Recherche fondamentale

75 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des sensibilisations cutanées hebdomadaires pendant six semaines, puis un gavage à l'éthanol trente minutes avant l'ingestion forcée de gluten, de façon à déclencher une réaction anaphylactique servant à étudier l'alcool comme cofacteur d'allergie. Certaines reçoivent aussi une puce implantée chirurgicalement dans l'abdomen, et le porteur décrit une baisse de température corporelle et des douleurs stomacales attendues. Il affirme que le modèle in vivo est "irremplaçable" pour reproduire la réaction allergique dans son ensemble.

Objectifs

Les allergies sont très répandues et ont été classées comme quatrième pathologie en termes de morbidité par l’Organisation Mondiale de la Santé. Ainsi, l’allergie est considérée comme un enjeu majeur de santé publique. Coûteuses, les allergies altèrent également la qualité de vie des patients. Depuis une vingtaine d’années, une augmentation constante de la prévalence de cette pathologie et notamment de la forme sévère (dite anaphylactique) a été constatée. A l’heure actuelle, les mécanismes impliqués dans le développement de la réaction allergique et les causes spécifiques de l’augmentation de leur prévalence sont peu établis. Les quelques études publiées sur la survenue de l’anaphylaxie révèlent une implication majeure de cofacteurs tels que l’effort, l’alcool et les anti-inflammatoires non stéroïdiens. Dans le cas de l’anaphylaxie induite par l’effort et dépendante du blé (cas le plus répandu), l’hypothèse soutenue repose sur une altération importante de la fonction gastro-intestinale notamment marquée par l’augmentation de la perméabilité intestinale lors de l’effort. Ces modifications favorisent ainsi le passage des allergènes dans le sang. Chez les sujets souffrant d’allergie d’origine alimentaire, la réaction et les symptômes sont alors amplifiés pouvant entraîner le décès du sujet. Il a également été admis que la réactivité IgE de certaines fractions protéiques diffère lors de la réaction anaphylactique. L’objectif de ce projet est d’établir le mécanisme impliqué dans l’anaphylaxie induite par l’alcool et dépendante du blé. L’alcool est considéré comme étant le deuxième cofacteur intervenant dans les réactions de l’allergie alimentaire, mais de manière surprenante les mécanismes moléculaires par lesquels l’alcool amplifie la réaction allergique n’ont jamais été élucidés. Le blé a été choisi car c’est un allergène commun et connu pour être impliqué dans la réaction allergique sévère et notamment en présence de cofacteurs. Plus spécifiquement, l’étude se focalisera sur le gluten, un complexe protéique du blé, composé des allergènes majeurs de la céréale. Aussi lors de cette étude, un examen approfondi de le barrière intestinale sera menée afin de déterminer les modifications dues au cofacteur. La symptomathie et le mécanisme de la réponse immunitaire lors de la réaction anaphylactique seront également caractérisés en détail.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’apporter des connaissances sur le mécanisme impliqué dans l’anaphylaxie induite par l’alcool et dépendante du blé. De ce fait, la réponse immunitaire précise de cette physiopathologie sera élucidée. Les effets de l’alcool au niveau de la barrière intestinale dans le cas d’une allergie alimentaire au blé seront déterminés. Aussi, une étude sur les fractions protéiques intervenant dans cette physiopathologie sera effectuée. A terme, ce projet a pour but de permettre une compréhension plus approfondie de l’anaphylaxie induite par l’alcool et dépendante du blé pour améliorer la prise en charge des sujets atteints. Des solutions préventives et thérapeutiques pourront être proposées.

Procédures

Lors de ce protocole, 5 groupes de 10 souris seront soumis à des sensibilisations percutanées hebdomadaires pendant 6 semaines. Les animaux seront alors anesthésiés tous les 7 jours pour la réalisation de la réalisation du geste. Aussi, sur ces souris, un total de 4 prélèvements de sang seront effectués avant le début des sensibilisations, après la 3ème sensibilisation, après la 4ème sensibilisation et après la 5ème sensibilisation. Elles seront effectuées 48h après les sensibilisations. Aussi, les souris subiront un gavage oral. Le groupe des 10 souris permettant d’évaluer l’impact du cofacteur seront gavées à l’éthanol 30 min avant le challenge au gluten. Quatorze souris de la procédure 1 subiront une chirurgie pour l’implantation de la puce Anipill (2 souris des groupes : CTL NA ; CTL SENS ; CTL CHAL et 4 souris des groupes : AA ; AA+EtOH). Elles seront anesthésiées par voie gazeuse, puis l’abdomen sera ouvert et une suture sera effectuée. Elles auront un suivi post opératoire.

Impact sur les animaux

Il est possible que les animaux aient des effets indésirables suite aux gestes pratiqués. En effet, lors des sensibilisations percutanées, une gêne peut être ressentie due à l’adjuvant utilisé (SDS) et à la répétabilité du geste (1 fois par semaine pendant 6 semaines). La phase de déclenchement de l’allergie alimentaire (challenge), peut également contribuer à des nuisances. Une baisse de la température corporelle des animaux est généralement observée. Aussi pour le groupe de souris étudiant l’effet du cofacteur dans l’allergie alimentaire au blé, la phase d’administration du cofacteur peut également être cause de stress et de gène au niveau de l’œsophage étant réalisé 30 minutes avant le challenge au gluten. Lors de cette étape, une baisse de la température corporelle pourra également être attendue ainsi qu’une baisse de l’état de santé général de l’animal. Les souris pourront aussi ressentir des douleurs stomacales liées à l’administration d’alcool et de gluten. La prise de température par voie rectale peut aussi entrainer un inconfort pour les souris. Aussi, des symptômes caractéristiques de l’anaphylaxie peuvent être observés. Généralement, les effets surviennent entre 0 et 30 minutes après le geste et peuvent persister pendant une trentaine de minutes.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort des animaux afin de récupérer les différents tissus nécessaires à l’étude immunologique et de la fonction gastro-intestinale.

Remplacement

Dans le cas de l’allergie alimentaire, les modèles in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes et en particulier le système immunitaire. Notamment, le cas de l’étude du mécanisme et de la symptomatie de la réponse allergique impliquant un co-facteur le modèle in vivo est irremplacable.

Réduction

Le protocole d’allergie alimentaire est régulièrement réalisé au sein du laboratoire. De ce fait, en se basant sur les études précédentes, le nombre de souris a été déterminé à 10 souris par groupe. Le nombre d’animaux réduit au minimum permettra d’obtenir des résultats statistiquement exploitables pour la réalisation d’analyses statistiques de type test de Wilcoxon-Mann-Whitney ou test de Student. La valeur P-value de p

Raffinement

Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l’expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux mais aussi la mise en place lors des procédures expérimentales d’analgésie et d’anesthésie permet de minimiser l’inconfort et la douleur. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront stabulées dans les cages d’un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité). Les souris seront hébergées en nombre de 5 par cage dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube, coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique. Aussi pour limiter l’inconfort lors de la prise de température, des puces seront placées chirurgicalement chez certaines souris (de 2 à 4 souris par groupe hormis pour le groupe contrôle alcool). Les mesures obtenues par les puces télémétriques Anipill seront comparées aux mesures prises par voie rectale pour évaluer la fiabilité des puces et pouvoir à termes favoriser l’utilisation des puces dans les protocoles. En parallèle de la procédure 1 et avant le challenge oral avec l’alcool, le groupe contrôle alcool réalisé sur un petit nombre de souris (n=10) déterminera exactement la dose d’éthanol la plus tolérable par les souris. Ainsi, cette procédure permet de limiter le nombre de groupe allergie alimentaire et cofacteur et de limiter des nuissances importantes sur les animaux.

Choix des espèces

Lors de cette étude, des souris femelles de souche Balb/c seront utilisées. Ces souches de souris constituent un modèle de choix, reconnu, dans le cadre d’étude du système immunitaire du fait de la caractérisation approfondie de ces souches. Il n’existe aujourd’hui pas de méthodes alternatives pour analyser efficacement et dans son ensemble la réaction allergique. De plus, l’allergie est caractérisée par des symptômes que seuls des modèles animaux peuvent adéquatement reproduire. Ainsi, l’expérimentation animale est un élément vital de ce projet afin de modéliser efficacement la réponse physiologique globale du système. Néanmoins, chaque fois que possible, les études sur les animaux seront remplacées par des systèmes in vitro. Des analyses phénotypiques des populations lymphocytaires seront réalisées. Les femelles Balb/c utilisées auront 3 semaines de vie à réception et auront 5 semaines de vie au début des procédures. Cinq semaines est l’âge idéal correspondant à des souris sevrées et adultes ayant un système immunitaire mature. Pour les souris avec une implantation d’une puce type Anipill, l’intervention chirurgicale sera effectuée à 4 semaines de vie permettant aux souris d’avoir un poids corporel correct.

Imagerie, puis ovariectomie par une incision d'une dizaine de centimètres sur la ligne médiane du ventre pour provoquer une ménopause, puis pose d'un stimulateur cardiaque destiné à déclencher une fibrillation auriculaire, avec des équipements électroniques implantés sous le muscle du cou : 95 brebis âgées de 7 à 10 ans vont passer par ces étapes. Pendant six mois au plus, elles repassent chaque mois sous anesthésie générale pour des séances d'imagerie, invasives ou non, et des prélèvements de fluides biologiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que la fibrillation provoquée est "asymptomatique chez la brebis" et cite comme effets possibles l'hypothermie et la désorientation au réveil des anesthésies, une hernie après l'incision et une cicatrisation prolongée autour des implants. Toutes seront tuées à l'issue, pour caractériser dans leurs tissus le remodelage cardiaque obtenu par la ménopause ou la fibrillation.

Objectifs

De plus en plus d’études montrent que la fibrillation auriculaire (FA) diffère entre les femmes et les hommes. Les femmes sont plus âgées au moment de l'apparition de la FA et la prise en charge est plus complexe et moins efficace. Parmi les rares études disponibles, nous observons qu’ un âge ménopausique plus jeune et un traitement hormonal limité ont été associés à un risque accru de FA et de maladies corrélées. Peu d'attention scientifique a été accordée aux différences entre les femmes et les hommes, d'où un manque de connaissances et de sensibilisation dans la communauté des chercheurs et dans le public. Par conséquent, afin d'améliorer le diagnostic et la thérapeutique de la maladie, nous devons mieux comprendre comment le rôle des hormones sexuelles influence le développement, la progression et le traitement de la FA. L'objectif de ce projet est la validation et caractérisation d’un modèle ovin de femelle ménopausée et son impact sur le remodelage atrial au cours de la fibrillation auriculaire

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de créer un modèle d’ovin pour mieux comprendre le rôle des hormones sexuelles dans la progression des maladies cardiaques, notamment de la FA. Les résultats de ce projet nous aideront à identifier les mécanismes spécifiques favorisants cette arythmie, et ils nous fourniront une base pour mieux prendre en charge les soins des patients atteints ou a risque de développer la FA à cause de leur sexe.

Procédures

Dans ce projet, 95 seront traitées. Ces animaux subiront des analyses d’imagerie, suivies par une procédure chirurgicale pour l’induction de la ménopause par ovariectomie. Ensuite, ils recevront un stimulateur cardiaque pour le déclanchement de la FA. Au long de leur suivi de maximum 6 mois, nous répèterons, avec une cadence mensuelle, ldes procédures d’imagerie non-invasive et invasive. Des prélèvements de fluides biologiques auront lieu mensuellement afin d’étudier les changements hormonaux et le bila métabolique. Toutes ces procédures seront effectuées sous anesthésie générale et monitorage des paramètres vitaux.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables éventuels peuvent être liés aux anesthésies (hypothermie) réalisées aux différentes procédures, notamment lors du réveil de l'animal (désorientation, apathie). L’ovariectomie par laparotomie médiale sur la ligne blanche d’une dizaine de centimètres pourrait éventuellement provoquer une hernie. Pour éviter ce type de complications, des points séparés et rapprochés seront réalisés afin d’éviter les tensions. Des effets indésirables attendus sont liés à l’implantation des équipements électroniques localisés en sous-musculaire dans la zone du cou pour induire et enregistrer la progression de la FA mais ils sont maîtrisés et correspondent à des phases de cicatrisation prolongées. L’induction de la FA chez la brebis peut provoquer une fréquence ventriculaire cardiaque irrégulière mais à noter que l’installation de la FA est asymptomatique chez la brebis ainsi les brebis saines et en FA sont indiscernable au niveau du comportement et de l’aspect physique.

Devenir

Tous les animaux impliqués dans ce projet seront mis à mort afin de caractériser à l’échelle tissulaire, cellulaire et biochimique les effets du remodelage cardiaque obtenu par la ménopause et/ou l’induction de fa fibrillation atriale. Ces données sont fondamentales pour prouver si et comment les hormones sexuelles jouent un rôle de protection contre la fibrillation atriale, et finalement envisager des thérapies ciblées et appropriée aux spécificités de la population féminine des patients.

Remplacement

Pour répondre aux questions d’ordre clinique, des modèles animaux de pathologies humaines et des tissus animaux sont nécessaires. Le remplacement des animaux n’est actuellement pas possible pour cette étude. En effet, les mécanismes physiologiques sont complexes dans leur globalité et nécessitent d’avoir recours à un modèle animal. S’y ajoute, qu’il n'existe pas à ce jour de modèles numériques ou même cellulaires pour répondre aux objectifs.

Réduction

Pour la première phase, nous avons estime une taille de 20 animaux en total, divisée entre un groupe ménopause et groupe ménopause + remplacement hormonale. Cela nous permettra d’avoir un nombre de 10 par groupe suffisant pour les observations des changements des niveaux hormonaux et ceux de type anatomique et électrophysiologique plus évidents. Pour la deuxième phase, nous avons fixé un nombre de 75 animaux max au long des 5 ans. Il s’agit du nombre minimal d’animaux nécessaire en se basant sur notre expérience antérieure dans l’utilisation d’autres modèles au cours de divers projets menés jusqu’à présent. Pour les deux phases, une attention sera portée à la réduction du nombre de ces animaux en recalculant le nombre statistiquement relevant après les premiers 5 et 10 animaux par groupe. Dans cet objectif de réduction, nous ferons également en sorte que chaque animal soit son propre contrôle dès que cela sera possible. Cela nous aidera dans le but d’obtenir des résultats plus robustes en utilisant moins d’animaux.

Raffinement

Le raffinement du projet et le respect du bien-être animal reposent sur plusieurs mesures, d’une part lors de l’hébergement dans des locaux agréés, les animaux bénéficient de soins quotidiens dispensés par du personnel compétent et soucieux du bien-être animal. Les animaux sont habitués au personnel animalier afin de limiter tout stress. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux ce qui leur permet d’exprimer des comportements naturels et ils disposent d’enrichissements adaptés (i.e. foin, pierre à sel, etc.). Afin de minimiser les risques amenés par la chirurgie, nous les habituerons à porter des gilets médicaux. D’autre part, lors de l’intervention chirurgicale et implantation de dispositifs de stimulation, la procédure est réalisée sous anesthésie générale (mise en œuvre et surveillance par du personnel dédié) et une analgésie adaptée est mise en place. Des critères d’alerte précis et effets adverses seront évalués et surveillés. Si un point limite est atteint, des mesures adaptées seront mises en place dans le plus court délai (administration d’une thérapie analgésique ou bien augmentation des doses si déjà en cours). Parallèlement, le responsable du projet, le responsable du bien-être et le vétérinaire délégué seront contactés.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proches de l’homme (ovin, porc, chèvre, chien), l’ovin a été identifié comme le plus adéquate car : •Les équipes possèdent une très grande expérience sur la création des modèles dans cette espèce ; •Ce modèle animal est bien décrit et caractérisé, et constitue une référence dans la communauté scientifique ; •Le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie dans la gestion de cette espèce ; •Les moutons fournissent également les dimensions et les propriétés physiologiques comparables à celles de l'homme. Nous utilisons des Femelles matures de 7 à 10 ans d’âge pour reproduire la ménopause et la susceptibilité à la FA chez la femme.

2288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des mutations sont introduites par électroporation dans le cerveau de souris nouveau-nées pour y induire un glioblastome, avant une euthanasie par perfusion intracardiaque précédée d'une thoracotomie sous anesthésie. Le porteur affirme n'avoir jamais observé d'effet dommageable jusqu'à six semaines, tout en décrivant au-delà une prostration et un poil hérissé qui le conduisent à ne pas garder les animaux plus longtemps. Il conclut qu'aucun modèle cellulaire ne récapitule les niches où se développent ces tumeurs et justifie l'étude sur l'animal entier.

Objectifs

Les glioblastomes (GBM) représentent la forme la plus fréquente et la plus agressive des tumeurs primaires du cerveau avec un pronostic de survie très bas. Lors d’experiences pilotes décrites dans une DAP précédente, nous avons établi un modèle de GBM chez la souris, qui permet d’étudier les étapes précoces de l’apparition des tumeurs. Ces tumeurs se déclanchent à cause de mutations qui surviennent dans des cellules souches du cerveau. Notre équipe travaille depuis longtemps sur ces cellules souches et nous sommes capables d’introduire des mutations en utilisant la méthode d’électroporation in vivo du cerveau de nouveaux-nés décrite dans les procédures et que nous utilisons régulièrement depuis plus de 10 ans. L’analyse de ces cellules ainsi modifiées sera effectuée à différents temps après l’induction des mutations et permettra de caractériser les évènements cellulaires et moléculaires qui interviennent pendant la période d’induction et de développement précoce des GBM.

Bénéfices attendus

Grâce à notre méthode qui permet d’introduire des mutations dans les cellules souches du cerveau, nous avons le moyen unique de pouvoir étudier les étapes précoces du développement des glioblastomes chez l’animal entier, possibilité qui n’existe pas à l’heure actuelle. Notre modèle pourra être utilisé pour tester l’effet de molécules particulières dans le développement précoce de ces cancers ou dans leur régression. Enfin, nous pourrons générer un modèle adulte des glioblastomes reflètant plus fidèlement ce qui se passe chez les patients atteints de ce type de cancer, dans le but ultime d’identifier des pistes thérapeutiques.

Procédures

Interventions: 1) electroporation du cerveau: geste réalisé sous anesthésie générale. Durée de l'acte: 1 minute maximum, effectué sur 2288 animaux nouveau-nés, 1 seule fois par animal. 2) Injection intrapéritonéale, durée moins de 1minute, effectuée 1 fois sur 336 animaux vigiles âgés de 2 à 30 jours, ou 2 fois sur 108 animaux âgés de 21 à 35 jours. 3) Thoracotomie dans le cadre d'une euthanasie par perfusion intracardiaque. Geste réalisé sous anesthésie générale sub-létale (surdosée) après une pré-médication avec un analgésique morphinique. Durée: 5 minutes, 1 seule fois car conduit à la mort de l'animal, sur 2288 animaux.

Impact sur les animaux

Les procédures sont appliquées sur des animaux nouveaux-nés qui sont euthanasiés entre 2 et 77 jours après. Nous pratiquons en routine depuis une douzaine d’année les procédures décrites dans ce projet et nous n’avons jamais observé d’effets nuisibles conséquents à ces actes sur la santé et le bien être des animaux. L’animal peut ressentir un stress au moment de sa contention et lorsqu’on introduit une aiguille fine dans son abdomen mais au regard de la durée extremement courte de l’intervention (moins d’une minute) nous pouvons estimer que le stress et la douleur induits sont très limités dans le temps. Les produits injectés n’entrainent pas d’effet indésirable sur les animaux. Nous n’avons jamais observé d’effet toxique du tamoxifène (molécule qui permet de réguler le récepteur à l’hormone oestrogène) injecté à des animaux dans d’autres projets. Les lignées transgéniques que nous utilisons dans ce projet sont non dommageables. Les autres effets indésirables attendus sont les effets du développement des tumeurs cérébrales. Dans un précédent projet, nous avons réalisé des expériences pilotes sur plusieurs animaux pour évaluer la taille des tumeurs et leurs conséquences sur leur santé et nous n’avons jamais observé d’effet dommageable selon la grille de score sur des animaux jusqu’à 6 semaines après l’induction des glioblastome malgré que la tumeur occupe une partie importante du cerveau. Il est possible que la tumeur engendre une augmentation de la pression intracranienne mais sans impact visible sur la santé de l'animal. Toutefois, nous avons observé sur quelques animaux l’effet de la tumeur après 6 semaines, qui apparait de façon soudaine et se caractérise par le comportement prostré de l’animal ayant un poil hérissé. Cependant nous ne gardons pas les animaux au-delà de ces 6 semaines car notre projet ne nécessite pas de garder des animaux présentant des tumeurs délétères pour leur santé.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélever leur cerveau en vue de leur analyse

Remplacement

Le but de notre projet est d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires intervenant dans les phases précoces de développement des GBM dans le contexte écologique de l’avènement des tumeurs en ciblant les cellules souches neurales de la ZSV des ventricules latéraux qui sont à l’origine de ces GBM. La prolifération et la différenciation de ces cellules souches sont contrôlées par des facteurs extrinsèques ou environnementaux présents au niveau de niches cellulaires qui entourent ces cellules. Ces facteurs sont sécrétés par exemple par les cellules gliales ou celles du système vasculaire. Malheureusement il n’existe pas de modèles cellulaires capables de récapituler ces niches cellulaires.

Réduction

Nous utiliserons une approche expérimentale simple et rapide qui permet de modifier l’information génétique des cellules souches directement dans le cerveau de souris nouveau-nés sans avoir besoin de créer des animaux transgéniques. Cette méthode par électroporation des cerveaux in vivo est utilisée en routine depuis plusieurs années dans le laboratoire. Grâce à notre expérience et notre maitrise de cette technique, notre taux de réussite est optimal et nous pouvons estimer au plus juste le nombre d’animaux suffisants à utiliser pour avoir des résultats reproductibles et tenant compte du taux d’échec des expériences réalisées par la suite sur les échantillons biologiques. Les groupes témoins et les groupes tests seront constitués à partir de mêmes portées, sans distinction de sexe, afin d’optimiser le nombre de nouveaux-nés utilisés par portée et donc de réduire le nombre de portée par expérience. Pour les analyses histochimiques, le nombre d’animaux nécessaires à l’étude a été réduit grâce au fait que chaque cerveau prélevé servira à l’analyse de plusieurs marqueurs. Le nombre d’animaux a été estimé en s’appuyant sur des tests statistiques appropriés pour ce type de procédure (test non paramétrique adapté aux petits échantillons, qui ne sont pas distribués selon une loi normale). De plus grâce à notre expérience concernant l’analyse statistique de résultats obtenus en utilisant ces méthodes dans d’autres projets, le nombre d’animaux pour ce projet a pu être réduit au strict nécessaire.

Raffinement

Selon les recommandations règlementaires, les souris sont élevées en groupes sociaux, dans des environnements enrichis par la présence de tunnel en carton, carré de coton et dôme pour la nidification, au sein d’une animalerie exempte de pathogènes et dont les paramètres physiques et sanitaires sont strictement contrôlés. 5 personnes sont dédiées à l’organisation, l’entretien des élevages et le soin aux animaux. Les animaux sont systématiquement anesthésiés avant toute procédure. Après l’expérimentation, ils sont hébergés dans une salle spécifiquement dédiée à la stabulation post-expérimentation, avec un suivi clinique quotidien. Les souriceaux d’une portée continuent d’être élevés tous ensemble avec leur mère. Tout au long de l’expérimentation et de la surveillance post-expérimentation nous nous attacherons à reconnaître douleur et anxiété et à les soulager si elles apparaissent, à agir lorsque les points limites prédéfinis sont atteints, à noter les observations faites et les actions entreprises. -Lors de la perfusion intracardiaque, pour éviter toute souffrance, une prémédication de buprénorphine est administrée avant la perfusion, puis les animaux sont anesthésiés par un surdosage d’anesthésique. L’acte n’est réalisé qu’après s’être assuré que l’animal est sans réaction.

Choix des espèces

De façon générale, la souris est le modèle mammifère le plus utilisé par la communauté scientifique pour établir des modèles de cancers in vivo permettant l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires des phases précoces de développement de cancer. Le modèle d'induction de glioblastome par mutation de 3 gènes critiques a déjà été décrit chez la souris par d'autres équipes scientifiques et mime différentes caractéristiques cellulaires et moléculaires de la genèse et du développement des glioblastomes. Ce modèle est donc réalisable et pertinent. De plus, grâce à notre adaptation basée uniquement sur l’électroporation, nous pouvons étudier les étapes d’induction et de développement précoce des glioblastomes dans des contextes génétiques mutants existant uniquement chez la souris. Tous les animaux seront électroporés au stade nouveau-né car c’est le stade où les cellules souches neurales qui bordent les ventricules latéraux sont extrêmement nombreuses et peuvent être modifiées génétiquement en introduisant facilement des molécules d'ADN. Les animaux seront euthanasiés à différents temps après l’électroporation, de 2 jours jusqu’à un maximum de 11 semaines, pour suivre l’évolution des cellules génétiquement modifiées. Toutefois la plupart des animaux sera euthanasiée avant 4 semaines.

6 furets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le titre annonce un vaccin contre la tuberculose, mais aucun vaccin n'est administré, les furets ne recevant que du sérum physiologique et servant à entraîner le personnel aux gestes techniques, jusqu'à douze prises de sang, un lavage broncho-alvéolaire, la pose de puces télémétriques et des administrations intratrachéales sous anesthésie générale. Ils sont tués à la fin pour prélever une banque de tissus témoins destinés aux projets suivants. Le porteur affirme qu'aucun système in vitro ne reproduit la complexité du tissu pulmonaire et décrit le furet comme un bon modèle pour remplacer le blaireau.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans un projet scientifique plus global visant à étudier la vaccination contre la tuberculose. Le modèle furet est utilisé pour la première fois dans nos conditions d’expérimentation. L’objectif est de permettre au personnel d’acquérir une maîtrise des actes classiquement utilisés dans les projets en infectiologie sur le modèle furet et plus particulièrement dans l’étude de la tuberculose animale. Pour ce projet, 4 animaux (sexe indifférent, en fonction des possibilités d'approvisionnement) seront utilisés. Ce projet a deux finalités : 1) Il répond à la réglementation en expérimentation animale en vigueur concernant la maitrise et le maintien du savoir-faire du personnel en particulier animalier. Ce projet a en effet pour objectif de les former à la mise en œuvre de gestes techniques (manipulation et contention, anesthésie générale, prise de sang, pose de puces télémétriques, administration par voie intratrachéale ou par voie digestive, injections intramusculaire et sous-cutanée et lavage broncho-alvéolaire) et à l’utilisation du modèle furet dans le cadre de projets de recherche impliquant un agent pathogène respiratoire. 2) Constituer une banque de tissus d’animaux sains qui serviront de contrôles pour les expériences ultérieures. A l’issue du projet, les animaux seront mis à mort afin de prélever une variété de tissus. Le personnel animalier est habitué à l’utilisation d’animaux vivants (animaux de rente et animaux de laboratoire) et au respect du bien être animal. Les furets seront hébergés dans leur nouvel environnement pendant une durée de 2 semaines avant les premières interventions (période d'acclimatation à l'environnement et période d'habituation au personnel). Ils seront hébergés dans des cages reliées entre elles par un sytème de tunnels. Plusieurs types d’enrichissement seront proposés : hamac, jouets.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont doubles : 1) Permettre la mise en place du modèle furet et l’acquisition d’un savoir-faire expérimental nécessaire à la recherche en infectiologie et plus particulièrement dans le cadre de l’étude de la vaccination contre la tuberculose. En effet, ce projet permettra d’optimiser les techniques (manipulation et contention, anesthésie générale, prise de sang, pose de puces télémétriques, administration par voie intratrachéale ou par voie digestive, injections intramusculaire et sous-cutanée et lavage broncho-alvéolaire) mais aussi de tester et adapter le matériel (enrichissement, télémétrie sur des animaux sains, friandises). 2) Constituer des banques de tissus et d’échantillons de sang pour réduire l’utilisation d’animaux lors des prochains projets. Tous ces échantillons et prélèvements constitueront les contrôles pour les prochains projets qui visent à étudier la réponse immunitaire après vaccination par le BCG (Bacille de Calmette et Guérin). Autrement dit, grâce aux prélèvements réalisés dans ce projet, il ne sera pas nécessaire d’avoir un lot contrôle non vacciné dans les prochaines études sur furet/BCG. Les prélèvements de sang permettront d’acquérir des données sur la population des cellules immunitaires d’animaux sains. Les différents tissus et organes prélevés à l’issue du projet constitueront une banque d’échantillons témoins. Par ailleurs, une partie de ces prélèvements sera également envoyée dans des plateformes spécialisées dans le marquage histologique des tissus. Il est également envisagé d’établir une grille de bien-être qui pourra être utilisée lors des prochains projets.

Procédures

Les animaux ne recevront que du sérum physiologique stérile. Il peut y voir des hématomes liés aux différentes injections. Les injections pourront être différées. Il peut y voir des soucis anesthésiques (cas rares) liés à la réaction propre à chaque individu face aux molécules d’anesthésies. Au cours des 3 mois du projet, chaque furet sera soumis au maximum à : - 12 prises de sang : au maximum 1 prélèvement par semaine. Une prise de sang dure quelques secondes - 1 LBA (lavage-broncho-alvéolaire) qui dure 2 à 5 min - 6 administrations en IM (intra musculaire) ou SC (sous cutanée), qui durent quelques secondes - 3 administrations par voie digestive, qui durent 2 à 5 minutes - 3 administrations en intra-trachéale, qui durent quelques secondes - 1 pose d’implant contraceptif en SC (sous cutanée), qui dure quelques secondes - 2 poses de puces télémétriques qui durent quelques secondes Tous ces actes se feront sous anesthésie générale pendant 5 à 30 minutes selon la nature et le nombre d’actes effectués

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pourraient être liés à une mauvaise réaction des animaux à l’anesthésie générale ou à un des gestes techniques qui induirait une réaction inflammatoire locale, un hématome ou une infection. En raison de leur hébergement en groupe, d'éventuelles blessures infligées par les congénères sont possibles (griffure, morsure…)

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l’issue du projet afin de constituer une banque de tissus d’animaux sains qui serviront de contrôles pour les expériences ultérieures.

Remplacement

A ce jour, il n’existe aucun système in vitro ou méthode alternative permettant de reproduire la complexité du tissu pulmonaire et les processus complexes de recrutement des cellules immunitaires. Le blaireau est l’espèce cible pour l’étude de la tuberculose mais les expériences sur cette espèce sauvage sont difficiles à mettre en œuvre. Cependant, il a été démontré par la communauté scientifique que le furet est un bon modèle pour remplacer le blaireau.

Réduction

Pour ce projet, le nombre d’animaux minimal a été fixé à 4 pour favoriser d’une part le lien social entre les animaux, pour avoir suffisamment d’échantillons biologiques qui soient statistiquement pertinents pour la suite du projet et enfin pour avoir la possibilité d’expérimenter les interventions sur différents animaux et former plusieurs personnes. Le nombre d’animaux utilisés pour fournir des échantillons « contrôle » a été déterminé grâce à un test statistique de calcul de la puissance ou de l'effectif nécessaire en utilisant un test de comparaison de deux échantillons indépendants. Un maximum d’analyses sera effectué sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, évaluation de la charge vaccinale). Ces animaux seront utilisés pour fournir les échantillons « contrôle » d’un projet qui se déroulera ultérieurement. Ces animaux n’étant ni vaccinés, ni infectés par Mycobacterium, la réponse immunitaire contre cette bactérie sera faible et homogène entre les animaux.

Raffinement

Le projet est prévu sur une durée de 3 mois (12 semaines). Une période d’acclimatation à l’environnement et d’habituation au personnel animalier sera mise en place à reception des animaux pendant 14 jours. Lors de cette période, la seule intervention du personnel sera d’habituer les animaux à leur présence et aux contacts : contention, jeux, friandises. Les animaux seront hébergés dans des cages conçues spécifiquement pour le furet. Chaque furet disposera de sa propre cage mais toutes les cages seront interconnectées entre elles par un système de tunnels permettant aux furets de se regrouper. Le tunnel constitue également une forme d’enrichissement. Un hamac en tissu sera suspendu à l’intérieur de chaque cage pour permettre aux furets d’avoir un coin de repos. Pour le jeu, différents types de jouets seront testés (balle, jouets en plastique dur, tissus, tunnel dans la cage…) afin de déterminer les plus attractifs. Des récompenses alimentaires pourront être données après les interventions qui ne nécessitent pas d’anesthésie générale (contentions, injections sous-cutanée et intramusculaire si possible). Les furets maintenus sous anesthésie générale gazeuse (avec induction en boite) seront sous monitoring (fréquence respiratoire, saturation, fréquence cardiaque, température), sous lampe et/ou tapis chauffant, et sous la supervision de personnel. Lors de l’intubation intra-trachéale, du gel de xylocaïne sera mis sur la sonde d’intubation et un spray de xylocaïne sera utilisé pour anesthésier la gorge. Lors da la phase de réveil, une surveillance rapprochée de l’animal sera faite. En cas de besoin, du doxapram et de la buprénorphine seront disponibles, pour faciliter le réveil et gérer une éventuelle douleur. En cas d'infection, un traitement antibiotique de 1ère intention à base d'amoxicilline sera mis en place. Deux visites quotidiennes seront réalisées afin de surveiller l’état de santé des animaux. Des point limites adaptés ont été définis et la vétérinaire de l’unité sera avertie en cas d’apparitions de signes cliniques.

Choix des espèces

Le furet est un modèle validé pour l’étude d’espèces de la faune sauvage (blaireau) qui constitue l’espèce ciblée par le projet de vaccination contre la tuberculose animale. Le furet et le blaireau sont deux espèces de Mustélidés qui sont sensibles à Mycobacterium bovis. Le blaireau étant une espèce sauvage, l’expérimentation sur cette espèce est soumise à une réglementation complémentaire contrairement au furet qui est une espèce domestique. Animaux adultes âgés d’environ 1 an (poids d’environ 1400 g pour les mâles et 1200 g pour les femelles). Le choix d’animaux adultes est conditionné par le fait que la vaccination est plus pertinente sur animaux adultes que chez des jeunes dont le système immunitaire est en cours de développement.

1392 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire le syndrome de Leigh, une maladie mitochondriale mortelle, elles développent une perte de poids, un retard de croissance puis une faiblesse musculaire et des difficultés respiratoires avant d'être tuées à des âges définis pour prélever leurs organes. Le porteur présente cette première étude comparative de deux modèles murins comme une source de connaissances sur une maladie sans traitement. Il affirme que les lignées cellulaires ne peuvent pas reproduire les mécanismes d'adaptation de l'organisme entier.

Objectifs

Les maladies mitochondriales sont des maladies causées par des mutations du génome des mitochondries, les centrales énergétiques des cellules, ou du génome nucléaire, et à l’issue souvent fatale. Elles peuvent se manifester à tout âge et se présentent comme des maladies qui affectent généralement les muscles et le cerveau. Il n’existe pas de thérapies efficaces contre ces maladies à ce jour, en raison d'une compréhension insuffisante des mécanismes sous-jacents. Des mécanismes complexes impliquant une réponse au stress lié aux déficits des mitochondries sont de plus en plus suspectés d’être impliqués dans ces pathologies. Le syndrome de Leigh représente la maladie mitochondriale pédiatrique la plus courante. C'est une maladie mortelle affectant à la fois le cerveau et les nerfs. Elle est causée par des mutations de plus de 75 gènes impliqués dans le métabolisme mitochondrial. Ce projet, financé par l’Association Française contre les Myopathies, vise à caractériser de manière exhaustive les mécanismes de réponse précoce au stress induits dans les organes par un dysfonctionnement des mitochondries, en comparant différents modèles de souris du syndrome de Leigh. Ceci devrait permettre d’avoir une meilleure connaissance des mécanismes physiopathologiques du syndrome de Leigh, afin de définir de nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Il s'agit de la première étude comparative métabolomique de 2 modèles murins du syndrome de Leigh, et qui, de ce fait, devrait apporter des connaissances importantes sur cette pathologie qui ne dispose d'aucun traitement à l'heure actuelle. Elle pourrait nous aider à identifier des cibles thérapeutiques concrêtes et jusqu'à aujourd'hui non suspectées.

Procédures

Les animaux ne vont pas subir d'intervention puisqu'ils seront euthanasiés dès qu'ils atteignent l'âge requis pour un prélèvement d'organes post-mortem (7 jours, 14 jours, 21 jours, 28 jours, 35 jours et 42 jours).

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans ce projet ont un phénotype dommageable qui commence par une perte de poids et un retard de croissance (à respectivement 4 et 3 semaines), puis des difficultés progressives à se mouvoir qui vont à terme résulter en phénotype de faiblesse musculaire, avec difficultés respiratoires peu avant le décès (vers 8 et 7 semaines respectivement).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure, car nous réalisons uniquement des prélèvements d'organes post-mortem à différents âges d'analyse.

Remplacement

Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle par un modèle in vitro, car les modèles physiopathologiques par définition étudient les conséquences pathologiques de la mutation sur l’ensemble de l’organisme. Les lignées cellulaires tels que les cellules de peau de patients atteints par le syndrome de Leigh ne peuvent pas reproduire les mécanismes complexes d'adaptation physiologique systémiques liés à ces dysfonctionnements des mitochondries.

Réduction

Nous réduisons au maximum le nombre d'animaux à utiliser pour obtenir des résultats exploitables au niveau statistique. Ainsi nous allons utiliser les mêmes souris pour les échantillons tissulaires destinés à la protéomique et la transcriptomique. Pour obtenir des résultats exploitables sur le plan statistique, nos expériences solides de ces méthodes Omics nous impose d'utiliser au minimum 15 souris/groupe expérimental pour la métabolomique.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la structure de bien être animal, les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets (maisons, copeaux, papier…). Les animaux sont surveillés quotidiennement par le personnel compétent. En raison du phénotype dommageable des souris, nous ajoutons de la nourriture directement dans les cages, et utilisons des biberons avec tétine longue, pour permettre aux animaux de s'alimenter plus facilement.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour les maladies humaines, car l'organisation de son génome est très similaire à celles de l'homme. De plus, la disponibilité de souris génétiquement modifiées permet d'étudier finement les mécanismes sous-tendant la pathogenèse de ces maladies mitochondriales. Dans le cas présent, l'utilisation de deux modèles du syndrome de Leigh, qui présentent des atteintes mitochondriales différentes , permettra de mieux comprendre la pathogenèse de cette maladie. Les souris seront utilisés à divers stades post-naissance, de 7 jours à 42 jours, afin de déceler les changements rapides qui s'opèrent lorsque le syndrome de Leigh se développe chez ces animaux.

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie de la moelle épinière par stéréotaxie créant une lésion de la myéline, ainsi qu'une castration ou une ovariectomie, pour étudier le rôle du récepteur des androgènes des astrocytes dans la réparation de la myéline. Le porteur indique que la lésion n'a pas entraîné de handicap dans ses études antérieures et prévoit la dissection du cerveau et de la moelle après mise à mort. Il affirme que les cultures cellulaires ne peuvent pas remplacer l'analyse chez l'animal pour ce processus de remyélinisation.

Objectifs

Bien que nous ayons identifié le récepteur des androgènes (AR) comme une cible thérapeutique clé pour promouvoir la réparation de la myéline, le mécanisme responsable de cet effet remyélinisant de la testostérone via ce récepteur n'est pas encore bien élucidé. L'objectif de notre projet d’étude consiste à déterminer quel type de cellule neurale est nécessaire pour exprimer AR (astrocytes, neurones...) afin de permettre l’activation des chimiokines et par conséquent le recrutement, au sein de la lésion démyélinisante, des oligodendrocytes matures et myélinisants, capables de promouvoir la réparation de la myéline. Au cours de nos travaux de recherche nous avons montré que la présence des cellules astrocytes au sein de la lésion démyélinisante est indispensable au recrutement d’oligodendrocytes et par conséquent à la remyélinisation. Au niveau fondamental, il est très important de caractériser la cellule cible, astrocytes, qui permet à la testostérone et son AR de promouvoir cet effet remyélinisant. Pour cela, nous utiliserons des souris transgéniques dont les astrocytes sont dépourvus du AR. Sur le plan clinique, les deux sexes, mâles et femelles, seront utilisés vu que cette maladie touche 3 fois plus de femmes que d’hommes. De même, Le statut hormonal des patients atteints de sclérose en plaques, souvent négligé, mérite une attention particulière pour des stratégies de remyélinisation efficace. Chez les hommes atteints de sclérose en plaques, de faibles niveaux de testostérone résultant de dysfonctionnements de l'hypothalamus et de l'hypophyse ont en effet été associés à une incapacité neurologique et à des résultats cliniques défavorables. En outre, le risque d'admission à l'hôpital pour une sclérose en plaques est significativement plus élevé chez les hommes diagnostiqués pour un hypofonctionnement testiculaire (baisse du niveau de testostérone et de son récepteur).

Bénéfices attendus

A terme, ce travail permettra de confirmer ou infirmer l’implication du récepteur astrocytaire des androgènes dans l’effet remyélinisant de la testostérone. Ce travail permettra de valider l’efficacité des protocoles proposés dans la réparation de la myéline des souris malades et il apportera des informations importantes sur les moyens d’optimiser le traitement de ces pathologies démyélinisantes chez les patients. En effet, et comme indiqué plus haut, les taux d’androgènes sont réduits chez les malades de sclérose en plaques, à travers nos travaux, nous suggérons un rétablissement de taux normaux de testostérone lors des traitements de ces malades en fonction du sexe. Il conviendrait donc de proposer des traitements personnalisés de remyélinisation et de la médecine de précision dans la sclérose en plaques. Il serait également possible et intéressant d'utiliser des androgènes synthétiques actifs par voie orale pour favoriser la réparation de la myéline

Procédures

Chacun des animaux inclus de ce projet subira une opération chirurgicale au niveau de la maoelle épinière par stéreotaxie. La durée de l'opération ne dépassera pas 10 min. L'animal sera sous anésthésie avant, pendant et après l'opération et durera entre 30 à 50 min. Le génotypage se fait sur des prélevements de queues de souriceaux de 11 jours, en quelques secondes.

Impact sur les animaux

Nos études précédentes, concernant la lésion in situ de la myéline par la LPC, au niveau d’une seule région de la moelle épinière, n’ont pas montré d’handicape chez les souris. Une fois l’effet de l’anesthésie est terminé, les animaux reprennent doucement leur activité et mobilité et quelques heures après l’opération, ils se comportent normalement. Néanmoins, le suivi sera effectué quotidiennement afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress et des fiches d’évaluations individuelles nous permettront de suivre la bonne récupération des animaux après les chirurgies. En Tous les autres animaux inclus de ce projet et ayant répondu à tous les critères du bienêtre animal seront euthanasiés à terme (4 semaines après l’opération chirurgicale). Leurs moelles épinières seront disséquées et utilisées pour les analyses nécessaires à ce projet.

Devenir

A la fin de l'expérience qui aura duré 4 semaines, le sang des animaux sera recueilli pour des analyses d’hormones stéroïdes (testostérone, estradiol…). Les restes des corps seront disséqués pour isoler les cerveaux et moelles épinières. Ces derniers seront maintenus dans le fixateur jusqu’au moment de les couper. Ces coupes serviront entre autres aux analyses immunohistologiques afin d’analyser l’état de la myéline chez ces différents types de souris, traitées ou non avec la testostérone.

Remplacement

Malgré une analyse de l’effet faisant l’objet de cette demande dans des cultures cellulaires, ces dernières ne peuvent pas remplacer l’analyse de l’effet chez l’animal. Les cultures mixtes (neurones, astrocytes et oligodendrocytes) sont compliquées à réaliser et en plus la myélinisation des axones in vitro ne donne pas de bons résultats. Le processus de remyélinisation met en jeu des interactions complexes entre tous les types cellulaires présents dans la moelle épinière, et que toutes ces interactions ne peuvent être reflétées dans des cultures cellulaires. Cependant, les cultures organotypiques de cervelet ou de moelles épinières peuvent les remplacer car la myélinisation se fait convenablement, mais seulement chez des souriceaux (entre jours postnataux 0 et 10). Cette étape du projet (effet du AR astrocytaire sur le développement de la myéline) est d’ailleurs réalisée sur des cultures organotypiques, réduisant le nombre d’animaux utilisé dans notre projet. Ainsi, nous ne pouvons utiliser des animaux adultes pour étudier les processus de myélinisation et remyélinisation en culture organotypique. Le recours à l’animal est donc nécessaire à notre projet d’étude.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit à 8 par point expérimental, le minimum requis lors de nos travaux précédents de façon à mettre en évidence des différences statistiques. Nous utiliserons 192 souris en 5 ans. Pour utiliser le strict nécessaire de souris, nous n’utiliserons pas de souris pour des contrôles absolus (exemple de souris non traitées ou traitées que par la testostérone) car nous utiliserons les souris des groupes expérimentaux pour servir d’autocontrôles (régions éloignées des zones lésées) et des souris dont le génotypage est de type sauvage. De même, si les résultats sont statiquement significatifs dès les premières expériences, nous tacherons à réduire sensiblement le nombre total de souris. Nous pourrions par exemple nous affranchir des souris prévues pour la 3ème année ; ce qui réduirait le nombre à 128 seulement !

Raffinement

Nos animaux seront hébergés par groupe de 5 animaux par cage dans des conditions optimales d’hébergement (nourriture et eau disponible à volonté, présence de lambeaux fins de papier pour faire un nid, petits cubes de bois à ronger). Avant la procédure chirurgicale, les animaux seront manipulés avec soin pour qu’ils soient habitués aux procédures expérimentales. Pendant la procédure chirurgicale, des mesures thérapeutiques seront mises en place telles qu’un traitement analgésique et un tapis chauffant sera utilisé pour l’animal, sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Nous utilisons l'animal le plus utilisé par les chercheurs, la souris C57BL/6, pour leur facilité d’hébergement et d’élevage. Leur génome est très bien connu, ce qui permet de les "modifier génétiquement". Cet avantage nous permet d’utiliser des souris transgéniques et des souris sauvages du même fond génétique dans nos études expérimentales. Nous utiliserons des souris transgéniques, dépourvues du récepteur AR dans les astrocytes. Pour les études in vivo, nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines pour la castration et l’ovariectomie et des souris de 10 à 12 semaines pour la lésion LPC. Puisque nous traitons nos animaux par les stéroïdes tels que la testostérone, la castration et l’ovariectomie des animaux est indispensable pour éliminer tout effet des stéroïdes endogènes, synthétisés par les testicules et les ovaires (voir§ 4.2.1.). Notre projet d’étude de démyélinisation et remyélinisation chez ces souris adultes nous permettront de mieux comprendre les processus pathologiques de la gaine de myéline, rencontrés chez l’homme, atteint de sclérose en plaques.

948 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des chirurgies d'induction de fibrose du foie, des injections répétées et un suivi hebdomadaire par imagerie et prélèvements sanguins sous anesthésie, pour valider des vecteurs de thérapie génique ciblant les cellules du foie malade. Le porteur signale des pertes de poids, des risques d'infection et des ruptures de suture liés aux interventions. Il conclut qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité de l'"organisme entier" et que le recours à l'animal est "nécessaire".

Objectifs

Les maladies du foie, de causes très variées (excès de gras, alcool, virus, médicaments, atteinte biliaire, génétique etc), sont un enjeu majeur de santé publique. Elles mènent à la cirrhose qui est la 14ème cause de mort dans le monde et au cancer du foie, 3ème cause mondiale de décès par cancer. Quelle que soit l’origine de la maladie, un tissu cicatriciel excessif responsable de la maladie est fabriqué par des cellules appelées « myofibroblastes ». En même temps, les cellules assurant les principales fonctions du foie appelées « hépatocytes » meurent. De nombreux traitement ont été proposés mais jusqu’à présent aucun ne s’est montré satisfaisant par manque d’efficacité de ciblage sécurisé d’un type cellulaire présent dans le foie et l’apparition d’effets secondaires indésirables (ex : l’élimination de cellules saines en même temps que les cellules pathogéniques). Ce projet vise à développer et tester l’efficacité préclinique d’un vecteur de thérapie génique permettant l’élimination spécifique des myofibroblastes rendant le foie malade quelle que soit l’origine de la maladie, et d’un vecteur de thérapie génique protégeant les hépatocytes de la mort au cours des maladies chroniques du foie.

Bénéfices attendus

Il n’existe aucun traitement curatif des maladies chroniques du foie. Ce projet comprend des études précliniques de validation de vecteurs de thérapie génique ciblée pour les maladies chroniques du foie chez les animaux en vue d’application clinique thérapeutique chez l’humain.

Procédures

Des souris auront une intervention chirurgicale unique et terminale, sous anesthésie générale et sous analgésique (10 min). Des souris subiront une opération chirurgicale d’environ 15min sous anesthésie générale et sous analgésique. 15 jours après ces souris auront une intervention chirurgicale terminale, sous anesthésie générale et sous analgésique (10 min). Des souris recevront une injection (5min). Une partie d’entre elles recevront une deuxième injection 1 à 3 semaines après (5 min). 1 fois par semaine, pendant 2 mois maximum, ces souris seront soumises, en même temps, à une imagerie médicale d’une durée de 10 min et à un prélèvement d’un faible volume sanguin, le tout sous anesthésie. Des souris seront opérées chirurgicalement (environ 15min) sous anesthésie et sous analgésique. Ces souris recevront deux injections à 1 semaine d’intervalle en 5min. 1 fois par semaine pendant 2 semaines, ces souris seront soumises en même temps à une imagerie médicale d’une durée de 10 min et à un prélèvement d’un faible volume sanguin, le tout sous anesthésie. Des souris seront nourries avec un régime particulier pendant 16 semaines maximum et recevront deux injections à 1 à 3 semaines d’intervalle (5min/acte). 1 fois par semaine pendant 8 semaines maximum, ces souris seront soumises en même temps à une imagerie médicale d’une durée de 10 min et à un prélèvement d’un faible volume sanguin, le tout sous anesthésie générale. Des souris seront injectées 2 à 3 fois par semaine pendant 12 semaines (5min). 1 fois par semaine pendant 6 semaines, sous anesthésie, ces souris seront soumises en même temps à une imagerie médicale d’une durée de 10 min et à un prélèvement d’un faible volume sanguin.

Impact sur les animaux

Pour induire la fibrose du foie, un des modèles expérimentaux est chirurgical (15 minutes par intervention). Une perte de poids post-opératoire, des infections ou des ruptures de sutures pourraient survenir. Plusieurs actes seront pratiqués sous anesthésie (10 minutes environ par intervention) pouvant induire des nuisances comme le risque d’arrêt cardio-respiratoire, l’hypothermie et la perte de repère transitoire au moment du réveil. Des nuisances peuvent également être induites par les prélèvements sanguins et les injections comme un stress émotionnel de courte durée (5min maximum par acte) liés à la contention et la douleur de l’introduction de l’aiguille ou des saignements et irritations. Les régimes alimentaires ou le produit injectable utilisés pour induire une fibrose hépatique aux animaux entrainent une perte de poids pendant les 3 premières semaines qui se stabilise ensuite. Un des modèles de fibrose nécessite l’utilisation de souris transgéniques développant spontanément une fibrose hépatique qui reste asymptomatique jusqu’à l’âge de 12 mois. Dans ce projet ces souris seront maintenues jusqu’à l’âge de 4 mois maximum.

Devenir

L'euthanasie de tous les animaux de toutes les procédures est nécessaire pour pouvoir isoler les cellules du foie, évaluer la maladie du foie et pour valider le ciblage cellule spécifique des vecteurs de thérapie génique. Le prélèvement du foie entier ne permet pas la survie des animaux.

Remplacement

Les maladies du foie reposent sur de multiples interactions dans l’organisme entier entre les processus de régénération, d'inflammation, de vascularisation et de cicatrisation impliquant le support des autres organes du corps et n’est pas modélisable in vitro. Le ciblage spécifique d'un organe par rapport à un autre via l’injection d’un vecteur génique dans la circulation sanguine et l’étude de sa répartition corporelle n’est pas modélisable in vitro. De même, le ciblage spécifique d’un sous type cellulaire du foie par rapport aux autres cellules du foie nécessite d’étudier l’organe en entier. Aucun modèle 3D in vitro du foie ne reproduit actuellement la réelle complexité cellulaire du foie ni sa structure. Enfin, Il n’existe pas de lignées cellulaires proche de la physiologie réelle du foie. Pour étudier les signatures cellulaires saines ou malades dans l’organe entier, nous serons donc contraints d’utiliser des cellules primaires dont la survie est limitée en culture et qui ne peuvent être obtenues qu’à partir du foie des souris. Ainsi, pour développer cliniquement une thérapie génique ciblée, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire.

Réduction

A cause des variabilités entre animaux et des risques d’échec des procédures, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Le nombre d’animaux utilisés pour le projet est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre notre objectif scientifique. Le nombre d’animaux a été évalué à 948 maximum. Les tests in vitro seront réalisés sur des cellules primaires mais qui ne peuvent être maintenues à long terme après isolement. Pour les types cellulaires qui le permettent, une amplification sera réalisée en culture. Afin de réduire le nombre d’animaux, un seul modèle de fibrose sera utilisé pour réaliser les expériences in vitro. Autant que faire se peut, nous nous efforcerons d’isoler plusieurs types cellulaires à partir des mêmes animaux. Le nombre de candidats vecteurs sera réduit de 3 vecteurs à 1 au cours des procédures réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Grâce aux prélèvements sanguins et au suivi du transgène fluorescent qui nous permettent d’observer dans le temps la pathologie et l’expression de notre vecteur au cours des expérimentations, 1 seul temps d’euthanasie est nécessaire. Ceci permet de réduire le nombre d’animaux utilisés dans cette étude.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats scientifiques dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les animaux seront anesthésiés pour chacune des procédures et un analgésique sera administré en per et/ou post opératoire pour éviter toute souffrance liée à l’intervention chirurgicale. Au cours des chirurgies, les souris seront placées sur une plaque chauffante pendant et après l’opération, jusqu’au réveil total, et leurs yeux seront protégés au cours de l’anesthésie par application d’ocry-gel. Au cours des expériences impliquant le produit médicamenteux induisant la fibrose, aucun analgésique ne sera administré en même temps aux souris afin d’éviter toute surdose et une insuffisance hépatique. Dans le cas des injections répétées, plusieurs sites d’injection seront alternés au cours des procédures pour éviter une irritation locale et diminuer le risque d’ascite. Des points limites ont été définis suivant une grille d'évaluation établie sur l’apparence physique, le poids et le comportement animal, adaptés à chaque procédure. Si l’animal atteint un point limite il sera soulagé par l’administration d’un analgésique et si les symptômes persistent où sont trop sévères, l'animal sera euthanasié. Les prélèvements sanguins et l’imagerie médicale réalisés au cours des procédures permettent également de surveiller précisément toutes déclarations de symptômes. Les souris seront prises en charge par du personnel qualifié et entrainé aux procédures, et examinées quotidiennement. Les animaux seront hébergés 7 jours avant le début des procédures jusqu’à l’euthanasie en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles dans un environnement enrichi favorisant les comportements exploratoires et réduisant ainsi le stress. Les animaux seront hébergés dans une pièce où les paramètres environnementaux (température, hygrométrie, lumière) et sanitaires sont contrôlés. Au cours des 7 jours d’hébergement avant procédure, les souris s’adapteront à leur nouvel environnement et un contact sera mis en place afin de les habituer aux manipulations et ainsi réduire leur stress au cours des procédures. Les personnes non formées agiront en tant qu’observateurs et toujours accompagnés par un membre formé.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris, dans la littérature est la plus référencée pour les modèles de maladies hépatiques notamment pour leur grande reproductibilité et leur capacité à développer une pathologie très proche de l’homme. De plus la souris possède une vésicule biliaire tandis que le rat n’en possède pas. Or la vésicule biliaire possède un rôle dans la régénération du foie et son absence au cours des modèles biliaires pourrait biaiser les résultats. La fibrose hépatique est un processus insidieux et indolore pouvant mettre plusieurs années à se déclarer chez l’humain adulte. Chez la souris elle est également asymptomatique et peut prendre jusqu’à 3 mois pour s’installer en fonction des modèles. Dans ce projet, les souris utilisées seront donc de jeune adulte de 8 à 10 semaines afin de participer à des procédures pouvant durer plusieurs mois sans être affectées par un vieillissement avancé.