Recherche fondamentale

484 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur implante des fibres optiques ou des électrodes dans leur cerveau lors d'une chirurgie d'une heure et demie, puis les soumet à une restriction alimentaire les maintenant à 90-95 % de leur poids pendant jusqu'à quatre mois pour les motiver à une tâche comportementale. Il présente cette faim imposée comme n'affectant que "très peu" le bien-être des animaux non-humains, tout en la décrivant comme le ressort de leur motivation. Ce projet fondamental cartographie des circuits de la prise de décision, avec une "perspective translationnelle" vers les pathologies mentales, et le porteur affirme que seuls des "organismes entiers" permettent d'en étudier les bases neuronales.

Objectifs

La prise de décision est un processus essentiel du comportement humain. Ce processus complexe nécessite d’apprendre de son environnement afin d’emmagasiner des connaissances mais également de s’adapter aux changements. Une prise de décision adaptée nécessite ainsi un équilibre entre les comportements d’exploitation (utilisation des connaissances acquises) et d’exploration (recherche d’options plus favorables) qui peuvent être fidèlement modélisés chez le rat afin d’en établir les bases neurales. Le projet vise à étudier les circuits cérébraux qui permettent une prise de décision adaptée dans un environnement changeant chez le rat. Nous souhaitons dans ce projet étudier la connectivité de plusieurs régions connues pour être impliquées dans la prise de décision mais dont le rôle précis n’est pas connu. Dans un premier temps nous réaliserons une étude descriptive de la connectivité entre ces différentes régions, puis nous testerons leur implication fonctionnelle en procédant à une déconnexion ou une activation réversible, afin de déterminer leur rôle précis.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de préciser la connectivité des différentes régions impliquées dans la prise de décision ainsi que de préciser leur rôle . Une hypothèse majeure actuelle est que la prise de décision maladaptive qui caractérise un grand nombre de pathologies mentales est associée à un syndrôme de dysconnectivité de ces régions, ce projet fondamental a donc une claire perspective translationnelle.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie d’injection intra cérébrale de composés et d’implantation à demeure de fibre optique ou d’électrode d’enregistrement d’une durée maximale d’une heure et demie. Ils seront soumis également à une restriction légère d’accès à la nourriture (rationnement afin de conserver 90-95% de leur poids initial) qui durera maximum 4 mois ainsi qu'à une tâche comportementale dont les sessions durent entre 20mn et 1h15 par jour pour une durée maximale de 4 mois.

Impact sur les animaux

Les chirurgies d’injection intra cérébrale de composés et d’implantation de fibres ou d’électrodes présentent un risque de diminution du bien-être animal dans les moments/jours qui suivent la chirurgie (inconfort, fatigue et parfois douleur). Afin de garantir la motivation des animaux pour la tâche comportementale ils seront mis en restriction alimentaire légère (90-95% de poids corporel) ce qui impacte très peu leur bien-être (légère sensation de faim garantissant la motivation des animaux à obtenir une récompense alimentaire).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Elucider les bases neuronales de fonctions cognitives ne peut, par définition, s’étudier que chez des organismes entiers. L’approche cognitive chez l’homme n’autorise pas la manipulation fine des circuits neuronaux qui est nécessaire à la compréhension de leur fonctionnement. De même, l’approche neurocomputationnelle faisant appel à la modélisation est utile mais reste complémentaire des approches interventionnelles in vivo qui permettent de valider la véracité des modèles prédictifs.

Réduction

Nous cherchons à utiliser le nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des données exploitables lors de l'utilisation des tests statistiques. Le recours à des méthodes réversibles permet de diminuer le nombre d’animaux nécessaire. De plus, nous effectuerons les différentes procédures dans un ordre logique permettant de ne pas réaliser les expérimentations sur les voies n’ayant pas été validées par les procédures précédentes, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Le bien-être animal étant essentiel pour garantir des données comportementales exploitables, toute souffrance sera évitée. Les animaux bénéficieront d’un enrichissement adapté (matériel de nidification, tunnel et barre à ronger) et seront hébergés en cage collective, même après les chirurgies. Les protocoles de chirurgie ont été optimisés afin de garantir des conditions optimales (analgésie centrale, locale, gel oculaire, tapis chauffant, scoring post-opératoire). Des points limites généraux et spécifiques ont été identifiés afin de permettre une prise en charge optimale de la douleur et de l’inconfort.

Choix des espèces

D’une façon générale les rongeurs sont un bon modèle d’étude du système nerveux. Les principes fonctionnels à l’œuvre dans ces circuits sont transposables à l'homme. De plus de nombreuses épreuves comportementales spécifiques permettent de modéliser chez le rat des aptitudes cognitives complexes. Les animaux utilisés pour ce projet seront des jeunes adultes âgés d’environ 3 mois au début des expériences afin de limiter la variabilité de taille.

1 215 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur les immunise quatre fois par voie nasale ou intramusculaire contre des virus respiratoires comme le SARS-CoV-2, la grippe ou le VRS, avec des prélèvements répétés de sang, de fèces et de sécrétions vaginales. Il décrit une hausse de température, une baisse d'activité et une inflammation possible au site d'injection, puis une mise à mort pour prélever poumons, tissu nasal et rate. Ce projet mesure seulement l'immunogénicité des formulations, la protection devant être testée ensuite sur d'autres animaux, et le porteur affirme que seul un "organisme entier" permet ces observations.

Objectifs

L’objectif est d’évaluer l’immunogénicité de formulations vaccinales contre des pathogènes respiratoires administrées par voie intranasale chez la souris.

Bénéfices attendus

Les vaccins contre les virus respiratoires sont actuellement peu efficaces pour induire une réponse immunitaire dans les tissus respiratoires qui permette une protection à long-terme contre les infections. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies vaccinales contre les virus respiratoires. Ce projet permettra de mettre en place de nouvelles formulations vaccinales administrées par voie intranasale qui induisent de fortes réponses immunitaires dans les tissus respiratoires, dont des réponses résidentes mémoire, et systémiques contre des virus respiratoires tels que SARS-CoV-2, influenza ou RSV. Ces données d’immunogénicité générées dans ce projet sont essentielles pour ensuite tester la protection induite par les formulations les plus prometteuses dans d’autres modèles de souris ou rongeurs. De plus, ce projet permettra d’apporter des nouvelles connaissances sur le développement des réponses résidentes mémoire au niveau des muqueuses. Il existe à ce jour peu d’adjuvants qui ont été testés pour l’induction des réponses mémoire. Les études d’immunogénicité sont très souvent concentrées sur les réponses IgA au niveau des muqueuses uniquement.

Procédures

1) Le marquage des souris sera réalisé à leur arrivée. 2) Les souris seront immunisées par voie intranasale (douleur modérée) sous anésthesie par isoflurane et/ou par voie intramusculaire (douleur modérée) dans le muscle d’une cuisse et sous anesthésie par isoflurane aussi. En tout, il y aura 4 immunisations soit par voie intranasale ou par voie intramusculaire. 3) Le prélèvement de sang en sous mandibulaire est un geste qui dure 30 secondes quand il est réalisé par une personne expérimentée. Ce geste sera réalisé avant chaque immunisation et avant la mise à mort sur souris vigile: 5 fois au total. 4) Les souris isolées pour le prélèvement des fèces seront maintenues dans des boîtes qui n’entravent pas leurs mouvements jusqu’à récupérer suffisamment de fèces, et ne seront pas gardées au-delà de 20 minutes dans ces boîtes. Le prélèvement se déroulera avant chaque immunisation et avant la mise à mort sur souris vigile: 5 fois au total. 5) Des prélèvements vaginaux (douleur légère) durent environ 5 min quand c'est réalisé par une personne expérimentée. Ce geste sera réalisé avant chaque immunisation et avant la mise à mort sur souris vigile: 5 fois au total. 6) Une injection intraveineuse avec un anticorps sera réalisée 3-5 minutes avant la mise à mort. Cette injection se fera à l’aide d’un tunnel fixé à la paillasse. La queue sera légèrement chauffée avec de l’eau à 37 degrés durant 2 minutes. Ensuite, la queue sera rapidement désinfectée et l’anticorps sera injecté. Cette injection sera réalisée sur souris vigile une fois avant la mise à mort. Tous les animaux subiront ces techniques sur une durée totale de 7 semaines.

Impact sur les animaux

Des effets indésirables peuvent survenir chez les souris après la vaccination comme une augmentation de la température du corps et une diminution de l’activité ainsi que du poids. Si une administration par voie intramusculaire est réalisée, une inflammation au site d’administration peut aussi survenir.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever des organes (poumons, tissu lymphoide nasal, rate) et des fluides muqueux comme les lavages bronchoalvéolaires et nasaux. Ces prélévements permettront d’analyser les réponses anticorps et cellulaires post-vaccination.

Remplacement

Le passage intra muqueux des antigènes avec ou sans vecteur sera aussi étudié dans des modèles in vitro de tissus respiratoires afin de sélectionner les antigènes les plus prometteurs. Cependant, il n’existe pas de méthode in vitro pour tester l’efficacité des adjuvants à induire des réponses adaptatives spécifiques. Les analyses in vitro ne permettent pas d’analyser l’effet de différentes formulations vaccinales sur les réponses immunitaires humorales et cellulaires dont les réponses mémoire. Seule l’utilisation d’un modèle animal permet d'observer ces effets sur un organisme entier.

Réduction

Le design des expériences sera optimisé afin de minimiser le nombre de souris utilisé dans les groupes contrôles. Lors de chaque expérience, nous inclurons donc le maximum de groupes expérimentaux pour un groupe contrôle, tout en se veillant que les expériences restent réalisables par les expérimentateurs vu le nombre d’analyses qui sera effectué et que ce soit robuste statistiqument. La répétition des expériences sera réalisée au maximum trois fois lorsque des résultats positifs seront observés dans un ou plusieurs groupes expérimentaux par rapport au groupe contrôle. Les résultats positifs sont définis comme des réponses immunitaires significativement plus élevées dans le groupe experimental que dans le groupe contrôle.

Raffinement

Les souris seront observées dans les heures suivant l’administration de la formulation vaccinale (examen à 3h, 24h, 48h et 72h) pour vérifier qu’il n’y ait pas d’installation d’un état de prostration et l’absence de douleur au site d’administration du vaccin par voie intramusculaire (difficulté à se déplacer, voire boitement, sensibilité importante au toucher des sites d’injection manifesté par un vif retrait de la patte). La température corporelle et le poids des souris seront suivis après chaque immunisation aux temps indiqués ci-dessus. L’immobilité, la prostration, l’apathie, une inflammation excessive au niveau des sites d’injection et/ou de prélèvements, ainsi qu’une perte de poids de plus de 20% du poids avant immunisation, seront considérées comme critères de points limites qui conduiront à la mise à mort immédiate de l’animal par dislocation cervicale. Etant donné que l’on analyse des réponses immunitaires post-vaccination, nous ne pouvons pas donner d’analgésiques ou anti-inflammatoires qui pourraient perturber les réponses immunitaires naturelles des souris.

Choix des espèces

La souris est le modèle le mieux adapté pour évaluer les réponses immunitaires spécifiques à un candidat vaccin. Nous avons sélectionné le modèle de souris C57BL/6 qui génère de bonnes réponses anticorps mais aussi de fortes réponses cellulaires étant donné que notre but est d'étudier les réponses cellulaires mémoire. De plus, les modèles de souris qui nous permettront dans le futur de tester la protection de nos formulations vaccinales prometteuses seront dans cette meme lignée de souris. Cependant, il reste nécessaire de confirmer l’immunogénicité de notre formulation qui donne les résultats les plus prometteurs dans une autre lignée et nous avons aussi sélectionné le modèle BALB/c qui génère globalement de fortes réponses immunitaires. Les experiences d’immunogénicité seront réalisées avec des souris agées entre 7 semaines et 6 mois car avant 7 semaines les souris ne disposent pas d’un système immunitaire complétement developpé et après 6 mois la réponse immunitaire risque d’être altérée. Etant donné qu’il a été démontré que l’âge pouvait avoir un impact sur les réponses immunitaires post-vaccination, certaines expériences d’immunogénicité avec la formulation la plus prometteuse chez les jeunes souris sera répétée chez des souris de plus de 2 ans.

760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris génétiquement modifiées développent des lésions de la protéine Tau et une neurodégénérescence, avec des difficultés de mobilité, et reçoivent une instillation nasale de peptides cinq jours par semaine pendant environ six mois. Le porteur les tue ensuite pour prélever sang et cerveau et évaluer l'effet des peptides sur la maladie d'Alzheimer. Il souligne le coût social de la maladie et l'échec des essais cliniques passés et présente les peptides comme de "potentiels agents thérapeutiques" sur la seule base de travaux préliminaires in vitro.

Objectifs

A ce jour 260 millions de citoyens européens souffrent de troubles cérébraux. La maladie d'Alzheimer (MA) représente la forme la plus fréquente de démence cérébrale. Selon les prévisions épidémiologiques, avec le vieillissement de la population, cette maladie devrait toucher 14 millions d'Européens d'ici à 2040 et coûter environ 140 milliards d'euros en soins par an, faisant de cette maladie un véritable enjeu de santé publique. En dépit des recherches intensives menées depuis plusieurs années, la maladie d’Alzheimer demeure à ce jour incurable. Seuls des traitements symptomatiques sont disponibles. La recherche de thérapies efficaces et spécifiques de la MA est donc un objectif clinique majeur. Cette pathologie se caractérise par la mort progressive des neurones causée par l'accumulation anormale de deux protéines dans le cerveau: le peptide Amyloïde β (Aβ) et la protéine Tau. En s’agrégeant ils forment des lésions cérébrales caractéristiques : (i) des dépôts de plaques amyloïdes de Aβ à l'extérieur des neurones, et (ii) des enchevêtrements de fibres de Tau à l'intérieur des neurones. Jusqu'à présent, il n'existe pas de traitement curatif prouvé pour la MA. Les essais cliniques ciblant ces deux protéines suscitent beaucoup d'espoir mais ne se sont pas révélés concluants. Un essai clinique européen de phase 2 par immunothérapie ciblant les formes pathologiques de la protéine Tau a démontré un ralentissement de la pathologie et une diminution des troubles cognitifs uniquement chez les patients pré-symptomatiques. Ainsi, les stratégies visant à bloquer l'agrégation de la protéine Tau semblent prometteuses pour ralentir la maladie, ou être utilisées en thérapie préventive. Ce projet propose de développer des peptides pour traiter la maladie, ces peptides agiraient spécifiquement sur l’agrégation anormale de la protéine Tau. L'analyse in vitro d’une quarantaine de peptides présélectionnés a permis d'isoler une douzaine de candidats potentiellement adaptés au diagnostic et d’envisager leur utilisation pour la thérapie. Dans ce projet nous proposons de tester quatre de ces peptides seuls ou en combinaison sur le développement de la pathologie dans un modèle de souris de la maladie d’Alzheimer (MA).

Bénéfices attendus

Des travaux préliminaires, in vitro, indiquent que les peptides générés ont un fort potentiel bloquant sur l’agrégation anormale de la protéine Tausont de forts inhibiteurs de la fibrillation de la protéine Tau, ce qui en faitfaisant d’eux de potentiels agents thérapeutiques pour la maladie d’Alzheimer.

Procédures

Entre le 1er et le 7ème mois, les souris seront traitées par instillation nasale (5 min par souris), 5 fois par semaine. A la fin de l’expérimentation, les souris seront soumises à, un prélèvement de sang (durée 5 min) sous anesthésie avant euthanasie

Impact sur les animaux

Cette étude utilise un modèle murin de la MA basé sur une mutation de la protéine Tau, entrainant l’agrégation anormale de la forme mutée de Tau à l’origine de la mort progressive des neurones.ce qui entraine une neurodégénérescence . Les études rapportent que la mort neuronale s’effectue dans les régions du tronc cérébral, zone de passage de nombreuses voies motrices et sensitives. Des difficultés de mobilités apparaissent donc au cours du développement de la maladie. Le traitement par les peptides thérapeutiques par voie intranasale est moins invasif que par injection. Cette méthode va toutefois nécessiter une période d’habituation à la manipulation des souris pour qu’elles soient le moins stressées possible lors de l’administration des peptides.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasié afin de récolter (i) des échantillons sanguins pour faire des dosages des marqueurs utilisés pour diagnostiquer la maladie d’Alzheimer et (ii) les cerveaux afin de faire des études immunohistologiques pour évaluer le potentiel des peptides à limiter le développement de la pathologie

Remplacement

Des études in vitro ont permis de sélectionner des peptides pouvant bloquer la formation de fibres amyloïdes Tau, comme retrouvées dans les cerveaux de patients malades de la maladie d’Alzheimer. Ces peptides sont développés à des fins thérapeutiques. Pour cela ils ont été précédemment testés sur des cellules représentatives du tissu cérébral pour étudier leur innocuité vis-à-vis de ces cellules et leur biodisponibilité cellulaire. De plus, afin d’étudier les mécanismes d’action de ces peptides sur la formation des fibres Tau, des études vont être menées sur des cellules qui reproduiront les lésions Tau caractéristiques décrites chez les patients. Ces étapes indispensables nous permettent de définir les caractéristiques et de sélectionner quels sont les meilleurs candidats pour bloquer la formation des agrégats toxiques de Tau sous forme de fibres. Toutefois, afin de définir l’efficacité réel d’un potentiel traitement de la maladie d’Alzheimer (sur l’apparition et la progression des lésions pathologiques au sein du cerveau) avec tel ou tel peptide, il est nécessaire de faire ces tests chez l’animal qui va développer la pathologie au cours du temps et dans son contexte biologique, qui est le cerveau. L’efficacité d’un traitement thérapeutique doit être éprouvé dans un organisme vivant au vu de la complexité de l’apparition et de la progression de la MA.

Réduction

Une étude du phénotype de la pathologie sera mis en place : étude de 14 animaux (7 femelles et 7 mâles) sur 2 portées différentes Cette étude se déroule en 2 étapes. Dans un premier temps, quatre peptides, à 3 doses différentes, seront instillés pendant 6 mois, séparément ou en combinaison (13 préparations possibles), avec 12 souris T par groupe de traitement . Cette étude qui va évaluer l’efficacité de chaque préparation sur la survie et sur le développement des lésions neurofibrillaires dans le cerveau des souris traitées, nous permettra de définir la dose et les 3 peptides les plus efficaces. A partir de ces données, une nouvelle étude sur 12 mois sera engagée avec 12 souris par combinaisons (7 préparations au lieu de 13). Deux groupes contrôles seront à nouveau réalisés (n=12 pour chaque groupe). Donc le nombre maximum de souris engagées dans l’étude est de 760 souris sur 60 mois. Les groupes de souris contiendront 12 animaux (les tests d’innocuité des peptides permettent de diminuer le nombre de souris) afin d’avoir des groupes valides pour les analyses statistiques des résultats.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe de 10 souris dans un environnement enrichi. En cas de bagarre entre les animaux, l’isolement de façon transitoire sera envisagé afin de garantir leur bien-être. L’application de critères d’arrêt et le suivi quotidien des animaux hébergés permettent de garantir leur bien-être. L’état de santé des animaux sera surveillé (état général) tout au long de l’expérience selon une grille de score dépendante de certains critères ce qui nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. De plus, une étude du bien-être animal est menée sur ces souris afin de définir précisément le phénotype de la souche à ce jour et dans nos locaux. Cette grille nous permettra de suivre l’efficacité des traitements sur la souche Tau-P301S.

Choix des espèces

L’objectif de ce projet est de développer des traitements contre la maladie d’Alzheimer. Cette pathologie se développe sur plusieurs années de vie avant que les premiers symptômes n’apparaissent, 20-30 ans plus tard. Nous avons donc besoin d’un modèle animal qui développe les lésions neurofibrillaires également au cours de son développement et de sa vie pour évaluer son efficacité. C’est pour cela que nous avons donc choisi la souche de souris, Tau-P301S, qui produit des lésions Tau au début de sa vie (avant 6 mois), mais les symptômes apparaissent quelques mois plus tard (8-12 mois) et sont évolutifs. Les animaux seront étudiés entre 1 et 12 mois, c’est à direc’est-à-dire dès le début du développement des lésions NFT et jusqu’au stade le plus tardif que les souris de ce modèle le permette entre le début de la maturité et l’âge adulte.Ainsi on pourra évaluer si les traitements peuvent prévenir ou ralentir le développement pathologie

792 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur déclenche un asthme allergique par cinq administrations intranasales d'extraits d'acariens, administre les molécules à tester, puis ouvre la trachée sous anesthésie pour mesurer la fonction pulmonaire avant un lavage bronchoalvéolaire. Il décrit surtout un stress lié aux instillations et à l'anesthésie et une biopsie pour le génotypage. Ce projet vise à établir une "preuve de concept" sur le rôle de certains lymphocytes, présentée comme une base pour de futurs essais cliniques, et le porteur juge le modèle murin "nécessaire" pour accéder aux cellules pulmonaires.

Objectifs

L’asthme est une maladie inflammatoire chronique des bronches qui se caractérise par des crises récurrentes. Les symptômes sont toux, sifflements, essoufflement et/ou oppression thoracique. Cette pathologie peut être allergique ou non-allergique, et impliquer différents types d’inflammations. Récemment, un nouveau type de cellules lymphoïdes ont été impliquées dans l'inflammation pulmonaire. L'objectif de cette étude est de déterminer dans un modèle d'asthme allergique expérimental les mécanismes par lesquels ces lymphocytes contribuent à la sévérité de l'asthme afin de pouvoir proposer dans le future des nouvelles thérapies. Ce projet est multisite car il comporte des étapes nécessitant une expertise spécifique non disponible en interne. Aucun animal supplémentaire sera ajouté.

Bénéfices attendus

Ce travail nous permettra de comprendre les mécanismes par lesquels une nouvelle population des lymphocytes influencent la sévérité de l'asthme allergique. Les résultats obtenus serviront de preuve de concept pour poser les bases de futurs essais cliniques chez l'homme.

Procédures

Le protocole d’asthme est réalisé par 5 administrations intranasales des extraits d’acariens ou le contrôle, d’une durée de 30 secondes. Les animaux subissent l'administration des molécules à tester par voie intrapéritonéal (6 administrations) d’une durée de 30 secondes. L’ouverture de la trachée est réalisée pour mesurer les fonctions pulmonaires grâce à un appareil dédié sur souris anesthésiées (d’une durée de 20 minutes), suivi d’un lavage bronchoalvéolaire (d’une durée de 50 secondes). Biopsie de la queue ou de l’oreille pour génotypage d’une durée de 10 secondes.

Impact sur les animaux

Les administrations intranasales peuvent entrainer un stress, une modification de la respiration ainsi qu’un changement de comportement. Les anesthésies peuvent entrainer un stress et le génotypage un stress ainsi qu’une douleur légère. Le stress dû au transport, lorsque les animaux sont déplacés d'une animalerie à l'autre.

Devenir

Mise à mort à la fin de la procédure pour les analyses de l'inflammation pulmonaires : histologie, cellules immunes présentes dans le tissu.

Remplacement

L'asthme est une pathologie complexe et hétérogène. Pour déterminer le rôle des lymphocytes que nous nous proposons d'analyser dans l'asthme sévère, il est nécessaire d'utiliser un modèle murin d'asthme pour avoir accès aux cellules présentes dans les poumons. L'étude sur la souris est donc une étape nécessaire, qui ne peut être remplacée par des expériences in vitro, pour valider une preuve de concept qui pourrait ensuite déboucher sur des essais cliniques impliquant ces lymphocytes.

Réduction

Le nombre de souris utilisé a été déterminé sur la base de nos travaux, des travaux publiés et d’une analyse sur logiciel statistiques approprié permettant d’utiliser le moins d'animaux possible pour aboutir à des résultats fiables.

Raffinement

Toutes les souris inclues dans ces différentes procédures seront suivies quotidiennement par les animaliers pour des signes de souffrance ou de difficultés respiratoires. La surveillance de l’état des animaux (poids, mobilité, comportement) sera faite 1 à 2 fois/semaine par l’expérimentateur dédié au projet. Si au cours de l’expérience une souris atteint un point limite, elle sera mise à mort. Un enrichissement des cages composé de maisonnettes en carton et de cotons d’enrichissement est prévu afin de diminuer le stress des animaux. Des seringues adaptées sont utilisées pour les injections. En cas de signes de souffrance, les animaux seront traités par injection d'antalgique.

Choix des espèces

Les modèles d’asthme induit par les extraits d’acariens chez la souris sont très bien décrits dans la littérature et miment certains symptômes de la pathologie humaine dont les atteintes pulmonaires. La souris est ainsi un modèle de choix pour étudier les mécanismes immuns impliqués dans la sévérité de l’asthme. Les souris utilisées auront entre 4 et 18 semaines. A 4 semaines les souris seront génotypées. Le protocole expérimental sera appliqué à des souris âgées de plus de 6 semaines car, comme décrit la littérature, à cet âge le système immunitaire est complétement développé.

396 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur soumet une partie des souris à une irradiation du corps entier suivie d'une greffe de cellules, et l'ensemble à des injections intrapéritonéales répétées et à des prélèvements sanguins rétro-orbitaux tous les quinze jours pendant trois mois, qu'il reconnaît pouvoir altérer leur vision. Ce travail vise à comprendre le rôle d'une molécule dans une forme agressive de mastocytose, un cancer du sang. Il cite un "dépôt de brevet" et des financements parmi les retombées attendues et affirme le modèle animal "indispensable", la complexité des interactions cellulaires n'étant selon lui pas reproductible in vitro.

Objectifs

Les mastocytoses systémiques (MS) sont des formes incurables de maladies du sang particulièrement difficiles à traiter. Ces maladies très hétérogènes allant de formes indolentes à des leucémies fatales, sont caractérisées par l’accumulation et l’activation incontrôlée des cellules immunitaires appelées mastocytes dans la moelle osseuse. Plus de 30% des patients atteints de MS agressives ne répondent pas aux traitements administrés en clinique. Il est donc essentiel de trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le métabolisme des cellules est fortement perturbé dans les cellules cancéreuses afin de répondre à leur besoin en énergie pour proliférer de façon aberrante. Nous avons donc identifié les altérations métaboliques dans les mastocytes de patients afin de tester le potentiel clinique de leur inhibition. Nous avons mesuré une forte concentration de kynurénine (L-Kyn), une petite molécule chimique, dans le plasma des patients atteints de formes agressives comparé aux indolentes et confirmé l’activité de la voie dont elle fait partie dans des mastocytes issus de la moelle osseuse de patients.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément comment la L-Kyn dont la concentration est élevée de façon physiologique dans le plasma des patients atteints de MS agressive, exacerbe les fonctions mastocytaires en régulant directement les fonctions des mastocytes ou leur microenvironnement (adipocytes médullaires). Ces analyses nous permettront d'une part de tester le potentiel de la voie de la kynurénine comme cible thérapeutique dans les MS agressives dans un contexte physiologique mais également d'identifier de nouvelles cibles en aval de la L-Kyn qui pourraient également être pertinentes. Cette étude est la première étape vers le développement de nouveaux médicaments ciblant ces régulations en combinaison ou non avec les traitements utilisés pour cette pathologie en routine clinique. Elle permettra également le dépôt de brevet et de financements indispensables pour la poursuite de ce projet. Ces pathologies agressives sont particulièrement invalidantes ; la médiane de survie des patients au diagnostic est de moins de 3 ans et de moins de 6 mois pour les formes les plus agressives. Cette étude est donc indispensable pour améliorer le devenir des patients et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques afin de prévenir ou freiner le développement de ces pathologies.

Procédures

Les animaux (procédures 1-2) recevront une injection intra-péritonéale sur animaux vigiles 3 fois par semaine pendant une semaine puis 5 fois par semaine pendant deux semaines. Les prélèvements sanguins seront réalisés en rétro-orbital sous anesthésie à l'isoflurane tous les 15 jours pendant 3 mois ou jusqu’à l’atteinte des points limites. Les animaux (procédures 3-5) recevront une irradiation sous-létale sur corps entier sur animaux vigiles. Une greffe intraveineuse en rétro-orbital unique sera réalisée. Une injection intra-péritonéale sur animaux vigiles 5 fois par semaine sera réalisée pendant deux semaines. Les prélèvements sanguins en rétro-orbital seront réalisés sous anesthésie à l'isoflurane tous les 15 jours pendant 3 mois ou jusqu’à atteinte des points limites.

Impact sur les animaux

La manipulation et la pesée pourraient entraîner du stress chez les animaux. Une mauvaise tolérance à l’irradiation sous-létale pourrait entraîner une inactivité et une mobilité réduite pendant quelques heures après l’irradiation (rare). Le même phénotype pourrait être observé après une greffe partielle des cellules injectées quelques jours après la transplantation. Une perte de poids pourra être observée et sera monitorée. Les prises de sang répétées dans le sinus rétro-orbital pourraient causer des problèmes de vision aux souris.

Devenir

La totalité des individus impliqués seront mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

L’utilisation de plusieurs modèles cellulaires in vitro seuls ne permet pas de rendre compte de la complexité des interactions cellulaires impliquées dans la maladie. Ce degré de complexité ne peut être atteint qu’avec un modèle animal afin de valider notre hypothèse. A cette étape du projet, il n’existe aucune autre méthode satisfaisante qui pourrait se substituer à l’expérimentation animale.

Réduction

Pour chacune des procédures, nous limiterons au nombre minimum d'animaux permettant de caractériser l'efficacité des molécules testées. Le calcul d’effectif pour chaque groupe dans chaque procédure sera réalisé en utilisant un calcul d'effectif pour chaque groupe dans chaque procédure sera réalisé en utilisant un calcul statistique approprié. Cette approche nous permet de conserver une méthode scientifique rigoureuse tout en réduisant au minimum le nombre d'animaux nécessaires. Nos approches pour évaluer l'efficacité de chaque composé étudié comprendront des groupes contrôles. Afin de réduire à son minimum le nombre d'animaux et dès que cela sera possible, ces groupes contrôles seront commun à plusieurs tests d'efficacité. Enfin, afin de réduire le nombre d'animaux issus de nos propres élevages, des animaux des deux sexes seront utilisés dans nos expériences.

Raffinement

Les expérimentations seront débutées au plus tôt 7 jours après réception des souris au sein de la zone d’expérimentation pour permettre leur acclimatation. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Les expérimentateurs et le personnel qualifié de l'animalerie sont formés pour limiter au maximum le stress des animaux lors de leur manipulation. Les animaux utilisés dans ces expériences seront soumis à une surveillance quotidienne. Les objectifs de toute procédure étant de donner à l’animal la meilleure qualité de vie possible et de garantir que toute souffrance due aux procédures soit détectée et réduite. Pour ce faire, le suivi de la maladie se fera par des mesures cinétiques utilisant des procédés non invasifs. Dès l’apparition des points limites, que nous avons choisis le plus précoce possible pour que l’animal reste asymptomatique, l’animal sera mis à mort. Par conséquent, cette mise à mort intervient avant l’apparition de symptômes et de nuisances dues à la pathologie. Nous optimiserons les conditions d'hébergement des animaux par la présence d'enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactes et/ou coton) et par leur maintien en groupes de 4 ou 5 afin d'éviter le stress de l'isolement. Pour limiter au maximum la souffrance des animaux, les prélèvements seront effectués sous anesthésie, et une analgésie sera mise en place si nécessaire (voir points limites).

Choix des espèces

Le projet nécessite l'utilisation d'une espèce de la classe des mammifères proche de l'homme pour sa physiologie (ici l'hématopoïèse). Sur cette base, en adéquation avec nos objectifs, le modèle murin apparaît le plus pertinent. En effet, bien que des formes ancestrales de systèmes hématopoïétiques aient été identifiées chez les Urochordés (Ciona Intestinalis), l’hématopoïèse donnant naissance à un système immunitaire adaptatif n’est présente que chez les vertébrés. Ceci restreint l’étude des mécanismes moléculaires de l’hématopoïèse à ces derniers parmi lesquels, le poisson zèbre et la souris, sont les modèles génétiques les mieux caractérisés. L’apport historique des modèles souris dans l’étude du système hématopoïétique, les outils développés chez cette espèce et l’absence d’expertise sur le poisson zèbre au sein de l’institut satisfait aux exigences d’utilisation de la souris comme espèce la moins susceptible de ressentir de la souffrance ou de la douleur pour les expérimentations proposées. Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature pour ces types de modèle de MS et ce type d'injection de cellules néoplasiques mastocytaires en intraveineux, c'est à dire des souris "jeunes adultes" âgées de 6 à 10 semaines au moment de la transplantation et/ou des injections intra-péritonéale prévues.

895 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur ligature ou pose un manchon sur la carotide et la jugulaire sous anesthésie, pour étudier la relation entre veine et artère lors du remodelage artériel, y compris dans un modèle d'athérosclérose. Il décrit des interventions d'une trentaine de minutes qu'il qualifie de "peu invasives" et prévoit d'écarter et de tuer les animaux dont la souffrance ne s'améliore pas sous 24 heures. Il présente ce travail fondamental comme une piste vers de nouvelles cibles thérapeutiques cardiovasculaires et affirme qu'aucune alternative ne permet d'étudier ces interactions.

Objectifs

Le remodelage artériel est un mécanisme d’adaptation de l’artère en réponse à un état physiologique ou pathologique. Au cours des expérimentations précédentes, nous avons montré l’existence d’une relation entre la veine et l’artère lors du remodelage artériel. Cette relation a été mise en évidence dans un modèle de remodelage physiologique par variation du flux artériel, mais également dans un modèle pathologique d’athérosclérose (maladie des grosses artères conduisant à un dépôt de graisse appelé athérome). Le signal conduisant au remodelage de l’artère serait transmis par l’intermédiaire du système immunitaire depuis la veine vers l’artère en passant par le tissu adipeux ou fibrotique. Nous devons compléter ces premiers résultats par l’identification des acteurs de la mise en place de cette relation. Pour cela, nous allons réaliser une étude des variations d’expression transcriptomique à partir des jugulaires et carotides lors de la mise en place du remodelage carotidien dans les 2 modèles expérimentaux physiologique et pathologique. Ensuite, nous allons mettre en évidence la localisation des acteurs moléculaires identifiés. Enfin, nous identifierons les facteurs circulants impliqués dans l’activation de la composante veineuse. Concernant le remodelage artériel pathologique d’athérosclérose, nous avons déjà montré qu’en inhibant la composante veineuse, le dépôt de plaque d’athérome était plus faible au niveau de la carotide. Nous devons montrer que c’est un phénomène local et non global. Pour cela, nous réaliserons une observation histologique à distance des carotides (l’aorte) pour montrer la persistance des plaques d’athérome sur ces sites alors qu’elles seront fortement diminuées sur les carotides.

Bénéfices attendus

Le rôle de la veine et du tissu périphérique dans le remodelage artériel est actuellement très peu connu. L’intérêt est donc dans un premier temps, de démontrer la place importante de ces tissus dans la physiologie artérielle. De plus, identifier les acteurs moléculaires et cellulaires impliqués dans le remodelage pathologique va permettre de proposer des cibles thérapeutiques cardio-vasculaires et de proposer la veine et non plus uniquement l’artère comme cible thérapeutique.

Procédures

- Ligature de la carotide et jugulaire : geste réalisé une fois par animal sous anesthésie générale couplée à une analgésie, avec une durée d'intervention de 30 minutes. 277 souris sont concernées. - Pose d’un manchon sur la carotide et la jugulaire ou ligature de la jugulaire : geste réalisé une fois par animal sous anesthésie générale couplée à une analgésie avec une durée d'intervention de 30 minutes. 456 souris sont concernées.

Impact sur les animaux

Les procédures opératoires sont peu invasives et n’entraînent pas de douleurs importantes. Un protocole d'analgésie est mis en place. Le modèle d’athérosclérose entraîne une prise de poids mais n’entraîne pas d’effets secondaires délétères sur le temps du protocole limité à 10 semaines maximum selon l’objectif technique.

Devenir

Les animaux sont systématiquement mise à mort afin de récupérer les tissus d’intérêts pour analyse.

Remplacement

Aucune alternative à l’utilisation d’animaux vivants ne permet d’étudier les mécanismes d’interaction entre la veine, l’artère et le tissu périphérique dans un contexte physiologique et encore moins pathologique. Les modèles prévus sont des modèles standards et bien documentés dont l’impact sur l’animal est bien maîtrisé.

Réduction

Le nombre d’animaux pour les expériences ont été précisément définies à l’aide d'un logiciel pour avoir assez de puissance statistique lors de l’étude. Des tests statistiques sont réalisés au cours du projet . Concernant l’étude transcriptomique de l’ensemble des transcrits, le nombre d’animaux inclus est conseillé par la plateforme technique réalisant l’expérience. Une procedure d'analyse est assurée par la plateforme pour obtenir une analyse statistique adéquat. Il est à noter que le choix de réaliser la technique de séquençage haut-débit plutôt que l’étude de cibles prédéfinies permet d’observer plus de cibles avec moins d’échantillons et donc moins d’animaux.

Raffinement

Pour les souris ayant été opérées, la réponse nociceptive des animaux sera régulièrement testée en cours d’intervention. Les éventuelles modifications du rythme cardiaque et respiratoire seront observées pour évaluer la souffrance, la détresse et l’inconfort des animaux pendant l’intervention chirurgicale. La douleur de l’animal sera évaluée quotidiennement selon une grille d’évaluation de la douleur. Nous nous intéressons à un processus inflammatoire sur un temps très court, nous surveillerons étroitement les animaux le jour de la chirurgie (ajout d’une visite en fin de journée) puis le lendemain (matin puis après-midi). En cas de souffrance constatée, l’animal sera isolé et mis à mort. Seules les souris prévues pour les temps longs à J56 post chirurgie pourront recevoir une nouvelle dose d’analgésique. Si aucune amélioration n’est constatée rapidement (24h maxi), l’animal sera écarté et mis à mort. Pour toutes les procédures, les souris seront surveillées quotidiennement afin de détecter d’éventuels inconforts.

Choix des espèces

Les souris génétiquement modifiées représentent des outils spécifiques dans la plupart des domaines de la recherche médicale. La souris est un excellent modèle pour la maladie humaine, l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme et peuvent être modifier pour se rapprocher au mieux de la pathologie recherchée. L’ensemble des souris utilisées seront des souris adultes âgées entre 3 et 6 mois, âge qui permet de standardiser la taille attendues des vaisseaux et qui permet un développement optimal du remodelage artériel.

124 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur provoque un accident vasculaire cérébral en poussant un fil dans l'artère cérébrale moyenne pour l'obstruer une heure, avant de tester quatre thérapies géniques virales censées limiter la lésion. Il décrit un déficit sensorimoteur, une désorientation au réveil et des pertes d'équilibre, puis une perfusion transcardiaque terminale pour prélever le cerveau. Il rattache le projet à un financement industriel et juge "indispensable" de développer de nouvelles stratégies, les procédures ne pouvant selon lui être remplacées.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de tester quatre virus adéno-associé (AAV) par administration de manière prophylactique en intra veineuse 14 jours avant l’induction de l’ischémie afin d’étudier la diminution des volumes lésionnels et œdème après AVC. Pour cela, ces AAV seront étudiés à l’aide d’un modèle d’ischémie-reperfusion. Leurs mécanismes d'action est suceptible d'agir sur la phase aigüe de l'AVC pour limiter la lésion et la formation d'oedème.

Bénéfices attendus

Ce projet fait l’objet d’un financement industriel afin d'étudier de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant la diminution de la lésion causée par l’occlusion artérielle. L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie. Toutefois, seule une faible proportion des patients (

Procédures

L’injection des virus adéno-associé (AAV) se fera par voie intra-veineuse. Cette méthode d’administration durera 1 minute. Les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau du cou afin de pouvoir insérer un monolfilament dans la carotide interne puis poussé jusqu’à la base de l’artère cérébrale moyenne (ACM) provoquant ainsi une occlusion. Cet acte chirugical durera 20 minutes. 1 heure plus tard, une seconde chirurgie sur le même site sera réalisée afin d’extraire ce monofilament et ainsi permettre une reperfusion. Cet acte chirugical durera 10 minutes. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au cœur. Une perfusion transcardiaque sera réalisée permettant de rincer le système vasculaire et pouvoir récupérer le cerveau. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes pour le prélèvement du cerveau. Les procédures douloureuse (chirurgie, perfusion transcardiaque) seront réalisées sous anesthésie générale associée à une couverture analgésique. Une fois le cerveau récupéré, des tranches d’1mm d’épaisseur seront faite à l’aide d’une matrice permettant de les colorer et ainsi déterminer les volumes lésionnels et oedème.

Impact sur les animaux

Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC à savoir : déficit sensorimoteur et lésions cérébrales. Cela peut occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion. L’embolisation de l’ACM provoque une désorientation prononcée au moment du réveil post-chirurgical (phénomène de circling). Les fonctions motrices peuvent également être altérées durant les premières heures après l’ischémie-reperfusion. Nous pouvons nous attendre à déceler sur certains animaux des signes de complications et de détresse postchirurgicales tels qu'une absence de réaction aux stimuli, une inactivité de l'animal dans sa cage ou encore une perte de poids suite à un arrêt de la prise alimentaire. Les situations précédemment citées définissent nos points limite à appliquer pour ce projet. Nous surveillerons à ce qu'ils ne soient pas dépassés. Aucune nuisance n’est à prévoir concernant les injections d’AAV car les gènes injecter ne sont pas délétères pour les hôtes. De plus, ces AAV ne sont pas réplicatifs. Les injections i.v par le sinus rétro orbital peuvent engendrer une hemorragie, un gonflement autour du site d’injection ou une cécité partielle.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau pour analyse.

Remplacement

L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que la souris est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, la souris est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC, ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos stratégies thérapeutiques. D’un point de vue statistique, nous avons déterminé que le nombre idéal d’animaux par groupe est de 28. En effet, ce nombre est reconnu pour réduire au maximum le nombre d’individus, tout en conservant la pertinence scientifique et la significativité statistique.

Raffinement

Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) dans la zone de sécurité L2 du bâtiment. Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la protection, la perfusion cérébrale ainsi que le devenir des lésions induites par une ischémie-reperfusion. Les animaux utilisés seront âgés de 10 semaines soit un poids de 25g pour les C57BL6N. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.