Recherche fondamentale
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Facteurs de non-réponse aux antibiotiques dans un modèle murin de prostatite (infection urinaire masculine)
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
3 984 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par une sonde introduite dans l'orifice urinaire sous anesthésie, puis reçoivent des injections répétées d'antibiotiques avant d'être tuées pour prélever vessie et prostate. Le porteur affirme que les souris ne montrent aucun signe extérieur d'infection ni de douleur, tout en reconnaissant un stress lié aux administrations répétées. Il présente l'étude des organes comme "impossible sans modèle animal" et oppose l'"organisme entier" aux analyses en tube à essai jugées "trop simplistes".
Objectifs
Les infections urinaires masculines (IUM) sont fréquentes et difficiles à traiter. Elles sont différentes des infections urinaires survenant chez la femme car chez l’homme, en plus de l’infection des urines et de la vessie il y a également une infection de la prostate. Malgré le traitement par antibiotique, les prostatites (infection de la prostate) récidivent très fréquemment, dans 20% des cas. Il a été montré que dans la grande majorité des cas, ces récidives sont dues à des bactéries qui n’ont pas été tuées par l’antibiotique et qui persistent donc dans la prostate. Ces rechutes vont être à l’origine d’une altération de la qualité de vie des patients et de la prescription de nouveaux antibiotiques qui peuvent provoquer des effets indésirables et sélectionner des bactéries résistantes au traitement antibiotique, rendant ainsi les infections plus difficiles à traiter. Il est donc urgent de comprendre pourquoi ces bactéries persistent dans la prostate, pour en améliorer le traitement. Pour cela, l’étude directe de la prostate est nécessaire, ce qui ne peut être réalisé chez l’humain. L’objectif de notre projet est de comprendre la discordance entre la non-réponse aux antibiotiques (persistance de bactéries dans la prostate) et la supposée sensibilité à l’antibiotique dans les tests habituellement réalisés en laboratoire de ville (examen bactériologique des urines). Pour ce faire, nous utiliserons un modèle d’infection urinaire de souris provoquant une infection de la prostate.
Bénéfices attendus
Notre objectif est d’améliorer le traitement des infections urinaires masculines pour éviter les rechutes.
Procédures
Tous les animaux sont infectés sous anesthésie générale. Les produits anesthésiants sont injectés dans le ventre de la souris à l’aide d’une petite aiguille. Les bactéries sont injectées à l’aide d’une petite sonde rentrée dans l’orifice urinaire. Cette étape d'infection dure environ 3 minutes par animal. -Le traitement antibiotique est réalisé par des injections sous cutanées d’antibiotiques sur un animal vigile (durée du geste d'environ 15 secondes). La fréquence (toutes les 4 à 12 heures) ainsi que la durée du traitement (24 heures à 5 jours) dépendent de l’antibiotique utilisé. -Les urines sont recueillies au cours d’une miction spontanée. -L’animal est mis à mort par surdosage en médicament anesthésiant administré sur animal vigile par une piqûre dans le ventre. -La vessie et la prostate sont ensuite prélevés stérilement après la mort de l’animal. -La durée de l'infection est variable de 48 heures à 21 jours.
Impact sur les animaux
Les souris ne présentent pas de signe extérieur d’infection dans ce modèle. Leur comportement est normal. Elles urinent de manière normale sans signe extérieur évoquant de la douleur au moment de la miction. Les produits administrés ne sont pas douloureux. Les administrations répétées d’antibiotiques pourront avoir un impact sur le bien-être animal et provoquer un stress auquel nous serons particulièrement attentifs.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure afin de prélever stérilement leurs organes (vessie, prostate ) après la mort pour analyser les bactéries qui s'y trouvent.
Remplacement
L’accessibilité aux organes touchés par l’infection urinaire masculine (prostate et vessie) en dehors des urines reste très limitée chez l’homme. Or l’étude simple des urines ne permet pas d’expliquer la récidive de l’infection urinaire. L’analyse des bactéries dans les prostates et les vessies est donc nécessaire et impossible sans modèle animal. L’étude des bactéries et de la réponse à l’antibiotique dans les tubes à essais est trop simpliste et ne rend pas compte des facteurs multiples qui sont impliqués dans un organisme entier.
Réduction
Grâce à une analyse statistique, nous réduisons au minimum le nombre de souris utilisées tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs c'est à dire qui nous permettent de conclure de manière fiable sur le plan mathématique. Les contrôles ayant été infectés par la même souche seront comptabilisés dans les analyses des différentes procédures ce qui pourra permettre de diminuer le nombre de contrôles dans une procédure ultérieure. De nombreuses analyses dans les tubes à essais seront réalisées en amont pour choisir les bactéries, les antibiotiques et les conditions les plus pertinentes afin de réduire les animaux utilisés. Nous optimisons au maximum nos expériences pour réaliser le plus d’analyses possibles à partir d’un même animal. Tous les organes prélevés sont congelés pour pouvoir les réanalyser au besoin ultérieurement.
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi c'est à dire avec des cotons pour jouer par exemple, avec une semaine d’adaptation avant l’expérimentataion. Un suivi quotidien sera réalisé. L’infection urinaire est réalisée sur une souris anesthésiée. Les souris seront euthanasiées si leur état se dégrade brusquement ou si elles présentent un état de souffrance. Une grille de score est prévue à cet effet qui sera également remplie quotidiennement.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme espèce animale pour réaliser les expériences de ce projet est pertinent car l’infection urinaire chez la souris est très proche de celle chez l’Homme. Ce modèle est utilisé depuis de nombreuses années dans la littérature scientifique. Nous étudierons des souris adultes de 8 à 12 semaines et uniquement de sexe masculin car la prostatite ne survient que chez les hommes adultes.
Rôle de CD44 dans l’absorption du fer par les cellules érythroïdes
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
3 945 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger, modéré et sévère. Selon les groupes, elles subissent des saignées, des injections lysant les globules rouges, une amputation du bout de la queue rouverte plusieurs semaines, une inflammation induite par le LPS ou un cancer du foie provoqué par injections répétées, et des femelles gestantes sont tuées pour prélever les embryons. Le porteur qualifie la procédure d'hépatocarcinome de plus lourde et euthanasie les animaux dégradés selon des points limites. Il cherche à établir le rôle d'un récepteur dans l'absorption du fer et juge les modèles de souris "incontournables".
Objectifs
Les globules rouges ont un important besoin en fer afin d’assurer leur fonction de transport d’oxygène aux organes. Ils utilisent le récepteur à la Transferrine (TfR1) pour acquérir le fer depuis la circulation sanguine. Plusieurs études ont déjà suggéré que les globules rouges utilisaient potentiellement un autre système pour l’absorption du fer, indépendamment de TfR1. Notamment, une étude récente a démontré pour la première fois que le récepteur à l'acide hyaluronique CD44 permettait l’absorption du fer par les cellules cancéreuses. Nous avons alors réalisé des expériences préliminaires in vitro qui suggèrent un mécanisme similaire dans les cellules érythroïdes (c’est-à-dire, les globules rouges et leurs précurseurs), dans lesquelles CD44 est très fortement exprimé. Ainsi, l’objectif de ce projet est d’évaluer le rôle de CD44 dans l’absorption du fer par les globules rouges in vivo, en conditions physiologiques, et en conditions pathologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait mettre en évidence pour la première fois le récepteur CD44 comme transporteur de fer dans les cellules érythroïdes, et ainsi permettre une découverte majeure dans la compréhension du métabolisme du fer. De plus, démontrer que CD44 permet le transport du fer dans les cellules érythroïdes en conditions pathologiques permettrait de l’utiliser comme cible thérapeutique pour les pathologies de surcharge en fer et d’érythropoïèse inefficace qui touchent des dizaines de milliers de personnes dans le monde. Enfin, il est estimé que près d’un million de personnes seront atteintes d’un cancer du foie en 2025, et étant donné l'importance de CD44 dans l'absorption du fer dans les cellules cancéreuses, ce dernier pourrait constituer une nouvelle cible thérapeutique intéressante.
Procédures
ANEMIE : Afin de mimer les conditions d'anémie, nous utiliserons deux méthodes disctinctes. Un groupe d'animaux aura un prélèvement sanguin de 500µl. Ce prélèvement ne sera réalisé qu’une seule fois et les souris seront euthanasiées 0 - 24h - 48h - 72h - 96h après. Un autre groupe d'animaux recevra deux injections d'un produit permettant la lyse des globules rouges. Les animaux seront sacrifiés 1 jour à 1 semaine après la deuxième injection. GLOBULES ROUGES : Pour mesurer la durée de vie des globules rouges, nous réaliserons une injection intraveineuse d'un marqueur fluorescent permettant de marquer les globules rouges. Afin de suivre l'évolution de la fluorescence, nous récupérerons quelques gouttes de sang au niveau de la queue le lendemain de l’injection du produit suite à une petite amputation (0.1mm). Ensuite, la plaie sera gratée 1 semaine, 2 semaines, 3 semaines et 1 mois après pour récupérer du sang. INFLAMMATION : Pour induire une inflammation aigue et passagère nous injecterons du LPS (produit dérivé bactérien). Les souris seront mises à mort 0 - 1h - 6h - 12h - 24h - 48h - 1 semaine après. HEPATOCARCINOME : Pour induire un cancer hépatique chez les souris, nous injecterons une fois par semaine un facteur pro-fibrotique pendant 6, 12, 18 ou 24 semaines selon les groupes de souris. Les souris sont euthanasiées à la fin des injections. ETUDE DES EMBRYONS : Accouplement des souris, puis euthanasie des femelles gestantes au jour embryonaire E14.5 afin d'étudier l'anémie des embryons.
Impact sur les animaux
Tout d'abord, pour limiter le stress induit par les manipulations chez les animaux, nous allons pour chacun d'entre eux, réaliser des habituations aux expérimentateurs pendant une souris (prise en main des souris, habituation à la voix et à l'odeur...). Les effets indésirables de son projet seront légers et modérés. Tout d'abord, le prélèvement sanguin va induire une légère anémie passagère chez les souris, ainsi qu'une faible douleur due au prélèvement jugulaire. L'injection du produit lysant les globules rouges va entrainer la perte d'une partie de ces cellules, mais les animaux récupèrent la quantité normale de globules rouges 1 semaine après l'injection. Il est nécessaire de placer les souris dans des boîtes de contention pour réaliser l'injection intraveineuse, ce qui entraine un stress chez les animaux. L'induction de l'inflammation systémique, atteint son pic entre 4h et 8h après l’injection, mais est rapidement résolue, avec un retour à la normale 48h après injection. La procédure d'étude de l'hépatocarcinome est la plus lourde, puisqu’elle entraine le développement d’un cancer du foie. L’état général des souris sera évalué quotidiennement et les animaux souffrants seront euthanasiés (prostration, poils ébouriffés, perte de poil…).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue des procédures, pour effectuer des prélèvement d'organes. Pour étudier le métabolisme du fer, il est nécessaire de récupérer le sang, pour réaliser des analyses des paramètres hématologiques ; ainsi que plusieurs organes impliqués dans l'homéostasie du fer (foie, rate, duodénum, moelle osseuse, rein). Ils seront récupérés pour analyse ultérieure en laboratoire : expression génique, protéique, histologie, par exemple.
Remplacement
Notre équipe a déjà pu établir que le transporteur CD44 permettait l'absorption du fer dans des cellules érythroïdes en culture. Les modèles in vitro ne permettent cependant pas de reproduire la complexité des mécanismes de régulation de l'homéostasie du fer. Les modèles de souris sont donc incontournables pour étudier précisément les mécanismes mis en place in vivo.
Réduction
L’expérience de la porteuse du projet dans les procédures que nous allons mettre en place nous permet d’optimiser le nombre d’animaux à analyser pour chacune de nos questions de recherche et le nombre de souris sera calculé a minima en tenant compte de la variance biologique des résultats. D'après l'anayse de la variance ANOVA univariée, suivie d'une analyse d'une comparaison multiple de Sidak, nous devrions utiliser 15 souris par lots afin d'obtenir une significativité statistique. De plus, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous allons prélever un maximum d’organes qui seront stockés à -80°C afin de pouvoir être réutilisés sans avoir à répéter les expériences in vivo. Nous sommes dans l'obligation d'utiliser des souris contrôle pour chacun de nos élevages car les fonds génétiques sont différents.
Raffinement
Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, un enrichissement sera rajouté aux animaux. A savoir, des igloos et des carrés de coton pur ou du papier absorbant permettant aux animaux de faire une nidation. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé au minimum une fois par semaine. Pour chaque procédure, des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. De plus, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent de la formation et de l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales. L’apprentissage et la maitrise des gestes techniques sont reportés dans les livrets de compétences des personnes concernées.
Choix des espèces
La souris est une espèce animale qui permet de développer de nombreux modèles mimant plusieurs pathologies humaines, et notamment c'est l'espèce qui reproduit le mieux le métabolisme du fer humain. De plus, cette espèce présente de nombreux intérêts pratiques qui justifient son utilisation comme modèle dans nos projets de recherche, notamment, de faibles coûts, un cycle reproductif court, une croissance rapide, une facilité de transport, une facilité de manipulation, et enfin une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Enfin, notre projet de recherche est basée sur l'utilisation de souris génétiquement modifiées et aucune autre espèce animale n'est disponible. Nous utiliserons des souris adulte, âgées de 8 à 32 semaines selon les procédures. Nous étudierons également le développement embryonnaire.
Le rôle de la protéine C activée dans le développement de l’arthropathie hémophilique chez des souris hémophiles A sévères – Projet Multi-établissement EU 2/2
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
88 souris hémophiles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger, modéré et sévère. Elles subissent des ponctions du genou provoquant des saignements articulaires répétés, des injections, une IRM de deux heures et des prises de sang, avant dissection des pattes arrière. Le porteur décrit comme seule nuisance une gêne locomotrice et applique un point limite de perte de poids de 20 %. Il vise à étudier le rôle d'une protéine dans la destruction articulaire et justifie le recours à l'animal par le "besoin d'un modèle vivant, dynamique et doté d'un système vasculaire et locomoteur".
Objectifs
L’hémophilie est une maladie hémorragique héréditaire rare liée à déficit en facteur VIII (FVIII) de la coagulation pour l’hémophilie A et le facteur IX (FIX) pour l’hémophilie B. La sévérité de l’hémophilie est définie par les taux de FVIII ou FIX plasmatiques. La forme sévère, où le taux du FVIII ou FIX est
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension des mécanismes de la destruction articulaire induite par l’hémophilie permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques mais également de disposer de nouveaux outils de diagnostic précoce. Pour cela, l’étude du rôle de l’APC nous semble intéressante puisque cette protéine régule d’autres qui sont chargées de la dégradation et du remodelage du cartilage articulaire. Si notre hypothèse est confirmée, alors un inhibiteur de l’APC peut être un candidat thérapeutique pour l’atteinte articulaire chez les hémophiles.
Procédures
Afin de mimer la maladie chez l’homme, les souris vont développer une atteinte articulaire suite à des saignements articulaires répétés. Le rôle de la protéine C activée (APC) va être étudié 7 et 30 jours après 2 ponctions du genou induisant un saignement articulaire. Cette atteinte articulaire va être étudiée en utilisant des méthodes complémentaires : mesures de marqueurs d’inflammation, de dégradation cartilagineuse, l’étude de modification des ARN au niveau des tissus articulaires et du sang, étude histologique avec marquage de molécules responsables de la dégradation articulaire. L’APC sera bloquée par un inhibiteur spécifique et les conséquences de cette inhibition seront comparées à la situation où l’APC est active au niveau du sang et du liquide synovial. Tous les actes qui peuvent engendrer une douleur ou un stress seront effectués sous anesthésie générale et si douloureux après administration d’un médicament anti-douleur. Après anesthésie et antalgie, les souris seront mises à mort sans réveil et les pattes arrières seront disséquées pour l’étude histologique après marquages et colorations spécifiques. Les animaux pourront être soumis, sous anesthésie générale, à une ponction articulaire (2-3 min), la mesure du genou droit (30 sec), une injection (1-2 min), une IRM du genou (120 min), une prise de sang et mise à mort (3-5 min). Les temps exprimé ne comptent pas l’induction et la vérification de la profondeur de l’anesthésie, compter 5min. Afin d’éviter de multiple anesthésie générale, le maximum de geste est groupé comme suit • Anesthésie générale + mesure du genou droit + ponction articulaire à J0, J15 et J30 : temps estimé : 9 min • Injection seule tous les 4 jours: temps estimé : 7 min • Injection d’inhibiteur tous les 4 jours: temps estimé : 9 min • Imagerie par IRM à J42 : temps estimé : 125 min • Prise de sang : 10 min. tous les gestes sont effectués dans l'UE1 à l'exception de l'IRM, la prise de sang et la mise à mort qsui sont réaisée dans l'UE2.
Impact sur les animaux
Au cours du projet la seule nuisance attendue concerne une gêne locomotrice après induction de la maladie articulaire. Nous n’attendons aucun autre effet secondaire ou douleur.
Devenir
Les animaux ne ressortent vivant de cette procédure car des prélèvements terminaux pour analyses histologiques et immunohistochimies sont prévus.
Remplacement
La nécessité d’un modèle animal est justifiée par le besoin d’un modèle vivant, dynamique et doté d’un système vasculaire et locomoteur pour cette étude sur les dégâts articulaires handicapants induits par l’hémophilie et son traitement. La mise au point des techniques in vitro est réalisée au maximum avant l’utilisation des souris ce qui nous permet de conserver le modèle de souris hémophile, modèle éprouvé et fiable pour notre étude
Réduction
En accord avec l’expérience acquise par le groupe, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre la validité statistique des résultats. De plus, les tests développés au laboratoire nous permettent d’effectuer un maximum de mesure et d’étude sur le même animal. Les mesures radiologiques réalisées sur une souris vivante sont corrélées aux mesures biologiques et histologiques de cette même souris et chaque souris constitue son propre contrôle pour l‘étude de l’articulation du genou droit.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour préserver le bien-être de l’animal. Quand cela est possible, les souris sont maintenues en groupe par fratrie avec l’utilisation de biberon à longues tiges, de l’eau gélifiée et de la nourriture dans la cage en cas de problèmes locomoteurs. Tous gestes traumatiques ou stressants seront réalisés sous anesthésies et analgésie préalables. Au cours de l'étude, les points limites sont appliqués avec comme limite stricte une perte de poids de plus de 20% due à une gêne locomotrice, gravité d'un hématome au point d'injection si les actions de corrections ne sont pas suffisantes.
Choix des espèces
La souris représente la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments de l’hémophilie et d’étudier la destruction articulaire induite par la maladie. Il est important de préciser que la souris hémophile, paradoxalement à la forme humaine de cette maladie, n’est pas victime de saignement spontané et les saignements sont provoqués que par des traumatismes. Pour cette étude, nous allons utiliser des souris matures. Il est important de travailler avec des jeunes adultes dont la croissance est finie. Les souris très jeunes sont à éviter car leur croissance articulaire n’est pas encore terminée et les souris très âgées sont également à éviter en raison de la modification possible de la coagulation avec l’âge et par conséquent la tendance hémorragique.
Encapsulation de principes actifs pour l’administration locale et la libération prolongée pour les traitements des cancers en intratumoral
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 290 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis l'implantation de microcapsules chargées d'un anticancéreux et jusqu'à trois prélèvements sanguins, pour tester une libération locale prolongée du médicament. Le porteur décrit une gêne modérée liée à la croissance tumorale et une toxicité possible des principes actifs, avec des amaigrissements. Il annonce au conditionnel des bénéfices pour les patients et affirme qu'aucune méthode substitutive ne reproduit le corps entier, jugeant l'usage d'animaux vivants "indispensable".
Objectifs
La plupart des agents anticancéreux sont administrés en intraveineuse : l'agent anticancéreux empreinte donc la circulation sanguine pour atteindre sa cible. Ce mode d’administration est limité entre autres par sa toxicité pour les tissus sains, ces derniers recevant également du sang contenant l'agent anticancéreux injecté. Une solution pour améliorer la réponse des patients et limiter les effets secondaires délétères est d’administrer l'agent anticancéreux localement dans les zones à traiter (dans ou proche de la tumeur). On peut ainsi contrôler précisément les tissus en contact avec l'agent anticancéreux. Notre objectif est de faire la preuve de concept d'une technologie s'inscrivant dans cette approche. Il s'agit de microcapsules remplies d’une substance active d'intérêt, et qui comprennent une ouverture permettant une libération locale prolongée et controlée au niveau de la tumeur. Ces microcapsules seront implantées dans les tissus entourant la tumeur et/ou à l'intérieur de celle-ci. Nous émettons l'hypothése que cette technologie peut s'avérer supérieure à l'injection seule par voie intraveineuse, à la fois en termes d'efficacité antitumorale et de toxicité au niveau du reste de l'organisme.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus chez le patient sont les suivants : - Diminuer les risques de toxicité systémique (cardiaque notamment) liés à une dose trop élévée, en détournant le médicament des organes non-cibles. - Les microcapsules ne demanderaient qu'une seule implantation, ce qui diminue la géne occasionnée par rapport à une chimiothérapie classique nécéssitant plusieurs rendez-vous. Dans le cas de tumeurs profondes, les microcapsules éviteraient également aux patients de devoir subir plusieurs interventions chirugicales potentiellement invasives. Les microcapsules présentent également plusieurs bénefices par rapport à l'administration intraveineuse ou locale : - Une absorption biopharmaceutique de la molécule d'intéret plus élevée. - Une plus grande stabilité biologique (la molécule est "protégée" à l'intérieur de la microcapsule). - Une spécificité et une précision plus élevées dirigées contre les cellules cancéreuses. - Une plus longue demi-vie, une amélioration de l'absorption des molécules cibles et une diminution des doses efficaces.
Procédures
Au démarrage de toutes les procédures, injection de microcapsules, une fois. L'implantation durera environ 15 min par animal. Des prélèvements de sang seront fait sur certains animaux sous anesthésie locale (maximum 3 prélèvements). Chaque prélèvements durera environ 5 min. Certains animaux seront aussi greffés avec des cellules tumorales sous anesthésie locale, une fois, durée 2 minutes.
Impact sur les animaux
Toutes les procédures impliquent l’injection chez la souris de lignées tumorales ou de microcapsules en sous-cutanée, ainsi que de principes actifs en intraveineux ou intratumoral. L’injection des lignées tumorales va conduire à la croissance de tumeurs. Ces tumeurs peuvent induire une gène modérée. Il existe également une possibilité de toxicité systémique ou locale des principes actifs utilisés (chimiothérapie), avec des amaigrissements possibles.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour analyses et études sur leurs organes et tissus.
Remplacement
Le but de ce projet est de maximiser l'efficacité des microcapusles et des principes actifs en mi,nimisant toutes les formes de toxicité afin d'aboutir à une méthode thérapeutique utilisable chez l'homme plus efficace et moins toxique que les injections locales ou systémiques. Comme il n’est pas possible à ce jour de reproduire toutes les fonctions du corps entier par des méthodes substitutives, l’utilisation d'animaux vivants est indispensable.
Réduction
Nous ne mettrons pas en oeuvre pas les conditions qui ne se justifieraient pas suite aux résultats des premières expériences, ce qui pourra permettre de réduire le nombre de souris indispensables à la réalisation du programme expérimental. Dans toutes les expériences, nous chercherons à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Le logiciel G*Power a été utilisé pour déterminer combien d'animaux sont strictement nécessaires à la réussite statistique des expériences.Les résultats seont analysés par comparaison entre plusieurs groupes faite par une analyse de variance suivie d’un post-hoc test pour les comparaisons entre 2 groupes. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, les différentes procédures seront mises en oeuvre séquentiellement.
Raffinement
Les souris seront maintenues à raison de 5 souris par cage dans un environnement enrichi (nid, maison, tunnel). Toutes les injections (sous-cutanées, microcapsules et cellules tumorales) seront réalisées sous anesthésie générale à l'isoflurane. Les souris seront suivies 4 à 5 fois par semaine afin de suivre différents signes de douleurs et d’inconfort (perte de poids, hypothermie, voussure du dos, pelage souillé). Dans la mesure du possible, les souris seront déplacées de leur cage vers l’appareil à anesthésie en utilisant des tunnels pour éviter de les prendre par la queue. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Un point de colle chirugicale sera appliqué sur la cicatrice cutanée provoquée par le passage de la seringue contenant les microcapsules, afin d'aider à la cicatrisation et de minimiser la gêne pour l'animal.
Choix des espèces
Le modèle murin (souris), avec son génome similaire au génome humain à 99%, constitue un modèle de référence pour les pathologies humaines. Le choix de cette espèce pour ce projet se base sur 2 arguments : - les principes actifs envisagés dans le projet ont tous été validés et testés dans la littérature sur des souris, nous permettant de minimiser les inconnues (efficacité, doses, toxicité etc), les risques et donc le nombre d'animaux utilisés. - les lignées cellulaires tumorales répondant aux principes actifs envisagés ont été développées dans cette espèce. Les animaux commandés seront des adultes de 5 à 6 semaines, ce qui correspond à des animaux à un stade de développement mature. Cet âge est celui qui est traditionnellement utilisé dans la littérature sur ce type de principes actifs/tumeurs. Ces animaux seront acclimatés durant une semaine avant d'être inclus dans le protocole.
Evaluation de la capacité de souches recombinantes de BCG, pro-autophagie, à mieux protéger contre l’infection à Mycobacterium tuberculosis dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
279 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Vaccinées avec des BCG recombinants, quatre-vingt-quatre d'entre elles sont ensuite infectées par la tuberculose en aérosol, maintenues en chambre de contention pendant quarante minutes, l'infection provoquant une inflammation pulmonaire et des lésions tissulaires. Le porteur les fait toutes tuer, faute de replacement possible en contexte infectieux. Il teste si l'induction de l'autophagie améliore la protection vaccinale et affirme que ce travail ne peut être envisagé que sur un modèle animal.
Objectifs
Le BCG (Bacille de Calmette et Guérin) est un vaccin utilisé dans la lutte anti-tuberculeuse depuis un siècle. Cependant son efficacité chez l’adulte est modérée et doit être accentuée par l’utilisation de nouvelles stratégies. Une de celles-ci, qui sera évaluée dans cette étude dans un modèle murin, est d’induire l’autophagie, un mécanisme physiologique de défense de l'hôte. L'objectif du projet est donc d’utiliser des BCG produisant un peptide inducteur de l’autophagie (BCG recombinants) et de comparer leur pouvoir immunogène et leur capacité à protéger des souris infectées avec le bacille tuberculeux par rapport au BCG. Une augmentation de la protection antituberculeuse est escomptée. Si tel est le cas, l'innocuité (absence d’effet toxique) des BCG recombinants sera évaluée également chez la souris.
Bénéfices attendus
La tuberculose, causée par Mycobacterium tuberculosis, demeure un problème majeur de santé publique à l’échelle mondiale, avec plus d’un million de décès par an. La difficulté à éradiquer la maladie est liée à trois facteurs principaux : la faible efficacité du vaccin BCG chez l’adulte, la co-infection avec le virus de l'immunodéficience humaine et l’apparition croissante de souches de Mycobacterium tuberculosis multirésistantes aux antibiotiques. L'amélioration du vaccin et la découverte de nouvelles voies thérapeutiques, notamment celles basées sur l’immunité de l’hôte, demeurent donc une priorité. L'autophagie est un mécanisme fondamental de défense de l'hôte notamment impliqué dans la lutte contre les infections. Des résultats expérimentaux obtenus in vitro et in vivo suggèrent fortement que l’autophagie pourrait augmenter l’efficacité de la vaccination par le BCG. Ainsi si les souches de BCG recombinants, qui vont être utilisées dans ce projet, augmentent l’immunogénicité et/ou la protection des souris contre l’infection à Mycobacterium tuberculosis, cela démontrera le rôle bénéfique de l’autophagie dans la vaccination. A plus long terme, si l’innocuité de ces souches est démontrée, leur utilisation en vaccination humaine pour la protection anti-tuberculeuse pourra être envisagée et pourrait donc augmenter la protection contre l’infection tuberculeuse.
Procédures
Une seule injection, d’une durée inférieure à 2 minutes, des différentes souches de BCG sera réalisée sur toutes les souris. 84 souris seront infectées par voie aérosol avec 100 bacilles tuberculeux. Cette infection sera réalisée sur animaux vigiles placés dans des chambres de contention pendant 40 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables sur les animaux seront induits à deux niveaux : 1) Lors de la réalisation des procédures 2) Par la pathologie induite par l’infection Lors de la réalisation des procédures, il s’agit d’un stress faible et de courte durée généré par les gestes techniques tels que la contention et les injections lors de la vaccination et l’infection des animaux. La vaccination des souris par le BCG sera effectuée par injection sur animal vigile après une légère contention. Cette opération indolore induit un léger stress de courte durée. Lors de l’infection par les bactéries par aérosol les animaux sont maintenus immobiles dans des chambres avec le nez pointant vers le flux d’air. Cette opération d’une durée d’environ 40 minutes (introduction et sortie des animaux des chambres et temps d’exposition à l’aérosol) induit un stress modéré. Suite à l’infection des souris par le bacille tuberculeux, les bactéries se multiplient dans les poumons de l’animal générant une inflammation et des lésions tissulaires. Pour les animaux immunocompétents, les effets attendus sont une gêne respiratoire modérée et un léger affaiblissement de l’animal se traduisant par des signes cliniques d’aspect (pelage) et de comportement (posture, mobilité). Ces signes cliniques apparaissent tardivement au cours de la procédure, et seront donc de courte durée de l’ordre de quelques jours. Pour les animaux immonodéficients, en plus des nuisances précédemment citées, une perte de poids pourra être enregistrée. La pesée des animaux ne génère pas de nuisance.
Devenir
Tous les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort car il n’y a pas de possibilité de replacement vu le contexte infectieux.
Remplacement
Ce travail d’investigation ne peut être envisagé que sur un modèle animal. En effet il s’agit de démontrer que l’activation de l’autophagie permet d’accroitre l’effet de la vaccination et ainsi d’aider le système immunitaire à mieux combattre l’infection par une meilleure élimination des bactéries. Or la vaccination est un procédé qui consiste à stimuler le système immunitaire afin qu’il développe une réponse adaptée et spécifique à un agent infectieux. Cette réponse nécessite de nombreux acteurs moléculaires et cellulaires dont le fonctionnement concerté ne peut se faire qu’in vivo. En amont de cette étude, des expériences in vitro et in vivo suggèrent fortement, mais sans le démontrer clairement, que l’autophagie pourrait avoir un effet bénéfique sur l’efficacité vaccinale du BCG.
Réduction
Les procédures mises en œuvre dans ce projet sont basées sur un nombre de 5 souris par condition. Dans ce modèle expérimental comme dans la plupart des modèles d’investigation in vivo, et bien que l’expérimentation soit réalisée sur des animaux issus d’une lignée, la variabilité inter individuelle en réponse à un stimulus est importante et ne nous permet pas de diminuer le nombre d’animaux par groupe en dessous de cette valeur afin d’obtenir une puissance statistique satisfaisante. Afin de réduire le nombre d’animaux, deux souches de BCG recombinants, exprimant les peptides les plus efficaces pour activer l’autophagie, parmi ceux décrits dans la littérature, seront testées. De plus cela permettra également de limiter le nombre d’animaux utilisés comme témoin car ainsi toutes les souris peuvent être infectées en même temps limitant ainsi la variabilité.
Raffinement
Dans ces expériences, les souches de souris ont été choisies en fonction de l’objectif de l’expérimentation. L’état sanitaire et le bien-être des animaux sont évalués tout le long de l’expérience par des personnels formés. Des mesures seront prises pour réduire au minimum les nuisances : anesthésie, limitation des temps de contention au minimum, surveillance accrue après chaque geste, mise en place d’une grille de scoring et de points limites précoces.
Choix des espèces
Plusieurs modèles animaux de tuberculose humaine existent mais l’espèce murine est la plus utilisée dans la littérature. Les données préliminaires existantes suggèrent que l’autophagie pourrait être impliquée dans l’accroissement du pouvoir vaccinal du BCG ont été obtenues, in vitro, grâce à l’utilisation de cellules murines et, in vivo, avec des souris. Les expériences seront réalisées sur des animaux âgés de 8 semaines. Il s’agit donc d’animaux adultes afin que leur système immunitaire soit totalement fonctionnel. En effet le but du projet est d’évaluer l’impact de l’autophagie sur le pouvoir vaccinal du BCG pour lutter contre l’infection tuberculeuse. La vaccination étant un procédé permettant à l’organisme de développer une protection spécifique vis-à-vis d’un agent infectieux grâce à son système immunitaire, les expériences doivent être réalisées avec des animaux ayant un système immunitaire parfaitement développé.
Méthode d’identification et de caractérisation génétique chez les rongeurs
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Rats : 1000
75 000 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal est contenu quelques secondes pour un tatouage et une biopsie d'oreille destinée au génotypage, sous isoflurane au-delà de quatorze jours. Le porteur réutilise environ 1 100 animaux pour d'autres projets ou pour la formation, et fait tuer les autres, notamment les génotypes non souhaités et les animaux d'élevage trop âgés. Il caractérise génétiquement quatre-vingts lignées de son animalerie et affirme qu'identifier les individus est "nécessaire" à leur utilisation scientifique.
Objectifs
L'objectif est de caractériser génétiquement les 80 lignées de notre animalerie pour gérer nos élevages et être utilisés dans des projets scientifiques (ex: identifier des biomarqueurs de l'hypoxie, étudier des gènes de l'infertilité, étude de l'arthrite, étude de cancérologie pour trouver et mettre au point des traitements, ...).
Bénéfices attendus
Notre établissement utilise en routine pour l'élevage des lignées génétiquement altérées: l'identification par tatouage des phalanges et la biopsie d'oreille pour le génotypage. Ce projet permettra de caractériser génétiquement les 80 lignées de notre élevage de souris et rats génétiquement altérées nécessaires à différents projets de recherche.
Procédures
L'intervention est une contention de l'animal (5sec) 1 seule fois pour l'identification et un prélèvement de tissu d'une biopsie d'oreille avec du matériel stérile et adapté (5sec) 1 seule fois. L'anesthésie par inhalation d'isoflurane est utilisée lors du tatouage et la biopsie d'oreille pour les animaux âgés de plus de 14 jours ainsi que les rats nouveaux nés.
Impact sur les animaux
La contention pouvant engendrer un stress et des douleurs légères au moment du tatouage et du prélèvement de tissu (biopsie d'oreille), nous serons vigilant à effectuer cette méthode d 'identification de façon rapide et avec précision. L’anesthésie par inhalation d'isoflurane est utilisée lors du tatouage et la biopsie d'oreille pour les animaux agés de plus de 14 jours ainsi que les rats nouveaux nés. Le geste sera réalisé par du personnel dûment formé ayant suivi un tutorat relatif à ce geste technique.
Devenir
Mise à mort des animaux pour les génotypes non souhaités, les animaux d'élevage trop âgés, les animaux au cours de leur élevage fin d'éviter des situations de souffrance. Gardés en vie pour une utilisation continue pour l'élevage ou vers les projets prévus pour ces animaux et réutilisation vers les projets non prévues pour ces animaux pour la formation.
Remplacement
L’utilisation de rongeurs à des fins scientifiques nécessite de pouvoir identifier les individus et de les caractériser d’un point de vue génétique le cas échéant. L’identification permet de repérer un animal parmi ses congénères et de le suivre tout au long de sa vie expérimentale. En plus de cette identification, une caractérisation génétique moléculaire est nécessaire lorsque l’on utilise des lignées de rongeurs génétiquement modifiées afin de s’assurer de la présence ou de l’absence d’une mutation d’intérêt dans leur génome ou pour suivre une sélection sur marqueurs génétiques par exemple. De plus ,il n'est pas possible dans le cadre de l'expérimentation des chercheurs de la plateforme de remplacer le modèle animal par un autre (in vitro, in silico,..)
Réduction
Une caractérisation génétique moléculaire est nécessaire lorsque l’on utilise des lignées de rongeurs génétiquement modifiées afin de s’assurer de la présence ou de l’absence d’une mutation d’intérêt dans leur génome ou pour suivre une sélection sur marqueurs génétiques par exemple. Seuls les animaux ayant besoin d'etre génotypés subiront une biopsie d 'oreille , les autres seront identifiés uniquement par technique du tatouage aux phalanges. La gestion des élevages se fait de façon raisonnée afin d'éviter au maximum la génération d'animaux surnéméraires non utilisés par la suite dans les expérimentations.
Raffinement
Le geste technique sera réalisé rapidement à l'extrémité de l'oreille ,afin de réduire supprimer ou soulager leur douleur ou leur détresse nous pratiquerons une anesthésie gazeuse par inhalation d'isoflurane lors du tatouage et de la biopsie de tissu pour les animaux agés de plus de 14 jours ainsi que les rats nouveaux nés.
Choix des espèces
L'objectif de ce projet est de produire et d'identifier des lignées de souris et rats génétiquement modifiées par croisement et ceci afin de répondre à de nouvelles questions scientifiques en lien avec les thématiques de recherche des instituts comme par exemple en oncologie, sur les maladies neurodégénératives , sur des pathologies de la grossesse ou sur des modèles de différentes pathologies touchant les organes. Les animaux seront identifiés à partir du 5ème jours jusqu'au 14ème jour, au dela la biopsie et l'identification par tatouage pourra se faire uniquement sous anesthésie volatile à l'isoflurane.
Validation de l’irradiation à ultra-haut débit de dose chez la souris: expérience pilote
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
6 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles sont anesthésiées à l'isoflurane puis irradiées à ultra-haut débit de dose lors d'une expérience pilote de radiothérapie FLASH. Le porteur indique qu'aucune nuisance n'est attendue et que l'irradiation est imperceptible, mais que les souris ne peuvent être gardées vivantes en raison des effets secondaires à long terme et seront tuées par dislocation cervicale. Il cherche à valider la faisabilité des irradiations avant une étude à plus grande échelle.
Objectifs
La radiothérapie FLASH est une nouvelle méthode d'irradiation à très haut débit de dose. Elle est décrite pour déclencher moins d'effets secondaires sur les organes sains tout en conservant la même efficacité anti-tumorale. Cependant, de nombreux aléas demeurent, parmi lesquels le type de particules ou encore la structure du faisceau. Nous disposons d'un cyclotron (accélérateur de particules) capable de contrôler certains de ces paramètres et ainsi permettre la validation à différents niveaux de la radiothérapie FLASH.
Bénéfices attendus
Ce projet validera la bonne réalisation des irradiations et la maitrise de la sécurité des animaux avant de passer à l'étape d'expérimentation à plus large échelle. Les procédures sont complexes au sein du cyclotron. Cette mise en oeuvre test permettra d'écarter ou corriger tout problème logistique imprévu pendant le parcours des animaux. Il n'y cependant aucun risque d'accident d'exposition.
Procédures
Les animaux seront transportés (30 min), anesthésiés (isoflurane, 12 min total) et irradiés (imperceptible).
Impact sur les animaux
Aucune nuisance n'est attendue. L'irradiation est imperceptible et il n'y a pas de procédure invasive.
Devenir
Il n'est pas possible de réutiliser ou conserver un animal irradié en raison des risques d'effets secondaires à long terme. Les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale.
Remplacement
Le bénéfice de la radiothérapie FLASH n'est pas visible in vitro. Il n'existe donc pas de procédure de remplacement possible.
Réduction
Le nombre de 6 animaux est le strict minimum possible afin de répéter l'irradiation pour s'assurer que le processus est reproductible (2 animaux seulement par condition). Il n'est pas possible de réduire.
Raffinement
La radiothérapie sera réalisée sous anesthésie isoflurane à 4% pour l'induction et 2% pour le maintien dans le but d'immobiliser l'animal, la radiothérapie étant imperceptible. Le réveil des animaux s'effectue sous contrôle visuel avec équipement chauffant à 37°C. Les animaux seront hébergés en groupes de 3 à 5/cage avec enrichissement (tunnel, dôme ou frisottis), accès à l'eau et la nourriture à volonté, et cycle jour-nuit 12h/12h. La dominance est observée et un groupe est recomposé uniquement en cas d'incompatibilité entre deux individus.
Choix des espèces
La souris, par son faible encombrement et sa vitesse de reproduction/développement, est le modèle de mammifères le plus pratique au laboratoire et le plus décrit en cancérologie. Le génome de la souris (différentes souches), entièrement séquencé, et sa physiologie sont similaires à l'homme avec une bonne conservation des gènes et des fonctions. Les organes d'intérêt pour notre étude sont particulièrement ressemblant à l'homme. De plus, la souris tolère l'homozygotie et permet de travailler sur des lignées pour des résultats scientifiques reproductibles. Les modèles immunodéficients tolèrent la greffe de cellules tumorales humaines. Enfin, ce modèle est accepté dans les phases de validation thérapeutique pré-clinique à visée humaine. De surcroit, la souris est un modèle qui a déjà été validé en radiothérapie FLASH ce qui permet d'effectuer un comparatif inter-études. Aucun pré-requis pour l'âge et le sexe. Les animaux seront récupérés de surplus d'élevage tels qu'ils sont pour éviter un suremploi.
Effets d’une alimentation riche en cholestérol pendant plusieurs générations chez la souris
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
832 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Nourries au cholestérol sur plusieurs générations, elles subissent des tests de tolérance au glucose et à l'insuline avec injections et prélèvements sanguins à la queue, avant d'être tuées à cinq mois pour prélever aorte, cœur, foie et autres organes. Le porteur indique avoir d'abord utilisé un petit ver, Caenorhabditis elegans, pour limiter le recours aux vertébrés. Il étudie l'hérédité épigénétique paternelle des maladies cardiométaboliques et renvoie au conditionnel les retombées thérapeutiques.
Objectifs
La prévalence de l'obésité s'est accrue de manière épidémique dans les pays développés. Compte tenu du lien étroit entre l'obésité et les maladies cardiovasculaires, l'une des premières causes de mortalité en France, cela pose un grave problème de santé publique. Bien qu'une mauvaise alimentation et la sédentarité sont des facteurs de risques importants pour le développement des maladies cardiovasculaires, de plus en plus de données épidémiologiques et expérimentales convergent vers la même idée : nos gènes se "souviennent" de l'hygiène de vie de nos parents ou en d'autres termes d'un phénotype nouvellement acquis. Dans le présent projet, il s'agit d'un désordre métabolique, peut être transmis via la lignée germinale paternelle et/ou maternelle. Ce type d'hérédité non-génétique est un processus nouveau mettant en jeu des mécanismes "épigénétiques" qui font appel à des modifications qui ne sont pas codées directement par l’ADN. Depuis plusieurs années, nous avons développé un modèle d'hérédité où l'obésité paternelle induite par une alimentation riche en graisse est transmise par le père via les spermatozoïdes. Cependant, faute de modèles expérimentaux adéquats, très peu de données existent concernant l'hérédité épigénétique des maladies cardiométaboliques et les éventuels mécanismes moléculaires impliqués dans ce type d'hérédité sont très mal connus.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à évaluer si la susceptibilité à développer des pathologies cardiométaboliques (notamment les cardiopathies coronariennes et maladies du foie gras) est modulée par l'héritage épigénétique paternel. Les bénéfices susceptibles d’émerger de notre projet consiste essentiellement en une meilleure compréhension des facteurs de risques héréditaires des maladies liées à un taux trop élevé de cholestérol (comme l’athérosclérose) qui pourra éventuellement déboucher sur une prise en charge thérapeutique améliorée de ces maladies.
Procédures
Les animaux vigiles seront soumis à 3 séries de prélèvements. A l'âge de 4 mois, les souris subissent un test de tolérance au glucose (Test GTT) et à l'âge de 4mois 1/2 un test pour mesurer leur sensibiltié à l'insuline (test ITT). Au total, les souris subiront 2 injections intrapéritonéales, à savoir une injection de glucose et une injection d’insuline. Pour réaliser ces injections, seules quelques secondes (5-10s) suffisent. Pour ces 2 tests, du sang sera prélevé au niveau de la queue . La glycémie est vérifiée toutes 15min la 1ère heure et toutes les 30 min la 2ème heure. A l'âge de 5 mois, les souris seront mises à mort et un prélèvement de sang sera effectué.
Impact sur les animaux
L' Injection Intrapéritonéale de Glucose ou d'Insuline et le prélèvement à la queue, associés aux tests GTT et ITT, induisent une douleur légère de courte durée. Le prélèvement de sang en fin de procédure induit également une douleur légère de courte durée.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort à la fin de la procédure expérimentale. Cela nous permettra de prélever plusieurs tissus (Aortes, Coeur, reins, tissus aadipeuc, pancréas, cerveau, foie). Certains seront directement congelés pour des analysies moléculaires et d'autres seront fixés pour analyses histologiques. Ce matériel biologique nous est indispensable pour réaliser les analyses moléculaires nécessaires à la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans l'hérédité épigénétique des maladies cardio-métaboliques.
Remplacement
L'hérédité transgénérationnelle est un mécanisme complexe d'interaction pour lequel il n'existe pas, à l'heure actuelle, de modèles in vitro. L'emploi d'un modèle animal comme la souris récapitulant la physiopathologie des maladies cardiovasculaires (notamment les cardiopathies coronariennes) chez le mammifère est donc essentiel.
Réduction
Avant ces expériences, nous avons utilisé, parallèlement à notre modèle murin et en collaboration, un modèle non-vertébré, Caenorhabditis elegans, un petit ver transparent et nonparasitaire. Ce modèle nous a permis d’étudier certains aspects des mécanismes moléculaires de cette hérédité sans avoir recours au modèle animal vertébré. D’autre part afin de calculer la taille de l’échantillon nécessaire (15 animaux/groupe), nous avons réalisé un calcul de puissance basé sur nos précédentes expériences, test qui permet de minimiser le nombre d’échantillons et donc d'animaux nécessaires pour valider ou non notre hypothèse de départ.
Raffinement
Dans un souci de Raffinement, voici les dispositions que nous mettrons en place pour minimiser les souffrances éventuelles et le stress qui pourraient être générées par nos expériences : • Nous nous attendons à ce que nos souris deviennent obèses. Pour éviter de les séparer lorsqu’elles vieillissent (et ainsi de respecter le maximum de souris autorisées par cage) et de les stresser inutilement (en évitant de perturber la dominance déjà établie), les souris seront regroupées par 4 dans une cage dès leur sevrage. Ces animaux seront observés hebdomadairement pour pouvoir détecter d’éventuels problèmes. Si un de nos animaux est gravement blessé (bagarre ou autres), et/ou perd 10% de son poids pendant 2 semaines consécutives, cet animal sera mis à mort et répertorié. • Un intervalle d’au moins une semaine sera respecté entre chaque test GTT et ITT. • Les souris seront identifiées par punch au sevrage. Cette identification est définitive et ne peut pas induire d’infection. • Afin de limiter le stress lors des tests GTT et ITT, chaque souris sera identifiée par 0, 1, 2 ou 3 traits au feutre au niveau de la queue pour accélérer leur identification (feutre inodore spécial et non toxique). Si lors des tests ITT, la glycémie est faible (
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme modèle en raison de ces similarités génétiques, et physiologiques avec l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peutt être modifié et analysé. C'est, par ailleurs, la raison pour laquelle l'ensemble des techniques de transgénèse chez les mammifères a débuté chez la souris. En plus, nous pourrons avoir d’une façon relativement rapide les 5 générations indispensables pour achever l'étude. Les souris seront utilisées à partir de l'âge de 3 semaines jusqu'à l'âge de 5 mois. L'âge de 3 semaines correspond à la puberté la souris. A cet âge, les cellules qui génèrent les spermatozoïdes sont très sensibles à divers stress environnementaux. A l'âge de 4 mois, les mâles seront croisés afin d'obtenir les futures générations. En maintenant une nourriture riche en cholestérol pendant 4 mois, nous pensons que des marques non-génétiques peuvent être induites par l’alimentation et sont susceptibles d’être transmises à la nouvelle génération. Les croisements seront effectués comme suit: un male préalablement nourri en HCD sera croisé avec une femelle C57BL/6J. Lors du croisement la nourriture sera la nourriture standard. Le lendemain après le croisment si un bouchon vaginal est observé le mâle sera remis dans sa cage avec ses comparses sous un régime HCD. Après avoir été croisés, les animaux agés alors de 4 mois 1/2 subiront les tests de GTT et ITT.
Enregistrement de neurones spinaux pour le criblage de candidats médicaments antalgiques contre la migraine
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
380 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent cinq injections d'un produit déclencheur de migraine, puis leurs neurones spinaux sont enregistrés sous anesthésie profonde, ce qui ne permet pas de les garder en vie. Le porteur décrit ces injections comme "brèves et indolores" et l'allodynie comme modérée, tout en classant la procédure en sévère du fait de la répétition des injections. Il cherche à cribler des candidats médicaments antalgiques contre la migraine.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mettre en place, valider, et utiliser un modèle de migraine expérimentale chez le rat pour tester des candidats médicaments anti-migraineux. Ce modèle est basé sur la mesure électrophysiologique de l’activité des neurones innervant la face et impliqués dans la génération de la sensation douloureuse.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester l’efficacité de candidats médicaments anti-migraineux sur des bases électrophysiologiques. Ainsi, il permettra de préciser le mode d’action des candidats médicaments, et d’avoir une meilleure évaluation de leur efficacité comparée à celle apportée par les tests comportementaux habituellement utilisés.
Procédures
Les animaux vigiles reçoivent 5 injections (1 jour sur 2) contenant un produit qui est connu pour pouvoir générer des migraines chez l’homme jusqu'au jour précédant la mesure électrophysiologiques. Les injections sont brèves et indolores.
Impact sur les animaux
L’injection i.p. du produit qui est connu pour pouvoir générer des migraines chez l’homme induit un stress très bref 1) due à la contention de l’animale et 2) une douleur très brève et modérée due à la pénétration de l’aiguille. En pratique, une injection correctement exécutée n’induit aucun reflexe défensif chez l’animal. L’état d’allodynie est modéré car d’après la littérature, les animaux traités ne présentent aucun signe comportemental de douleur spontanée. Cependant, la répétition des injections justifient une classification sévère.
Devenir
Les mesures électrophysiologiques sont invasives (elles se pratiquent sous anesthésie profonde) et ne permettent pas de garder les animaux en vie à la suite de l’expérience.
Remplacement
L’utilisation d’animaux pour les tests d'efficacité d’analgésiques/antalgiques est rendue nécessaire par le fait que les mécanismes physiopathologiques comme les mécanismes d'action des candidats-médicaments sont des processus complexe impliquant la totalité du système nerveux (de manière imagée, des communications réciproques entre le cerveau, la moelle épinière, et les tissus périphériques).
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit par 3 actions conjointes : 1) le soin apporté à chaque expérience, conjugué à plus de 10 ans de pratique dans le domaine (une spécialisation extrême est indispensable à l’obtention d’un taux de succès élevé); 2) le ciblage d’une population de neurone bien définie (neurones spinoparabrachiaux soit de la couche I, soit des couches III-V), qui permet de réduire les variations expérimentales liées aux caractéristiques individuelles des neurones enregistrés; 3) une approche par étape, avec des lectures intermédiaires des résultats, afin d’arrêter rapidement les plans d’expériences improductifs.
Raffinement
Les approches physiologiques chez l’animal anesthésié permettent un certain nombre de raffinements. Premièrement, la mesure de l'activité des neurones spinaux se fait chez l'animal anesthésié et permet de pouvoir tester l’efficacité de candidats médicaments sur la réponse à des stimuli très nociceptifs sans aucune souffrance pour l'animal (impossible chez un animal vigile). Deuxièmement, plusieurs doses de candidat médicaments peuvent être testées chez un même animal dans la même expérience, et il est possible de faire des prélèvements sanguins au cours de l’expérience (chez le rat) pour corréler l’exposition plasmatique aux effets observés. Troisièmement, le nombre d'animaux utilisés est réduit par le fait que chaque animal est son propre contrôle (principe des mesures répétées). Enfin, la mesure concomitante des paramètres cardiovasculaires apportent des renseignements connexes essentiels sur les caractéristiques du candidats médicaments.
Choix des espèces
Le choix de l'espèce, ici le rat, dépend des données déjà acquises sur le candidat médicament à tester, et sur le développement de la recherche dans le domaine de la migraine. L’ensemble des mesures électrophysiologiques dans ce domaine s’est fait chez le rat.
Manipulation pharmacologique de canaux mis en jeu lors d’un challenge hypercapnique chez un modèle murin du syndrome d’Ondine
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système respiratoire
698 souris vont être utilisées, une majorité tuée sans réveil, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance sans réveil et modéré. Des nouveau-nées et juvéniles sont anesthésiées puis tuées pour prélever une partie du système nerveux central, tandis que des adultes reçoivent des solutions par aérosol ou par voie intranasale sous anesthésie. Le porteur souligne que ces souris mutantes, modèles du syndrome d'Ondine, présentent une sensibilité accrue à l'anesthésie et un risque de défaillance respiratoire, l'arrêt cardiorespiratoire figurant parmi les points limites. Il teste des agents pharmacologiques sur des canaux respiratoires et affirme que cette fonction ne peut être étudiée que sur des souris vivantes.
Objectifs
Les syndromes d’hypoventilation alvéolaire centrale (SHAC) sont des pathologies associées à une dérégulation du fonctionnement du système nerveux autonome. Ces SHAC sont associées à une altération de la respiration, ils surviennent dès la naissance. Ces pathologies s’accompagnent d’une réduction voire d’une absence de réponse respiratoire à l’hypercapnie (trop de CO2 dans l’air inspiré), cette réponse est vitale et nécessaire pour éliminer le CO2 de l’organisme. L’endormissement et le sommeil s’accompagnent d’irrégularités respiratoires pouvant conduire à une situation d’hypercapnie, ainsi, les personnes atteintes de ce syndrome doivent tout au long de leur vie supporter une aide ventilatoire dès qu’elles s’endorment. Des cellules du système nerveux sont sensibles à l’hypercapnie, par le biais de canaux présents à la surface de leur membrane. Ces canaux sont sensibles aux variations d’acidité (trop de CO2). Les expérimentations seront réalisées chez des souris mutantes modèle d’un SHAC et leurs congénères sauvages. L’approche utilisée chez des souris nouveau-nées et juvéniles permettra d’identifier l’agent pharmacologique des canaux sensibles à l’acidité le plus efficace, elle nécessitera une chirurgie permettant d’isoler la partie du système nerveux central comportant la commande respiratoire. Chez les souris adultes, l’approche utilisée est non invasive, elle permettra de déterminer l’effet bénéfique d’un agent pharmacologique des canaux sensibles à l’acidité sur la respiration. In fine, les données obtenues devraient donc permettre de mieux comprendre comment ces canaux sensibles à l’acidité peuvent moduler la commande respiratoire. Ainsi, les éléments observés chez l’animal (dans des conditions non réalisables chez l’Homme) permettront le développement de nouvelles pistes thérapeutiques dans le cadre des SHAC.
Bénéfices attendus
Les souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine que nous utilisons dans ce projet sont porteuses d’une mutation sur un gène dont la protéine est exprimée dans une population de neurones indispensables à la réponse respiratoire à l’hypercapnie (chémosensibilité au CO2/H+). A la naissance, ces souris ne présentent pas de réponse respiratoire à l’hypercapnie, cette dernière est partiellement restaurée chez les souris adultes. Le blocage des canaux sensibles aux protons pourrait potentiellement 1/améliorer la respiration des souris nouveau-nées, juvéniles ou adultes, 2/restaurer une réponse respiratoire à l’hypercapnie chez les souris nouveau-nées ou juvéniles et 3/restaurer ou potentialiser la réponse respiratoire à l’hypercapnie des souris adultes. De plus, nous souhaitons 1/identifier les cibles cellulaires et moléculaires des canaux sensibles aux protons au niveau de la commande centrale respiratoire et 2/déterminer si ces cibles évoluent selon l’âge des souris mutantes dont certaines récupèrent naturellement une faible réponse respiratoire à l’hypercapnie. In fine, les données obtenues devraient permettre de mieux comprendre comment les canaux sensibles aux protons peuvent moduler la commande centrale respiratoire. Ainsi, les éléments observés chez l’animal (dans des conditions non réalisables chez l’Homme) devraient permettre d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques chez les patients.
Procédures
L’identification par tatouages et les prélèvements de bout de queue pour identification génétique des souris juvéniles mutantes et contrôles sont réalisés par un personnel formé et ne dure que quelques secondes. Les données de la littérature mettent en évidence une sensibilité du modèle animal à l’anesthésie chez ces souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine ce qui conduit à un risque accru de défaillance respiratoire. Les souris mutantes et contrôles nouveau-nées et juvéniles sont anesthésiées (quelques minutes) puis euthanasiées par une méthode réglementaire afin d’isoler rapidement une partie du système nerveux central. Les souris adultes seront exposées via un système d’aérosol à une solution contrôle et une solution contenant un agent bloquant (10 minutes à chaque fois) avant la mesure non invasive des variables ventilatoires. 48h séparent l’administration de la solution contrôle par aérosol de celle de l’agent pharmacologique. Les autres souris adultes seront anesthésiées grâce à un gaz anesthésiant (pendant 10 minutes maximum) et dès l'anesthésie installée, l'administration par voie nasale de la solution contrôle et de l’agent bloquant (faible volume) sera réalisée. 48 heures séparent les 2 anesthésies. La mesure des variables ventilatoires chez les souris adultes sera réalisée de façon non invasive pendant 70min (1 fois par jour pendant 2 jours) dans une enceinte hermétiquement fermée et alimentée par un flux d’air en continu.
Impact sur les animaux
L’identification et le prélèvement caudal réalisé une unique fois chez l’animal pour la détermination de son génotype apparaît comme une source de douleur et de stress. Les données de la littérature mettent en évidence une sensibilité exacerbée à l’anesthésie chez ces souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine ce qui conduit à un risque accru de défaillance respiratoire. L’administration intranasale du solvant ou de l’agent bloquant, peut entraîner une altération de la ventilation par obstruction des voies aériennes supérieures, sous anesthésie générale.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin des actes en vue des prélèvements et analyses nécessaires.
Remplacement
L’utilisation de neurones isolés en culture ne permet pas d’appréhender les relations entre les structures neuronales et de mettre en évidence le développement de réseaux substitutifs nécessaires à la correction de la pathologie. La fonction respiratoire nécessite l’utilisation de modèles murins ex vivo et in vivo. Le projet nécessite d’avoir accès à la commande centrale respiratoire dans des conditions qui ne peuvent être obtenues autrement que par un travail sur des souris vivantes. L’étude de l’influence des canaux sensibles aux protons sur la commande centrale respiratoire nécessite de conserver ex vivo un réseau vivant et fonctionnel de neurones et donc l’utilisation de souriceaux. L’étude des corrections des variables respiratoires par des agents bloquants des canaux sensibles aux protons ne peut être réalisée que sur des souris adultes vigiles, non contraintes et non anesthésiées.
Réduction
Nous utilisons aussi bien les souris mâles que les femelles dans nos travaux afin de limiter le nombre d’animaux. Le nombre total d’animaux impliqués sera de 698 (349 souris mutantes utilisés). La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance. Ainsi, 23 souris nouveau-nées et 25 souris adultes mutantes par groupe sont nécessaires pour mettre en évidence des différences biologiquement significatives dans les variables respiratoires. Des tests statistiques seront réalisés a posteriori pour procéder à une interprétation fiable des résultats. Les mêmes animaux seront engagés dans l’analyse de la commande respiratoire et dans l’analyse des populations cellulaires impliquées.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. La température et l'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. L’habituation aux enceintes de pléthysmographie (technique permettant de mesurer de manière non invasive la ventilation de la souris in vivo) se traduit par la disparition des épisodes d’augmentation anormale de la fréquence respiratoire et de toilettages des souris lorsqu’elles sont dans un nouvel environnement. Après 5 jours d’habituation, les souris sont calmes et leur respiration est régulière dès le placement dans l’enceinte. Les souris mutantes présentent une sensibilité exacerbée à l’anesthésie ce qui conduit à un risque accru de troubles respiratoires mortels lors des injections intranasales sous anesthésie. De ce fait, lors des injections intranasales de l’agent bloquant des canaux sensibles aux protons ou du solvant sous anesthésie, une surveillance accrue et en continue du rythme cardiorespiratoire est assurée par l’expérimentateur jusqu’au réveil complet de la souris. En cas de défaillance cardiorespiratoire, l’anesthésie est stoppée, la souris est réanimée si nécessaire par l’expérimentateur. Les points suivants seront considérés comme des points limites : -tout dérèglement physiologique aboutissant à une incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire -modification du comportement caractéristique d’une douleur intense, une détresse ou une souffrance (absence de locomotion, pelage hérissé et ou terne, prostration, dos vouté) -anomalies pouvant entrainer une douleur intense ou une souffrance, par exemple une perte de la masse corporelle supérieure ou égale à 20 pour cent de la masse initiale de l’animal, plaies et ulcères, tumeurs, fractures… -Lors des injections intranasales de l’agent bloquant des canaux sensibles aux protons ou du solvant sous anesthésie, une surveillance accrue et en continue du rythme cardiorespiratoire est assurée par l’expérimentateur jusqu’au réveil complet de la souris du fait d’une sensibilité accrue des souris mutantes à l’anesthésie. L’arrêt cardiorespiratoire est considéré comme le point limite associés à ces injections.
Choix des espèces
Les rongeurs (rats et souris) sont depuis de nombreuses années les espèces animales de choix pour l’étude des mécanismes associés à la genèse et à la régulation de la respiration par la commande centrale respiratoire. Le modèle animal du syndrome d’Ondine n’existe, de nos jours, que sur modèle de souris mutées pour un gène sur des neurones impliquées dans la sensibilité au dioxyde de carbone. Ces souris mutantes ont été validées par des études antérieures. Le projet nécessite d’avoir accès à la commande centrale respiratoire dans des conditions qui ne peuvent être obtenues que par un travail sur les souris mutantes ; étude de l’influence par les canaux sensibles aux protons/dioxyde de carbone sur la commande centrale respiratoire ex vivo ; étude sur des tranches de tissu des propriétés électriques des neurones avec l’âge ; étude de la ventilation chez l’animal adulte vigil et de l’influence de l’agent bloquant des canaux sensibles aux protons/dioxyde de carbone appliqués par aérosol ou par administration intranasale.
Physiopathologie, neuromodulation et métabolisme dans des modèles expérimentaux de la maladie d’Alzheimer et de Tauopathies (version3)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
17 480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance sans réveil et modéré. Elles reçoivent des injections répétées de composés, de vecteurs viraux ou d'anticorps, parfois par voie intracérébroventriculaire sur animal vigile, subissent un régime obésogène de vingt semaines, des prélèvements de sang et de liquide céphalorachidien, des biopsies de queue et des tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé. Le porteur annonce qu'aucun animal ne sera réutilisé ni adopté. Il étudie des modèles de la maladie d'Alzheimer et des tauopathies et qualifie le recours à l'animal de "stricte nécessité".
Objectifs
L’objectif général des projets de notre laboratoire et de la présente demande vise à mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de la MA. L’objectif de nos études est d’une part d’appréhender les mécanismes cellulaires et moléculaires contribuant au développement de la pathologie Tau dans la MA et les tauopathies ; et d’autre part, de définir des preuves de concepts permettant une translation vers le patient tant sur le plan diagnostic (biomarqueurs) que thérapeutique. Cette stratégie expérimentale a fait ses preuves par le passé avec le développement de start-up, de transfert de nouveaux biomarqueurs vers le CHU ainsi que la mise en place de différents essais thérapeutiques chez patients atteints de maladie d’Alzheimer et de tauopathies. Ainsi, notre projet permet non seulement de lever des interrogations fondamentales quant aux processus pathologiques mis en jeu dans la MA mais répond également à des besoins cliniques en terme de diagnostic, pronostic et thérapeutique.
Bénéfices attendus
Notre projet va permettre différentes avancées scientifiques permettant de faire progresser la connaissance de la physiopathologie de la MA et des tauopathies. Notre projet vise à mieux comprendre les mécanismes conduisant au développement séquentiel de la pathologie Tau dans la MA et les possibilités de les bloquer par des approches à bases d’anticorps et de nanobodies. Ces études se doublent d’approches visant à développer les nanobodies en tant que biomarqueurs en imagerie cérébrale. Le laboratoire a également découvert de nouvelles formes pathogéniques de la protéine Tau qui semblent précocement impliquées dans la maladie d’Alzheimer vs. d’autres tauopathies. Notre projet vise donc à mieux comprendre les mécanismes conduisant aux espèces pathogénique de Tau et à développer des outils immunothérapeutiques permettant leur clairance et des stratégies améliorant ces immunothérapies avec à terme, la possibilité d’initier des essais cliniques. Par ailleurs, notre projet s’intéresse également au rôle de Tau dans la régulation de l’homéostasie glucidique, dont la dérégulation augmente le risque de développer la MA. Enfin, notre projet s’intéresse aux effets de la caféinede mieux comprendre le rôle respectif de ses récepteurs centraux dans ses effets bénéfiques. Là encore l’intérêt clinique est évident. La compréhension de l’impact de drogues approuvées par la FDA sur le développement de la pathologie Tau mais également du passage d’anticorps thérapeutiques dans le cerveau est de nature à implémenter les approches cliniques existantes et de susciter des essais cliniques ultérieurs.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes injections de composés pharmacologiques, de vecteurs viraux ou d’anticorps réalisées entre 1 à 6 fois pour des durées variant de 1 à 10 minutes. Dans certains protocoles les animaux seront soumis à un régime obésogène pour une durée de 20 semaines et leur caractéristiques métaboliques évalués (glycémie, tolérances au glucose et à l’insuline). Des prélèvements de sang ou de liquide céphalorachidien seront réalisés entre 1 et 4 fois pour des durées de 1 à 30 min); de même que des biopsies de queue, réalisées 1 fois durant moins d’une minute. Le cerveau de certains animaux sera prélevé à des ages précoces afin de réaliser des cultures cellulaires ou de cultiver des tranches de cerveaux, procédure unique durant moins de 5 secondes. Nous réaliserons également des tests de comportement (entre 1 et 2 fois avec des durées variant de 10 min à 8 jours) afin d’évaluer les performances cognitives des animaux ainsi que de l’imagerie cérébrale par IRM (1 fois durant 30 min) et PET (1 fois durant 30 min) pour évaluer la morphologie et l’activité cérébrale.
Impact sur les animaux
Nuisances possibles suite aux différentes manipulations de animaux : -Douleur associé à la biopsie de queue -Stress associé aux investigations comportementales et aux injections intracérébroventriculaires d’oligomères réalisées sur animal vigile en contention -Douleurs opératoires associées aux injections stéréotaxiques/prélèvements de LCR et douleurs/infections post-opératoires -Impact oculaire suite aux injections dans le plexus retro-orbital -Douleur associée aux prélèvements à la veine caudale -Stress métabolique suite au traitement par un régime riche en graisse -Stress hypoglycémique dans le test de tolérance à l’insuline -Douleur lors de la perfusion intracardiaque Toutes ces nuisances possibles seront prises en charge de manière adéquate.
Devenir
En dehors de la procédure de génération et de génotypage, l'ensemble des animaux sera mis à mort en fonction des objectifs annoncés. Aucun animal ne sera réutilisé ni adopté.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer différents aspects de la physiopathologie de la MA et des tauopathies, le lien complexe entre neurones et cellules gliales, en lien avec les performances cognitives des animaux. L'utilisation d'animaux vivants revêt donc un caractère de stricte nécessité avec le développement d’approches neurobiologiques intégrées. Ces évaluations ne peuvent pas être réalisées en utilisant des alternatives aux modèles animaux. Le laboratoire est néanmoins conscient de l’aspect nécessaire de recourir à des méthodes alternatives quand cela est possible, ce qui est effectivement fait pour un certain nombre d’études cellulaires et moléculaires ne nécessitant pas de modèles animaux.
Réduction
Le nombre total d’animaux concernant les procédures de l’ensemble des protocoles de notre laboratoire sur les 5 ans à venir est estimé à 17480. Cette utilisation maximise les données obtenues de chaque animal, ce qui peut limiter ou éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal. Pour chacun des groupes constitués, le nombre d'animaux a été réduit au maximum tout en permettant l'obtention de résultats satisfaisant (différences statistiquement observables). Pour limiter le nombre d’animaux, lorsque cela sera possible une réutilisation des animaux des animaleries employés pour la formation sera réalisée. Un calcul du nombre d’animaux total nécessaire par groupe a été effectué pour respecter le principe des 3R.
Raffinement
Les animaux seront observés tous les jours, pesés régulièrement, par du personnel spécialement formé. Durant les différents protocoles, tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress auquel les animaux sont soumis. Les animaux seront hébergés en groupe, et des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition, par exemple coton pour la confection de nids... Les animaux seront suivis précisément pour chaque protocole, pour lesquels des points limites adaptés ont été définis. Toute souffrance, angoisse ou comportement inhabituel sera pris en charge par des approches appropriées. Les procédures expérimentales de chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale par une combinaison de kétamine et de xylazine par voie intrapéritonéale. En cas de douleur, un analgésique sera administré. Les animaux présentant un des points limites spécifiés pour chaque approche expérimentale seront euthanasiés dans une salle dédiée; le tout en lien avec le responsable du bien être animal.
Choix des espèces
Dans toutes nos études, nous utilisons des souris, la plupart étant génétiquement modifiées afin de reproduire des caractéristiques pathologiques reproduisant un certain nombre d’altérations retrouvées dans la MA et les tauopathies (lésions amyloïdes, pathologie Tau, perte de fonction de Tau…). Le phénotype de ces animaux est modulé par l’administration de drogues, l’injections de préparations humaines, l’expression cérébrale de différents gènes via différents vecteurs viraux ou le croisement avec d’autres lignées permettant de faire varier les phénotypes pathologiques et d’apporter des preuves de concept précliniques importantes pour des approches biomarqueurs et thérapeutiques futures. Dans la plupart des expérimentations, les souris seront utilisées à l’âge adulte : de 1 mois à 12 mois. Certaines expérimentations se feront aux stades embryonnaires ou jeune après la naissance.
Maintien de lignées murines mutées pour le gène Apc
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
2 640 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour entretenir une lignée mutée pour le gène Apc qui développe spontanément des tumeurs intestinales. Elles sont identifiées par tatouage et biopsie d'oreille avant sevrage. Le porteur indique que les mâles servent une fois à la reproduction puis sont tués pour éviter la souffrance liée aux tumeurs, que les souris sauvages sont tuées et que les femelles mutées partent vers d'autres protocoles. Il maintient ce modèle pour tester le pouvoir pro-carcinogène de bactéries et affirme que le recours à l'animal reste "nécessaire".
Objectifs
De plus en plus de données de la littérature suggèrent que les bactéries du microbiote intestinal (c’est-à-dire des bactéries hébergées dans notre tractus digestif) pourraient être impliquées dans le développement du cancer colorectal (CCR). En collaboration avec le service hospitalier de chirurgie digestive, le laboratoire a identifié des bactéries retrouvées à haute fréquence au sein des tumeurs colorectales humaines. Des expérimentations menées in vitro nous ont permis de sélectionner des bactéries potentiellement pro-carcinogènes. Nous souhaitons valider ces souches dans un modèle murin. Cependant, les souris ne développent aucun CCR de façon spontanée. Le modèle murin de CCR disponible est le modèle Apc/Min. Ces animaux présentent une mutation génétique induisant le développement spontané d’un cancer intestinal. Le but de cette demande est d'entretenir la lignée Apc/Min de manière à pouvoir tester régulièrement le pouvoir pro-carcinogène de différentes souches bactériennes d'intérêt. Par ailleurs, nous nous intéressons également au rôle de l'autophagie (un processus cellulaire permettant de dégrader entre autres, les bactéries ayant pénétré à l’intérieur de la cellule) dans le développement du CCR lors d'infections bactériennes. En effet, ce processus semble impliqué dans l'initiation/progression de plusieurs cancers dont les CCR. Pour cela, nous devons entretenir une lignée Apc/Min dans laquelle un gène crucial pour la mise en place de l'autophagie a été délété. Ce projet nous permettra de répondre à plusieurs questions : (i) nous déterminerons quelles bactéries sont potentiellement pro-carcinogènes et (ii) nous déterminerons si l'autophagie joue ou non un rôle dans ce processus.
Bénéfices attendus
Notre demande a pour objectif de pouvoir maintenir dans notre animalerie des souris Apc/Min et Apc/Min déficientes pour l'autophagie soit dans les cellules épithéliales intestinales soit dans la lignée myéloïde. Cette demande s'inscrit dans un projet qui a pour but de tester le pouvoir pro-carcinogène de diverses souches bactériennes (cette seconde partie faisant l'objet d'une demande spécifique d'autorisation APAFiS). Nous espérons ainsi identifier quelles sont les souches et éventuellement leurs toxines qui aggraveraient la pathologie et comprendre si l'autophagie est impliquée. Ainsi, sur le long terme, nos travaux pourraient permettre de comprendre comment les bactéries impactent le développement du cancer colorectal mais également d’identifier des bactéries à surveiller plus particulièrement chez les patients susceptibles de développer un cancer colorectal.
Procédures
Les animaux seront identifiés par un tatouage. Cette manipulation ne prend pas plus de 20 secondes. Une biopsie d'oreille sera prélevée de manière à effectué le génotypage. Cette manipulation ne prend pas plus de 20 secondes. Ces 2 interventions se feront sur animaux vigiles âgés de 20 jours maximum.
Impact sur les animaux
Les souris Apc/Min sont des souris mutantes (suite à une exposition à des radiations) qui développent spontanément des tumeurs intestinales. En règle générale, ces animaux développent en moyenne 2 tumeurs colorectales. Ces animaux peuvent vivre 5-6 mois sans être affectés par le développement des tumeurs. Ceci implique néanmoins un taux de renouvellement « élevé » des mâles reproducteurs. Ils serviront 1 fois à la reproduction puis seront mis à mort pour éviter toute souffrance due au développement de la tumeur. D’expérience ce renouvellement permanant des mâles Apc/Min reproducteurs prévient totalement la gêne/souffrance occasionnée par le développement tumoral. Cependant, nous suivrons attentivement les animaux et un système de score a été mis en place de manière à limiter au maximum la souffrance et définir des points limites (cf annexe).
Devenir
Cette demande vise à maintenir dans notre animalerie le modèle Apc/Min que nous utilisons dans des protocoles expérimentaux. Les mâles Apc/Min seront utilisés pour remplacer les anciens reproducteurs. Les souris sauvages seront mises à mort. Les femelles Apc/Min seront utilisées à des fins expérimentales.
Remplacement
Le but de cette demande s'inscrit dans une démarche visant à déterminer le pouvoir pro-carcinogène de souches bactériennes ainsi qu'une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeu (notamment l'autophagie). De manière à limiter au maximum l’utilisation d’animaux, les souches bactériennes potentiellement d’intérêt sont testées in vitro. Nous recherchons des signatures pouvant laisser penser à un effet pro-carcinogène et plus précisément les dommages dans l’ADN et/ou des modifications significatives du cycle cellulaire. Uniquement des souches validées pour ces paramètres seront testées chez l’animal. Le recours à l’animal reste nécessaire car il nous permet de valider si effectivement la bactérie favorise le développement du cancer colorectal et d'apprécier l'impact d'une autophagie fonctionnelle ou non sur le développement de la pathologie.
Réduction
Le nombre de cages de reproduction est réduit au maximum de manière à nous assurer le maintien de la lignée.
Raffinement
Le milieu sera enrichit à l’aide de maisons en carton ou en plastique. Les animaux ne seront jamais isolés et toujours en groupe. Lors des reproductions nous mettrons 1 mâle en présence de 2 femelles. Un suivi quotidien des animaux par des expérimentateurs habitués à ce modèle sera effectué de manière à repérer toute détresse animale. De plus, nous utilisons un système de score (présenté en annexe) dont les paramètres sont : l'apparence, le comportement naturel, l'hydratation, les signes cliniques, et le comportement provoqué.
Choix des espèces
L'étude du CCR en modèle animal se fait toujours sur des souris. Cependant, ces animaux ne développent pas spontanément de CCR. Deux grands modèles existent : -modèle génétique : mutation du gène Apc. C'est ce modèle que nous avons choisi car ces animaux présentent une mutation du gène Apc comme les patients, en faisant de ce fait un bon modèle. -modèle inflammatoire : AOM/DSS. Association d'un carcinogène (AOM) et d'un agent induisant une inflammation colique: le DSS. Ce modèle sert surtout pour mimer le développement d'un CCR chez les patients souffrant de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (une population à haut risque de développer un CCR). Pour la reproduction, nous utiliserons des animaux matures sexuellement. Les mâles Apc/Min seront sacrifiés après leur première reproduction de manière a éviter que le développement du cancer n'affecte leur bien être