort de l’animal. 30 min après la mort de l'animal le cœur est prélevé. Durée totale de la procédure sous anesthésie générale : 70 minutes environ.
Impact sur les animaux
Tous les travaux se dérouleront sur des animaux sous anesthésie générale, complétée par des antalgiques. La mise à mort aura lieu durant la phase d'anesthésie (induction d'un arrêt cardiaque in situ) et donc sans réveil de l'animal. Le seul moment où l'animal est susceptible de ressentir un stress est l'induction de l'anesthésie à l’initiation de l’expérimentation. Les protocoles utilisés ont été mis en œuvre pour éviter toute douleur ou souffrance de l'animal. Il s’agit de procédures sans réveil.
Devenir
Le projet consiste à réliser à un prélèvement cardiaque en vue d’éudier le comportement du cœur isolé dans les conditions opératoire pré-transplantation. Tous les animaux utilés sont sont mis à mort (sous anesthésie et sans souffrance) du fait du prélèvement du cœur.
Remplacement
En amont du projet, de nombreux essais ont été réalisés sur modèles cellulaires ce qui a permis d’obtenir nos premiers résultats. Les cellules ont été placées dans différentes solutions (7 solutions testées) et à différentes températures (7 températures évaluées entre 5 et 35°C). Notons toutefois, les protocoles de conservation sur cellules restent très insuffisants pour représenter la complexité des phénomènes physiopathologiques survenant au niveau du greffon cardiaque. Ce projet a pour objet de tester un nouveau dispositif médical et une nouvelle procédure spécifique de perfusion du greffon lesquels nécessitent l’utilisation d’un modèle animal pertinent. Ainsi, pour nous rapprocher au mieux des conditions cliniques, nous mènerons nos travaux chez l’animal, ce qui nous permet de mimer les situations rencontrées en clinique.
Réduction
Concernant la réduction du nombre d'animaux utilisés (8 par groupe), nous nous sommes basés sur une évaluation statistique permettant d’évaluer avec précision le nombre minimal d’animaux nécessaires pour valider nos hypothèses scientifiques. Par ailleurs, en plus de notre fournisseurs agréé, éleveur de porcs fermiers, nous pourrions bénéficier de quelques animaux destinés à être mis à mort dans le cadre d’une autre étude, ce qui permettrait une réduction globale du nombre d’animaux.
Raffinement
Nous sommes en contact avec d’autres équipes (laboratoires), disposées à récupérer du matériel biologique issu de ces animaux (rein, foie, pancréas, cerveau, peau, oreilles, sang ...), en post-mortem. Par ailleurs, de nombreuses petites actions de raffinement seront mise en place comme : le passage régulier de l’animalier dans l’enclos, le fait que celui-ci habitue le porc à sa présence, le caresse au niveau du cou, l’utilisation d'une crème de type Lidocaïne appliquée au niveau de la zone d’injection (cou et cuisse) avant l'anesthésie, et l'utilisation d'une seringue munie d’un prolongateur, permettant l'induction de l'anesthésie à distance de l'animal (ce qui réduit considérablement le stress lié à l’induction de l’anesthésie). De manière générale, le programme antidouleur envisagé est bien adapté. Un autre point concerne l’isolement préopératoire des animaux sur plusieurs jours lors de l’hébergement. Nous tenterons de pallier à cette situation en hébergeant (autant que possible) 2 animaux simultanément. Ce qui impliquera pour nous d’utiliser ces 2 animaux sur la même demi-journée d’expérimentation. Enfin, plusieurs points limites dans nos procédures sont à mentionner, excluant les animaux de l’étude : (i) mauvais état général de l’animal en préopératoire durant l’hébergement (fièvre, blessures, diarrhées…), (ii) mauvaise tolérance aux anesthésiques, pouvant provoquer chez lui un arrêt cardio-respiratoire imprévu, (iii) accident de chirurgie (hémorragie suite à une blessure irréversible sur l’aorte ou sur l’artère pulmonaire, fibrillation irréversible du cœur), (iv) infection du cœur (péricardite découverte lors de l’ouverture du thorax). .
Choix des espèces
Pour nous rapprocher au mieux des conditions cliniques, et dans une optique de transfert clinique, nous mènerons nos travaux chez le porc. Nous avons choisi cette espèce animale, du fait de la proximité anatomique et physiologique entre le cœur de porc et le cœur humain. Par ailleurs, le dispositif médical de perfusion des greffon cardiaque que nous avons conçu est destiné aux cœurs humains. Il est donc indispensable de le tester et l’évaluer expérimentalement avec des greffons de taille similaire. Le cœur de porc se prête parfaitement à cette évaluation. Nous utiliserons de jeunes porcs d’environ trois mois ayant un poids compris entre 35 et 40 kg. Nous avons historiquement une bonne expérience de l’utilisation de ces animaux, à cet âge. En effet, les résultats obtenus ont fait l’objet de nombreuses publications. En outre, pour des raisons pratiques, les animaux de plus de 45-50 kg sont non adaptés à nos installations et à notre matériel, et de ce fait, augmenteraient les difficultés d’expérimentations, tant du point de vue de la manipulation de l’animal que de la gestion de l’anesthésie (perturbations susceptibles de survenir par phénomène de relargage de l’anesthésie du fait de la masse graisseuse importante chez les animaux dépassant les 50 kg). Les animaux utilisés seront donc de jeunes adultes, permettant une transposition par rapport aux patients donneurs jeunes (issus par exemple et tragiquement d’un accident de voiture). La taille et la physiologie des cœurs de ces animaux est proche de celles des cœurs humains. Des animaux plus jeunes ou plus âgés nous éloigneraient de ces critères cliniques.
Rôle d’une voie de l’inflammation dans l’immunodépression suite à une infection chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère, la quasi-totalité en gravité sévère. Elles subissent soit une péritonite provoquée par perforation du tube digestif, soit une injection d'un composant bactérien, pour étudier le rôle d'une voie de l'inflammation dans l'immunodépression qui suit une infection grave. Le porteur indique que la péritonite peut provoquer des douleurs, une perte de poids et une réduction de la mobilité. Sur le remplacement, il affirme que des cellules isolées ne refléteraient pas la complexité de la réponse immunitaire et conclut que le modèle murin est "indispensable".
Objectifs
Chez les patients de réanimation présentant une infection sévère, des altérations de la réponse immunitaire se développent responsables de la majorité des décès. Les mécanismes à l’origine de ces dysfonctionnements des cellules du système immunitaire restent mal connus. L’activation d’une voie de signalisation particulière de l’inflammation pourrait participer à ce phénomène. Cette voie est activée chez des patients présentant une infection sévère hospitalisés en réanimation. Dans d’autres contextes cliniques que les infections sévères et notamment en cancérologie, des données de la littérature associent l’activation de cette voie et la survenue d’altérations du système immunitaire. L’hypothèse de recherche est que cette activation au cours des infections sévères est responsable du développement des altérations du système immunitaire. Au cours de ce projet, le rôle de cette voie de l’inflammation dans le développement des dysfonctionnements du système immunitaire après le sepsis sera déterminé en utilisant un modèle murin d’infection sévère par péritonite ou par injection d’un composant bactérien (lipopolysaccharides). L’activation de cette voie et les altérations immunitaires présentées par ces souris dans différents organes (rate, moelle osseuse, sang, péritoine, poumon) seront étudiées. Des dosages sanguins de marqueurs d’activation de l’inflammation seront également réalisés.
Bénéfices attendus
Les infection sévères sont une pathologie fréquente à l’origine d’une morbi-mortalité considérable. Le pronostic des patients développant ces infections sévères est principalement grevé par le développement d’une immunodépression à l’origine à moyen terme d’infections secondaires nosocomiales et à long terme du développement de maladies cardiovasculaires et de cancers. Une meilleure compréhension des mécanismes de cette immunodépression post-septique est jugée nécessaire par l’Organisation Mondiale de la Santé pour progresser dans la prise en charge de cette pathologie. En focalisant les efforts sur une voie de l’inflammation clé au cours des infections, cela permettra de générer des pistes pour de nouvelles approches thérapeutiques susceptibles de prévenir les dysfonctions immunitaires et d’améliorer le devenir de ces patients. L’existence de médicaments capables d’inhiber cette voie de l’inflammation utilisés en pratique clinique et bien tolérés dans d’autres indications rend cette perspective très concrète. Ces stratégies thérapeutiques innovantes auraient un effet préventif des conséquences à moyen et long terme de ces infections sévères.
Procédures
Le projet s’appuie sur 2 modèles murins d’infections. Le premier modèle est une infection au niveau abdominal (péritonite) créée par perforation du tube digestif (durée de la procédure : 5 minutes), les souris contrôles subissant exclusivement une incision de la paroi abdominale (durée de la procédure : 3 minutes). Cette intervention est réalisée une seule fois en début de procédure, à J0. Le deuxième modèle consiste en l’injection d’un composant bactérien (injection sur 10 secondes), les souris contrôles recevant une injection d’eau et de sel. Cette injection est réalisée une seule fois en début de procédure à J0. Les prélèvements sanguins seront réalisés exclusivement sous anesthésie générale le jour de la mise à mort (1 mL, 10 secondes) et les différents autres prélèvements en post-mortem.
Impact sur les animaux
La péritonite peut être à l’origine de douleurs, d’une perte de poids et d’une réduction de la mobilité. Il existe également une douleur au point d’injection lors de l’injection d’anesthésique. L’injection du composant bactérien est à l’origine d’une perte de poids, d’une douleur au point d’injection lors de l’injection et d’une réduction de l’activité et de la mobilité.
Devenir
Une mise à mort sera réalisée à l’issue des procédures du fait du prélèvement nécessaire d’organes vitaux (poumon par exemple) ne permettant pas d’envisager une autre issue.
Remplacement
Un modèle utilisant uniquement des cellules isolées ne pourrait refléter toute la complexité de la réponse du système immunitaire contre les infections sévères et les relations entre les cellules de l’immunité. L’utilisation d’un modèle murin est donc indispensable.
Réduction
Le calcul du nombre d’animaux par groupe a été réalisé afin de pouvoir mettre en évidence des différences significatives entre les groupes. Au cours de chaque expérience, de multiples analyses utilisant des techniques différentes seront réalisées sur les différents prélèvements afin de minimiser le nombre de souris utilisé.
Raffinement
Afin de limiter la souffrance des animaux et d'assurer leur bien-être, une prise en charge de la douleur (anesthésie générale lors de l'intervention, administration d’antalgiques) et une prise en charge de la déshydratation seront réalisées. A l'issue de la chirurgie, les souris seront replacées dans leurs cages avec un aménagement spécifique pour garantir leur confort. La cage sera placée dans une armoire chauffante. Une surveillance quotidienne avec pesée des souris et grille d'évaluation spécifique sera effectuée jusqu'à mise à mort. En cas de douleur ou d’inconfort trop important, une mise à mort anticipée des souris sera réalisée.
Choix des espèces
Les souris sont les animaux les plus utilisés en immunologie avec un large choix de solutions techniques dédiées disponibles commercialement et des modèles génétiquement modifiés sont d’ores et déjà disponibles. Il s'agit de jeunes adultes (8-12 semaines) dont le système immunitaire est à maturité.
Etude de la biodistribution et du clivage des activateurs tissulaires du plasminogène (tPA) recombinants
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
96 souris vont être utilisées, opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Placées dans un cadre stéréotaxique, elles reçoivent une injection dans le cerveau, un prélèvement de liquide céphalo-rachidien puis un prélèvement sanguin terminal, pour comparer deux formes d'une enzyme impliquée dans le traitement de l'AVC. Le porteur indique employer une analgésie pour limiter la douleur liée à la chirurgie et au cadre stéréotaxique. Sur le remplacement, il affirme que les méthodes sans animaux "ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information" et retient la souris comme espèce la plus étudiée dans l'ischémie cérébrale.
Objectifs
Cette étude vide à comprendre l’implication de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) dans l’interaction sang-cerveau. Le tPA est une enzyme sécrétée par les cellules endothéliales et par les neurones. Il intervient principalement dans la fibrinolyse et la plasticité cérébrale en tant que neuromodulateur. Le tPA peut être sous 2 formes actives (monomère (sc-tPA) ou hétérodimère (tc-tPA)). Cependant, leurs rôles sont souvent confondus et peu de données physiologiques sont disponibles quant à leur proportion dans les tissus ainsi que leurs éventuels passages entre les différents tissus (sang, cerveau et liquide cephalo-spinal (LCS)). Le tPA possède également un rôle dans le traitement de patients. En effet, lors d’un accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique, les patients peuvent être traités par thrombolyse par injection de tPA. Or, l’activité enzymatique ainsi que l’activité neuromodulatrice ne seraient pas les même selon la forme du tPA (études in vitro). Ainsi, nous voulons développer un tPA comme outil pour pouvoir comparer ses formes afin de comprendre l'impact des formes du tPA lors de la thrombolyse.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d’apporter des nouvelles connaissances sur la forme majoritaire du tPA dans les tissus de l’organisme. Nous pourrons comprendre et analyser sa biodistribition, sa demi-vie et son passage dans les tissus.
Procédures
Une procédure chirurgicale divisée en 3 interventions: 1) Injection (animaux anesthésiés + analgesie, durée de la procédure : 15 minutes) 2) Prélèvement de Liquide Cérébro-Spinal (LCS) (animaux anesthésiés + analgesie, durée de la procédure : 10 minutes) 3) Prélèvement sanguin et Mise à mort (animaux anesthésiés + analgesie, durée de la procédure : 5 minutes)
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d'apparaitre sont des douleurs post-injection et liées à l’utilisation du cadre stéréotaxique ainsi que le stress à la suite de l'anesthésie. Afin de limiter toute douleur occasionnée par la chirurgie, nous utiliserons un analgésique lors du protocole chirurgical. Les mesures pour réduire au maximum toute forme d’inconfort et de souffrance sont le suivi strict et rapproché des animaux et la manipulation uniquement par des personnels expérimentés.
Devenir
A l’issu de la procédure, tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’ischémie cérébrale. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon nos travaux précédents publiés et la littérature. 96 souris seront nécessaires pour réaliser cette étude. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (nombre d’animaux total : 96) a été évalué par une analyse statistique.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant toute la durée de la procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal. Le transport des animaux en salle d'expérimentation sera réalisé en limitant les secousses et le bruit. La température en salle d'expérimentation est controlée et adaptée au bien être des animaux. Les mesures pour réduire au maximum toute forme d’inconfort et de souffrance sont le suivi strict et rapproché des animaux, l’hébergement en petits groupes sociaux stables (n = 5) avec un enrichissement minimum (un rouleau cartonné + une feuille de papier essuie-tout), et la manipulation uniquement par des personnels expérimentés. Les animaux seront maintenus dans des conditions optimales d’hébergement, dans un environnement stabilisé en température (21°), hygrométrie (55%), luminosité (100 lux), et durée du cycle de lumière (12h/12h). Afin de limiter toute douleur ou inconfort occasionnée par la chirurgie, les animaux recevront une injection d'un analgésique avant le début du protocole pour prévenir toute douleur occasionnée. De plus les animaux seront thermorégulés par un système de couverture chauffante.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine pré-clinique de l’étude de molécules fibrinolytiques et les techniques employées sont bien connues et maitrisées dans notre équipe. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier du tPA. Les souris Swiss utilisées dans cette étude seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature.
Etude de la réponse du pathogène opportuniste humain Staphylococcus aureus au niveau des abcès à la suite d’une infection locale et systémique
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
250 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles sont infectées par le staphylocoque doré, par voie sanguine ou sous la peau, pour étudier la compétition pour les métaux entre la bactérie et l'hôte, avant d'être tuées pour prélever les tissus. Le porteur indique que l'infection générale peut provoquer une perte de poids marquée, une baisse d'activité et des variations de température, et que l'infection cutanée forme une plaie purulente dès le troisième jour. Sur le remplacement, il affirme que la réponse immunitaire coordonnée "ne peut être étudiée qu'au sein de l'animal".
Objectifs
Les métaux comme le fer et le manganèse sont des micronutriments cruciaux pour toutes formes de vie. L'hôte exploite ce besoin comme une arme contre l'infection, privant les organismes pathogènes comme le staphylocoque doré de ces ressources essentielles à sa survie lors d'un processus appelé "immunité nutritionnelle". Le projet vise à étudier le combat pour l’accès aux métaux entre l’hôte et le pathogène et comprendre comment S. aureus échappe à l’immunité nutritionelle. Afin d’identifier les facteurs impliqués dans l’adaptation aux changements de disponibilité en métaux, nous suivrons les réponses des deux protagonistes au cours de l’infection. Les niveaux de métaux variant selon l’organe infecté, nous utiliserons des modèles d’infection locale (infection de la peau) et systémiques (infection générale).
Bénéfices attendus
Les scientifiques du monde entier cherchent à développer de nouvelles stratégies pour lutter contre les bactéries pathogènes devenues résistantes aux antibiotiques actuels comme le staphylocoque doré. Ce dernier est une menace majeure pour la santé humaine et l'une des causes les plus courantes d'infections bactériennes. Une approche prometteuse est de perturber/empêcher l’accès du pathogène aux ressources essentielles telles que les métaux. Cependant, afin de développer et parfaire ces nouvelles approches thérapeutiques, mais aussi de limiter l’apparition de mécanismes de résistance, une compréhension détaillée des interactions complexes entre l’hôte et le pathogène pendant l'infection est essentielle. Ceci est particulièrement important au niveau des abcès car ils sont les principaux contributeurs à la pathogénicité du staphylocoque doré. En effet, il s’agit de réservoirs difficilement accesibles aux antibiotiques qui favorisent les infections chroniques chez l'Homme. Cette étude permettra donc d’établir une base solide pour le développement de nouveaux antibiotiques ciblés.
Procédures
Un groupe subira une injection intraveineuse sous anesthésie d'une durée de 5 minutes. Un autre groupe subira une injection sous la peau sous anesthésie d'une durée de 5 minutes puis 1 à 3 anesthésies d'une durée de 15 minutes pour suivre le processus infectieux.
Impact sur les animaux
Lorsque les souris sont infectées par cette bactérie, elles peuvent ressentir une certaine douleur lors de l'injection. Toutefois, cette procédure sera effectuée sous anesthésie. En raison de l'infection générale, les souris peuvent souffrir d'une perte de poids significative, d'une baisse d'activité et d'hyperthermie, voire d'hypothermie dans une phase très avancée de l'infection. Lorsque les bactéries sont injectées sous la peau, une petite lésion cutanée se forme dans les 24 premières heures en raison de la réponse immunitaire de la souris. Au bout de 3 jours, la lésion est beaucoup plus grande, et une plaie se forme. Les souris peuvent potentiellement montrer une baisse d'activité et avoir une plaie purulente à partir du 3ème jour après l'infection.
Devenir
Les souris seront mises à mort afin de collecter les tissus/organes requis pour le projet.
Remplacement
L'utilisation d'un modèle animal telle que la souris est essentielle pour étudier les facteurs impliqués dans le combat entre le staphylocoque doré et l'hôte. En effet, la souris présente une réponse immunitaire bien caractérisée et proche de celle de l’Homme. Comme cette réponse implique l'action coordonnée de différents types de cellules de l’hôte, elle ne peut être étudiée qu’au sein de l'animal.
Réduction
Le nombre d'animaux a été réduit autant que possible tout en conservant un nombre suffisant pour une analyse fiable. L'utilisation de chaque animal sera optimisée en réalisant différents types d'analyses sur un même animal. Une étude pilote sera menée pour déterminer le nombre de cellules infectées obtenues par souris, afin d'utiliser le plus petit nombre possible d'animaux.
Raffinement
Le projet a été conçu en intégrant des mesures pour réduire le stress et, si possible, la souffrance des animaux. Une période d'acclimatation de 2 semaines est observée avant le début des expériences. De plus, les animaux seront logés en petits groupes d'individus compatibles dans des conditions contrôlées. Des méthodes pour réduire certains des effets du stress (objets de cellulose pour la nidification ou la mastication) seront mises en place sans toutefois interférer avec le déroulement de l'infection. Les animaux seront préalablement habitués à être manipulés dans un tunnel transparent afin de réduire leur stress. L'inoculation bactérienne sera effectuée sous anesthésie générale. Des points limites ont été établis pour soustraire l'animal à la souffrance.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris femelles agées de 7 et 10 semaines, modèle utilisé communément dans la littérature. Ceci permettra de comparer nos résultats aux études déjà réalisées. Le modèle d'infection des souris par le staphylocoque doré a été largement étudié et montre des signes similaires de maladie comparés aux infections humaines. Lorsque les humains contractent une infection grave à staphylocoques, ils peuvent avoir notamment des bactéries dans le sang et une formation d’abcès dans de nombreux organes. Ainsi, comme nous étudions la réponse immunitaire de l'hôte après une infection à staphylocoques, il est utile d'utiliser un modèle qui ressemble le plus possible au système immunitaire humain.
Caractérisation des mécanismes participant à la transformation des cellules hématopoïétiques et liés à l’anomalie moléculaire IDH2 R140Q
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
229 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire une anomalie liée aux leucémies aiguës myéloïdes, elles développent avec l'âge des maladies du sang et subissent des injections et jusqu'à dix prélèvements sanguins, avant d'être euthanasiées pour analyse des tissus. Le porteur indique que ces souris peuvent former, rarement, des tumeurs solides de gravité modérée. Sur le remplacement, il affirme que le recours aux animaux est "incontournable" pour saisir les conséquences de ces anomalies au sein d'un "organisme vivant".
Objectifs
Ce projet a pour but d’étudier l’un des mécanismes à l’origine de l’apparition d’hémopathies malignes chez l’homme. Les hémopathies malignes sont des affections de la moelle osseuse, tissu qui est responsable de la fabrication de l’ensemble des cellules du sang (globules rouges, globules blancs et plaquettes). Les hémopathies malignes regroupent un ensemble hétérogène de cancers des cellules sanguines ; on distingue les leucémies, les syndromes myélodysplasiques, les syndromes myéloprolifératifs et les lymphomes. Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) représentent la majorité des leucémies aiguës de l’adulte. Comme toutes les hémopathies, les LAM sont la conséquence de nombreuses anomalies génétiques acquises au cours du temps.
Bénéfices attendus
L'étude de modèles animaux reproduisant les anomalies moléculaires d’intérêt et développant à terme des pathologies proches de la maladie humaine pourrait permettre potentiellement de comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la prédisposition au cancer chez les individus présentant des hématopoïèses clonales à potentiel indéterminé (dont les anomalies IDH2). Ceci pourrait permettre également de tester des nouveaux traitements pertinents.
Procédures
Les animaux pourront avoir des injections uniques sous anesthésie locale (durée 1 minute). Des prélèvements de sang sous anesthésie locale seront faits (durée 3 minutes) chez certains animaux, au maximum une fois par semaine quand les animaux développent une hémopathie. Le nombre de ces prélèvements pourra être de 10 au maximum par animal.
Impact sur les animaux
Les injections et les prélèvements de sang pourront impliquer des contraintes et un stress légers et temporaires. Les animaux pourront développer avec l'âge des syndromes hémopathiques avec (rarement) formation de tumeurs solides de gravité modérée.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour analyses sur tissus et organes post-mortem.
Remplacement
Les conséquences fonctionnelles de ces évènements « fondateurs » du cancer ne peuvent être pleinement appréhendées qu’au sein d’un organisme vivant ; en effet ces anomalies génétiques fondatrices influent sur l’expression de nombreux gènes qui eux-mêmes conditionnent le devenir des cellules en réponse aux multiples signaux extra-cellulaires présents chez un individu et au sein d’un tissu (homones, facteurs de croissance etc…). L’utilisation d’animaux est incontournable pour évaluer l’importance des processus biologiques affectés par ces anomalies fondatrices. Pour ces raisons, nous établissons des lignées de souris génétiquement modifiées reproduisant les anomalies moléculaires d’intérêt et développant à terme des pathologies proches de la maladie humaine.
Réduction
Dans toutes les procédures, nous chercherons à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.Les nombres d'animaux nécessaires ont été déterminés par calcul de puissance. Pour les analyses subséquentes, nous utiliserons un test statistique non paramétrique Mann-Whitney-Wilcoxon. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, les différentes procédures seront mises en oeuvre séquentiellement, en fonction des résultats obtenus. Les nombres indiqués dans ce projet sont des nombres maximaux.
Raffinement
Tout signe de souffrance ou de douleur chez l’animal entrainera la mise en place d’un soin particulier, antalgiques et morphiniques,. Des points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les souris seront maintenues à raison de 5 souris par cage dans un environnement enrichi (nid, maison, tunnel). - Toutes les injections seront réalisées sous anesthésie locale ou générale. - Les prélèvements sanguins seront tous réalisés sous anesthésie générale . Dans la mesure du possible, les souris seront déplacées de leur cage vers l’appareil à anesthésie en utilisant des tunnels pour éviter de les prendre par la queue. - Les souris auront un suivi clinique quotidien.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’animal vertébré le plus utilisé dans la recherche translationnelle sur les cancers et les tests de toxicité, aussi bien qu'en recherche fondamentale. Cela se traduit par un accès à une quantité importante de publications scientifiques et techniques détaillées essentielles à nos études. C'est donc le modèle animal le plus pertinent pour ces études d'hémato-oncologie. Animaux adultes, ces pathologies se développant progressivement avec l'âge chez l'adulte.
Evaluation de l’activité anti-inflammatoire d’une bactérie intestinale dans un modèle murin de psoriasis cutané
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un psoriasis provoqué par une crème appliquée sur les oreilles sous anesthésie, et un gavage répété cinq jours sur sept pendant quatre semaines, pour tester une bactérie intestinale censée atténuer les lésions cutanées. Le porteur indique que le gavage répété peut enflammer la sphère ORL et le haut de l'œsophage et provoquer une perte de poids par défaut d'alimentation. Il affirme qu'aucun test sans animal ne peut intégrer la réaction immunitaire de la peau et conclut que l'étude "ne peut être conduite qu'in vivo".
Objectifs
Le Psoriasis est une maladie cutanée chronique qui touche environ 5% de la population générale. De plus en plus d'études suggèrent un rôle du microbiote intestinal (bactéries intestinales) dans le développement des lésions de psoriasis. Ces découvertes permettent d'envisager le développement de traitements probiotiques, à base de "bonnes" bactéries intestinales, qui viendraient améliorer les lésions cutanées après administration orale. Dans cette étude, nous testerons l'impact d'une "bonne bactérie" administrée par voie orale chez une souris atteinte de psoriasis. Le but est démontrer que ce nouveau type de traitement fonctionne sur un modèle de souris (amélioration du psoriasis) avant d'envisager son développement chez l'homme.
Bénéfices attendus
En cas de résultats positifs, une étude chez l'homme sera envisagée : nous pourrons dans ce cas étudier si un traitement oral par P. distasonis (une "bonne" bactérie intestinale aux propriétés anti-inflammatoires) permet d'améliorer le psoriasis chez l'homme.
Procédures
Le traitement à base de P. distasonis, une bactérie intestinale bénéfique, sera réalisé par gavage sur animaux vigiles, 5 fois par semaine sur 28 jours (durée 30 sec). Afin de mimer des lésions de psoriasis, une crème (imiquimod) sera appliquée sur les oreilles des animaux sous anesthésie pendant 30min. Pour cela, les animaux seront anesthesiés 3 jours consécutifs sur 2 semaines consécutives et une derniere fois après resolution de l'inflammation 7 jours plus tard (7 injections = 30sec). La mesure de la réponse clinique (mesure de l'épaisseur de l'oreille) sera réalisée sous anesthésie 5jours/7 pendant 30 secondes.
Impact sur les animaux
Le gavage répété 5j/7 sur plusieurs semaines pourrait induire une inflammation de la sphère ORL et de la partie haute de l'oesophage. Cette inflammation pourrait entraîner une perte de poids par défaut d'alimentation. Ce modèle engendre une inflammation legère au niveau de l'oreille qui ne gène pas la souris et ne gènere pas de grattage. Les souris seront régulièrement anesthesiées (5j/7) durant plusieurs semaines, ce qui peut génerer un stress.
Devenir
Après anesthésie, tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'étude afin de récupérer les organes ce qui permettra d'analyser les propriétés anti-inflammatoires de P. distasonis
Remplacement
L’objectif de cette étude est d'évaluer l'impact d'un candidat médicament sur un modèle d'inflammation cutanée (psoriasis). Aucun test in vitro ne permet d’intégrer la réaction immunitaire de la peau et des organes immunitaires associés dans leur ensemble dans le cadre de cette pathologie. Celle-ci ne peut donc être conduite qu’in vivo.
Réduction
L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique et a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Aussi, un minimum de 10 animaux par groupe (3 dosages de P. distasonis et un groupe contrôle non traité) est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. Trois dosages de P. distasonis seront testés, celle-ci n'ayant jamais été testée auparavant.
Raffinement
Des mesures seront mises en oeuvre pour optimiser le bien-être des animaux. A leur arrivée dans l'animalerie, une période d'acclimation d'une semaine sera respectée avant le debut de la procédure expérimentale, et les souris seront maintenues entre 4 et 5 souris par cage, afin de les maintenir au maximum en groupe social. Des points limites bien définis et suffisamment précoces et prédictifs pour prévenir tout stress et toute douleur de l’animal ont été mis en place. L’observation des animaux sera effectuée 5jours/7 et nous attacherons une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci. Dans le cas où des animaux perdraient du poids, des aliments réhydratés seraient disposés dans la cage. Pour les gavages, des sondes gastriques souples reconnus pour etre moins irritante pour les animaux seront utilisées et les gavages seront réalisés par une personne expérimentée ayant déjà réalisé des gavages répétés.
Choix des espèces
L’espèce souris est un modèle très utilisé en pathologie immunologique, telle que l'inflammation cutanée et notamment le psoriasis, en raison des nombreux outils mis à disposition pour l’analyse des réponses immunes. Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de cytokines inflammatoires. De plus, l’utilisation de ce modèle, couramment employé dans ce domaine, nous permettra de discuter nos résultats par rapport aux données existantes de la littérature. Les souris provenant de fournisseurs arrivent à l’âge de 6 semaines et sont acclimatées au moins une semaine au sein de notre animalerie avant d'entrer dans nos protocoles. Les souris entrent dans les procédures à 7-25 semaines, âge auquel les souris présentent un système immunitaire suffisamment mature pour effectuer une sensibilisation efficace.
Discrimination de l’importance de l’immunité adaptative sur une association thérapeutique dans le cancer du côlon chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales dans la patte puis plusieurs injections, pour comparer une association de deux traitements anticancéreux chez des souris pourvues ou privées d'un système immunitaire complet. Le porteur indique que la tumeur dans la patte peut réduire la mobilité et l'alimentation, entraîner une perte de poids et parfois des nécroses cutanées. Les retombées pour les patients sont renvoyées au "long terme", l'objectif immédiat restant de décrire la cascade immunitaire qui rend l'association efficace.
Objectifs
Notre intérêt pour l’immunothérapie a explosé ces dernières années grâce à l’apparition de nouveaux types de traitement. Ces traitements sont capables de permettre la mise en place d’une réponse de longue durée contre le cancer mais chez un nombre limité de patients. Un autre traitement appelé anti-VEGFR2 empêche la création de nouveaux vaisseaux sanguins dans la tumeur, limitant ainsi la croissance tumorale en la privant des nutriments et de l’oxygène apportés par le sang. Plusieurs études ont montré que l’anti VEGFR2 était également capable d’augmenter l’efficacité des traitements d’immunothérapies. Cependant, les mécanismes permettant d’expliquer cette amélioration restent encore à découvrir et plus particulièrement ceux impliquant les cellules du système immunitaire. C’est pourquoi nous souhaiterions étudier l’efficacité de cette association de traitements dans des souris possédant ou non un système immunitaire complet. Le but de ce travail est de définir la cascade d’événements menant à l’efficacité antitumorale de l’association d’un anti-VEGFR2 avec une immunothérapie. Notre hypothèse est que l’efficacité de cette association thérapeutique repose sur une réponse immunitaire précise. Pour vérifier cette hypothèse, nous allons utiliser des souris ayant un système immunitaire complet ou non afin de comparer l’importance de certaines cellules sur l’efficacité de l’association thérapeutique.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement pour les patients en améliorant notre compréhension d'un phénomène immunitaire bénéfique à l'encontre du cancer. A mi-chemin entre la recherche fondamentale et appliquée, ce projet vise à long terme à améliorer les mécanismes immunitaires naturellement mis en place chez les patients cancéreux afin d'augmenter leur chance de survie.
Procédures
Sous anesthésie générale par isoflurane, les animaux subiront 1 injection sous cutanée de 1 minute, 10 jours plus tard, 3 injections Intrapéritonéale (IP) de 1 minute, réparties sur une semaine et certaines souris auront également 1 Intra veineuse (IV), de 1 minute chacune environ.
Impact sur les animaux
Les animaux vont être soumis au maximum à 1 injection IV de 1 minute, 1 injection sous-cutanée de 1 minute sous anesthésie et 3 injections IP de 1 minute, répartie sur plusieurs jours. Les administrations IV et SC ne sont pas connues pour être particulièrement douloureuses. L’injection des tumeurs en sous-cutané dans la patte des souris pourrait diminuer la mobilité des souris ainsi que leur capacité à se nourrir. De ce fait, il est possible qu’un effet indésirable de cette expérimentation soit une perte de poids. En réalisant des injections en sous-cutané, il est parfois possible d’observer la formation de nécroses cutanées. Dans de précédentes expériences, nous avons montré que les traitements n’ont pas d’effets indésirables sur les souris mais nous continuerons de le vérifier.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de prélever les tumeurs.
Remplacement
Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d’un organisme. Nous réalisons à ces fins des études sur les modèles d’animaux greffés avec des cellules tumorales. Par la suite, le décryptage des mécanismes moléculaires sera réalisé in vitro.
Réduction
Les groupes expérimentaux seront constitués de n=10 individus afin de générer des cohortes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer les effets anti-tumoraux des traitements tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les variations dans les croissances tumorales peuvent être faibles, nous répèterons les expériences 2 fois de manières indépendantes. Des tests statistiques seront réalisés pour permettre d’analyser les données
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. Chaque animal sera examiné et pesé 3 fois par semaine. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. Les injections de cellules tumorales et les traitements seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane. Aucune douleur associée à ces gestes n’est donc attendue. De plus, leur habituation aux gestes de contention devrait permettre de réduire le stress dû à ces manipulations. Afin de limiter la perte de poids des souris potentiellement due à des problèmes de mobilités induits par les tumeurs, nous allons ajouter des croquettes dans les cages afin que la nourriture leur soit plus accessible. De plus, des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance.
Choix des espèces
Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature. Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation de par l’utilisation de souris génétiquement modifiés. Enfin, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme.
Implication du canal potassique TREK1 dans les arythmies ventriculaires chez la souris mâle
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
165 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent, sous anesthésie, des séances d'imagerie, une mesure de pression par une aiguille insérée jusque dans le ventricule droit, et une stimulation cardiaque destinée à déclencher des arythmies, une partie étant en plus placée trois semaines en atmosphère appauvrie en oxygène. Le porteur indique que cette stimulation peut provoquer une fibrillation ou une tachycardie ventriculaire et le décès de certains animaux, et que l'hypoxie entraîne une baisse d'activité et une perte de poids. Sur le remplacement, il affirme que l'étude chez l'animal est "essentielle" et "ne peut être remplacée", un seul patient porteur du déficit ayant été identifié.
Objectifs
Les arythmies ventriculaires, correspondant à un défaut de contraction des ventricules, est la forme d’arythmie la plus mortelle. En effet, elle représente la moitié des décès d’origine cardiaque et environ 30 % des décès totaux en France. Ces arythmies résultent principalement d’un dysfonctionnement acquis ou inné de protéines exprimées dans les cellules du cœur appelées canaux ioniques. Des arythmies provenant du ventricule droit hypertrophié/dilaté sont décrites chez les patients souffrant d’hypertension pulmonaire et notamment dans le contexte de maladies hypoxémiantes qui peuvent être liées à la pollution. A travers ce projet, nous proposons d’étudier le rôle que pourrait jouer le canal ionique TREK1 dans ces arythmies, à l’aide d’un modèle de souris dans lequel son expression a été invalidée. Sa sensibilité à l’étirement en fait une cible particulièrement attractive dans le ventricule droit étiré suite à une hypertension pulmonaire. Une meilleure connaissance du rôle physiopathologique des canaux ioniques, ici TREK1, permettra de mieux appréhender le mécanisme de déclenchement des arythmies ventriculaires et d’adopter des stratégies thérapeutiques plus efficaces dans le contexte des pathologies du ventricule droit.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de mettre en évidence le rôle du canal TREK1 dans la fonction contractile, l’activité électrique cardiaque mais surtout dans le déclenchement d’arythmies au niveau du ventricule droit, région du cœur dans laquelle il est fortement exprimé. Ce projet est renforcé par une approche expérimentale multi-niveaux : -Celui de l’animal (ECG/IRM/stimulation transoesophagienne), -Celui de l’organe (cartographie optique), -Celui du tissu (histologie), -Celui de la cellule cardiaque, de la cellule musculaire lisse -Celui de la protéine/de l’ARNm Ce projet permettra une meilleure compréhension du rôle du canal TREK1 et par conséquent de mieux appréhender le(s) mécanisme(s) de déclenchement des arythmies ventriculaires qui peuvent conduire à la mort subite. Des stratégies thérapeutiques visant TREK1 pourraient alors s’avérer efficaces dans le traitement d’arythmies ventriculaires chez l’Homme.
Procédures
Les souris seront soumises à deux types d’interventions non invasives sous anesthésie générale puis une mesure invasive avant euthanasie: • Examens d’imagerie par IRM non invasif (environ 1h30) • Enregistrement ECG non invasif (environ 15 min) • Mesure de pression intraventriculaire droite invasive (20 min) Ces trois expérimentations seront réalisées sur 80 animaux répartis en 2 conditions : • Milieu normal: 20 souris saines et 20 souris déficitaires en TREK1 • Milieu appauvri en oxygène : 20 souris saines et 20 souris déficitaires en TREK1 (3 semaines). Un autre groupe d’animaux sera aussi soumis à une intervention invasive sous anesthésie générale, la stimulation cardiaque transoesophagienne (environ 15 min). Cette intervention sera réalisée sur 80 animaux répartis en 2 conditions : • Milieu normal : 20 souris saines et 20 souris déficitaires en TREK1 • Milieu appauvri en oxygène : 20 souris saines et 20 souris déficitaires en TREK1. Les trois procédures seront réalisées une seule fois sur chaque animal.
Impact sur les animaux
Les anesthésies répétées lors des différentes procédures du projet peuvent induire des effets indésirables. Elles seront espacées au minimum de deux jours et une surveillance accrue aura lieu lors du réveil de l'animal (signes de désorientation, apathie). Les autres effets indésirables prévus sur les animaux et liés aux différentes techniques utilisées sont principalement de classe modérée : • Imagerie à résonance magnétique, Electrocardiogramme et mesure de pression au niveau du ventricule droit: anesthésie générale pouvant entraîner des difficultés respiratoires se manifestant par des spasmes abdominaux et ne devraient pas engendrer de nuisances ou d’effets indésirables particuliers sur les souris. •Mesure de pression au niveau du ventricule droit : geste invasif avec une incision de la couche musculaire au niveau de l’abdomen en dessous du diaphragme et insertion d’une aiguille fine reliée à un capteur de pression à travers celui-ci jusque dans le ventricule droit. •L’hypertension pulmonaire n’induit pas de souffrances élevées chez l’homme mais plutôt une gêne respiratoire exacerbée lors d’un effort. •Lors de l’exposition à l’hypoxie dans un caisson, un stress est généré aux souris se traduisant par une baisse d’activité et d’appétit dans les premiers jours (perte de poids de 5 à 10%) avant un retour à la normale. •L’induction d’arythmies ventriculaires par la stimulation des ventricules pourrait entrainer des effets indésirables sévères (fibrillation ventriculaire, tachycardie ventriculaire) et même conduire au décès de certains animaux.
Devenir
Tous les animaux seront sacrifiés à la fin des procédures et le cœur sera prélevé pour réaliser la cartographie optique sur cœur isolé, les études histologiques ou les études électrophysiologiques et de biologie moléculaire sur cardiomyocytes isolés.
Remplacement
Il est connu que TREK1 est exprimé dans le cœur et impliqué dans une pathologie cardiaque, la tachycardie ventriculaire. A ce jour, un seul patient avec un déficit en TREK1 au niveau du cœur a été identifié empêchant l’étude du rôle de ce dernier dans l’activité électrique du cœur chez l’Homme. L’utilisation d’animaux sains et déficitaire en TREK1 est donc la seule façon de répondre à cette question et de reproduire la situation pathologique présente chez l’Homme. Cette étude chez l’animal est donc essentielle et ne peut être remplacée.
Réduction
Le caractère non invasif de l’électrocardiogramme et de l’imagerie à résonance magnétique permettra de réaliser d’autres expériences telles que les mesures de pression au niveau du ventricule droit mais aussi l’étude à l’échelle du cœur entier ou de la cellule cardiaque sur les mêmes animaux. Ce projet permettra d’évaluer avec fiabilité le rôle du canal TREK1 dans l’activité du cœur ainsi que dans les arythmies du ventricule droit. Dans ce projet, 160 souris sont prévues et réparties dans les 2 conditions suivantes (2 groupes avec n=80/groupe): - Normoxie: (milieu avec un taux d’oxygène normal) 40 Wild-type: •20 stimulation transoesophagienne •20 imagerie à résonance magnétique / électrocardiogramme / pression ventricule droit 40 Knock-out: •20 stimulation transoesophagienne •20 imagerie à résonance magnétique / électrocardiogramme / pression ventricule droit -Hypoxie: (milieu appauvti en oxygène). Le nombre d’animaux est répartit comme la condition Normoxie. A ça s’ajoute 5 souris supplémentaires utilisées pour la formation d’un expérimentateur à la stimulation transoesophagienne au début de l’étude. Concernant la partie sur l’animal entier, 5 échecs par groupe sont considérés pour chaque protocole (imagerie à résonance magnétique, électrocardiogramme, stimulation transoesophagienne et pression ventricule droit) pour les motifs suivants : - Arrêt de l’examen pour le bien-être animal - Valeurs aberrantes des données collectées - Mort de l’animal. Concernant la partie sur cœur entier, les animaux sont divisés en 3 : imagerie sur cœur entier (15 animaux par groupe), mesure de l’activité électrique sur cellules cardiaques isolées (50 animaux par groupe) et biologie moléculaire/histologie (15 animaux par groupe). De manière similaire à la partie sur l’ animal entier, des échecs (3 pour l’imagerie optique et la biologie moléculaire/histologie et 5 pour la mesure de l’activité électrique sur cellules cardiaques isolées) sont considérés pour les motifs suivants : - Ischémie du cœur isolé - Mort des cellules cardiaques après isolement - Valeurs aberrantes des données collectées. Une analyse descriptive (moyenne, percentile, écart standard de la moyenne) sera effectuée ainsi que la vérification que chaque groupe suit la loi normale (test de Shapiro-Wilk). Dans le cas attendu que les données collectées ne suivent pas la loi normale (échantillon de n
Raffinement
Les mesures de RAFFINEMENT sont mises en place à toutes les étapes du projet, notamment au cours de l’hébergement (cage collective, litière et enrichissement adapté). Un suivi quotidien sera réalisé par des personnes formées, compétentes et soucieuses du bien-être animal, basées notamment sur l’apparence physique externe, la prise de poids et le comportement. Ces contrôles permettent de repérer tout animal en souffrance, d’en avertir le responsable du projet et de prendre les mesures appropriées. Afin d’éviter toute souffrance, les animaux seront anesthésiés et analgésiés quand nécessaire et des points limites seront déterminés afin de réduire la souffrance et/ou d’interrompre le protocole en cas d’apparition de signes de détresse. L’atteinte d’un point limite entraîne une ou plusieurs des actions suivantes : • Augmentation des fréquences d’observation des animaux : mise en place d’un suivi deux fois par jour (visites, signes cliniques relevés). • En cas de perte de poids, du gel diet riche en énergie ou des pellets humides seront mis à disposition. Si l’animal est hébergé en groupe, il sera isolé en cage individuelle afin de pouvoir contrôler son alimentation et son hydratation. • En cas de perte de poids continue (entre 10% et 20%), une surveillance accrue sera effectuée et les soins renforcés. En cas de perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal enregistré pour cet animal et pour une durée de 48 heures, l’animal sera mis à mort immédiatement sur décision du responsable du projet et/ou du vétérinaire désigné. • En cas de réduction de la mobilité, des pellets humides seront mis à disposition. • En cas de plaies, des soins seront administrés (désinfection avec un antiseptique, nettoyage de la plaie). • En cas de persistance du pli cutané, une réhydratation sera mise en place (injection intraperitonéale de NaCl 0.9% tiède, gel diet). L’animal sera isolé en cage individuelle afin de pouvoir contrôler sa réhydratation. Tout constat d’un mal-être est remonté au responsable du projet et au vétérinaire délégué pour des examens approfondis et traitements adaptés. Si la douleur, la souffrance et l’angoisse ne pouvaient être réduites à leur minimum, une décision d’interruption d’expérimentation sera prise.
Choix des espèces
Les rongeurs sont des espèces classiquement utilisées pour étudier les effets de la suppression d’un gène d’intérêt. Dans ce projet, il s’agit d’un modèle de souris n’exprimant plus le canal ionique TREK1 et qui a l’avantage d’avoir été déjà utilisé à des fins de recherche scientifique. L’activité électrique cardiaque variant en post-natal et jusqu’à l’adolescence, nous travaillerons sur des souris adultes de 15 semaines. Ce modèle de rongeurs va permettre de mettre en évidence le rôle du canal TREK1 dans la fonction du cœur mais également dans le dysfonctionnement électrique et mécanique du cœur par ECG, IRM et stimulation transoesophagienne (S.T). Les résultats obtenus dans ce projet pourront être transposés chez l’Homme et ainsi permettre le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques visant directement TREK1.
Etude de l’implication de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) dans les processus de remyélinisation du système nerveux périphérique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Opérées 45 minutes sous anesthésie pour léser le nerf sciatique, 608 souris passent ensuite des tests de démarche au catwalk, d'écartement des orteils et de sensibilité à l'épingle, avant d'être toutes tuées pour prélever ce nerf. La déclaration les classe toutes en souffrance sévère. Le projet veut confirmer le rôle d'une protéine, l'activateur tissulaire du plasminogène, dans la reconstitution de la gaine de myéline après la lésion, chez des souris de 6 à 10 semaines et de 26 à 30 semaines. Face à ce classement, le porteur décrit des signes de douleur chez certaines souris dans les premières heures après l'opération, et un affaiblissement de la patte arrière gauche qui disparaît en quelques jours ou semaines.
Objectifs
Des études préliminaires ont montré que l'activateur tissulaire du plasminogène (tPA) était une molécule impliquée dans les processus de myélinisation, c'est à dire la formation de la gaine de myéline entourant les neurones du système nerveux central. De plus, des études de la littérature ont mis en évidence une implication de cette molécule (tPA) dans la myélinisation périphérique puisqu'elle est exprimée dans les cellules responsables de la myélinisation (cellules de Schwann) et qu'elle joue un rôle dans la récupération fonctionnelle (motrice et sensitive) après lésion du nerf sciatique chez la souris. Ainsi, le tPA est impliqué dans les processus de myélinisation centraux et périphériques, dans certaines conditions physiologiques ou pathologiques. C'est pourquoi l'objectif de ce projet est d'étudier l'implication du tPA dans les processus de myélinisation induite après lésion du nerf sciatique chez la souris, ainsi que d'étudier le rôle et les mécanismes impliquant le tPA exprimé par les cellules de Schwann en contexte de remyélinisation.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra alors de confirmer l'implication du tPA en contexte de remyélinisation dans le système nerveux périphérique et de pouvoir définir les mécanismes l'impliquant dans cette remyélinisation en contexte de lésion du nerf sciatique.
Procédures
Chaque animal fera l'objet d’une lésion du nerf sciatique (n=608, durée de la procédure : 45min) grâce à une chirurgie réalisée sous anesthésie et analgésie. Les animaux seront soumis à des tests fonctionnels : test du catwalk (évaluation de la démarche), test de capacité d'écartement des orteils (évaluation de la récupération motrice), test de l'épingle (évaluation de la récupération sensitive)(n=608, durée de chaque test : 10min). Tous les animaux (n=608) seront mis à mort à l'issue du projet afin de récupérer et étudier les nerfs sciatiques.
Impact sur les animaux
Certains animaux peuvent montrer des signes de douleur dans les premières heures après la chirurgie. Un affaiblissement de la patte arrière gauche (correspondant à la zone du nerf sciatique lésée) qui disparaît dans les premiers jours/semaines après lésion du nerf sciatique.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort, ce qui permettra de prélever leurs nerfs sciatiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, l'étude de l'expression des protéines dans le nerf sciatique, l'étude de l'ultrastructure des cellules myélinisantes ainsi que la récupération fonctionnelle sont des paramètres qui ne peuvent être étudiés via l'utilisation de méthodes alternatives.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux, déterminé par l'utilisation d'outils statistiques, afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et la littérature. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de l'aisance des expérimentateurs.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel qualifié 7j/7, cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Des dômes de cellulose et des carrés de cotons seront placés dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal. Des points limites seront mis en place afin de réduire ou arrêter toute souffrance occasionnée chez l'animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l'espèces animale la plus étudiée dans le cas des modèles de lésion du nerf sciatique. Les techniques employées concernant ce modèle animal sont bien connues. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait de ce modèle utilisé dans ce projet une approche expérimentale fiable. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend ces espèces particulièrement intéressantes pour cette étude. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 10 semaines concernant la cohorte corerspondant aux "jeunes adultes" et entre 26 et 30 semaines concernant la cohorte correspondant aux "adultes âgés". L'étude sera réalisé chez le "jeune adulte" et chez "l'adulte âgé" afin de pouvoir comparer la différence de récupération fonctionnelle ainsi que les paramètres histologiques pouvant potentiellement différer entre ces deux stades de développement chez la souris. Nous réaliserons nos modèles sur des adultes afin de pouvoir pratiquer sur des animaux du même stade de développement que ceux utilisés en majorité dans les modèles de lésion du nerf sciatique.
Réaction inflammatoire lors de la toxoplasmose oculaire
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
2836 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une injection dans chaque œil pour une infection à Toxoplasma gondii, avec un suivi par fond d'œil répété cinq fois sur quatorze jours, pour étudier la réaction inflammatoire de la rétine. Le porteur indique qu'avec les souches virulentes l'inflammation oculaire s'aggrave au-delà du septième jour, et précise ne pas administrer d'analgésique de crainte de fausser la réponse immunitaire. Sur le remplacement, il affirme que seuls des modèles vivants permettent d'étudier les interactions entre le parasite et l'organisme hôte, et retient la souris comme espèce la mieux caractérisée sur le plan immunologique.
Objectifs
L’infection au parasite protozoaire Toxoplasma gondii est la première cause infectieuse d’inflammation rétinienne chez l’Homme. Or, les mécanismes physiopathologiques de cette maladie sont mal connus. Ceci est avant tout dû à la difficulté d’accès aux yeux humains. Ces contraintes rendent difficile de trouver un consensus sur le traitement. Notre recherche vise à trouver des cibles spécifiques pour l’intervention médicale. Pour des raisons évidentes, le modèle humain ne peut pas être étudié en grand détail, même si nous avons réussi à tirer des conclusions importantes de l’analyse des médiateurs inflammatoires dans l’humeur aqueuse des patients. Pour les questions plus détaillées, nous avons établi un modèle de souris, sur lequel nous avons déjà démontré le rôle de plusieurs médiateurs inflammatoires. Nous nous posons maintenant la question comment cette inflammation est contrôlée dans la rétine. L’œil est considéré comme organe où les réactions inflammatoires pourraient provoquer des dommages irréversibles et qui sont donc bien contrôlées. Or, le mécanisme précis de ce contrôle est mal étudié, surtout lors d’une infection toxoplasmique. Les candidats classiques d’une telle réaction anti inflammatoire, sont des récepteurs et d’autres facteurs immunosuppressives. Ces facteurs sont effectivement exprimés ou sécrétés par des cellules de la barrière oculaire. Ils feront donc partie de notre étude. En plus, nous venons de publier une étude in vitro qui décrit pour la première fois les rôles des interférons de type I et III. Comme il n’avait aucune étude sur ces interférons lors d’une toxoplasmose oculaire, l’étude de leurs fonctions sera au centre de nos expériences. Enfin, une infection toxoplasmique peut avoir des conséquences cliniques très variées selon la souche de T. gondii infectante. Cette différence est aussi observée au niveau oculaire. Les raisons physiopathologiques de ces différences n’ont pas été étudiées dans des modèles animaux. Nous envisageons donc de comparer les infections avec quelques souches isolées des patients et ayant provoquées des manifestations cliniques différentes et bien caractérisées.
Bénéfices attendus
Malgré l’importance clinique de la toxoplasmose oculaire, les mécanismes immunologiques de cette pathologie ne sont que peu connus, malgré quelques progrès ces dernières années. Nous regardons spécifiquement la réaction anti-inflammatoire dans l’œil lors de l’infection. La question derrière est : Comment cet organe particulièrement sensible peut-il se défendre contre une infection, sans trop de destruction par une inflammation trop prononcée ? Les retombés et les bénéfices attendus du projet sont multiples. Nous avons récemment publié un article basé sur des expériences in vitro sur le rôle des interférons dans les mécanismes immunologiques de la toxoplasmose oculaire. Ce projet va donc nous permettre de confirmer, de renforcer et de compléter nos résultats obtenus in vitro. Les résultats ainsi obtenus seront ensuite partagés avec la communauté scientifique par la publication d’un article dans un journal international indexé et revue par des paires. Le projet permettra donc de faire évoluer la connaissance générale dans différent domaines : La toxoplasmose oculaire, mais également plus largement de la réponse immunitaire oculaire. D’autres retombés à plus long terme sont également à prévoir. En effet, une meilleure compréhension des mécanismes de réponse immunitaires peut servir à améliorer ou à mettre en place des nouvelles stratégies diagnostique et thérapeutique. L’objectif à long terme, nécessitant une compréhension très détaillée de l’ensemble des mécanismes impliqués est d’avoir un traitement personnalisé et adapté au besoin du patient. Cela nécessite notamment une bonne compréhension des marqueurs souche-dépendants de la toxoplasmose oculaire, étudiés au cours de ce projet. Ensuite, une connaissance approfondie des interactions entre le parasite et l’expression de certains facteurs immunomodulateurs est également très intéressante. En effet, de nombreuses thérapies visant les check-points immunitaires sont déjà sur le marché traitant une multitude d’atteintes allant du cancer ainsi que certaines immuno-pathologies.
Procédures
Toutes les souris dans ce projet sont anesthésiées (générale) pour une durée de 5 minutes. Durant ce temps, elles reçoivent une injection intraoculaire dans chaque œil. Ensuite, une petite partie de souris sont de nouveau soumises à une anesthésie générale, pour une durée de 3 minutes. Durant cette période, les souris reçoivent une injection de traceurs fluorescents. Finalement, en utilisant une technique d’analyse non invasive, certaines souris sont anesthésiées pour une durée de 5 minutes durant laquelle un fond d’œil est réalisé. Cette procédure est réalisée 5 fois sur une période de 14 jours.
Impact sur les animaux
Les différentes nuisances potentielles pour les animaux sont : L’injection intra-oculaire n’est pas spécifiquement douloureuse, en effet, cette procédure est effectuée sans anesthésie générale chez l’homme. La manipulation de la souris est une source de stress. - L’infection intraoculaire d’une souche toxoplasmique non-virulente Me49. Par expérience, nous savons que le pic de l’inflammation est à 7 jours post-injection, ensuite elle rediminue progressivement pour atteindre un retour à la normale aux alentours du jour 14 post-injection. Sauf cas rare, au pics de l’inflammation, aucune dégradation de l’état générale de la souris n’est observable. Les souris gardent un comportement normal, sont curieuses et explorent leur environnement. Les poils ne sont pas non plus hérissés. Une légère augmentation de la sécrétion lacrymale ainsi que des foyers infectieux de la rétine sont observation en histologie. Ces foyers infectieux ne sont pas douloureux (asymptomatique chez l’Homme) mais peuvent causer une réduction de l’acuité visuelle. - L’infection intraoculaire avec des souches toxoplasmiques virulentes. La principale différence est la cinétique de l’inflammation. Pour la souche non-virulente l’inflammation de la rétine diminue à partir de jour 7. Pour les souches virulentes, l’inflammation devient de plus en plus importante après jour 7.
Devenir
L'étude se termine par la mise à mort des animaux pour prélèvements oculaires.
Remplacement
Nous utilisons en parallèle des modèles in vitro afin d’identifier les mécanismes au niveau cellulaire. Par contre, comme la rétine est un organe complexe, seulement des modèles in vivo peuvent identifier les interactions entre le parasite et l’organisme hôte, d’autant plus que nous étudions la réponse immunitaire. Nous veillons à faire un maximum d’expériences et de mise à point expérimentale sur nos modèles in vitro et d’utiliser le modèle animal pour des études d’interactions au niveau physiologique. Dans l'autre sens, les connaissances obtenues dans notre modèle animal permet de plus en plus d’expériences ciblées in vitro.
Réduction
Nous utilisons, si possible, des techniques multiplexes, pour détecter plusieurs paramètres dans un même échantillon. Nous nous basons sur nos précédentes études chez la souris pour définir nos effectifs minimaux permettant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. L’utilisation des techniques non-invasives, comme le fonds d’œil, nous permet de suivre le cours de l’infection sur une même souris et donc de minimiser le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera assuré par l’enrichissement de l’environnement (lanières de carton, coton, tunnels, dôme) et la formation des groupes sociaux. Le protocole d’infection, avec inoculation d’une faible dose de parasites, et la durée limitée des expériences, résultera, par expérience, en une infection peu ou pas douloureuse pour les souris. Cette injection se fait sous anesthésie générale, ce qui diminue très grandement le stresse induit par la procédure. L’injection n’étant pas douloureuse et les foyers infectieux de la rétine ne provoquant pas de douleur, l’utilisation d’analgésique n’est pas nécessaire ici. Chez l’homme c’est une procédure réalisée sous anesthésie locale sans prescription d’analgésique. De plus, l’utilisation d’analgésique pourrait influencer la réaction immunologique, rendant les données non-interprétable. Enfin, pour les procédures de neutralisation de cytokines, l’injection intravitréenne des parasites et des anticorps neutralisants se fait au même temps. Nous avons inclus dans le projet l’utilisation d’une technique de fond d’œil non-invasive afin de faire un suivi de l’infection au cours du temps sur une même souris. Les résultats ainsi obtenue pourrons être utilisé pour perfectionner notre modèle d’infection actuel. Néanmoins, cette procédure sera faite en collaboration avec un spécialiste des pathologies oculaires chez les rongeurs qui apporte son matériel. Nous ne pouvons donc pas employer cette technique pour les autres expériences. Néanmoins, nous avons un protocole de point limite que nous utilisons et perfectionnons depuis longtemps au sein du laboratoire pour diverse projets très similaires. Ce protocole détaillé dans une section dédiée permet une détection précoce de la souffrance chez la souris dans le cadre de nos procédure expérimentale. Pour sa mise en œuvre nous sommes notamment assistés et conseillés par un ophtalmologue faisant partie de notre équipe.
Choix des espèces
La souris est l'animal le mieux caractérisé au niveau immunologique, ce qui facilite l'interprétation des résultats. En plus, l'immense majorité d'études sur la toxoplasmose dans la littérature ont été fait chez la souris, où les cinétiques d’infection sont les mieux connues. Tout cela fait de la souris l'espèce la plus propice de donner des résultats significatifs. Des animaux adultes de 6 à 12 semaines d’âge sont utilisés, pour avoir des souris avec un système immunitaire développé et des groupes homogènes
Nouvelles approches pour l’évaluation et le traitement des douleurs arthritiques chez les ovins. Partie 01
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
68 brebis vont être utilisées, 34 tuées à l'issue et 34 renvoyées dans leur élevage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant du léger au sévère. Une arthrite est déclenchée par une injection dans l'articulation sous anesthésie, suivie d'une IRM, de prélèvements sanguins, d'injections et de quinze administrations intranasales d'ocytocine, avec quatre tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé. Le porteur décrit une boiterie et un œdème articulaire pendant quatorze jours et prévoit une mise à mort si le score de douleur reste élevé plusieurs jours. Il affirme que le remplacement du mouton est impossible car l'espèce est "l'objet de l'étude", ce projet étant la partie 01 d'un travail mené dans deux établissements.
Objectifs
Chez les animaux d’élevage, la douleur reste un concept délicat à aborder. En effet, l'évaluation de la douleur chez ces animaux repose sur l'évaluation subjective de quelques critères zootechniques, cliniques et comportementaux (productivité, postures, etc.) dont les conclusions vont significativement varier en fonction de l'expérience et de la sensibilité des professionnels et qui ne permettent pas d’évaluer la douleur dans toutes ces dimensions (cognitive/émotionnelle/sensorielle). L'absence de biomarqueurs spécifiques permettant de réaliser un diagnostic précis de l'état douloureux d'un animal et/ou de quantifier l'intensité douloureuse conduit à un déficit d'évaluation. Ce déficit d'évaluation limite la prise en charge précoce des douleurs favorisant le développement de douleurs chroniques avec pour conséquence une augmentation de l'anxiété et du stress de l'animal douloureux mais également de ses congénères via des mécanismes de contagion émotionnelle, encore largement incompris. Par ailleurs, ce déficit d'évaluation ne permet pas de valider de manière précise l'efficacité des traitements antalgiques conventionnels chez les animaux d'élevages or, l'utilisation de ces traitements est limitée 1/ par leurs effets secondaires notamment sur la reproduction (ex : AINS), 2/ par la réglementation qui limite la présence de résidus médicamenteux dans les produits animaux de consommation et 3/ par le coût de ses traitements qui restent à la charge des professionnels. Ensemble, ces contraintes font que la prise en charge de la douleur des animaux élevages est limitée. Il existe donc un besoin impérieux d'innovation pour améliorer d'une part, l'évaluation de la douleur avec pour objectif de tester l'efficacité réelle des antalgiques sur ces animaux et d'autre part, pour stimuler le développement de nouvelles molécules plus efficaces, dépourvues d'effets secondaires et qui satisfassent les contraintes spécifiques de l’élevage. Dans ce contexte, ce projet propose de combiner des approches d’imagerie médicale, d’éthologie et de pharmacologie afin de 1/ mettre en évidence de nouveaux biomarqueurs spécifiques de l’état douloureux dans un modèle d’arthrite inflammatoire chez le mouton et 2/ démontrer l’efficacité antalgique de l’ocytocine, un composé déjà présenté comme antalgique sur les douleurs inflammatoires chez les rongeurs et dont l’utilisation pourrait satisfaire aux contraintes de l’élevage. Ce projet sera réalisé dans deux unités expérimentales.
Bénéfices attendus
Les résultats issus de ce projet auront plusieurs bénéfices aussi bien d'un point de vue scientifique que du point de vue de la médecine vétérinaire. D'un point de vue scientifique ce projet apportera de nouvelles connaissances sur les mécanismes de contagion émotionnelle de la douleur et de son impact sur l’expression des comportements sociaux chez les animaux. D’un point de vue de la médecine vétérinaire, si les résultats de ce projet démontrent l’efficacité antalgique d’un traitement intranasal d’ocytocine, alors nous aurons alors fourni les premiers arguments pour un repositionnement de l’ocytocine comme analgésique pour le traitement des douleurs inflammatoires chez les ovins.
Procédures
Au sein de l'EU1 les interventions suivantes seront réalisées: Huit prélévements sanguins (veine jugulaire) durant quelques secondes / Deux injections sous cutanées durant quelques secondes / Quinze administrations intra nasales durant quelques secondes / Quatre tests comportementaux qui seront réalisés 8 fois. Un test ne sera effectué qu’une seule fois et durera 5min ; les 3 autres seront effectués 8 fois et ils dureront 3min, 10min et 30min. Au sein de l'EU2 les interventions suivantes seront réalisées: Une injection intraarticulaire réalisée au sein de l'EU2 sous anesthésie générale et sous analgèsie (45 min) pour l'induction d'un modèle d'arthrite / Une procédure d'imagerie médicale IRM réalisée sous anesthésie générale (1h45) dans lEU2
Impact sur les animaux
L’induction du modèle d'arthrite induit l'apparition d'une boiterie, un œdème articulaire et des signes de douleur à la flexion modérée pendant 14 jours. Les différents actes expérimentaux peuvent engendrer du stress pour l’animal. L'administration intra nasale peut être un acte désagréable pour l’animal mais l’ocytocine ne présente pas d'effet secondaire. Les prises de sang réalisées à la veine jugulaire peuvent entrainer une légère douleur ainsi que l’apparition d’un éventuel hématome au niveau du site de prélèvement. Les injections sous cutanées réalisées de part et d’autre des flancs de l’animal ainsi que l’injection intra-articulaire (tibiotarsiennes) pour induire le modèle d'arthrite peuvent également engendrer une douleur légère au niveau du site d’injection. Les tests comportementaux peuvent induire un stress léger. Le transport des brebis d’un établissement utilisateur à l’autre peut générer du stress pour l’animal.
Devenir
34 brebis seront replacées dans leur élevage et 34 autres brebis seront euthanasiées afin de récolter les tissus d’intérêt (articulation, moelle épinière, cerveau) pour des études ultérieures.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer nos animaux avec une autre espèce ou un substitut non-vivant. L’utilisation du mouton est nécessaire car notre projet répond à des questions précises concernant l’élevage et la médecine vétérinaire de cette espèce. De plus, nous souhaitons étudier l'impact d'une douleur modérée sur l'expression des comportements sociaux dans cette espèce et cette question ne peut pas être abordée par des méthodes alternatives.
Réduction
Pour une étude basée sur un approche IRM, notre effectif est plutôt important (N=4x8 animaux). Ainsi, nous optimisons nos chances d’obtenir un contraste suffisant entre les groupes expérimentaux. Les conditions de vie sont en adéquation avec les besoins de l’espèce (i.e. herbivore social). Les conditions de vie du groupe « arthrite-serum physiologique » (i.e. traitement avec l’impact le plus négatif) correspondent à la réalité observée naturellement, voire moins douloureux puisque nos animaux ne développeront pas d'atteinte sur d'autres articulations ou encore des atteintes pulmonaires comme observées lors des infections à agalacticae sur les exploitations. La taille de nos effectifs (8 individus par groupe) nous permettra de réaliser des analyses statistiques. Le choix des tests dépendra de la distribution des données et de l’homogénéité des variances. Si les conditions de normalité de la distribution et d’homogénéité des variances sont remplies, nous utiliserons des tests paramétriques. Si ces conditions ne sont pas remplies, nous utiliserons des tests non-paramétriques tels que les tests de permutation pour comparer les lots expérimentaux. Des matrices de corrélation pourront être utilisées pour tester les éventuels liens entre paramètres comportementaux et neurobiologiques, si la variabilité intra-groupe le permet.
Raffinement
Les conditions de vie des animaux seront en adéquation avec les besoins de l’espèce. Ils seront hébergés dans le bâtiment conditionnés de l'EU1 et auront accès à l'eau et à la nourriture ad libitum. L'enclos des animaux sera enrichi avec un promontoire permettant à l'animal de monter et descendre afin qu'il puisse changer son point d'observation et faire de l'exercice. Lors du transport des animaux entre les deux unités expérimentales, les animaux recevront une injectionde neuroleptique afin de limiter le stress. Lors de l'induction du modèle les animaux seront anesthésiés et analgésiés afin de limiter l'induction de douleurs inutiles liés à l'injection intrarticulaire de BCII. Tous les animaux seront visités quotidiennement et une surveillance accrue sera réalisée post induction du modèle. Deux expérimentateurs indépendants utiliseront deux échelles d'évaluation publiées et validées pour évaluer la douleur chez les animaux Expérimentateurs. Ainsi, si un animal Expérimentateurs présente pendant plus de trois jours un score supérieur à 5 sur l'une de ces deux grilles l'animal recevra une injection d'antalgique et sera euthanasié par un employé qualifié de l'EU1. L'animal Observateur sera replacé au sein du cheptel de l'EU1 et sortira de l'expérimentation. Lors des prélèvements, des tests comportementaux, et des injections intranasales, les animaux recevront une récompense sous forme d'aliments juste après les procédures afin de réduire le stress engendré par la procédure.
Choix des espèces
Le mouton est utilisé dans cette étude à cause de la forte incidence (jusqu'à 40% des jeunes animaux dans certaines fermes) des pathologies l'arthritiques observées dans cette espèce. Ces arthrites sont causées par plusieurs bactéries et cette situtation sanitaire présente une sérieuse atteinte au bien-être des animaux. Ainsi l'utilisation du mouton est nécessaire car cette espèce est l'objet de l'étude. Les animaux utilisés seront des femelles de race Ile de France agées entre 9-10 mois. Ce projet sera réalisé chez des jeunes animaux car la prévalence des arthrites infectieuses est plus importante chez les jeunes ovins.
Caractérisation des circuits neuronaux impliqués dans le signal « glucose-portal » et ses effets sur le métabolisme
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
80 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 64 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 16 un niveau modéré. Elles subissent une injection cérébrale par chirurgie stéréotaxique pour inactiver un noyau, et pour la plupart la pose d'un cathéter dans la veine porte par une seconde chirurgie, avec mesures de glycémie et prélèvements avant la mise à mort. Le projet cherche à savoir si ce noyau cérébral est "nécessaire" à l'effet coupe-faim du glucose produit par l'intestin. Le porteur indique utiliser des animaux de réforme pour la mise au point et affirme que l'étude d'un "organisme entier" ne peut être remplacée par des cellules ou des organoïdes.
Objectifs
L’obésité et le diabète de type 2 connaissent une croissance alarmante. La dérégulation de la glycémie, notamment chez des personnes diabétiques ou obèses, est un problème majeur de santé publique nécessitant une recherche constante quant aux thérapies proposées. Les études précédentes ont mis en évidence que la production de sucre (glucose) par l’intestin exerce des effets bénéfiques sur l’équilibre glucidique et énergétique. L’intestin est en effet capable de produire du glucose en dehors des repas dans une veine spécifique (veine porte), située entre l’intestin et le foie. La détection de glucose dans cette veine après un repas induit un signal nerveux qui cible le cerveau, et qui en retour, va diminuer la taille du repas suivant. Ainsi, lorsque nous imitons la production de glucose par l’intestin en perfusant du glucose directement dans la veine porte, nous observons une diminution de la prise alimentaire associée à une activation de 3 régions du cerveau, connues pour contrôler la faim. Cependant, les études réalisées jusqu’alors ne permettent pas de déterminer si l’activation de chacun de ces 3 noyaux est nécessaire ou si elle est redondante pour les effets coupe-faim de la production intestinale de glucose. Un des noyaux impliqué dans ces effets coupe faim, est un centre important d’intégration des signaux provenant du système digestif et est connu pour moduler la prise alimentaire. Dans ce projet, nos objectifs sont de déterminer si l’activation de ce noyau est nécessaire à la mise en place de l’effet coupe-faim induit par la production intestinale de glucose. Pour cela, nous étudierons, sur une durée d’un an, si l’inactivation de ce noyau cérébral spécifique (par l’injection d’un virus directement dans le cerveau) annule les effets coupe-faim de la détection de glucose dans la veine porte.
Bénéfices attendus
Les mécanismes moléculaires par lesquels la production intestinale de glucose exerce ses effets bénéfiques sur l’obésité, le contrôle glycémique et l’accumulation de graisses dans le foie ne sont pas connus. Les résultats issus de ce projet nous permettrons d’identifier précisément quelles régions du cerveau sont indispensables aux effets bénéfiques de la production intestinale de glucose. Ils s’intègrent dans une étude plus globale qui cherche à comprendre comment le glucose est détecté dans la veine porte et comment le cerveau reçoit et intègre informations nutritionnelles envoyées par l’intestin. A plus long terme, ces mécanismes pourraient représenter une cible thérapeutique intéressante pour lutter contre l’obésité et ses complications.
Procédures
A l’âge de 12 semaines, certaines souris subiront : - une injection (5 secondes) d'un composé destiné à inactiver des neurones spécifiques, suivie de deux mesures de glycémie par prélèvement de sang à la queue (3 secondes chacune) et deux mesures de poids et de prise alimentaire sur 24h, puis 15 jours après, une injection cérébrale au cours d’une chirurgie sous anesthésie générale d’une durée de 30 minutes/souris (8 souris). - une injection cérébrale au cours d’une chirurgie sous anesthésie générale d’une durée de 30 minutes/souris (8 souris). - une injection cérébrale au cours d’une chirurgie sous anesthésie générale d’une durée de 30 minutes/souris, puis 15 jours après, une injection intrapéritonéale suivie d’une chirurgie sous anesthésie générale permettant la pose d’un cathéter dans la veine porte d’une durée de 20 minutes/ souris (64 souris).
Impact sur les animaux
- L’injection peut entrainer une légère douleur au niveau de l’abdomen ainsi qu’un stress. Une attention particulière sera portée lors de l’injection pour éviter au maximum toute inflammation du péritoine. - Les interventions chirurgicales sont susceptibles de provoquer de la douleur. - L’injection du virus peut entrainer une faible réponse immunitaire localisée. - La chirurgie réalisée dans le cerveau peut entrainer des problèmes neuro-musculaires. - Au cours de la chirurgie, l’anesthésie gazeuse peut entrainer des difficultés respiratoires. - La chirurgie peut entrainer une hémorragie locale. Ces nuisances sont diminuées par la mise en place de raffinements spécifiques.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélèvements d’organes et analyses des tissus. Le cerveau, le foie et les tissus gras seront étudiés pour déterminer si l’inactivation du noyau cérébral annule les effets bénéfiques de la détection de glucose dans la veine porte préalablement observé sur ces tissus.
Remplacement
Cette étude ne peut pas être réalisée sur cellules ou organoïdes car la détection du glucose dans la veine porte a des impacts sur l’ensemble du métabolisme et implique des dialogues entre organes. En effet, le glucose produit par l’intestin est détecté dans les vaisseaux et active un signal nerveux vers le cerveau. En réponse, le cerveau va émettre des signaux nerveux en périphérie qui ont des effets bénéfiques anti-obésité et anti-dabiète. Pour comprendre comment la production intestinale de glucose exerce ses effets bénéfiques, il est donc nécessaire de l’étudier dans l’organisme entier.
Réduction
La totalité des animaux utilisés dans la procédure de mise au point sont des animaux de réforme, systématiquement mis à mort en dehors de ce projet. Ainsi, l’utilisation de ces animaux contribue à la réduction du nombre d’animaux, en évitant de produire des animaux spécifiquement pour cette expérience. De plus, certaines interventions seront mises en œuvre sur les animaux d'un même lot de façon à ne pas recourir à des animaux supplémentaires. Le nombre de souris utilisées pour l’expérience propre a été calculé au plus juste par des méthodes statistiques et à partir des connaissances des modèles animaux et du métabolisme glucidique, mais aussi des résultats d’études précédentes ayant permis de valider la preuve de concept : Soit au maximum 16 souris par groupe. De plus, différents tissus (foie, reins, tissus adipeux, pancréas, …) seront prélevés afin de déterminer si l’inactivation du noyau cérébral annule les effets bénéfiques à court terme induit par le signal glucose portal dans ces tissus. Ces tissus pourront constituer une banque de tissus commune au laboratoire pouvant être utilisés par la suite pour d’autres problématiques relatives à la production intestinale de glucose, notamment en évaluant la stéatose hépatique et le brunissement du tissu adipeux. Au total, ce projet nécessitera au maximum 80 souris mâles.
Raffinement
Les souris seront accueillies à l’âge de 5 semaines et auront ainsi une longue période d’acclimatation avant le début des procédures à l’âge de 12 semaines. Les souris seront hébergées en animalerie conventionnelle avec eau et nourriture ad libitum avec enrichissement. Pendant cette phase d’acclimatation, des pesées hebdomadaires seront réalisées et les animaux seront observés et manipulés quotidiennement. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie avec un traitement analgésique et antalgique adapté pendant plusieurs jours afin de limiter la souffrance, la douleur et le stress de l’animal pendant et après cette chirurgie. Après les chirurgies, un suivi intensif est régulier sera réalisé tous les jours tout au long de l’expérience pour identifier et réduire d’éventuelles souffrances selon une grille de score spécifique. Des signes de maladie, de perte de poids, de souffrance, de lésions ou de détérioration de l’état de santé général constituent des points particuliers limites au-delà desquels, si aucun moyen de prévention/correction de la douleur n’a été efficace, les souris sont mises à mort.
Choix des espèces
Le rôle de l’intestin, organe capable de produire du sucre entre deux repas ou lors de jeûne, sur le métabolisme glucidique et énergétique a été étudié chez les rongeurs. Les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que les mammifères. Ces études sont réalisées afin de fournir des bases fondamentales à la recherche clinique humaine et la souris est un modèle dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils d’analyse disponibles (anticorps, kit biochimiques…). Les animaux seront tous utilisés à l’âge adulte, entre 12 et 15 semaines. A cet âge, les individus présentent un meilleur rétablissement post-chirurgical.