Recherche fondamentale

414 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée, pour étudier les effets cardiovasculaires de faibles doses de rayonnements gamma. Elles reçoivent une irradiation du corps entier ou localisée, des examens cardiaques répétés pendant plusieurs mois, un transport entre deux sites, et pour les mâles une contention en tube puis une chirurgie finale. Le porteur affirme que l'irradiation à faibles doses n'entraîne ni douleur ni lésion, tout en reconnaissant un stress possible, des douleurs liées aux aiguilles et un risque d'arrêt cardiaque sous anesthésie. Il présente le projet comme un appui aux normes de radioprotection et juge le recours à la souris "nécessaire", faute d'études in vitro suffisantes.

Objectifs

Il est important de connaitre les effets à court et long terme des irradiations faibles doses sur le système cardiovasculaire et d’en comprendre les mécanismes car cela touche des populations vivant dans des zones contaminées mais aussi des femmes traitées par des rayons X pour un cancer du sein. Les effets cardiovasculaires à long terme des doses faibles à modérées de rayonnements ionisants seront évalués sur des souris afin d’apporter des réponses très attendues qui permettront d’alimenter le système de radioprotection. Ce projet permettra aussi d’identifier les cellules et les voies de régulation qui sont impliquées dans les effets à long terme de ces rayons. Ce projet sera complémentaire aux études épidémiologiques et permettra d’apporter des réponses notamment dans les gammes de doses où les études épidémiologiques manquent de puissance statistique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’obtenir de nouvelles connaissances sur les pathologies qui peuvent se développer chez les populations exposées à des rayonnements faibles ou localisés afin d’actualiser les connaissances et participer à la détermination des normes en radioprotection pour des institutions du domaine de la radioprotection. La connaissance des cellules et voies impliquées permettra ensuite de poursuivre les études in vitro.

Procédures

Au total 414 souris (234 femelles et 180 mâles) seront utilisés pour 1 procédure modérée. 180 animaux subiront 1 fois une irradiation corps entier à des doses faibles n’entrainant ni douleur, ni brulure que ce soit pendant l’irradiation ou après celle-ci. 234 animaux subiront une irradiation localisée à de faibles doses. Les 414 animaux subiront ensuite des examens non douloureux et non invasifs sous anesthésie et vigiles (1 par mois pendant 3, 9 ou 15 mois). Les animaux seront ensuite transportés en voiture dans une autre animalerie pour permettre l’investigation cardiovasculaire. Ces investigations comprennent des mesures non invasives et non douloureuses sur animaux vigiles mais aussi des investigations invasives sous anesthésie. Les 180 mâles seront placés 5 minutes, 1 fois par jour pendant 5 jours dans un tube à contention. Les altérations cardiovasculaires déjà observées sur des groupes sont modérées et non douloureuses. L’intervention finale pour les 180 mâles sera une intervention chirurgicale qui durera 10 minutes sera effectuées sous anesthésie et analgésie par des personnes agrémentées. L'intervention finale pour les 234 souris femelles sera un prélèvement sanguin de 1mL sous anesthésie générale. les animaux sont euthanasiés par une méthode réglementaire à l’issue de la chirurgie pour les mâles et du prélèvement de sang pour les femelles. Les animaux sont euthanasiés par une méthode réglementaire à l’issue de la chirurgie pour les mâles et du prélèvement de sang pour les femelles.

Impact sur les animaux

L’irradiation à de faibles doses n’entraine pas de douleur ni de lésion pour les animaux. Ils pourront développer des maladies cardiovasculaires qui restent peu sévères et indolores. Un stress (peur ou détresse) des animaux est possible lors de la mise en boite d’irradiation (414 animaux) et dans les tubes à contention (concernant 180 mâles). Les procédures avec aiguille peuvent potentiellement conduire à une douleur, à une peur et à des infections (pour les 414 souris). L'anesthésie générale peut entrainer même rarement un arrêt cardiaque et durant la chirurgie il peut y avoir une hémorragie. Le transport des 414 animaux entre les 2 sites peut engendrer une peur temporaire et un stress thermique de courte durée.

Devenir

A la fin de la procédure toutes les souris seront euthanasiées pour prélever des organes (cœur et poumons) qui permettront une analyse histologique complétant les analyses fonctionnelles réalisées sur tous les animaux de ce projet.

Remplacement

Pour mimer une irradiation localisée ou en corps entier, il est nécessaire d’avoir recours à une exposition d’animaux vivants permettant l’étude sur un modèle intégré des différentes fonctions cardiovasculaires. La régulation des paramètres cardiovasculaires, la participation de cellules au remodelage vasculaire ne peuvent être évaluées qu’in vivo, c’est pourquoi ce projet nécessite des modèles murins. De plus, les études in vitro présentent des limites pour l’évaluation des mécanismes au niveau cellulaire après une exposition à des doses faibles à modérées et ne permettent pas d’identifier des processus physiologique et/ou physiopathologique. En effet, il est très difficile de maintenir des cultures cellulaires au-delà de 3 semaines dû au vieillissement cellulaire et aux cycles limités des cellules. Néanmoins pour une partie du projet (dès que possible, les voies et les molécules impliquées seront étudiées in vitro sur des cellules en culture (progéniteurs en culture, cellules vasculaires en culture).

Réduction

Au total, 414 animaux seront prévus dans ce projet (234 souris femelles et 180 souris mâles). Le nombre d'animaux par groupe (8-10 pour les feemeellees et 15 pour les mâles) a été établi avec l’utilisation d’outils statistiques permettant d’optimiser la puissance de l’étude et avec notre expérience concernant ce type d'analyses et ces modèles murins pour être au minimum et pour conserver un nombre d’animaux suffisant pour nos analyses statistiques et compte tenu de la diversité des analyses prévues sur les différents organes. A notre connaissance, ces expériences n'ont jamais été réalisées ni en France, ni dans le monde, par d'autres équipes dans un protocole expérimental semblable.

Raffinement

Les volumes injectés sont les plus petits possibles. Les animaux sont pesés régulièrement tout au long de la procédure. Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec eau et nourriture ad libitum. La température et l’hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés à plusieurs (2 à 6 souris par cage) et l’isolement est évité. Le milieu est enrichi avec des lanières de papier, morceau de bois et maison en carton. Pendant l’ensemble des procédures, une surveillance quotidienne sera effectuée par les zootechniciens et hebdomadaire par le porteur de projet selon un tableau. La profondeur de l'anesthésie sera vérifiée en testant l'absence de réflexe de retrait de la patte (après pincement). Les infections ou blessures éventuelles seront traitées localement par application de Vétédine, crème ou spray antiseptique. Les points limites adaptés ont été établis pour chaque étape et leur absence sera vérifiée de façon appropriée.

Choix des espèces

La souris est un modèle mieux caractérisé que le rat pour les études sur le système cardiovasculaire et déjà utilisé pour les études sur la toxicité radio-induite à long terme. La souris permet de garantir l’homogénéité des résultats et la possibilité de surveiller le développement des complications cardiaques dans un espace de temps raisonnable. Les souris seront âgées de 2 mois (8 semaines) au moment de l’irradiation car à cet âge leur système nerveux et cardiovaculaire sont matures. Les animaux arriveront entre 4-6 semaines pour avoir des groupes d’hébergement stable et limiter ainsi les bagarres. Les animaux auront pour les longs termes entre 3 et 15 mois lors des réalisations des protocoles décrits dans cette demande.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée, pour tester une lignée porteuse d'une mutation proche de celle des patients atteints de myopathie à agrégats tubulaires. Elles subissent des tests de force et de locomotion répétés chaque semaine, un test de saignement pour évaluer la coagulation et des injections de traitement, avant une mise à mort pour prélever les muscles. Le porteur présente la plupart des tests comme non invasifs tout en décrivant du stress et des douleurs liées aux injections. Il affirme qu'un modèle cellulaire ne permet pas d'évaluer la contractilité musculaire ni les effets sur un organisme entier, s'agissant d'une maladie multisystémique.

Objectifs

La myopathie à agrégats tubulaires (TAM), associée au syndrome de Stormorken (STRMK) est une maladie touchant notamment les muscles, la coagulation sanguine et la peau. Cette myopathie peut être causée par différentes mutations génétiques, et il manque encore des modèles adaptées pour étudier la maladie et la traiter. Ce projet vise donc à étudier une nouvelle lignée de souris avec une mutation similaire à celle trouvée chez les patients. Si les principaux signes de patients sont trouvés chez les souris, cette lignée serait confirmée comme un modèle approprié pour le TAM/STRMK. Ce modèle permettra de mieux comprendre le syndrome TAM/STRMK, en fonction de la mutation. En plus, dans ce projet, nous mettrons également en œuvre une stratégie thérapeutique visant à prévenir et à inverser la maladie dans le modèle murin en ciblant un acteur clé de la cause de la maladie.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra d’approfondir notre connaissance des causes et du fonctionnement de la maladie. De plus, avoir en notre possession des modèles TAM/STRMK nous permettra de trouver la thérapie la plus appropriée, en fonction de la cause génétique spécifique. Enfin, cette étude présente un intérêt pour un éventail plus large de maladies comme la dystrophie de Duchenne ou la pancréatite aiguë.

Procédures

Des tests de comportement seront réalisés une fois par semaine sur les souris vivantes, à partir de 1 mois (cohorte 1) ou 4 mois (cohorte 2) et jusqu'à 4 mois (cohorte 1) ou 8 mois (cohorte 2) d'âge. Le test de comportement permettant d’évaluer la force globale de l’animal sera réalisé 3 fois par jour. Chaque essai durera au maximum 60 secondes. Le test permettant de mesurer la force musculaire des pattes de l’animal dure 10 secondes, et sera répété 3 fois par jour. Le test permettant mesurer l’activité locomotrice spontanée dure 12h. Le test de saignement, utilisé pour évaluer la coagulation sanguin, sera réalisé une fois, et il durera au maximum 10 minutes. Les mesures de force musculaire seront réalisées pendant 10 minutes. Le test de production de force du muscle durera au maximum 30 minutes. A l’issue de cette procédure, l’animal anesthésié sera euthanasié. Le test pour l'obtention du sang sera répété 2 fois dans la vie de la souris, et durera 1 minute. Des injections pour administrer le traitement prendront environ 2 minutes par souris.

Impact sur les animaux

Le nouveau modèle peut avoir un impact indésirable sur l'animal. Les tests de comportement peuvent induire du stress chez l'animal. De plus, les injections administrées pour le traitement peuvent causer de la douleur à l'animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issu des tests pour préléver les muscles nécessaires aux analyses moleculaires.

Remplacement

L’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer les effets sur la contractilité du muscle, ni d’évaluer les effets sur l’ensemble de l’organisme qui dans notre cas est crucial car nous étudions une maladie associée à un phénotype multisystémique.

Réduction

Dans le cadre de notre expérimentation, nous employons des tests phénotypiques non invasifs, ce qui signifie que nous n'occasionnons aucun préjudice aux animaux que nous étudions. Cette approche nous permet d'effectuer un suivi longitudinal en répétant les expériences sur les mêmes individus au fil du temps. En ce qui concerne les analyses moléculaires et histologiques, elles seront réalisées uniquement à la fin du traitement, ce qui évite de constituer un groupe d'animaux pour chaque point du suivi sur la durée. . Nous cherchons également à réduire au minimum le nombre d'animaux afin d'obtenir des résultats statistiquement significatifs. Nos recherches antérieures ont montré que l'utilisation d'un maximum de 15 souris par groupe est nécessaire pour mener à bien une étude concluante. Les effectifs seront déterminés et les résultats analysées avec des statistiques adaptés.

Raffinement

Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. L’analyse de la capacité à se retourner et à se mouvoir, la couleur de la peau, la présence d'une poche de lait seront évalués chez le nouveau-né tous les 2 à 3 jours. A partir du sevrage, les animaux seront hébergés en groupe dans des cages placées dans un environnement où la température sera maintenue constante, la qualité de l’air sera assurée par une ventilation et un cycle de 12 h jour/nuit sera imposé. Les animaux recevront de l'eau et de la nourriture ad libitum. La litière sera changée aussi souvent que nécessaire afin de maintenir les animaux au propre et au sec. Le milieu sera enrichi avec des nids. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 1 fois par semaine. Dès lors qu’une perte de poids sera notée, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. La plupart des expérimentations seront réalisées à l’aide de tests permettant une exploration totalement non invasive de la fonction musculaire dans des conditions physiologiques in vivo ce qui limite le développement de la douleur. Afin de diminuer le stress lié aux différents tests, une session de familiarisation sera effectuée pour chaque test avant le début du suivi longitudinal. Pour le temps de saignement et les prélèvements sanguins, l'animal sera anesthésié. Ainsi, pour les mesures de force musculaire, l’animal sera anesthésié avec un mélange de produits anesthésiants et analgésiants permettant d’éliminer le stress et la douleur liés à la procédure. L’animal sera placé sur une plaque chauffante tout au long de la procédure afin de maintenir la température corporelle à sa valeur basale. Un contrôle visuel de la respiration sera effectué. En cas de souffrance de l'animal, nous mettrons en place des mesures pour minimiser son inconfort et sa douleur. Nous utiliserons une grille de scoring pour évaluer le niveau de douleur observé chez l'animal. Si nous constatons un niveau de douleur élevé, nous prendrons les mesures appropriées pour soulager la douleur et assurer le bien-être de l'animal. La grille de scoring nous permettra de surveiller attentivement l'état de l'animal et d'adapter les interventions nécessaires pour réduire toute souffrance.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris afin de mieux comprendre les propriétés physiologiques des différents muscles et organes suite à une modification génétique, ainsi que pour tester de nouvelles approches thérapeutiques. Cette approche globale de l'organisme revêt une importance particulière dans le cadre de notre étude sur le TAM/STRMK, une maladie multisystémique. Ayant précédemment étudié le TAM/STRMK dans un autre modèle murin de la maladie, nous souhaitons approfondir nos connaissances en utilisant cette nouvelle lignée de souris avec une mutation similaire à celle trouvée chez les patients. Les souris utilisées seront étudiées à l'âge adulte, après 4 semaines jusqu'à 8 mois (pour la caractérisation de l'animal), et après 4 semaines jusqu'à 7 mois (pour le traitement).

792 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée, pour ce volet multisite d'une étude sur les lymphocytes dans l'asthme allergique. Elles reçoivent des extraits d'acariens par voie nasale pour induire l'asthme, puis des injections de molécules à tester, avant une ouverture de la trachée sous anesthésie et un lavage des bronches. Le porteur annonce une mise à mort en fin de procédure pour analyser l'inflammation pulmonaire et signale un stress lié au transport entre animaleries. Il affirme que le recours à la souris est une étape "nécessaire", non remplaçable par des expériences in vitro.

Objectifs

L’asthme est une maladie inflammatoire chronique des bronches qui se caractérise par des crises récurrentes. Les symptômes sont toux, sifflements, essoufflement et/ou oppression thoracique. Cette pathologie peut être allergique ou non-allergique, et impliquer différents types d’inflammations. Récemment, un nouveau type de cellules lymphoïdes ont été impliquées dans l'inflammation pulmonaire. L'objectif de cette étude est de déterminer dans un modèle d'asthme allergique expérimental les mécanismes par lesquels ces lymphocytes contribuent à la sévérité de l'asthme afin de pouvoir proposer dans le future des nouvelles thérapies. Ce projet est multisite car il comporte des étapes nécessitant une expertise spécifique non disponible en interne. Aucun animal supplémentaire sera ajouté.

Bénéfices attendus

Ce travail nous permettra de comprendre les mécanismes par lesquels une nouvelle population des lymphocytes influencent la sévérité de l'asthme allergique. Les résultats obtenus serviront de preuve de concept pour poser les bases de futurs essais cliniques chez l'homme.

Procédures

Le protocole d’asthme est réalisé par 5 administrations intranasales des extraits d’acariens ou le contrôle, d’une durée de 30 secondes. Les animaux subissent l'administration des molécules à tester par voie intrapéritonéal (6 administrations) d’une durée de 30 secondes. L’ouverture de la trachée est réalisée pour mesurer les fonctions pulmonaires grâce à un appareil dédié sur souris anesthésiées (d’une durée de 20 minutes), suivi d’un lavage bronchoalvéolaire (d’une durée de 50 secondes). Biopsie de la queue ou de l’oreille pour génotypage d’une durée de 10 secondes.

Impact sur les animaux

Les administrations intranasales peuvent entrainer un stress, une modification de la respiration ainsi qu’un changement de comportement. Les anesthésies peuvent entrainer un stress et le génotypage un stress ainsi qu’une douleur légère. Le stress dû au transport, lorsque les animaux sont déplacés d'une animalerie à l'autre.

Devenir

Mise à mort à la fin de la procédure pour les analyses de l'inflammation pulmonaires : histologie, cellules immunes présentes dans le tissu.

Remplacement

L'asthme est une pathologie complexe et hétérogène. Pour déterminer le rôle des lymphocytes que nous nous proposons d'analyser dans l'asthme sévère, il est nécessaire d'utiliser un modèle murin d'asthme pour avoir accès aux cellules présentes dans les poumons. L'étude sur la souris est donc une étape nécessaire, qui ne peut être remplacée par des expériences in vitro, pour valider une preuve de concept qui pourrait ensuite déboucher sur des essais cliniques impliquant ces lymphocytes.

Réduction

Le nombre de souris utilisé a été déterminé sur la base de nos travaux, des travaux publiés et d’une analyse sur logiciel statistiques approprié permettant d’utiliser le moins d'animaux possible pour aboutir à des résultats fiables.

Raffinement

Toutes les souris inclues dans ces différentes procédures seront suivies quotidiennement par les animaliers pour des signes de souffrance ou de difficultés respiratoires. La surveillance de l’état des animaux (poids, mobilité, comportement) sera faite 1 à 2 fois/semaine par l’expérimentateur dédié au projet. Si au cours de l’expérience une souris atteint un point limite, elle sera mise à mort. Un enrichissement des cages composé de maisonnettes en carton et de cotons d’enrichissement est prévu afin de diminuer le stress des animaux. Des seringues adaptées sont utilisées pour les injections. En cas de signes de souffrance, les animaux seront traités par injection d'antalgique.

Choix des espèces

Les modèles d’asthme induit par les extraits d’acariens chez la souris sont très bien décrits dans la littérature et miment certains symptômes de la pathologie humaine dont les atteintes pulmonaires. La souris est ainsi un modèle de choix pour étudier les mécanismes immuns impliqués dans la sévérité de l’asthme. Les souris utilisées auront entre 4 et 18 semaines. A 4 semaines les souris seront génotypées. Le protocole expérimental sera appliqué à des souris âgées de plus de 6 semaines car, comme décrit la littérature, à cet âge le système immunitaire est complétement développé.

792 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée, pour étudier un type de lymphocytes dans l'asthme allergique. Elles reçoivent des extraits d'acariens par le nez pour déclencher l'asthme, puis des injections de molécules à tester, avant une ouverture de la trachée sous anesthésie pour mesurer les fonctions pulmonaires et un lavage des bronches. Le porteur décrit un stress respiratoire et une douleur légère liée au génotypage, et annonce une mise à mort en fin de procédure pour analyser l'inflammation des poumons. Il affirme que l'étude sur la souris est une étape "nécessaire" qui ne peut être remplacée par des expériences in vitro.

Objectifs

L’asthme est une maladie inflammatoire chronique des bronches qui se caractérise par des crises récurrentes. Les symptômes sont toux, sifflements, essoufflement et/ou oppression thoracique. Cette pathologie peut être allergique ou non-allergique, et impliquer différents types d’inflammations. Récemment, un nouveau type de cellules lymphoïdes ont été impliquées dans l'inflammation pulmonaire. L'objectif de cette étude est de déterminer dans un modèle d'asthme allergique expérimental les mécanismes par lesquels ces lymphocytes contribuent à la sévérité de l'asthme afin de pouvoir proposer dans le future des nouvelles thérapies. Ce projet est multisite car il comporte des étapes nécessitant une expertise spécifique non disponible en interne. Aucun animal supplémentaire sera ajouté.

Bénéfices attendus

Ce travail nous permettra de comprendre les mécanismes par lesquels une nouvelle population des lymphocytes influencent la sévérité de l'asthme allergique. Les résultats obtenus serviront de preuve de concept pour poser les bases de futurs essais cliniques chez l'homme.

Procédures

Le protocole d’asthme est réalisé par 5 administrations intranasales des extraits d’acariens ou le contrôle, d’une durée de 30 secondes. Les animaux subissent l'administration des molécules à tester par voie intrapéritonéal (6 administrations) d’une durée de 30 secondes. L’ouverture de la trachée est réalisée pour mesurer les fonctions pulmonaires grâce à un appareil dédié sur souris anesthésiées (d’une durée de 20 minutes), suivi d’un lavage bronchoalvéolaire (d’une durée de 50 secondes). Biopsie de la queue ou de l’oreille pour génotypage d’une durée de 10 secondes.

Impact sur les animaux

Les administrations intranasales peuvent entrainer un stress, une modification de la respiration ainsi qu’un changement de comportement. Les anesthésies peuvent entrainer un stress et le génotypage un stress ainsi qu’une douleur légère. Le stress dû au transport, lorsque les animaux sont déplacés d'une animalerie à l'autre.

Devenir

Mise à mort à la fin de la procédure pour les analyses de l'inflammation pulmonaires : histologie, cellules immunes présentes dans le tissu.

Remplacement

L'asthme est une pathologie complexe et hétérogène. Pour déterminer le rôle des lymphocytes que nous nous proposons d'analyser dans l'asthme sévère, il est nécessaire d'utiliser un modèle murin d'asthme pour avoir accès aux cellules présentes dans les poumons. L'étude sur la souris est donc une étape nécessaire, qui ne peut être remplacée par des expériences in vitro, pour valider une preuve de concept qui pourrait ensuite déboucher sur des essais cliniques impliquant ces lymphocytes.

Réduction

Le nombre de souris utilisé a été déterminé sur la base de nos travaux, des travaux publiés et d’une analyse sur logiciel statistiques approprié permettant d’utiliser le moins d'animaux possible pour aboutir à des résultats fiables.

Raffinement

Toutes les souris inclues dans ces différentes procédures seront suivies quotidiennement par les animaliers pour des signes de souffrance ou de difficultés respiratoires. La surveillance de l’état des animaux (poids, mobilité, comportement) sera faite 1 à 2 fois/semaine par l’expérimentateur dédié au projet. Si au cours de l’expérience une souris atteint un point limite, elle sera mise à mort. Un enrichissement des cages composé de maisonnettes en carton et de cotons d’enrichissement est prévu afin de diminuer le stress des animaux. Des seringues adaptées sont utilisées pour les injections. En cas de signes de souffrance, les animaux seront traités par injection d'antalgique.

Choix des espèces

Les modèles d’asthme induit par les extraits d’acariens chez la souris sont très bien décrits dans la littérature et miment certains symptômes de la pathologie humaine dont les atteintes pulmonaires. La souris est ainsi un modèle de choix pour étudier les mécanismes immuns impliqués dans la sévérité de l’asthme. Les souris utilisées auront entre 4 et 18 semaines. A 4 semaines les souris seront génotypées. Le protocole expérimental sera appliqué à des souris âgées de plus de 6 semaines car, comme décrit la littérature, à cet âge le système immunitaire est complétement développé.

716 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée. Elles sont irradiées, reçoivent des injections répétées de cellules humaines et de vésicules pendant quinze jours, avec des prélèvements de sang hebdomadaires, dans un modèle de réaction du greffon contre l'hôte. Sur le remplacement, le porteur se limite à indiquer que des résultats in vitro prometteurs l'encouragent à valider l'effet dans un système plus complexe qu'un puits de culture. La justification du recours à l'animal tient en une phrase, sans examen d'alternatives.

Objectifs

Le but de cette étude est d’évaluer in vivo le rôle protecteur de vésicules extracellulaires (EV) issues de cellules humaines régulatrices et des cellules régulatrices elles même dans un modèle de réaction du greffon envers l'hôte. In vitro, nous avons déjà validé le pouvoir immunomodulateur de ces EV (autologues et allogéniques) et avons validé que cet effet est efficace pendant 4j. Ces expériences préliminaires ont permis de préparer au mieux cette demande d’autorisation d’expérimentation et respectent ainsi la règle des 3R et notamment la réduction du nombre d’animaux à utiliser. Afin de valider ces observations in vivo, nous utiliserons des souris immunodéprimées (NSG).

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus avec ces expériences réalisées chez la souris nous permettront ou non d'avancer vers une utilisation thérapeuthique chez l'homme des EV-Reg ou des cellules régulatrices que nous sommes en capacité de produire in vitro. Si nous démontrons que ces stratégie contrôlent l'activation du système immunitaire, elles pourraient être appliquées cliniquement chez des patients transplantés afin de prévenir le rejet de greffe.

Procédures

Les souris vigiles seront irradiées, une seule fois. Durée de l'intervention 3 min. Les souris anesthésiées seront injectées en i.v. à J0 puis tous les 3j pendant15j. Durée de l'intervention 2 min. Certaines souris seront injectées i.p. tous les jours de J0 à J7. Durée de l'intervention 10 sec. Enfin, un prélèvement sanguin sera réalisé une fois par semaine tant que les souris sont gardées en vie. Durée de l'intervention 1 min.

Impact sur les animaux

Effet lié à l’irradiation sur les souris => stress lié au changement de cage. Effet lié à l’injection i.v. et aux prélèvements sanguins sur les souris => stress lié à l’anesthésie. Effet lié à l’injection i.p. => stress lié à la contention de la souris

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés pour permettre une analyse des organes cible de la maladie induite.

Remplacement

Les cellules régulatrices et les vésicules extracellulaires (EV) produites par ces cellules régulatrices ont été finement étudiées in vitro. Les résultats sont prometteurs et nous encouragent à valider l'effet observé dans un système plus complexe qu'un puits de culture.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit au minimum afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. De plus certains groupes ne seront envisagés que si les hypothèses posées sont validées dans les groupes précédents.

Raffinement

Pour leur confort, les animaux seront hébergés dans des cages adaptées, avec enrichissement (frisottis et/ou dôme) et accès libre à l’eau et à la nourriture. Afin de réduire le stress et la douleur des animaux, toutes les injections i.v. se feront sous anesthésie gazeuse, sur tapis chauffant et le suivi clinique régulier des souris (surveillance du poids, aspect clinique général) nous permettra de palier à la douleur éventuelle. Le bien-être des animaux est surveillé tout au long de l’étude avec une évaluation quotidienne des signes généraux.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes (NSG) sont des souris qui ne possèdent pas de système immunitaire propre et dans lesquelles peut se développer un système immunitaire humain après injection de cellules immunitaires humaines. Ces souris humanisées sont des modèles alternatifs à l'utilisation de primates pour tester des nouvelles stratégies thérapeutiques. 8-12 semaines de vie de sorte que les souris ne soient ni trop petites et ni trop fragiles. Aussi nous essayerons autant que faire se peut d’avoir des groupes homogènes en terme d’âge.

820 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée, pour étudier l'inflammation de l'hypothalamus provoquée par un régime riche en graisses. Une partie subit une ou deux chirurgies du crâne pour implanter une pompe et une canule assurant des perfusions dans le cerveau pendant quinze jours, une autre reçoit un régime gras puis des injections et des prélèvements de sang à la queue. Le porteur qualifie lui-même ces chirurgies stéréotaxiques de lourdes et douloureuses, et décrit des pertes de poids, de la prostration et des douleurs au crâne. Il affirme qu'il est impossible de reproduire in vitro les échanges entre organes et conclut que l'utilisation de modèles animaux est "nécessaire".

Objectifs

Dans le contexte de l’obésité nutritionnelle, il est actuellement reconnu que la consommation d’un régime riche en lipides (HFD) entraine une inflammation très rapide de l’hypothalamus, une région du cerveau qui joue un rôle crucial dans la régulation de la prise alimentaire et de l’homéostasie énergétique. Les médiateurs et les mécanismes impliqués dans la mise en place de cette réponse inflammatoire aigue de l’hypothalamus et des perturbations métaboliques associées restent cependant à élucider. Récemment, nous avons mis en évidence que l’inflammation hypothalamique induite par 3 jours de régime HFD s’accompagne d’une forte augmentation de la production hypothalamique d’une hormone (X) connue pour ses propriétés pro-inflammatoires et favorisant le développement de l’insulino-résistnace, principal facteur de risque du diabète de type 2. Dans ce contexte, ce projet vise à démontrer in vivo l’implication de cette hormone hypothalamique dans la mise en place de l’inflammation précoce de l’hypothalamus et de déchiffrer les mécanismes cellulaires et moléculaires sous tendant ses effets. Il n’existe à ce jour aucune méthode de substitution aux animaux de laboratoire pour étudier l’impact physiologique d’un dérèglement nutritionnel. Le modèle animal envisagé dans cette étude est un modèle souris (souche C57BL6) particulièrement bien documenté dans la littérature pour ce type d’étude. Le nombre d’animaux est minimalisé en vue d'appliquer les réglementations européennes en terme de réduction. L’objectif de Raffinement et d’enrichissement est pris en compte afin de s’assurer du bien-être des animaux (surveillance quotidienne). Le recours à l'anesthésie et analgésie sont prévus pour éviter toute souffrance des animaux.

Bénéfices attendus

Cette étude va permettre de caractériser plus précisément les mécanismes et les médiateurs jouant un rôle crucial dans l'apparition de la neuroinflammation hypothalamique et à l'origine de désordre métabolique. Identifier ces facteurs pourrait ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques permettant de prévenir les effets de l’obésité au niveau hypothalamique et ainsi éviter le développement du Diabète de type II.

Procédures

400 souris au total subiront une chirurgie stéréotaxique, et 160 souris au total subiront 2 chirurgies stéréotaxiques : une 1ère chirurgie stéréotaxique (30 min/souris) afin d'injecter la tat cre, et une 2ème chirurgie stéréotaxique (30 min/souris) une semaine plus tard pour poser le système de pompe et de canule pour réaliser des perfusions intracérébroventriculaires (perfusion de 15j). 420 souris au total seront nourries avec pour moitié un régime normal et pour moitié un régime riche en graisse pendant 3 à 8 jours et toutes les souris seront soumises à des mesures de glycémie à différents temps ( 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min au plus) suite à une injection rapide en intraperitonéale (2-3 secondes) de glucose, d'insuline ou de pyruvate. Ceci implique plusieurs prélèvements à la queue d’une goutte de sang (6x5μl de sang au plus = 30μl). Une seule incision au niveau de la queue a lieu au début de l'expérience, elle est faite en une seconde.

Impact sur les animaux

Les procédures font intervenir des injections et perfusions et des chirurgies qui peuvent entraîner des effets indésirables sur les animaux tels qu’une perte de poids, des troubles alimentaires, un manque de toilettage, de la prostration, une agressivité lors de la manipulation, des douleurs ou gêne au niveau du crâne. Toutes les précautions seront prises pour éviter au maximum ces effets.

Devenir

400 souris au total serviront à toutes les analyses immunohistochimiques et hybridation in situ pour étudier les ARN et protéines sur tissus et 420 souris serviront aux études de HITS CLIP pour l’identification des cibles, de PCR quantitative pour évaluer les niveaux d'expression des ARN et de western blot pour l'expression protéique. Tous les détails sont précisés dans chacune des procédures en réponse à des objectifs précis.

Remplacement

Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscle, tissus adipeux) qui communiquent entre eux en permanence pour informer l’organisme des besoins énergétiques. Il est impossible de mimer in vitro toutes ces interactions, c’est pour cela que l’utilisation de modèles animaux est nécessaire pour ce projet. Cependant, veuillez noter que pour réduire le nombre d’animaux au maximum une partie des expériences sera réalisée in vitro, sur des lignées de cellules microgliales et neuronales hypothalamiques afin de déchiffrer les voies de signalisations sous tendant les effets proinflammatoires de l’ hormone X. Cependant, les expériences prévues sur les tanycytes seront réalisées sur des cultures primaires à partir d’hypothalamus de souris car il n’existe pas à ce jour de lignée de tanycytes commerciales. Ceci nécessite par conséquent l’utilisation de beaucoup d'animaux, et ne permet donc pas le remplacement.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux, tout ce qui est possible de faire in vitro a été planifié. De plus, des tests de puissance ont été réalisés au laboratoire pour chaque test planifié et notre expertise depuis plusieurs années sur ce type d'expérience nous permet vraiment d'évaluer à juste titre nos besoins expériementaux.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en cage individuelle puisqu’il est primordial pour notre étude de contrôler quotidiennement et individuellement la prise alimentaire et le poids corporel de chaque individu. Ils seront maintenus dans des milieux enrichis (maison, nid, bâtons de bois, cotons) ce qui améliorera leur bien-être. Il est indispensable d'avoir un suivi personnalisé du poids corporel et de la prise alimentaire, en effet, si nous n'obtenons pas de résultats homogènes au sein d'un groupe expérimental, nous remonterons l'historique de l'animal en comparant sa prise alimentaire et son poids corporel notamment afin de vérifier s'il a plus ou moins mangé/pris de poids qu'un autre individu du même groupe expérimental, ce qui permettra d'expliquer certaines différences. Bien que les procédures chirurgicales soient lourdes et douloureuses, nous avons instauré une médication et un suivi post-opératoire approprié permettant de réduire les possibles douleurs à leur minimum. En effet, les chirurgies stéréotaxiques sont réalisées sous Isoflurane accompagnée d'une injection de Lidocaïne au niveau de site de l'incision avant en tant qu'anesthésique local. Durant toute la procédure chirurgicale, les animaux reposent sur un tapis chauffant et reçoivent une injection de solution saline en sous-cutanée pour prévenir leur déshydratation. Aussi, lors de la phase de réveil, les animaux, toujours sur un tapis chauffant, reçoive une injection intrapéritonéale de glucose. De plus, en période post-opératoire, dès la fin des sutures, un analgésique est injecté en sous-cutané, idem le jour suivant l'opération. Nous avons également mis en place une grille d'évaluation permettant au chercheur de suivre les signes de souffrance des animaux. Elle se compose de scores et d'actions à réaliser selon le score. La grille de contrôle du poids est la suivante : normal : score = 0 ; perte de 5 à 10 % : score = 1 ; perte > 15 % : score =2. La grille de contrôle du comportement est la suivante : normal : score = 0 ; prostration, manque de toilettage : score = 1 ; hyperactivité lors de la manipulation, vocalisations sonores répétées : score = 2. Un score égal à 1 dans les deux grilles déclenche la sortie de l'animal de la procédure. Un score égal à 2 dans les deux grilles entraine la sortie de l'animal de la procédure et l'euthanasie si absence d'amélioration des scores.

Choix des espèces

Le modèle de souris est un outil complémentaire essentiel, partageant avec l’humain de fortes homologies dans les régulations physiologiques, en particulier le contrôle de l’homéostasie glucidique. Nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines au début des procédures, âge à partir duquel toutes les structures cérébrales sont matures.