Recherche fondamentale

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes sont rendues hypothyroïdiennes par un régime pauvre en iode, leurs portées adoptées par d'autres mères, puis les descendants sont exposés cinq jours à 4 °C ou soumis à un régime obésogène avec des tests de glycémie par incisions répétées de la queue. Le porteur indique qu'un échec d'adoption expose les nouveau-nés à la dénutrition et à l'hypothermie, et que l'exposition au froid comme l'obésité font perdre du poids. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut se substituer à l'étude de la communication mère-petits à l'échelle de "l'organisme entier".

Objectifs

Chez l’homme comme chez la souris, les hormones thyroïdiennes stimulent la dépense d’énergie. Les hormones thyroïdiennes agissent en particulier dans le tissu adipeux brun. Ce dernier est spécialisé dans la dissipation d’énergie et la production de chaleur. Chez la souris lors d’une exposition au froid mais aussi en réponse à un régime riche en graisse ce tissu est activé ce qui permet respectivement le maintien de la température corporelle et de limiter la prise de poids. Outre cet effet stimulateur de la dépense d’énergie chez l’adulte, les hormones thyroïdiennes sont présentes en forte concentration durant la période périnatale, pendant laquelles elles contrôlent le développement de nombreux organes, dont celui du tissu adipeux brun. La grossesse entraîne très fréquemment une baisse des concentrations sanguines d’hormones (hypothyroïdie). Si cette dernière est corrigée dans de nombreux pays, elle ne l’est pas en général dans les pays en voie de développement. La mère, mais aussi le fœtus/nouveau né, se retrouvent alors en hypothyroidie. Dans ce projet nous étudierons si une hypothyroïdie limitée à la période de développement du tissu adipeux brun chez l’embryon/nouveau né, impacte la capacité de ce tissu à produire de la chaleur lors d’une exposition au froid ou à un régime obésogène à l’âge adulte.

Bénéfices attendus

Les périodes fœtale et postnatale sont critiques pour déterminer les capacités métaboliques de l’adulte que ce soit chez l’homme mais aussi chez la souris. Les concentrations d’hormones thyroïdiennes sont fortement régulées pendant ces deux périodes et sont très importantes pour le développement de nombreux organes. Nous établirons ici si une hypothyroïdie précoce entraine une prédisposition à développer des anomalies métaboliques chez l’adulte. Si tel est le cas, une meilleure maîtrise de la concentration des hormones chez la mère et/ou le nouveau né permettrait non seulement de limiter les problèmes développementaux mais aussi d’assurer un équilibre métabolique chez l’adulte. Ceci est particulièrement important dans un contexte d’épidémie mondiale d’obésité et d’hypothyroïdie fœtale et postnatale mal contrôlées dans de nombreux pays.

Procédures

L’ensemble des animaux évoqués sont vigiles sauf indication contraire Dans une première expérience des femelles gestantes seront nourries pendant la gestation avec de la nourriture pauvre en iode contenant une molécule bloquant la production d’hormone thyroïdienne entraînant une « hypothyroïdie ». D’autres auront un régime contrôle. A la naissance, les portées des mères hypothyroïdiennes sont données à adopter à des mères normales et vice versa. Les mères hypothyroïdiennes sont maintenues sous leur régime spécial jusque 15 jrs après la naissance. Ensuite tous les animaux reçoivent un aliment normal jusqu’à leurs 2 mois. Ils sont alors injectés sous la peau (1 fois, 15s) pour introduire sous anesthésie gazeuse (1 fois, 5 mn) une puce éléctronique qui permettra de monitorer la température corporelle. Après 5 jrs de récupération, une partie des animaux est gardée à 23°C, l’autre hébergée pendant 5 jrs à 4°C. 2 injections en sous-cutanée sont réalisées à 30 mn d’intervalle avec un analgésique et un anesthésique (2 fois 15s) pour permettre le prélevement de sang terminal Dans une deuxième expérience des femelles gestantes seront nourries pendant la gestation avec de la nourriture pauvre en iode contenant une molécule bloquant la production d’hormone thyroïdienne entraînant une « hypothyroïdie ». D’autres recevront un régime contrôle. A la naissance, les portées des mères hypothyroïdiennes sont données à adopter à des mères normales et vice versa. Les mères hypothyroïdiennes sont maintenues sous leur régime spécial jusque 15 jrs après la naissance. Ensuite tous animaux reçoivent un aliment normal jusqu’à leurs 2 mois. Pour certains des animaux, le régime alimentaire normal sera remplacé par un régime obésogène pour 2 mois. Avant changement et à l’issue de ces 2 mois, toutes les souris seront soumises à un test pour mesurer leur capacité à utiliser du glucose administré en gavage (1 fois, 15 s). L’évolution de la glycémie sera mesurée 5 fois dans une goutte de sang issue d’une légère incision à la queue (1 incision, 5s par prélèvement). Après une semaine toutes les souris seront soumises à un autre test sanguin pour mesurer leur capacité à utiliser le glucose en réponse à une injection d’insuline dans la cavité abdominale (1 fois, 15 s). L’évolution de la glycémie sera mesurée comme après gavage au glucose. injections en sous-cutanée sont réalisées à 30 mn d’intervalle avec un analgésique et un anesthésique (2 fois 15s) pour permettre le prélevement de sang final

Impact sur les animaux

Après sevrage les mâles issus d’une même portée doivent être répartis dans les différents groupes expérimentaux (température ou nourriture), certains peuvent être isolés pendant une partie des expériences. En cas d’échec d’adoption les petits risquent d’être dénutris et en hypothermie Légères douleurs liées à différents types d’injection dans l’abdomen (glucose, insuline, anesthésique) ou au gavage Légères douleurs liées à la présente de la puce implantée sous la peau L’hypothyroïdie chez le nouveau né, et l’exposition au froid chez l’adulte peut entrainer une perte de poids Les prélèvements à la queue dans les tests de réponse au glucose et à l’insuline peuvent provoquer une douleur légère. Sous le régime obésogène les animaux peuvent prendre beaucoup de poids. Cette forte prise de poids peut s’accompagner de difficulter à se déplacer. Lors des tests de réponse à l’insuline, les souris peuvent se retrouver en hypoglycémie

Devenir

L’ensemble des animaux est mis à mort pour prélèvements des tissus à analyser

Remplacement

Aucun modèle in vitro ne peut se substituer au modèle animal pour ce type d'études physiologiques qui impliquent la communication entre la mère et ses petits, différents organes et des effets au cours du temps. Les mécanismes sont complexes et doivent être envisagés à l'échelle de l'organisme entier.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum pour permettre l’obtention de résultats significatifs. 8 animaux par condition expérimentale sont nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. En effet les effets de l’hypothyroïdie sont variables d’un animal à l’autre. De plus les points limites peuvent être atteints pour quelques animaux durant les expériences ce qui entraînent leur retrait de la procédure. Nous utiliserons donc 10 animaux par groupe pour prendre en compte ce risque. Nous ne répéterons pas les expériences si nous n’avons pas besoin de matériel supplémentaire. D’autre part, toutes les femelles gestantes que nous utilisons pour obtenir des petits ayant été exposés à une hypothyroïdie précoce ne seront pas commandées en même temps. Dès que le nombre de petits sera suffisant, les commandes seront arrêtées

Raffinement

Autant que possible, les animaux sont maintenus en groupes sociaux à deux ou trois animaux par cage pour limiter le stress. Si les animaux viennent à être séparés suite à des blessures, ou pour permettre la ventilation des animaux dans les différents groupes, on leur procurera un enrichissement supplémentaire dans leur cage. Nous veillerons au bien être et à la bonne santé des animaux tout au long des expériences, en leur effectuant des visites trois fois par semaine, en vérifiant leur poids, et observant que leur comportement soit normal. Des lotions antiseptiques seront appliquées en cas de blessure Lorsqu’une perturbation importante des animaux est attendue, comme la perte de poids lorsque les animaux sont hébergés à 4°C, la fréquence de la surveillance des animaux est augmentée à deux fois, voire trois fois par jour. La nourriture obésogène a tendance à rancir, elle est donc renouvelée deux fois par semaine. L’insuline peut faire chuter le taux de glucose sanguin. Lors des tests de tolérance à l’insuline, on veille à ce que ce taux ne descende pas en dessous d’un seuil critique. Si ce seuil est atteint l’animal est immédiatement injecté avec du glucose Des analgésiques et anesthésiques sont utilisés pour limiter la douleur lors de l’implantation de puces électroniques sous la peau et lors des prélèvements sanguins avant la mise à mort des souris.

Choix des espèces

Les rôles des hormones thyroïdiennes chez la souris sont très similaires à ceux chez l’homme. Chez ces deux espèces les hormones thyroïdiennes contrôlent le développement de nombreux organes et stimulent la dépense énergétique chez l’adulte. La souris est aussi le modèle le plus utilisé de nos jours pour le genre d’études que nous proposons (adoptions, effet du développement sur la physiologie de l’adulte) ce qui nous permet d’une part de comparer directement nos résultats à ceux obtenus par d’autres équipes de recherche et d’autre part de disposer du matériel nécessaire pour réaliser les expériences. Nous nous intéressons aux conséquences d’une hypothyroïdie précoce sur la capacité au maintien de la température et sur la prédisposion à l’obésité chez l’adulte. Nous travaillerons donc avec des femelles gestantes et étudierons leurs descendants jusqu’à l’âge de 2 ou 4 mois selon les expériences.

792 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent en intraveineuse une dose unique de candidats anticancéreux, subissent des prélèvements de sang répétés à la queue, puis un prélèvement terminal de grand volume par ponction cardiaque sous anesthésie "pouvant induire un arrêt cardiaque", les effets indésirables attendus allant de la perte d'appétit à la diarrhée. Le porteur précise que les souris écartées du protocole, trop légères ou mal injectées, servent d'abord à s'entraîner aux gestes techniques avant d'être tuées. Il affirme qu'un "organisme entier et vivant" est "nécessaire" pour ces analyses de tolérance.

Objectifs

Ce projet vise à déterminer la tolérance lors de l’administration des candidats de thérapie ciblée anticancéreuse. Les données de tolérance sont nécessaires afin d’analyser le comportement des candidats anticancéreux dans la circulation sanguine en dose unique. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats de tolérance (projet actuel), seront objectivables entre l’humain et le modèle souris et serviront, à terme, à définir les modalités d'administration du médicament (dose et fréquences), lors des premiers essais cliniques. Ils permettront également d’objectiver des évènements indésirables. La première dose de cette étude sera déterminée en se basant sur une dose de référence connue, efficace et bien tolérée.

Bénéfices attendus

Les données de tolérance seront nécessaires afin d’analyser le comportement des candidats anticancéreux dans la circulation sanguine. Ces études permettront de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité et ainsi, à terme, de déterminer les doses et les fréquences des premières études cliniques chez l’Homme.

Procédures

# Une contention et des prélèvement(s) sur animal vigile seront prévues sur chaque animal : -lors de l’injection par voie intraveineuse dans le veine de la queue des candidats anticancéreux J(0) (5minutes) -lors de chacun des prélèvements sanguins (en éraflant la veine de la queue pour ne prélever qu'une goutte de sang) à chaque temps (J(-3) , J(3) et J(9) post-traitement - 5 minutes). Une anesthésie générale sans réveil sera effectuée sur chaque animal en fin d’expérimentation et/ou atteignant les critères éthiques pour effectuer un prélevement sanguin final de grand volume, suivie d’une mise à mort (10 minutes).

Impact sur les animaux

# Les animaux subirons un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : (1) changes, (2) pesées, (3) contentions et (4) anesthésies. # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors : (1) de l’injection par voie intraveineuse des candidats anticancéreux (au temps J(0)), et (2) de chacun des prélèvements sanguins(en éraflant la veine de la queue pour ne prélever qu'une goutte de sang) à chaque temps (J(-3) , J(3) et J(9) post-traitement). # S’agissant d’une expérience de tolérance, les composés de la classe thérapeutique utilisée peuvent induire des évènements indésirables à haute dose (parmi les plus attendus : perte d’appétit, fatigue, diarrhées, perte de cheveux…), pouvant aller jusqu'à l'atteinte des critères ethiques. Il est à noter que ces effets sont généralement transitoires (environ une semaine pour les doses les plus fortes et culminant autour du 3ème jour post-traitement). # Un prélevement sanguin final de grand volume, pouvant induire un arrêt cardiaque, sera pratiquée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil sur l’ensemble des animaux arrivant en fin d’expérience (à 28 jours post-traitement) ou en cas d'atteinte des critères éthiques.

Devenir

L’ensemble des animaux entrés en procédure seront euthanasié : - Tous les animaux ayant atteint les critères éthiques ainsi que les animaux arrivant en fin d’expérience à 28 jours post-traitement auront un prélèvement sanguin de grand volume (par piqure dans le coeur) effectuée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil. - Les animaux ayant atteint les critères éthiques et dont l’état ne permet pas de pratiquer ce prélèvement de grand volume , seront mises à mort par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse. - Les souris non entrées en protocole (problème à l'injection, poids inférieur à 24g...), seront reformées pour pouvoir pratiquer des entrainement aux geste techniques, puis mises à mort par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse.

Remplacement

S’agissant d’analyses de tolérance, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. De plus, les candidats médicaments de thérapie ciblée anticancéreuse étudiés dans ce projet ayant une efficacité comparable entre humains/souris aucune alternative ne peut se substituer à un modèle souris.

Réduction

Le procédé de micro-échantillonnage lors des prélèvements sanguins permet d’obtenir l’ensemble des valeurs pour un même animal en ne lui prenant que de très faibles quantités de sang. Le nombre d’animaux utilisés est ainsi considérablement réduit par rapport à un prélèvement sanguin classique et les variations inter-individus seront également mieux maîtrisées. En cas d’obtention de la dose maximum tolérée, les animaux prévus pour les doses suivantes seront annulés. Les animaux étant livrés chaque semaine pour les différents tests de dose, cela permettra de diminuer le nombre d’animaux entrés en protocole. Pas d’utilisation de groupe contrôle nécessaire par rapport aux échantillonnages de par l’utilisation d’un prélèvement sur les souris en expérience à J(-3) avant traitement par les candidats anticancéreux (permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux).

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et un enrichissement de l’environnement (coton pour nidification, tunnels, bâtons à ronger, ou équivalents). Avant la mise en place du protocole, les souris seront acclimatées pendant une période d’une semaine afin de limiter leur stress. Chaque essai de dose sera séparé du précédent d’une semaine, ce qui permettra d’ajuster au mieux les doses (ainsi que la souffrance résultant d’utilisation de doses trop élevées). Une surveillance comportementale et physiologique poussée des animaux ainsi que la définition d’une grille de score adaptée et suffisamment prédictive permettra d’anticiper et d’éviter au mieux toute souffrance animale. Les animaux seront observés sur critères physiques et comportementaux deux fois par jour pendant les trois premiers jours de traitement, puis une fois par jour jusqu’à la fin de l’expérience à J(28), et seront pesés une fois par jour pendant la première semaine, puis trois fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience à J(28). Un système de surveillance est mis en place au sein de l'établissement utilisateur pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue le week-end et les jours fériés. Les animaux inclus dans la grille de score n'atteignant pas les critères éthiques de mise à mort recevront des soins adaptés (alimentation et abreuvement facilités, réchauffement...). Une pommade antalgique/anesthésique pourra également être utilisée en cas d’inflammation au site d’injection. Le prélèvement sanguin final de grand volume (par piqure dans le coeur) sera effectuée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil et les prélèvements d’organes seront réalisés après la mort de l'animal.

Choix des espèces

S’agissant d’analyses de tolérance, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. De plus, les candidats médicaments de thérapie ciblée anticancéreuse étudiés dans ce projet ayant une efficacité comparable entre humains/souris, aucune alternative ne peut se substituer à un modèle souris. La souris est une espèce animale à la fois petite et bien caractérisée pour ces études. En plus, les données d’efficacité anticancéreuses et de pharmacocinétique (le devenir du médicament dans le sang au cours du temps) seront générées sur cette même espèce animale afin de déterminer au mieux les doses et les fréquences d'administration de ces candidats médicaments de thérapie ciblée anticancéreuse chez l'Homme.. Les animaux seront livrés à 7 semaines de développement et inclus en expérience à 8 semaines . A cet âge-là, les animaux sont adultes avec un système immunitaire et des organes matures permettant une tolérance pertinente par rapport au type de thérapies utilisées dans ce projet.

24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Privées de système immunitaire, elles reçoivent sous anesthésie un tatouage puis des injections intradermiques de mélanocytes humains, avant un suivi photographique de la pigmentation puis leur mise à mort à deux et quatre semaines pour prélever la peau. Cette étude pilote vise seulement à fixer le nombre de cellules à injecter en vue de futurs essais sur un modèle de vitiligo, maladie décrite comme "bénigne" mais lourde psychologiquement. Le porteur affirme que le remplacement "n'est pas envisageable" car aucun modèle in vitro ne suivrait la fonctionnalité des mélanocytes dans le temps.

Objectifs

Les objectifs de ce projet constituant une étude pilote, sont d’évaluer in vivo chez la souris l’évolution de la pigmentation cutanée au cours du temps suite à l’injection intradermique de différentes quantités de cellules responsables de la pigmentation cutanée appelées mélanocytes. Il s’agit d’un nouveau produit de thérapie innovante en cours de développement qui utilise des mélanocytes obtenus par différenciation de cellules souches humaines. Ce nouveau produit permettrait de repigmenter des zones cutanées dans le cadre d’une maladie appelée vitiligo au cours de laquelle des taches blanches, parfois des poils blancs, apparaissent sur la peau. Pour effectuer l’évaluation de ce nouveau produit de thérapie innovante, une suspension de mélanocytes à différentes concentrations, sera injectée en différents points dans une zone préalablement délimitée par tatouage sur des souris immunodéficientes, c’est à dire dépourvues d’un système immunitaire fonctionnel, afin d’éviter tout rejet. Un suivi de la pigmentation cutanée sera effectué de façon hebdomadaire à l’aide d'une caméra. Des prélèvements des sites d’injection des mélanocytes seront effectués à 2 temps différents mais relativement précoces après injection des mélanocytes humains afin de réaliser des analyses qui permettront de caractériser la présence et la fonctionnalité des mélanocytes. Cela permettra notamment de définir le nombre de mélanocytes à injecter dans le cadre d’études d’efficacité futures sur un modèle de vitiligo.

Bénéfices attendus

Le vitiligo est une maladie auto-immune, liée à un dysfonctionnement du système immunitaire, au cours de laquelle des taches blanches (parfois des poils blancs) apparaissent sur la peau. Elle concerne 0,5 à 1,0 % de la population mondiale selon des données de 2017. Ces dépigmentations peuvent survenir à n’importe quel moment de la vie, n’importe quel âge, et quelle que soit la couleur de la peau. Bien qu’il soit considéré comme une maladie bénigne, le vitiligo n’est pas anodin : il a des répercussions psychologiques importantes qui peuvent altérer la qualité de vie des personnes qui en souffrent (dépression, angoisse, isolement…). Des traitements existent, à base de crèmes, en association ou non avec un traitement par la lumière (photothérapie), traitements par voie orale ou sous-cutanée, mais la repigmentation est un phénomène long, 6 à 24 mois de traitement sont nécessaires pour obtenir des résultats satisfaisants, avec des effets secondaires plus ou moins importants, et une récidive dans 40 à 50% des cas. La greffe de mélanocytes provenant du patient lui-même est une solution mais elle nécessite de prélever de la peau dans une zone pigmentée, engendrant la création de cicatrices pouvant elles-mêmes être peu ou pas pigmentées. Il est donc important et nécessaire de développer de nouvelles thérapies permettant de traiter et de repigmenter plus rapidement les zones atteintes de dépigmentation, d’en évaluer la fonctionnalité et la stabilité au cours du temps par des approches simples et sur des modèles expérimentaux représentatifs de la pathologie humaine. Ces nouvelles thérapies pourront ainsi être évaluées par la suite chez l’Homme et elles permettront d’améliorer la prise en charge et la qualité de vie de personnes atteintes de vitiligo.

Procédures

Les 24 souris nécessaires à la réalisation de ce projet seront tout d’abord soumises à un tatouage de 4 points effectués sur le dos en arrière des omoplates, sous anesthésie générale, réalisés en 10 minutes environ. Une semaine plus tard, les 24 souris seront soumises chacune à 4 injections dans la peau de cellules responsables de la pigmentation cutanée ou du milieu dans lequel elles seront mises en suspension, à l’intérieur de la région délimitée par les 4 points de tatouage. Ces injections seront réalisées sous anesthésie générale, en 10 minutes environ. Pour chaque souris, les sites d’injection seront observés et photographiés chaque semaine afin de suivre l’évolution de la pigmentation cutanée au cours du temps. Ces observations et photographies seront effectuées sous anesthésie générale, en 5 à 10 minutes environ.

Impact sur les animaux

La douleur induite lors de la réalisation des points de tatouage puis des injections intradermiques des mélanocytes sera très limitée du fait de leur exécution sous anesthésie générale en un temps relativement court (moins de 10 minutes). Le suivi de l’évolution de la pigmentation cutanée effectué de façon hebdomadaire au cours de l’étude, nécessitant la mise sous anesthésie générale afin de positionner correctement la caméra au niveau de la région délimitée par les 4 points de tatouage, n’engendrera pas de douleur et sera réalisé en un temps très court (5 à 10 minutes environ). Un suivi quotidien du comportement des animaux et régulier de leur évolution pondérale sera effectué tout au long de l’étude mais aucune modification comportementale notoire et aucune perte de poids significative ne sont attendues.

Devenir

Les 24 souris seront euthanasiées pour moitié 2 semaines après injections dans la peau de cellules responsables de la pigmentation cutanée ou du milieu dans lequel elles seront mises en suspension, et pour l’autre moitié au bout de 4 semaines, avec 3 souris de chacun des 4 groupes expérimentaux par temps de prélèvement, par injection d’une surdose d’euthanasique sous anesthésie générale profonde. Un prélèvement sera effectué au large des sites d’injections pour la réalisation d’analyses qui permettront de caractériser la fonctionnalité des cellules injectées au cours du temps.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de caractériser sur un temps prolongé la fonctionnalité de mélanocytes injectés, processus dépendant de mécanismes complexes (influence du microenvironnement cutané et réaction immunitaire). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet constituant une étude pilote mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. La réalisation de 4 sites d’injection intradermique par souris permet de limiter le nombre d’animaux nécessaires mais de fournir suffisamment d’échantillons par temps de mesure pour la réalisation des analyses envisagées. Une analyse statistique sera réalisée à partir des résultats des analyses effectuées.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux suite à la réalisation des points de tatouage, des injections intradermiques et des prises de photos hebdomadaires avec la caméra, effectuées sous anesthésie gazeuse. Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré deux fois par semaine, et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal atteint est observée, ou si des signes d’infection des sites d’injection ou des modifications du comportement des animaux sont observés (cachexie, vocalises, convulsions…), ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les souris seront placées par 2 dans des cages de 18.9x29.6x12.8 cm équipées d’un couvercle filtrant dans une animalerie dédiée au souris immunodéficientes. Elles seront maintenues en cycle de lumière inversé pour observer leur comportement pendant leur phase active et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie), des bâtonnets d’ouate étant placés dans leur cage comme enrichissement pour assurer leur bien-être, remplacés lors de chaque change de litière. De la nourriture irradiée et de l’eau filtrée seront mises à disposition pour chaque cage.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant la réalisation d’injections intradermiques. D’autre part, l’utilisation de souris immunodéficientes, très peu pigmentées, permettra d’éviter le rejet des mélanocytes humains injectés. Les animaux seront des souris âgées de 6 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris classiquement décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études de greffes cutanées (généralement 6 à 8 semaines), l’injection intradermique de mélanocytes humains étant considérée comme une greffe cutanée.

5 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis renvoyées vivantes à l'animalerie des clients ou collaborateurs via un transporteur. Elles arrivent porteuses de tumeurs greffées par des tiers et reçoivent une à dix séances de radiothérapie sous anesthésie gazeuse, l'établissement facturant ces irradiations comme une prestation de service à des sociétés privées ou des collaborateurs. Le porteur affirme qu'aucun effet secondaire n'est attendu de la radiothérapie et que la douleur ne justifie pas d'analgésique, tout en prévoyant la mise à mort des souris qui se dégraderaient. Sur le remplacement, il conclut que l'étude des médicaments ne peut se passer d'un "organisme entier" aux fonctions physiologiques intactes.

Objectifs

L’objectif des projets nécessitant de la radiothérapie (RT) préclinique est de développer l’association de la RT avec des traitements anticancéreux de types chimiothérapie, thérapie ciblée, nano médicaments ou encore immunothérapie. Ces projets nécessitent d’optimiser les schémas d’association (administrations simultanés ou en décallé, et dans ce cas optimiser l'ordre d'administration) et les fractionnements (dose et nombre de séances) optimums de la RT afin de pouvoir proposer en essai clinique des schémas d’associations les plus efficaces. Notre équipe possède un appareil de RT 3D guidée par l’image permettant de délivrer des traitements par RT similaires à ceux délivrés pour les patients. Ce type d’installation et de savoir-faire restent rares sur notre territoire Français et unique dans un rayon de 200km autour de notre établissement. C’est pourquoi des collaborateurs ou sociétés privées, évaluant ce type de combinaisons, font appel à nos services pour délivrer des traitements de RT sur leur souris. Ce projet concerne donc exclusivement le traitement par radiothérapie qui sera délivré pour nos clients ou collaborateur. Ces éances de radiothérapie sont réalisées sur des souris anesthésiés (anesthésie gazeuse) afin d'éviter les mouvements durant le traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de développer et optimiser de nouvelles combinaisons et sera une base solide pour le développement d’essais cliniques.

Procédures

Les animaux seront traités par Radiothérapie externe (+/- imagerie par scanner pour des technique complexe de radiothérapie), sous anesthésie gazeusev(Isoflurane 2.5%). Ces séances pourront durer entre 5 minutes et 50 minutes selon la technique utilisée. Les animaux pourront recevoir de 1 à 10 séances de radiothérapie.

Impact sur les animaux

Les tumeurs formées par certianstypes de cellules peuvent former des nécroses en surface. En cas d’apparition de nécrose rune évaluation de potentielle de douleur sera réalisée par palpation de la tumeur nécrosée. Aucun effet secondaire ou nuisance dû à la Radiothérapie n’est attendu.

Devenir

Tous les animaux seront renvoyés à l’animalerie d’origine des collaborateurs / clients à l’issue de la procédure via un transporteur spécialisé.

Remplacement

L’étude de l’efficacité des médicaments ou des nanoparticules ne peut se passer d’un organisme entier avec ses fonctions physiologiques intactes et donc d’étude sur animaux. De plus, pour l’étude d’association avec des immunothérapies nécessites l’étude sur des animaux présentant un système immunitaire efficace. Enfin, il est largement décrit dans la littérature que l’effet de la radiothérapie dépend du niveau d’oxygénation (hétérogène uniquement en clinique et sur le modèle animal) et du microenvironnement tumoral composé à la fois de cellules cancéreuses, de cellules immunitaires, de fibroblastes, collagène et vaisseaux sanguins. Le REMPLACEMENT des animaux est donc impossible pour ces études. Toutefois des études préalables de l'activité des molécules d’intérêts sur culture cellulaire permettront de s’affranchir de l’utilisation d’animaux non justifiée (REMPLACEMENT).

Réduction

Les effectifs des animaux qui seront irradiés seront calculés et justifiés dans les DAPs de nos collaborateurs/clients. Ceux-ci seront calculés en fonctions des souches d’animaux utilisés, modèles tumoraux et des efficacités attendues de leurs combinaisons.

Raffinement

La totalité de la procédure expérimentale sera réalisée sous anesthésie isoflurane afin maintenir les animaux immobile et de réduire leur niveau de stress. La douleur associée à cette procédure ne nécessitera donc pas l’emploi d’analgésique. Après une séance de RT, les animaux sont réveillés sous lampe chauffante pour prévenir toute hypothermie puis replacés dans leur cage. Si besoin (cas de traitement par plusieurs séances de RT avec un les animaux pourront être hébergés dans notre animalerie afin de limiter le stress induit par les transports. Sinon les animaux, hébergés dans leur cage d'origine, avec les mêmes congénères, retourneront à l'animalerie des collaborateurs via un transporteur spécialisé, garantissant le maintien d'une tempéraure stable. Le trajet dure entre 5 minutes et 15 minutes. Dans le cas d'un hébergement dans notre animalerie, les souris seront maintenues dans des cages de 8-10 individus en présence d’enrichissement. Aucune toxicité n’est attendue suite à la RT délivrée. Cependant si des signes de douleur sont observés (animal prostré, perte d’orientation, perte de poids …), les animaux seront mis à mort après anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

La petite taille des souris, leur grande fécondité, leur coût de production et d’entretien relativement peu élevé en font un animal de choix pour les laboratoires. De plus, le modèle murin est parfaitement approprié car les expérimentations in vitro ne permettent pas de simuler la complexité d’un organisme, notamment dans les études impliquant l’activation du système immunitaire. En oncologie, la plupart des modèles expérimentaux de cancers humains sont développés chez la souris. Dans le cas d’étude avec de l’immunothérapie, la souris porteuse de tumeurs syngéniques reste le modèle de choix dans les études de l’activation du système immunitaire anti-tumoral. La prise tumorale dans des souris avec un fonds génétique stable et homogène permet de travailler avec un nombre d’animaux relativement réduit et de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Les animaux seront utilisés à l’âge déterminé par l’équipe qui greffe les tumeurs (âge dépendant du modèle, de la nécessité ou non d’avoir un système immunitaire mature…)