Recherche fondamentale

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections intrapéritonéales, sont hébergées isolées pendant quatorze jours et mises à jeun, avant des mesures gustatives au gustomètre et au lickomètre présentées comme non invasives. Le porteur les fait tuer pour prélever le cerveau et en réaliser l'histologie. Il étudie le rôle de l'inflammation cérébrale postprandiale sur le goût et rattache au conditionnel des retombées sur les troubles du comportement alimentaire.

Objectifs

L’existence de la réaction inflammatoire postprandiale (postprandial inflammatory response, PIR) systémique est maintenant bien documentée mais, ses effets sur l’organisme sont encore mal connus. La PIR apparaît chez l’individu sain dans un contexte de physiologie normale. Elle se caractérise par l’augmentation transitoire de facteurs inflammatoires circulants après un repas. La PIR est exacerbée lorsque le repas est riche en graisses. Notre équipe a montré que la PIR se développait aussi dans le cerveau, elle se caractérise par une activation des cellules inflammatoires spécifiques (les cellules microgliales) chez l’individu sain en réponse à un repas gras. Cette réponse est visible 3 heures après le début du repas. Elle se produit dans l’hypothalamus, une structure impliquée dans la régulation de la prise alimentaire, du poids corporel et du métabolisme énergétique. Nous avons déjà identifié des effets bénéfiques de la PIR en montrant qu’elle contrôlait la prise alimentaire en favorisant la satiété et en limitant les apports caloriques après consommation d’un repas gras. Pour démontrer cela, nous avons éteint la PIR cérébrale chez la souris et observer les conséquences de cette extinction, en comparant le comportement alimentaire de souris modifiées génétiquement (sans la PIR) et de souris normales. L’objectif désormais est d’explorer la sensibilité gustative de ces animaux. Il s’agit de déterminer si la PIR agit sur les préférences alimentaires et/ou l’appréciation alimentaire. Pour évaluer cette possibilité, nous allons mesurer les performances gustatives chez des souris dont la PIR cérébrale a été abolie ou non. L’approche de perte de fonction est possible grâce à l’étude d’animaux mutants ne pouvant pas déclencher la PIR au niveau cérébral. Ces performances seront mesurées grâce à des dispositifs appelés gustomètre et lickomètre. Des animaux non mutants seront les témoins de l’expérience. Les animaux seront étudiés sous régime standard ou gras pendant 48 heures. A la fin des études, les animaux seront mis à mort et les cerveaux seront collectés post-mortem pour analyses moléculaires. Au total, 90 souris seront utilisées dans ce projet.

Bénéfices attendus

Les résultats permettront de mieux comprendre les fonctions de la PIR cérébrale chez l’individu sain, et donnera des informations nouvelles sur les mécanismes cérébraux impliqués dans le contrôle de la satiété et du métabolisme énergétique. Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur le contrôle de l’appétit, et pourrait permettre de mieux comprendre les troubles du comportement alimentaire tels que la boulimie, l’hyperphagie, ou l’anorexie.

Procédures

les animaux seront isolés et des mises à jeun de durée differentes à des temps differents seront réalisées. Certains animaux recevront des injections d'un composé pour induire l'expression de leur gène muté.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances sont liées aux 5 injections IP du composé entrainnant l'expression du gène muté des animaux à 5 semaines (douleur liée à une injection Intrapéritonéale) et aux conditions d’hébergement isolées pendant 14 jours. Ue stress métabolique léger sera induit par la mise en jeun pendant 5 heures. Enfin, la contention des animaux (pour mesurer le poids des animaux) représente aussi des nuisances de faible intensité pour les animaux.

Devenir

Les 90 souris seront toutes mises à mort afin de prélever le cerveau en vue d’analyses histologiques.

Remplacement

Cette étude nécessite l’utilisation de modèles expérimentaux vivants. En effet, il n’existe pas actuellement de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier l’équilibre énergétique et le dialogue inter-organes d’un point de vue intégré. De plus, les réponses comportementales autonomes que nous souhaitons étudier représentent des paramètres complexes qui ne sont pas modélisables in vitro ou in silico. Ainsi ce projet sera réalisé chez la souris, qui constitue un modèle de référence pour les études métaboliques et neurophysiologiques. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses métaboliques et comportementales fines.

Réduction

La procédure décrite (contrôle des conditions nutritionnelles et métaboliques) a été optimisée, standardisée et validée précédemment, ce qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, et donc de réduire les effectifs nécessaires au projet. Une étude pilote sera réalisée afin de s’assurer de l’optimisation des procédures. Le fait de travailler avec des animaux standardisés (sexe, âge, et fond génétique maitrisés) dans des conditions d’élevage standardisées (environnement, nutrition, intervention humaine) est un élément qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, et donc de réduire les effectifs nécessaires dans l’étude. Nous utiliserons des tests statistiques permettant d’identifier de manière optimale les différences significatives entre les groupes expérimentaux, ce qui permet enfin de mener des études conformes sur des effectifs réduits.

Raffinement

Depuis la naissance des animaux dans l’animalerie, tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux (manipulation par les personnes compétentes, calme dans les pièces). Les animaux seront élevés dans un environnement enrichi et placés dans une pièce en cycle jour-nuit 12h-12h inversé pour étudier le comportement des animaux pendant leur période nocturne d'activité. L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à des dômes de nidification et des carrés de coton qui permettent l’expression de comportements innés de construction du nid et permettent aux animaux de s'exposer au milieu extérieur de leur propre volonté . Un suivi quotidien sera assuré pour veiller au bien-être des animaux. Les différentes manipulations des animaux et injections seront effectuées par du personnel compétent, conformément à la législation. Les principaux dispositifs instrumentaux utilisés dans ce projet (gustomètre et lickomètre) permettent des mesures non-invasives.

Choix des espèces

La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique et nous disposons maintenant d’outils génétiques spécifiques à cette espèce et d’intérêt dans notre projet. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes mâles, âgées de 9 semaines. Cet âge correspond à un cerveau mature stabilisé.

54 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris nude subit une chirurgie de trente minutes créant une poche sous-cutanée dans le dos pour y implanter une racine de dent humaine de dix millimètres. Le porteur attend une douleur post-opératoire modérée et une gêne liée à la dent implantée. Il teste un dispositif de régénération de la pulpe dentaire, développe des cultures en bioréacteur mais affirme que le modèle animal reste le "seul" à permettre de vérifier la formation d'une pulpe vascularisée.

Objectifs

Le but de ce projet est de tester un dispositif médical implantable pour permettre la régénération de la pulpe dentaire. Le dispositif est un cône qui peut être inséré dans la racine d'une dent à la fin d'un traitement de racine lorqu'un saignement aura été provoqué dans le canal par le chirurgien-dentiste pour former un caillot sanguin. Ce cône permettra la prolifération du tissu nouvellement formé, comme lors d'un processus de cicatrisation, sur la longueur totale du canal c'est-à-dire jusqu'à la couronne dentaire. Ce cône permet également la libération d'un agent antibactérien, l'acide tannique, pour assurer la désinfection totale du canal. Le projet a donc également pour objectif de vérifier l'innocuité de l'agent antimicrobien sur la régénération tissulaire.

Bénéfices attendus

Le bénéfice de ce projet est la validation d'une nouvelle approche de traitement des nécroses pulpaires. Le traitement permettrait de ne plus utiliser de matériaux pour une obturation canalaire à la fin d'un traitement de racine qui a encore un taux d'échec de 10%. La régéneration du tissu permettra une réponse biologique à des agressions futures de la dent (carie ou fracture) et favorisera donc le maintien de la dent sur l'arcade sur une période plus prolongée.

Procédures

La procédure chirurgicale sous-cutanée est réalisée sous anesthésie générale et couverture antalgique et dure au maximum 30 minutes. Le geste proposé dans cette demande est la création d’une poche sous-cutanée dans le dos de la souris pour l’implantation d’une racine d’une dent humaine. L’idée ici est de permettre la mise en place de phénomènes de vascularisation pour étudier la mise en place d’un néo-tissu pulpaire dans le canal radiculaire de la racine implantée.

Impact sur les animaux

La procédure employée est peu invasive puisqu’il s’agit de réaliser une poche sous-cutanée dans le dos de l’animal. On peut donc s’attendre à une douleur post-chirurgicale d’intensité modérée. L’insertion d’une dent (longueur 10 mm) va générer une gène mais qui ne devrait pas avoir de retentissement sur l’activité de la souris. La procédure peut néanmoins générer un stress au moment de l’acte chirurgical.

Devenir

Les animaux utilisés sont des souris nude qui ont un phénotype dommageable. Ces animaux ne peuvent dont pas être adoptés. Aux vues du type d’expérience menée, la réutilisation des animaux n’est pas envisageable non plus. L’ensemble des animaux qui seront utilisés seront donc mis à mort. Ceci a été discuté avec le vétérinaire en charge de l’animalerie dans laquelle se passera l’expérimentation.

Remplacement

Nous développons actuellement des dispositifs de culture tridimensionnelle en bioréacteur pour permettre de recréer l’environnement du canal radiculaire d’une dent humaine. Mais les processus de formation du tissu ne peuvent être étudiés jusqu’au bout car le volume du tissu empêche l’oxygénation et l’élimination des déchets de l’activité métabolique cellulaire. Ceci n’est possible que dans un modèle animal. Le modèle choisi ici d’implantation ectopique d’une dent humaine est déjà très couramment utilisé dans le monde et est le seul qui permet à ce jour de vérifier la formation d’une pulpe dentaire vascularisée (Ling Lei et al. Mesenchymal stem cell characteristics of dental pulp and periodontal ligament stem cells after in vivo transplantation, Biomaterials 35(2014) 6332-6343; Qian Li et al. Multifunctional peptide-conjugated nanocarrieres for pulp regeneration in a full-length hman tooth root. Actac Biomaterialia 17 (2021) 252-265).

Réduction

Les premières étapes du projet ont été conçues pour permettre la réduction du nombre d'animaux utilisés. Elles doivent permettrent en effet d'affiner la formulation du dispositif médical pour n'avoir à en tester qu'un seul type, avec une dose d'acide tannique (agent antimicrobien) définie comme efficace et non toxique. Les premières phases de la régénération tissulaire (cicatrisation) induites par notre procédure ont été testées in vitro pour s'assurer du potentiel de réussite de cette expérimentation. Etant donné le nombre d'analyses nécessaires (études histologiques, immunohistologiques...) et afin de valider les résultats, le nombre maximum d'animaux a été évalué à 54 souris pour 2 ans. De plus, uniquement l'implant validé in vitro, sera testé en implantataion sous cutanée. Il n'y aura pas de tests statistiques, nous effectuerons des observations directes. Par exemple, pour la biocompatibilité, nous regarderons en priorité le recrutement et l'infiltration éventuelle de cellules inflammatoires. Le n a été déterminé pour avoir une triplicat par temps d'implantation.

Raffinement

Afin de nous assurer du bien-être des animaux au cours de ce protocole nous avons mis en place les mesures suivantes : - la chirurgie sera réalisée sous anesthésie/analgésie en prenant garde que la température de l'animal soit maintenue tout au long de la procédure. De plus un traitement analgésique pos-opératoire sera mise en place. - L'état de santé des animaux sera suivi quotidiennement en période post-opéraoire puis tous les 3 jours jusqu'à la fin de la procédure. - Des points limites pédictifs ont été mis en place pour interrompre la procédure et soulager les animaux. Enfin comme nous utilisons des animaux immunodéprimés, il est prévu que l'hébergement se fasse en portoirs ventilés permettant de préserver la qualité de l'air de la cage et ainsi d'éviter aux animaux d'être infectés par des pathogènes ambiants potentiels.

Choix des espèces

Le modèle utilisé est la souris. Le modèle murin d’implantation sous cutanée est lui très simple et favorise donc une diminution drastique de l’inconfort de l’animal (procédure rapide, avec peu de dommage tissulaire associé). De plus cela permet d’utiliser des modèles pour lesquels la réponse immunitaire a été altérée ce qui est essentiel dans notre cas puisque la source d’agent chimiotactique est humaine. Nous utiliserons des souris nude. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (après 8 semaines minimum) pour présenter des systèmes physiologiques (notamment immunitaire) matures.

220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées au polluant PFOS par gavage deux fois par semaine pendant vingt-huit jours, vaccinées contre la grippe, puis soumises à des prélèvements sanguins répétés en rétro-orbitaire. Le porteur les fait tuer pour prélever les organes cibles du système immunitaire. Il affirme que la souris est le "meilleur modèle" et qu'il n'existe "pas encore" de méthode alternative, tout en présentant l'objectif final du programme comme la mise au point de tests sans animaux.

Objectifs

De nombreuses substances chimiques produites par l’activité humaine polluent l’environnement. Ces polluants environnementaux sont multiples et leurs effets néfastes sur la santé humaine sont nombreux. Parmi les polluants environnementaux, certains sont des polluants organiques persistants, c’est-à-dire qu’ils s’accumulent dans l’environnement mais aussi dans les organismes, comme l’organisme humain, du fait d’une très lente élimination. Ils représentent une large famille de plusieurs milliers de composés produits intentionnellement par synthèse chimique pour leurs propriétés diverses. Ces substances se répandent dans l’environnement lors de leur production et de leur utilisation. La population humaine y est donc largement exposée, notamment, par ingestion ce qui peut entraîner de nombreux problèmes de santé comme la perturbation endocrinienne (maladies thyroïdiennes, problèmes de fertilité…), des lésions hépatiques et des cancers. L’agence sanitaire européenne a proposé une réévaluation de la toxicité de ces polluants organiques persistants en incluant leurs effets sur le système immunitaire. L’objectif de cette expérience pilote consiste à mettre au point un protocole adapté visant à analyser, chez la souris, les conséquences d’une exposition par ingestion (gavage) à un polluant organique persistant, sur la réponse immunitaire consécutive à une vaccination anti-grippale. L’administration par ingestion a été choisie afin de mimer le principal mode d’exposition de la population humaine. Le polluant choisi pour cette expérience est l'un des plus connus de sa catégorie.

Bénéfices attendus

Ce programme de recherche en immunotoxicologie englobe de nombreux laboratoires de recherche français et étrangers. Il s’agit d’une démarche de caractérisation des effets de polluants environnementaux sur l’organisme. Ces effets constituent un réel enjeu de santé publique. Ce projet d’immunotoxicologie dont fait parti cette première demande d'autorisation à projet, a pour objectif de développer des biomarqueurs d’exposition et des méthodes de mesures standardisées avec l'objectif à la fin de la réalisation complète du programme de mettre en place des tests réglementaires robustes ne faisant pas appel à l’expérimentation animale.

Procédures

Gavage : 2 fois par semaine pendant 28 jours. Le temps de gavages est de moins d'une minute. Injection intra-musculaire : 2 injections maximun sur 74 jours. Une injection dure environ 30 secondes. Prélèvements sanguins tous les 5 jours pendant 47 jours. Comme ce prélèvement se ferra au niveau sinus retro-orbitaire en tenant compte de la sédation par inhalation, de la contention et de la récupération du sang la durée est estimée à 3 minutes par prélèvement.

Impact sur les animaux

Le gavage peut induire une iritation de l'oesophage. La toxicité du polluant peut provoquer une réaction chez l'animal. La vaccination en intra musculaire peut provoquer une douleur localement. Les prises de sang répétés engendrent des contraintes aux animaux à cause de la contention et du renouvellement de leur volume sanguin induit par les prélèvements et pouvant avoir une influence sur leur état général.

Devenir

A l'issu de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de récupérer les organes cibles pour étudier dans le détail le système immunitaire.

Remplacement

La souris est le meilleur modèle pour ce genre d’étude d’immunotoxicité sur la réponse vaccinale et il n’existe pas, encore à ce jour, de méthode alternative à ce modèle. Il permet d'étudier la réponse intégrée de l'organisme, cruciale dans la réponse immunitaire. Dans cette DAP nous prévoyons une première partie expérimentale afin de mettre au point nos techniques d'analyse et de valider le design expérimental post mortem prévu. Selon les résultats obtenus grâce à cette étude, un nouveau projet sera mis en oeuvre sur des souris mâles et femelles en testant différentes doses de polluant, probablement plus faibles que la dose utilisée dans cette présente expérience . Ceci permettra d’évaluer l’effet genre ainsi que la relation entre la dose de polluant et son effet sur la réponse vaccinale. Dans l’ensemble notre projet permettra de mieux comprendre l’impact des polluants environnementaux sur la réponse immunitaire consécutive à une vaccination dans un modèle in vivo. Les résultats obtenus in vivo seront comparés à ceux que nous obtiendrons en parallèle sur des modèles in vitro et ex vivo (cellules humaines) afin d’aider à la mise en place de tests réglementaires robustes ne faisant pas appel à l’expérimentation animale.

Réduction

Les procédures ont été conçues afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant l’obtention de résultats statistiquement exploitables. De plus, afin d’obtenir le maximum d’informations sans augmenter le nombre d’animaux utilisés, nous élargirons notre étude à d’autres tissus que ceux composant le système immunitaire (rate, sang), notamment le foie, qui joue un rôle crucial dans le métabolisme et la détoxication. Afin de rationaliser le recours aux animaux, le plan expérimental prévoit le prélèvement de plusieurs tissus sur une même souris (rate, foie, sang), la congélation de plusieurs échantillons d’un même tissu pour des analyses a posteriori (par notre laboratoire ou dans le cadre de collaborations), ainsi que l’analyse de plusieurs paramètres sur un même prélèvement (ARN, protéines). En particulier, nous travaillons en concertation avec différents laboratoires de recherche impliqués dans le programme et avons établi une procédure de partage des prélèvements biologiques murins afin d'optimiser l'utilisation des souris.

Raffinement

Les procédures ont été pensées afin de limiter la douleur, des points limites nous permettant d’estimer le degré de douleur ou d’inconfort ont été définis et une grille de scoring a été établie. Des actions d'enrichissement du milieu de vie sont proposées pour réduire les nuisances. Les animaux seront hébergés en portoir ventilé par groupe de 5 avec accès ad libitum à l’eau et à la nourriture et à de l’enrichissement comme des maisons type igloo en plastique ou en carton. Pour réaliser les prélévements de sang les animaux seront sédatés par une anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

Le modèle est couramment utilisé dans le domaine de la toxicologie selon la bibliographie. Les animaux seront expérimentés à partir de 7 à 8 semaines d'âge, qui correspond à la fin de la phase exponentielle de croissance, selon la fiche référence de la souche du fournisseur et cet âge.

402 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent du tamoxifène par gavage ou injection pour éteindre un gène, puis des injections destinées à marquer les cellules, y compris des souriceaux nouveau-nés gavés tous les deux jours. Le porteur indique que ces manipulations peuvent entraîner une perte ou une prise de poids, une diarrhée et une déshydratation. Il relève de la recherche fondamentale sur la membrane basale de l'intestin, utilise des organoïdes "dans la mesure du possible" mais affirme qu'ils ne reproduisent pas cette membrane.

Objectifs

L'épithélium intestinal est une barrière qui protège l'organisme de l'environnement hostile de la lumière intestinale. Il empêche le passage des toxines, des agents pathogènes et des déchets tout en permettant l'absorption des nutriments et des ions. Pour maintenir l'intégrité du tissu, l'ensemble de l'épithélium est remplacé en 3 à 5 jours chez la souris. L'épithélium recouvre les villosités, des protubérances en forme de doigts qui s'avancent dans la lumière de l'intestin, et les cryptes, des invaginations qui descendent dans le tissu conjonctif de l’épithélium. Si la formation initiale de l'intestin est un processus embryonnaire, les grands changements morphologiques tel que l'invagination des cryptes, ne se produisent que pendant la période postnatale. Tout au long de leur vie, les cellules épithéliales restent attachées à la membrane basale (BM). Elle est composée principalement de protéines qui s'auto-assemblent pour former une structure en forme de feuille. La BM fournit un support structural à l'épithélium, favorise l'attachement des cellules et maintient le sens des cellules. Cependant, la composition des protéines de la BM n'est pas uniforme, elle change tout au long de la vie et de la maladie. Le rôle que joue la composition de la membrane basale dans le comportement des cellules épithéliales reste inexploré. Les cellules épithéliales intestinales présentent un cycle de vie étroitement régulé. Les cellules souches se divisent dans les cryptes et se différencient en cellules sécrétrices et absorbantes à la sortie des cryptes. Les cellules migrent ensuite activement vers l'extrémité de la villosité, où elles meurent après s'être détachées de la BM. Nous ne savons pas ce qui détermine les limites des cellules en division dans la crypte, limite la perte des cellules à l'extrémité de la villosité, caractérise les signaux qui guident la migration des cellules et déclenche le commencement de la migration cellulaire au cours de la vie de l'animal. Dans ce projet, nous visons à évaluer le rôle de certaines des protéines qui composent la membrane basale sur le comportement des cellules pendant le développement postnatal et la vie adulte.

Bénéfices attendus

Différentes pathologies sont possibles lorsque l'homéostasie intestinale n'est pas maintenue. Il s'agit notamment de problèmes digestifs, de maladies inflammatoires de l'intestin et de cancers. L'implication de la membrane basale dans ces pathologies n'a pas été étudiée. Comprendre le rôle de la membrane basale dans le maintien de l'homéostasie peut apporter un éclairage nouveau sur des pathologies connues. Bien que ce projet relève de la "recherche fondamentale", la compréhension du rôle régulateur de la membrane basale en général et de la Laminine 5 en particulier dans la régulation de l'homéostasie intestinale peut offrir de nouvelles pistes pour la recherche de pathologies dans l'intestin et, par conséquent, pour la découverte de nouvelles voies de traitement.

Procédures

Dans la première procédure, l’élimination ciblée du gène d’intérêt sera générée par l’administration de tamoxifène par gavage oral ou par injection IP. Pour la suppression complète, le tamoxifène sera administré une fois par jour pendant 5 jours consécutifs à des souris adultes. Pour l’élimination à long terme des gènes de la membrane basale, nous mettrons également en œuvre un régime d’administration à long terme de tamoxifène à l’aide d’aliments contenant du tamoxifène. La nourriture tamoxifène remplacera la nourriture normale pendant 4 à 12 semaines. Jusqu’à 54 heures avant la mise à mort de l’animal, les souris seront injectées une fois avec un produit non irritant ni toxique pour marquer les cellules proliférantes et suivre leur migration vers le haut des villosités. 2 heures avant de mettre à mort l’animal, les souris seront injectées une fois (selon la première injection) pour marquer les cellules proliférantes. Dans la deuxième procédure, des expériences similaires seront réalisées sur des souris néonatales. Les animaux seront gavés 2 à 3 fois toutes les 48h.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues suite à l’administration de produits non toxiques et non irritants seront celles liées aux administrations elles-mêmes : gêne de courte durée au point d’injection ou gêne de courte durée dans la gorge lors des gavages. Suite à l'administration de ces produits, nous nous attendons à observer des changements dans l’intestin et l’épithélium intestinal des souris. Ces changements pourraient entraîner une perte ou un gain de poids, une diarrhée et une déshydratation ou une constipation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

L'intestin est un système physiologique complexe impliquant de nombreux composants : bactéries, sang, lymphatiques, neurones, tissu conjonctif, membrane basale et différents types de cellules. L'objectif principal de ce projet étant d'identifier la régulation de la membrane basale sur l'homéostasie et le développement de l'intestin, la réduction du système in vitro pourrait nous empêcher d'identifier les effets régulateurs sur les différentes parties qui composent l'intestin. Nous utiliserons des organoïdes dans la mesure du possible, mais ils ne peuvent pas répondre à toutes nos questions de recherche car il n'existe aucun moyen de reproduire la membrane basale in vitro, mais seulement certains de ses composants de base. Pour l'utilisation des organoïdes, nous produirons un stock d'organoïdes provenant des mêmes souris mutantes et de type sauvage pour les études de fonctionnalisation in vitro. Ces organoïdes peuvent être étendus, presque indéfiniment, pour optimiser le nombre d'animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est ajustés au plus bas mais compatible avec l’obtention de résultats statistiquement fiables. Tous les animaux, quel que soit leur génotype et leur sexe seront utilisés, ce qui permet d’avoir à la fois des animaux contrôles et des animaux d’intérêts. Pour réduire la variabilité de l'échantillon, nous utiliserons autant que possible des compagnons de portée. Des expériences pilotes seront menées sur un petit nombre d'animaux afin de déterminer les conditions expérimentales optimales. Les tissus extraits seront utilisés pour des expériences multiples afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les croisements de souris seront optimisés pour produire le plus grand nombre d'animaux de tous les génotypes d’intérêt. Plusieurs types d'analyses seront effectués sur la même souris, comme le suivi de la prolifération, de la migration. Ces souris seront également utilisées pour l'histologie et l'immunofluorescence. Cela permettra de réduire le nombre de souris nécessaires pour ces procédures. Des outils statistiques seront utilisés pour déterminer le nombre minimal de souris nécessaires pour chaque expérience, afin de produire des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Il n’y a pas besoin d’analgésique ou d’anesthésiant puisque l’administration de tamoxifène se fera par voie orale avec l’aide d’une canule souple en plastique non traumatisante. Pour les injections intrapéritonéale, une administration d’analgésique ou d’anesthésiant reviendrait à faire subir l’injection 2 fois. Aucun change de cage ne sera effectué la première semaine après la naissance afin de limiter le stress. De plus, la mère sera manipulée à chaque fois avant les souriceaux, afin d’y incorporer son odeur sur les gants, pour éviter tout risque d’abandon par la mère. La bonne prise en charge des souriceaux par la mère sera vérifiée Les procédures décrites ont un faible impact sur le bien-être des animaux. Néanmoins, comme il s'agit d'un nouveau modèle génétique pour l'ablation de gènes, nous ne pouvons pas déterminer si l'ablation du gène entraînera un phénotype nocif. Par conséquent, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant l'administration du tamoxifène. Pour l'effet à long terme, les animaux seront surveillés tous les 3-4 jours. Leurs poids, ainsi que leur comportement général et leur apparence seront notés et les signes d'inconfort selon la grille de score seront évalués. Si des signes de douleur sont identifiés, l'animal sera mis à mort dans les 24 heures.

Choix des espèces

Il n’est pas possible d’étudier le développement des tissus intestinaux à partir d’études in vitro, le seul moyen intéressant reste l’utilisation d’un modèle évolutif et ressemblant au modèle humain, comme c’est le cas pour la souris. La souris de laboratoire est largement utilisée dans la recherche gastro-intestinale. Ses similitudes avec l'Homme, tant au niveau génétique qu'au niveau de la physiologie, de la morphologie et de la structure de l'organe, font qu'il est facile de relier les résultats obtenus chez la souris à ceux obtenus chez l'Homme. En outre, la disponibilité d'une variété d'outils génétiques, ainsi qu'un assemblage complet et annoté du génome, de même qu'une reproduction rapide en font un bon modèle pour ce projet. Une petite cohorte de 5 animaux nouveau-nés de chaque groupe d'âge : P2, P7, P14, P21 sera utilisée pour tester le rôle de la membrane basale sur le développment de l’intestin. À ces âges, la morphologie de l'intestin change considérablement, et nous aimerions tester l’implication de la membrane basale dans ces changements. Pour tester l'effet de la perte de Lama3 pendant l'homéostasie, nous utiliserons des souris adultes âgées de 2 à 4 mois. À cet âge, le système intestinal est considéré comme mature et sa fonction est connue, ce qui constitue une bonne base de comparaison lorsque nous modifions la composition de la membrane basale.

5 184 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie sous anesthésie, une auto-administration de cocaïne et des injections de cocaïne ou de yohimbine, avant des tests comportementaux de rechute. Le porteur indique que la cocaïne peut provoquer une perte de poids et une hyperactivité transitoires, et que la yohimbine reproduit chez la souris des effets observés chez l'humain. Il vise à établir le rôle des neurones de l'insula portant les récepteurs à la progestérone, et renvoie au long terme les retombées thérapeutiques annoncées contre la rechute à la cocaïne.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont triples : - Premièrement, tester l’effet d’un traitement à la progestérone sur les tests comportementaux de rechute induite par l’exposition aux signaux associés à la cocaïne, par l’injection de la cocaïne ou par un stress - Deuxièmement, l’identification le rôle causal des neurones de l’insula exprimant les récepteurs à la progestérone sur la rechute à la cocaïne - Troisièmement, déterminer comment l’activité des neurones de l’insula qui expreiment les récepteurs à la progéstérone est modifiée par le traitement à la progestérone sur la rechute à la cocaïne

Bénéfices attendus

Ce projet sera une caractérisation unique de l'effet de la progestérone sur l'activité des neurones exprimant les récepteurs à la progestérone (PR) du cortex insulaire pendant la rechute de cocaïne. Nous pourrons ainsi élucider le rôle causal de cette population neuronale dans la rechute à la cocaïne, et démontrer l’effet protecteur de la progestérone dans la rechute chez les animaux mâles et femelles. A long terme, ce projet a le potentiel d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques applicables à l’humain (homme et femme) pour prévenir la rechute à la cocaïne grâce à un traitement à la progestérone.

Procédures

Chez les femelles, le cycle hormonal sera suivi pendant 7 jours par un prélèvement vaginal quotidien. Les échantillons seront collectés à l'aide d’un coton-tige stériles humidifiées avec du sérum physiologique stérile. Toutes les procédures chirurgicales, seront réalisées sous anesthésie générale, avec injection d’anti-inflammatoires et ajout d’anesthésiants locaux sur la zone d’incision. L’acte chirurgical sera effectué dans des conditions de propreté maximales. Des antibiotiques et analgésiques seront administrés en cas d’infection ou de douleur post-opératoire.

Impact sur les animaux

La prise de cocaïne peut engendrer plusieurs nuisances expérimentales : 1) une perte de poids lors dès les premières prises, mais cette perte n’excède pas 3 ou 4 jours à l’issus desquels les animaux retrouvent leur poids initial 2) une hyperactivité qui disparaît au bout d’1 heure après la fin de la prise de drogue. Les effets toxiques de la yohimbine sont similaires à ceux observés chez l'homme : l'hypertension, la tachycardie, la stimulation du système nerveux central et l'antidiurèse peuvent se produire. Néanmoins en injection aigu à la concentration utilisée les effets indésirables restent minimes mais nous contrôlerons l’était général des animaux pendant 24 heures après l’injection.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de procéder à des analyses sur les tissus cérébraux.

Remplacement

Le projet porte sur une analyse de la connexion des neurones et de leurs propriétés de transmission d’informations au cours du comportement. Par conséquent cette procédure doit être effectuée chez des animaux vivants. L’étude de ces phénomènes n’est donc pas possible sur des cellules isolées, car elles ne permettent pas la quantification des connections neuronales ou la mesure de l’activité en réponse à une stimulation sensorielle.

Réduction

Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux afin d’obtenir une analyse fiable (le nombre d’animaux estimé permet d’effectuer des tests statistiques) et complète de la connectivité et de l’activité de la région cérébrale d’étude. Nous utiliserons ainsi 5184 animaux sur cinq ans.

Raffinement

La majorité des animaux seront hébergés en cages collectives, afin de limiter le stress dû à l’isolement. Nous avons réduit au strict minimum les animaux hébergés individuellement pour des raisons expérimentales (endommagement du matériel implanté pouvant mettre en péril la santé de l’animal si arraché par un congénère). Les cages seront également enrichies en nids en coton. Une surveillance particulière sera adressée aux animaux en période péri-opératoire. L’acte chirurgical sera effectué dans des conditions de propreté maximales. En cas d’infection, le vétérinaire référent sera sollicité pour mettre en place un traitement antibiotique approprié.

Choix des espèces

Des souris génétiquement standards (C57Bl6/J) seront utilisées afin de caractériser leur comportement lors des procédures d’auto-administration de cocaïne, de rechute et d’enregistrement de l’activité neuronale. Des souris génétiquement modifiées (PR-IRES-Cre) seront également utilisées lorsque nous étudierons une population neuronale spécifique (exprimant les récepteurs à la progesterone) afin de cibler, lors de l’étude du role causal, uniquement ces neurones d’intérêt. De plus, il a été démontré que le comportement des animaux peut varier entre les souches génétiquement modifiées ou standards. Ainsi, nous utiliserons également des souris PR-IRES-Cre pour des études comportementales afin de comparer leur comportement avec les souris génétiquement standard. Tous les animaux utilisés seront adultes (10 semaines) afin d’étudier des populations et des circuits neuronaux matures.

1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Privées de système immunitaire, elles reçoivent sous la peau des fragments de tumeurs pancréatiques de patients, une série de 750 d'entre elles étant traitée par cinq molécules de chimiothérapie avant prélèvement des tumeurs. Le projet compare des tumeurs de patients à survie courte et longue pour chercher des cibles et des marqueurs prédictifs, les tumeurs pouvant provoquer inconfort et ulcérations. Le porteur affirme que les souris immunodéficientes forment un modèle "qui ne peut être remplacé" pour conserver les caractéristiques des tumeurs humaines.

Objectifs

L’adénocarcinome pancréatique (ACP) est l’un des cancers les plus graves. Avec plus de 12000 décès par an en France qui lui sont imputés, il pose un problème majeur de santé publique. En dépit des importants efforts de recherche consentis au cours des dix dernières années, les traitements conventionnels n’ont qu’un impact limité. La chirurgie reste la seule stratégie potentiellement curative, mais seuls 20% des patients peuvent en bénéficier car la plupart du temps, au moment du diagnostic, ce cancer est déjà à un stade très avancé, la médiane de survie de ces patients restant inférieure à 6 mois et la survie à 5 ans inférieure à 3%. Pratiquement tous les patients souffrant d’un ACP développent des métastases (cellules cancéreuses qui ont migrées dans d’autres organes) et décèdent des conséquences dévastatrices de leur développement. Le point de départ de ce projet est la constatation que très peu de patients atteints d’ACP survivent longtemps ; de plus nous manquons de nouvelles molécules thérapeutiques capables de s’attaquer spécifiquement aux cellules cancéreuses pancréatiques en épargnant autant que possible les cellules non cancéreuses. De nombreux travaux de recherche ont montré que les tumeurs pancréatiques sont très hétérogènes d’un patient à un autre et que cette hétérogénéité est associée au niveau de résistance aux chimiothérapies et au temps de survie du patient. Nous avons donc émis l’hypothèse que les tumeurs des patients de courtes ou de longues survies présentent des mécanismes et des caractéristiques moléculaires différentes entre elles, ce qui nous a déjà permis, dans des travaux antérieurs, d’identifier des marqueurs biologiques capables de prédire la survie des patients. Notre projet a donc pour objectif de déterminer les caractéristiques moléculaires des tumeurs de patients de courtes survies et celles des patients de longues survies associées ou non à des protocoles de chimiothérapies, puis de les comparer entre elles ceci dans le but de mieux comprendre la biologie de l’ACP, de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques spécifiques à chaque groupe de patients et d’identifier des marqueurs biologiques capables de prédire la réponse aux traitements des patients.

Bénéfices attendus

Le point de départ de ce projet est la constatation que très peu de patients atteint d'ACP survivent longtemps. Notre projet a donc pour objectif de comparer les caractéristiques moléculaires des tumeurs de patients de courtes et longues survies obtenues par des analyses biologiques et moléculaires, lesquelles sont associées au niveau de résistance aux chimiothérapies et au temps de survie du patient. Les bénéfices attendus de ce projet seront donc l'identification de nouveaux mécanismes moléculaires activés par la cellule tumorale permettant ainsi le développement de nouvelles molécules thérapeutiques, de nouveaux marqueurs biologiques capables de prédire la résistance / sensibilité aux chimiothérapies et/ou de permettre un diagnostic précoce des patients. Il nous permettra ainsi de mieux comprendre la biologie du cancer pancréatique ainsi que les raisons de son pronostic sombre et de la réponse limitée des patients aux différents traitements.

Procédures

Pour atteindre les objectifs de ce projet, 3 procédures seront réalisées : Pour les procédures 1 et 2 les tumeurs seront découpées en petits morceaux et injectées sous anesthésie chez la souris en sous-cutanée entre les omoplates avec une aiguille. Une fois que la tumeur aura atteint le volume souhaité, la souris sera mise à mort puis la tumeur sera prélevée pour réaliser les différents analyses biologiques. Une 3ème procédure nous permettra de déterminer l’efficacité anti-tumorale des différentes chimiothérapies actuellement utilisées en clinique sur les xénogreffes de tumeurs pancréatiques de patients, puis d’identifier des signatures moléculaires prédictives de la sensibilité aux traitements, recherchées sur les tumeurs prélevées. Une série de souris porteuses d’une xénogreffe de tumeur pancréatique de patient établit selon la procédure n°2, sera traitée avec 5 molécules thérapeutiques différentes composées de 3 injections maximum par souris par traitement. Les souris témoins recevront une solution de sérum physiologique. Les animaux seront pesés avant injection et les tumeurs mesurées au pied à coulisse (instrument de mesures).

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sur les animaux comprennent les implantations de tumeurs faites en sous cutanée entre les omoplates sous anesthésie ; le développement de tumeurs sous-cutanées qui peuvent générer éventuellement un certain inconfort ou être la source d’ulcérations cutanées bien que ces effets n’ont jamais été observés dans nos expériences précédentes lors de notre vigilance quotidienne ; les injections de molécules chimiothérapeutiques qui peuvent générer une douleur, ces traitements peuvent être la source de différentes nuisances telles que la diminution du poids, l’absence d’activité bien que ces effets n’ont jamais été observés dans nos expériences précédentes ; la contention de l’animal vigile nécessaire pour les diverses injections ou les mesures des volumes tumoraux ou les manipulations de l’animal pour prise de poids corporel ou l’anesthésie peuvent être un facteur de stress éventuel.

Devenir

L'ensemble des animaux des 3 procédures seront mis à mort sous anesthésie afin de prélever les tumeurs qui serviront (1) à maintenir la bio-banque de tumeurs pancréatiques et à extraire le matériel biologique (ADN, ARN, protéines, …) de chaque tumeurs de patients pour des analyses moléculaires ultérieures, (2), à réaliser des coupes histologiques des tumeurs (anatomo-pathologie) afin d’identifier de nouveaux marqueurs biologiques prédictifs de la résistance / sensibilité aux chimiothérapies.

Remplacement

Au vu de la complexité du cancer du pancréas, l’utilisation des souris immunodéficientes, qui sont des modèles bien établis en cancérologie expérimentale, est justifiée et ne peut être remplacée car elles permettent d’une part la prise des xénogreffes de tumeurs pancréatiques dérivées de patients et éviter les phénomènes de rejets et d’autre part le maintien des caractéristiques moléculaires de la tumeur originelle du patient ; ces caractéristiques seront nécessaires pour identifier de nouvelles cibles diagnostiques et thérapeutiques et de nouveaux marqueurs biologiques capables de prédire la sensibilité aux différentes chimiothérapies spécifiques selon le profil « tumoral du patient ». Cependant, dans un souci de remplacement, les marqueurs biologiques qui seront identifiés et les informations de sensibilité /résistance aux chimiothérapies qui seront obtenues dans ce projet, auront pour avantage dans le futur de diminuer fortement l’utilisation d’animaux, en particulier en testant directement les marqueurs biologiques prédictifs de l’efficacité des traitements sur les tumeurs du patients. De plus, ce projet va nous permettre de cultiver les cellules tumorales pancréatiques de chaque tumeur de patients en 2 et 3 dimensions pour réaliser des études in vitro et ex vivo ce qui nous évitera l’utilisation d’animaux supplémentaires.

Réduction

Concernant les procédures 1 et 2, le nombre de souris nécessaires est fondé sur une estimation maximale du nombre de xénogreffes de tumeurs pancréatiques de patients à implanter et à la quantité de matériels biologiques nécessaires pour réaliser les différentes analyses moléculaires et biologique. Pour la procédure 3, nous n'utiliserons que le nombre d’animaux nécessaires pour l'exploitation statistiques des données, à savoir 750 animaux. Le nombre de souris de chaque groupe a été calculé avec un test statistique de puissance. Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons aussi mis au point un système de congélation de tissu qui nous permet de congeler les xénogreffes de tumeurs pancréatiques pour les conserver en "dormance" dans l'azote liquide. Ce système permet de conserver des tissus vivants pour des études futurs en dehors de la souris et limitera considérablement l'utilisation des animaux.

Raffinement

Dès réception, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation de 7 à 10 jours pendant laquelle ils seront familiarisés à la manipulation par les expérimentateurs. Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux. Dans chaque cage, nous mettons plusieurs types d’enrichissement ; les litières sont changées toutes les semaines ; de petits groupes sociaux sont constitués afin d'éviter le stress de l’isolement ; La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Les souris sont endormies sous anesthésie pour tous les actes qui pourraient générer de la douleur (implantation de tumeurs), puis mises sous une lampe chauffante et surveillées jusqu'à leur réveil. Un contrôle quotidien des souris sera effectué en plus d'un contrôle approfondis bihebdomadaire de l'état clinique de nos animaux sera réalisé́, d’avantage si leurs état le nécessite.

Choix des espèces

Pour mener à bien notre projet, nous avons besoin d'une espèce de mammifère dépourvu de système immunitaire pour éviter les phénomènes de rejets des xénogreffes de tumeurs humaines. Ces souris qui sont des modèles bien établies en cancérologie expérimentale et qui ont fait l’objet de plusieurs centaines de publications, permettent la prise des xénogreffes de tumeurs pancréatiques, le maintien des caractéristiques moléculaires des tumeurs, et d’étudier au sein d’un organisme entier la stabilité et l’efficacité des molécules chimiothérapeutiques. De plus, la souris est facilement manipulable, de par sa petite taille, d’une utilisation simple et peu coûteuse, ce qui en fait un modèle expérimental de choix pour notre projet. Les souris seront reçues à 4 semaines. Cela permettra aux animaux de récupérer du stress engendré par le transport et de s'adapter à leur nouvel environnement. Nous les laissons s'habituer et s'adapter pendant 1 à 2 semaines avant de commencer les expérimentations. De plus, cela nous permettra de travailler chez le jeune adulte et de garder nos animaux sur une durée plus longue, certaines tumeurs mettent plusieurs semaines avant d’atteindre une taille compatible avec les besoins en matériels biologiques nécessaires à nos projets.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Privées de système immunitaire, elles subissent des chirurgies abdominales pour implanter des tumeurs du côlon ou du pancréas, parfois une ablation de la rate, puis une seconde chirurgie de résection guidée par fluorescence, avec risque de douleur, de perte de poids et d'infection. Le projet fait la preuve de concept d'anticorps couplés à une sonde pour mieux repérer et retirer les tumeurs pendant l'opération. Le porteur affirme que cette démonstration ne peut se faire que sur des animaux porteurs de ces tumeurs, les tests in vitro ayant déjà été réalisés.

Objectifs

Malgré l'émergence des thérapies personnalisées, la chirurgie joue toujours un rôle essentiel dans le traitement de nombreux cancers comme les cancers colorectaux et pancréatiques. Un problème majeur réside dans la difficulté de détecter les tumeurs et de visualiser les marges tumorales. La chirurgie guidée par fluorescence (FGS) permet aux chirurgiens une meilleure visualisation des structures anatomiques en temps réel. De plus, la FGS peut être améliorée en associant une imagerie pré-opératoire par imagerie nucléaire (SPECT) pour localiser avec précision les tumeurs. Dans le projet, nous proposons de faire la preuve de concept de l’intérêt d’utiliser des anticorps ciblant les tumeurs, conjugués à une sonde (Ac bimodaux) permettant de réaliser de l'imagerie bimodale (radionucléide/fluorescence) afin d'améliorer la stadification pré-opératoire (SPECT), la détection per-opératoire des tumeurs et leur résection (FGS) mais aussi d'améliorer le suivi post-opératoire (SPECT). Nous avons déjà montré dans des modèles de tumeurs sous-cutanées que ces Ac bimodaux étaient visualisables par imagerie in vivo (SPECT et fluorescence) et qu’ils nous permettaient de réaliser de la FGS. Pour prouver le potentiel thérapeutique de l’utilisation de ces Ac bimodaux en chirurgie par fluorescence, il nous faut maintenant utiliser des modèles précliniques mimant la pathologie humaine, tels que des modèles orthotopiques de cancer du côlon et du pancréas, mais aussi des modèles mimant la formation de métastases hépatiques ou de carcinomatoses péritonéales. L’objectif est d’optimiser la résection tumorale par l’utilisation de chirurgie assistée par fluorescence après injection de ces Acs bimodaux et de démontrer l’absence de reprise tumorale suite à l’acte chirurgicale. A terme nous nous attendons à démontrer que l’utilisation de ces Ac bimodaux permet une visualisation fine des tumeurs avant la chirurgie (imagerie SPECT) et une détection plus précise par fluorescence permettant de minimiser l'étendue de la résection. L'absence de récidive pourra être détectée en ré-injectant cet Ac bimodal quelques mois après la chirurgie pour visualiser l’absence de récidive (SPECT). Ce projet ce déroulera sur 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Le but de ce travail est de pouvoir faire la preuve de concept de l’utilisation de la chirurgie assistée par fluorescence à l’aide d’Ac bimodaux afin d’éliminer les tumeurs primaires ou disséminées. Ce projet nécessite donc la mise au point des modèles précliniques mimant la pathologie humaine des cancers coliques et pancréatiques avec des tumeurs orthotopiques mimant des tumeurs primaires et des modèles mimant la formation de métastases hépatiques ou de carcinomatoses péritonéales d’origine colique. Ce projet devrait permettre une meilleure prise en charge chirurgicale des patients atteints de cancers primaires ou métastatiques en permettant une meilleure détection des tumeurs, facilitant leur élimination en épargnant le tissu sain et évitant ainsi une récidive tumorale.

Procédures

Trois des modèles nécessiteront l’utilisation d’une procédure chirurgicale (sous anesthésie gazeuse) afin d’implanter les cellules tumorales. Cet acte (30 min/souris) implique l’ouverture de la cavité abdominale, l’implantation des tumeurs (cellules ou fragment de tumeur), la fermeture de la cavité abdominale. Dans le cas du modèle de métastases hépatiques, la rate de ces souris sera enlevée suite à l’injection des cellules tumorales. Pour le modèle de carcinomatose péritonéale, les cellules tumorales seront injectées en intrapéritonéale après anesthésie gazeuse des souris (1-2 min/souris). Ce développement de modèles tumoraux aura lieu dans l’établissement utilisateur 1. Les souris seront alors transférées dans l’établissement utilisateur 2. Les souris recevront 1 injection intrapéritonéale (1-2 min/souris) tous les 7 jours (sous anesthésie gazeuse) du composé permettant l’imagerie des tumeurs. Ces souris seront ensuite anesthésiées à l’isoflurane pour être imagées. Tous les animaux porteurs de tumeurs (orthotopiques ou métastases) subiront une chirurgie d’exérèse assistée par fluorescence après injection des Ac bimodaux (30 min/souris).

Impact sur les animaux

Les modèles animaux mimant la formation de tumeurs primaires coliques ou pancréatiques (modèles orthotopiques) et métastatiques d’origine colique nécessitent un acte chirurgical. L’ouverture de la cavité abdominale des souris, l’injection des cellules tumorales dans le pancréas, la réalisation d’une splénectomie ou encore la ligature d’un morceau de tumeur sur le caecum sont des interventions pouvant entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par les interventions chirurgicales. Le développement des tumeurs primaires, ainsi que l’apparition des métastases peuvent également être à l’origine de souffrance et de gênes qui seront évaluées par observations fréquentes des animaux (3 fois par semaine) et estimation de la prise tumorale par imagerie de bioluminescence après injection I.P. de luciférine. Les séances d’imagerie courte étant réalisées sous anesthésie à l’isoflurane, cet acte n’induira pas de stress supplémentaires aux animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de pouvoir vérifier par autopsie l’absence de reprise tumorale.

Remplacement

La preuve de concept de l’utilisation de ces Acs bimodaux pour de la chirurgie assistée par fluorescence nécessite de pouvoir se rapprocher le plus possible de ce qui est retrouvé chez l’Homme et donc d’avoir les tumeurs primaires sur les organes d’origine et les métastases se disséminant. Le but est de montrer que les tumeurs sont plus facilement détectables, qu’elles peuvent être éliminées plus finement et ainsi permettre une meilleure récupération post-chirurgie et enfin qu’il y a moins de récidive. Cette preuve de concept ne peut donc être faite que sur des animaux présentant ce type de tumeurs et sur lesquels sera fait la FGS. Tous les tests in vitro préalables ont déjà été faits, tout comme la preuve de concept sur des modèles plus artificiels d’animaux porteurs de tumeurs sous-cutanée.

Réduction

Pour chaque Ac bimodal à tester (5), deux groupes de 5 souris (contrôle vs Ac bimodal) seront constitués afin de générer des groupes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer l’efficacité de la chirurgie tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. La visualisation de la récidive par imagerie SPECT après injection du même Ac bimodal permet de réduire le nombre d’animaux qui sont leur propre contrôle. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées (formation de niveau concepteur de projet avec soit une formation chirurgie du petit animal soit être chirurgien) afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les prises tumorales peuvent être différentes d’une chirurgie à l’autre, nous répèterons les expériences 2 fois de manières indépendantes.

Raffinement

Les souris seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Les souris étant immunodéprimées, elles seront hébergées sous couvercle filtrant et une antibiothérapie préventive sera utilisée avant chaque chirurgie. La totalité des procédures chirurgicales impliquant les animaux (injection sous-cutanée, intraveineuse, imagerie, chirurgie abdominale) est réalisée sous anesthésie suivie d’un réveil sous lampe chauffante ou couveuse, réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Tout au long des opérations, un contrôle de la profondeur d’anesthésie (pincement de la patte, contrôle de la respiration), la déshydratation (pli de peau) et l’hypoxie (couleur des muqueuses) seront contrôlées. Étant donné que la température ne peut pas être contrôlée et que le risque d’hypothermie est sévère lors d’une anesthésie, des tapis chauffants seront utilisés tous le long de l’expérimentation. Les animaux bénéficieront d’une réhydratation per- et post-opératoire ainsi qu’une prise en charge antalgique adaptée. Un système facilitant la prise alimentaire ainsi que la prise de boisson sera mis en place (nourriture gélifiée). Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance. Les injections intrapéritonéales (cellules pour le modèle de carcinomatose péritonéale et luciférine) seront réalisées sous anesthésie. Aucune douleur associée à ces gestes n’est donc attendue. Le développement des tumeurs (taille et nombre) sera estimé de manière non-invasive par imagerie de la bioluminescence après injection de luciférine.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles utilisés pour tester facilement les nouveaux outils permettant de faire de la chirurgie assistée par fluorescence. Nous utiliserons des souris immunodéficientes Swiss Nude, nous permettant d’implanter des cellules tumorales humaines (HCT116-luc et PANC-1-luc). Ces souris ont déjà été utilisées lors des premiers travaux avec des tumeurs humaines xénogreffées. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 10 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids suffisant (supérieur à 20g).