Recherche fondamentale

12 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles de la dystrophie myotonique de type 1, elles reçoivent jusqu'à trente-six injections sous-cutanées sur douze semaines pour tester si une molécule réduit l'expansion d'ADN caractéristique de la maladie. Le porteur indique que les injections répétées peuvent causer des irritations et des ulcérations de la peau, et que les souris sont tuées à la fin pour des analyses incompatibles avec leur maintien en vie. Il présente cette étude comme un travail pilote et précise que les 12 souris proviennent de croisements déjà réalisés pour d'autres projets.

Objectifs

La dystrophie myotonique de type 1 est une maladie qui touche plusieurs organes tels que le muscle et le cerveau. Elle se caractérise principalement par un trouble du tonus musculaire et une détérioration progressive des fonctions neuromusculaires. Cinq formes cliniques ont été décrites dans la population atteint de la dystrophie myotonique de type 1. Parmi ces cinq formes, il y a une forme tardive qui se caractérise par une cataracte et une forme congénitale qui se caractérise par des problèmes musculaires et cognitifs très sévères. Le défaut génétique de cette maladie correspond à une expansion d'un morceau d'ADN dont la taille augmente généralement au cours des générations et dans les tissus. Plus la taille est grande, plus les symptômes sont sévères et l’âge d’apparition précoce. L’objectif principal du projet est d’identifier de nouveaux facteurs impliqués dans la diminution de la taille du morceau d'ADN et donc de ralentir la progression de la maladie. L’objectif du projet est de tester les effets d'une molécule chimique sur la taille du morceau d'ADN chez la souris et ainsi savoir si cette molécule pourrait être utilisée comme outils thérapeutique.

Bénéfices attendus

Chez les patients atteints de la dystrophie myotonique de type 1, la taille du morceau d'ADN dans les tissus augmente avec l’âge du patient et est corrélé avec la progression des symptômes de la maladie. Plus la taille du morceau d'ADN est grand plus les symptômes sont sévères. Il est donc important de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à réduire la taille de ce morceau d'ADN dans l’ensemble des tissus et donc à ralentir les symptômes chez les patients. Il a été montré qu’une molécule chimique peut réduire la taille de ce morceau d'ADN dans des modèles cellulaires. Une étude pilote chez l’animal permettra de savoir si cette molécule, peut également réduire la taille de ce morceau d'ADN dans plusieurs tissus tels que le muscle après 3 mois de traitement. Cette étude permettra également de savoir si l’effet de cette molécule est homogène entre les tissus et de mieux comprendre son mode d’action, in vivo. À ce jour, aucun traitement curatif n’est disponible pour la dystrophie myotonique de type 1. Cette étude pilote est une étape importante pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

Le temps de la procédure est de 3 min. Les injections sous-cutanées seront réalisées 3 fois par semaine sur une période de 12 semaines. Le nombre maximum d’injections sera de 36 par souris. Les injections seront réalisées sur animal vigile. Les injections de la molécule d’intérêt se fera sur un lot de 6 animaux et les injections de l’adjuvant se fera sur un autre lot contrôle de 6 animaux. Les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire à l’issue de la période de traitement afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses.

Impact sur les animaux

Les souris hemizygotes, qui vont être utilisées dans ce projet, ne présentent aucun phénotype. Dans le cadre de ce projet, une procédure d’injection sous-cutanée va être utilisée. Les animaux pourront ressentir une douleur ponctuelle réversible liée aux injections. Les injections répétées peuvent causer des irritations et des ulcérations de la peau et des muqueuses. Les injections répétées seront réalisées à des endroits différents afin de diminuer les risques d’apparition de plaie, d’ulcère… Aucun effet indésirable résultant de la molécule ou de l’adjuvant a été répertorié dans la littérature.

Devenir

Afin de pouvoir analyser la distribution de la taille du morceau d'ADN dans différents tissus, les 12 souris seront euthanasiées à l'issue de la procédure. Les différentes analyses de biologie moléculaire réalisée dans le cadre de l’étude pilote ne sont pas compatibles avec le maintien en vie des animaux.

Remplacement

Il a été montré qu’une molécule chimique réduit le morceau d'ADN dans les cellules. Si certains mécanismes cellulaires peuvent être étudiés en culture, seule l'utilisation d'un modèle animal permet d'étudier les mécanismes tissu-spécifiques. C’est pour cela qu’un modèle murin de la dystrophie myotonique de type 1 est utilisé dans l’étude pilote. L’objectif de ce projet est d’étudier les effets de cette molécule sur la taille du morceau d'ADN dans différents tissus tels que le muscle qui est l’un des tissus les plus atteints chez les patients.

Réduction

Afin d'optimiser et de réduire le nombre d'animaux, les 12 souris utilisées dans cette étude pilote proviendront de croisements réalisés pour d’autres projets du laboratoire qui ont été autorisés. Sur la base de nos expériences préliminaires, une analyse statistique a permis d’estimer à 6 le nombre de souris nécessaire par condition (Molécule versus Adjuvant). Le nombre d’animaux est minimisé dans le cadre d’une étude pilote avec un protocole mis en place précédemment par des collaborateurs internationaux.

Raffinement

Les conditions d'hébergement des animaux seront adaptées pour réduire à son minimum le stress et la souffrance animale. Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température (20-24 degrés) et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (éclairage 6h30-18h30). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l’isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec des nids de lanière kraft. La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance de celui-ci. Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long de l’étude, avec un suivi journalier de la boisson, la nourriture et de l’état des animaux. La douleur liée aux injections est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Les animaux seront particulièrement surveillés après l’administration de la molécule et de l’adjuvant pour visualiser tout signe de toxicité imprévue qui nécessiterait l’euthanasie de l’animal. L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent.

Choix des espèces

Un modèle murin de la dystrophie myotonique de type 1 sera utilisé dans le cadre de ce projet. Dans ce modèle de souris, la taille du morceau d'ADN malade augmente au cours des générations et dans les tissus. Notre choix s'est donc orienté vers ce modèle afin de valider le rôle de notre molécule sur la dynamique de ce morceau d'ADN, in vivo. Les souris hémizygotes d’intérêt seront inclues au début de la procédure à l’âge de 3 mois. Les souris seront euthanasiées à l’âge de 6 mois après 3 mois de traitement. Les changements de la taille de ce morceau d'ADN sont facilement détectés dans les tissus de souris âgées de 3 mois par les méthodes de biologie moléculaire utilisées au laboratoire. Il a été montré que les variations de taille de ce morceau d'ADN sont plus importantes chez des souris de 6 mois comparées aux souris de 3 mois.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dans le cadre de travaux pratiques de master, elles sont immunisées trois fois par différentes voies, orale, nasale, sous-cutanée, intradermique ou sublinguale, avec prélèvements de sang, de fèces et de lavages vaginaux. Elles sont ensuite tuées pour étudier les réponses immunitaires dans la rate et les ganglions, une inflammation ou une prostration marquée entraînant une mise à mort anticipée. Le porteur affirme que cet apprentissage ne peut se faire sur un autre support qu'un "organisme entier" et que les analyses in vitro ne suffisent pas.

Objectifs

Chaque année, les étudiants devront réaliser un TP durant 2 semaines dont le but est d'évaluer les réponses immunitaires suite à l'immunisation par différentes voies muqueuses chez la souris (souche OF1).

Bénéfices attendus

Le projet permet aux étudiants Master d’observer les effets des différentes voies d’immunisation d’une formulation vaccinale sur un organisme entier. Il permet d’apprendre aux étudiants la manipulation des souris, les prélèvements de sang, sécrétions muqueuses et organes afin d’etudier les réponses immunitaires après diffférents types d’immunisation.

Procédures

Les souris seront immunisées 3 fois par voie orale, nasale, sous-cutanée, intradermique ou sublinguale. Le sang, les fèces et les lavages vaginaux seront prélevés 2 fois pour mesurer les réponses anticorps.

Impact sur les animaux

Des effets indésirables peuvent survenir chez les souris après la vaccination comme une inflammation au site d’administration de la formulation vaccinale pour les voies intradermique et sous-cutanée, une augmentation de la température du corps et une diminution de l’activité des souris ainsi qu’une légère perte de poids des souris. Ces paramètres seront vérifiés 3h, 24h, 48h, 72h après chaque immunisation. Les animaux seront surveillés pour vérifier l’absence d’inflammation du site d’injection (voies intradermique et sous-cutanée) et la température corporelle sera surveillée à chaque temps à l’aide d’un thermomètre rectal. Les souris seront pesées 72h après l’immunisation. L’apparition de troubles du comportement pouvant traduire une douleur ou une détérioration de l’état général seront surveillés. L’immobilité, la prostration, l’apathie, une inflammation excessive au niveau des sites d’injection et/ou de prélèvements, seront considérées comme critères de points limites qui conduiront à la mise à mort immédiate de l’animal.

Devenir

A la fin de l'expérience, tous les animaux seront mis à mort afin de pouvoir étudier les réponses immunitaires post-vaccinales au niveau de la rate et ganglions.

Remplacement

Cette étude permet d'apprendre aux étudiants comment on analyse les réponses immunitaires après vaccination chez la souris et comment on prélève les échantillons pour analyser ces réponses immunitaires. Cette apprentissage ne peut pas se faire avec un support pédagogique autre qu'un modèle souris. Les techniques ne peuvent pas être pratiquées et s'acquérir différemment. De plus, les étapes préliminaires d’analyse in vitro, bien qu’indispensables, ne sont pas suffisantes pour analyser l’effet des différentes voies d'immunisation d’une formulation vaccinale sur les réponses immunitaires. Les analyses in vitro avec des lignées cellulaires, ex vivo avec des cellules humaines ou murines ou des modèles 3D peuvent permettre d'analyser comment l'antigène et/ou l'adjuvant entre(nt) dans les tissus et active(nt) certaines cellules immunitaires mais il faut un organisme entier pour que tous les acteurs cellulaires soient présents et puissent se déplacer dans les sites d'induction afin que des réponses immunitaires post-vaccinales puissent étre générées. Ainsi les effets des voies d'immunisation ne peuvent pas être étudiés autrement que dans un modèle in vivo.

Réduction

Le nombre de souris utilisées dans cette étude est restreint afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés au cours de ce TP. Etant donné que lors de chaque promotion annuelle il y a 30 étudiants, l’utilisation de 30 souris permet à chaque étudiant de manipuler, réaliser les prélèvements et de préléver les organes d’un animal. Etant donné que l’on a 6 conditions différentes (5 voies d’administration de la formulation vaccinale et le groupe contrôle négatif), 5 souris seront utilisées par groupe.

Raffinement

Les souris seront observées dans les heures suivant l’administration de la formulation vaccinale (examen à 3h, 24h, 48h et 72h) pour vérifier qu’il n’y ait pas d’installation d’un état de prostration, l’absence de douleur au site d’administration par voie intradermique et sous-cutanée (difficulté à se déplacer, voire boitement, sensibilité importante au toucher des sites d’injection manifesté par un vif retrait de la patte).

Choix des espèces

La souris développe des réponses immunitaires très similaires aux humains. C’est la raison pour laquelle parmi les espèces animales utilisées en expérimentation, la souris est l'animal le mieux adapté pour évaluer les réponses humorale et cellulaire après vaccination. Les souris OF1 sont connues pour développer une forte réponse humorale et présentent donc un intérêt pour notre étude dans le cadre de ce TP. Les souris seront âgées de plus de 7 semaines pour s’assurer que le système immunitaire est mature.

816 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles enchaînent mises à jeun, contentions répétées, gavages et injections, et une inflammation intestinale leur est provoquée par un produit ajouté à l'eau de boisson, avant un prélèvement sanguin terminal. Le porteur décrit des signes de souffrance attendus, poil hérissé, perte de poids, léthargie, dos courbé, ataxie et tremblements. Il affirme que ces phénomènes sont "impossibles à étudier directement chez l'Homme", tout en indiquant avoir déjà utilisé des organoïdes intestinaux pour une partie des questions.

Objectifs

L’intestin est composé d’un épithélium simple, directement en contact avec le bol alimentaire et le microbiote. Il exerce trois fonctions principales, qui sont cruciales pour le maintien de l’homéostasie : i) la digestion et l’absorption des nutriments ii) un rôle endocrine et iii) un rôle de barrière sélective entre la lumière digestive et le milieu intérieur. Bien que l’hyper-perméabilité intestinale et le passage consécutif de produits bactériens dans le sang aient été proposées comme un des facteurs participant à l'inflammation chronique qui accompagne l'obésité et le diabète de type 2, les mécanismes moléculaires à l’origine des défauts d’intégrité épithéliale lors de ces pathologies demeurent mal compris. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer si la perte d'action de l’insuline, une caractéristique du diabète, conduit à une altération de la fonction barrière de l'intestin et une susceptibilité accrue à l'inflammation intestinale.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est la mise en évidence que la perte d'action intestinale de l'insuline contribue à l'hyperperméabilité et au risque accru d'inflammation ou d'infection intestinales au cours du diabète. Notre projet identifiera à la fois les cellules cibles impliquées et les voies de signalisation permettant l'action de l'insuline dans l'épithélium intestinal, ce qui est essentiel pour la conception de stratégies préventives et thérapeutiques.

Procédures

Tous les animaux feront l'objet d'une contention et d'une prélèvement par biopsie (30 secondes) -Un 1er lot d'animaux vigiles feront l'objet d'une mise a jeun (14h), de 2 à 7 contentions (30 secondes chacune), de 0 à 5 administrations orale de produit (1 min chacune), d'un prélèvement de sang (1min) et d'une injection de produit (1min). Ce 1er lot d'animaux recevra également un traitement dans l'eau de boisson (7 jours) induisant une inflammation intestinale. -Un 2ieme lot d'animaux fera l'objet d'une mise a jeun (14h), de 3 à 8 contentions (30 secondes chacune), de 0 à 5 administrations orale de produit (1 min chacune), d'un prélèvement de sang (1min) et de 2 injections de produit (1min). -Un 3ième lot d'animaux fera l'objet de 2 mises à jeun (4h et 14h), de 4 à 9 contentions (30 secondes chacune), de 2 à 7 administrations orale de produit (1min) d'un prélèvement de sang (1min) et d'une injection de produit (1min). -Un 4ième lot d'animaux fera l'objet de 2 mises à jeun (4h et 14h), de 3 à 8 contentions (30 secondes chacune) de 1 à 6 administrations orale de produit (1min), d'un prélèvement de sang (1min) et d'une injection de produit (1min). - Tous les animaux seront placés sous analgésie anesthésie profonde pour un prélèvement sanguin terminal unique (30 secondes par souris).

Impact sur les animaux

L'identification, les prélèvements, l’anesthésie/analgésie, la contention le gavage et les injections sont des sources de stress pour les animaux. Certains actes peuvent induire une sensation de douleur chez l'animal : douleur de courte durée au site d’injection (piqûre de l’aiguille) ou liées à l’inflammation intestinale. Concernant les procédures incluant l’induction d’une inflammation intestinale ou l’infection par des entéropathogènes, l’apparition de signes généraux de souffrances peut survenir : poil ébouriffé (ou hérissé), perte de poids, écoulement des yeux, léthargie, dos courbé, ataxie, tremblement.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés en vu de prélevements de sang et d'organes pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Dans ce projet, les modèles animaux seront développés dans le but d'obtenir des modèles de pathologies métaboliques (diabète) et inflammatoires (inflammation intestinale, infections entériques). Les dérégulations métaboliques et la réponse inflammatoire sont des phénomènes complexes faisant intervenir de nombreux dialogues inter-organes. Les animaux seront donc utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro. Ils permettent d'obtenir une représentation simplifiée de systèmes biologiques impossibles à étudier directement chez l'Homme. Cependant, nous avons utilisé des systèmes de culture tridimensionnelle à partir d'organoides intestinaux pour démontrer que la perte d'action de l'insuline altère certaines fonctions propres à l'épithélium intestinal.

Réduction

L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée. L'étude comprend 816 animaux. Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel approprié. La "significativité" des différences expérimentales sera évaluée par des tests adaptés à la comparaison de deux groupes ou plus. De plus, pour caractériser la réponse de l’intestin à l’insuline, nous avons utilisé une technique qui ne nécessite pas de traitement sur animaux vigiles et qui permet à partir d’une seule souris d’étudier plusieurs parties de l’intestin (duodénum, iléon et colon), et l'effet de plusieurs traitements, réduisant ainsi considérablement le nombre de souris.

Raffinement

La durée et dose des traitements seront réalisées selon les protocoles préétablis et maitrisés par notre équipe. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures (analgésiques, anesthésiques) afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. L’application des points limites établis (apparence, mobilité, comportement, changement de poids, suivi post- opératoire) pour chaque procédure de ce projet sera effectué.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour les études ayant attrait à la caractérisation de pathologies métaboliques et inflammatoires. Seule cette espèce possède des modèles présentant une délétion spécifique du récepteur de l'insuline dans des tissus d’intérêt, permettant ainsi la caractérisation de l'action de l'insuline au cours de ces pathologies. Les souris utilisées seront âgées de 8 à 10 semaines pour toutes les procédures. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal totalement mature.

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent contentions, biopsies, mises à jeun, gavages, prélèvements de sang et injections, certaines recevant une pompe osmotique implantée chirurgicalement sous la peau et un diabète induit provoquant polydipsie et glycosurie. Le porteur décrit des signes de souffrance possibles comme un poil hérissé, une perte de poids et une léthargie, avant un prélèvement sanguin terminal. Il indique que les dérégulations métaboliques et inflammatoires sont "impossibles à étudier directement chez l'Homme" et recourt à l'animal quand la culture in vitro ne suffit pas.

Objectifs

L’intestin est composé d’un épithélium simple, directement en contact avec le bol alimentaire et le microbiote. Il exerce trois fonctions principales, qui sont cruciales pour le maintien de l’homéostasie : i) la digestion et l’absorption des nutriments ii) un rôle endocrine et iii) un rôle de barrière sélective entre la lumière digestive et le milieu intérieur. Bien que l’hyper-perméabilité intestinale et le passage consécutif de produits bactériens dans le sang aient été proposés comme un des facteurs participant à l'inflammation chronique qui accompagne l'obésité et le diabète de type 2, les mécanismes moléculaires à l’origine des défauts d’intégrité épithéliale lors de ces pathologies demeurent mal compris. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer si la perte d'action d’un facteur qui médie les effets du glucose, conduit à une altération de la fonction barrière de l'intestin et une susceptibilité accrue à l'inflammation intestinale.

Bénéfices attendus

Le bénéfice potentiel de ce projet serait de mieux comprendre la fonction d'un facteur relayant habituellement les effets du glucose dans l'intestin. Il permettrait de notamament de comprendre si son blocage pourrait suffir à renforcer la barrière formée par l'intestin et ainsi empêcher l'augmentation de la perméabilité intestinale en cas d'hyperglycémie, ce qui est essentiel pour la conception de stratégies préventives et thérapeutiques, dans le contexte clinique des patients diabétiques et/ou obèses.

Procédures

Tous les animaux feront l'objet d'une contention et d'une prélèvement par biopsie (30 secondes). Un 1er lot d’animaux feront l’objet de deux mises à jeun (5h et 14h), de 6 administrations orales de produit (1min chacunes), de 3 prélèvements de sang (1min pour le prélèvement mandibulaire et 30sec par prélèvementcaudal) et de 2 injections de produit (1min chacun). ; 1 minute par prélèvement mandibulaire et 30sec par prélèvement caudal), Un 2ieme lot d’animaux feront l’objet de deux mises à jeun (5h et 14h), de 6 administrations orales de produit (1min chacunes), de 3 prélèvements de sang (1min pour le prélèvement mandibulaire et 30sec par prélèvementcaudal) et de 2 injections de produit (1min chacun). ; 1 minute par prélèvement mandibulaire et 30sec par prélèvement caudal), Ces animaux seront également placés sous anesthésie et analgésie pour la réalisation d’un acte chirurgical (implantation sous cutanée d'une pompe osmotique, 20 minutes). Un 3ieme lot d’animaux feront l’objet de trois mises à jeun (deux de 4h et une de 14h), de 8 administrations orales de produit (1min chacune), d’un prélèvement de sang (1min) et d’une injection de produit (1min). Un 4ieme lot d’animaux feront l’objet de trois mises à jeun (deux de 4h et une de 14h), de 8 administrations orales de produit (1min chacune), d’un prélèvement de sang (1min) et d’une injection de produit (1min). -Tous les animaux seront placés sous analgésie et anesthésie profonde pour un prélèvement sanguin terminal unique (30 secondes par souris).

Impact sur les animaux

Les prélèvements, l’anesthésie, la contention le gavage et les injections sont des sources de stress pour les animaux. Certains actes peuvent induire une sensation de douleur chez l'animal : douleur de courte durée au site d’injection (piqûre de l’aiguille) ou encore les douleurs post-opératoire (implantation de la pompe) ou liées à l’inflammation intestinale. De plus, la chirurgie comporte un risque pour l'animal lié à l'anesthésie (réveil, dépression respiratoire, hypothermie). Les souris rendues diabétiques présenteront une polydipsie associée à une glycosurie. L’implantation des pompes osmotiques en sous cutanée peuvent entraîner localement une inflammation (rougeur, gonflement) ou une infection (écoulements). L’infection par des entéropathogènes, ou l’induction d’un diabète, peut entraîner l’apparition de signes généraux de souffrance : poil ébouriffé (ou hérissé), perte de poids, écoulement des yeux, léthargie, dos courbé, ataxie, tremblement.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés en vu de prélevements de sang et d'organes pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Dans ce projet, les modèles animaux seront développés dans le but certaines caractéristiques de pathologies métaboliques (diabète) et inflammatoires (inflammation intestinale, infections entériques). Les dérégulations métaboliques et la réponse inflammatoire sont des phénomènes complexes faisant intervenir de nombreux dialogues inter-organes. Les animaux seront donc utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro. Ils permettent d'obtenir une représentation simplifiée de systèmes biologiques impossibles à étudier directement chez l'Homme.

Réduction

L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée. Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel approprié. L'étude comprend au total 280 animaux. La "significativité" des différences expérimentales sera évaluée par des tests adaptés à la comparaison de deux groupes ou plus. De plus des expérimentations ont préalablement été effectuées pour caractériser les conséquences intestinales de la perte d’action du glucose à partir d'organoides intestinaux issus de souris dont l’intestin ne répond pas au glucose.

Raffinement

La durée et dose des traitements seront réalisées selon les protocoles préétablis et maitrisés par notre équipe. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures (analgésiques, anesthésiques) afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. L’application des points limites établis (apparence, mobilité, comportement, changement de poids, suivi post- opératoire) pour chaque procédure de ce projet sera effectué.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour les études ayant attrait à la caractérisation de pathologies métaboliques et inflammatoires. Seule cette espèce possède des modèles présentant une délétion spécifique du récepteur de l'insuline dans des tissus d’intérêt, permettant ainsi la caractérisation de l'action de l'insuline au cours de ces pathologies. Les souris utilisées seront âgées de 8 à 10 semaines pour toutes les procédures. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal totalement mature.

36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent chaque semaine pendant huit semaines une injection intrathécale de protéines pathologiques prélevées sur des patients atteints de la maladie de Charcot, pour tenter de reproduire la maladie, et subissent des tests de motricité, de force musculaire et de curiosité. Le porteur indique que les souris pourraient développer une réduction de la mobilité et une perte musculaire progressive, un point limite portant sur la fonction motrice déclenchant alors la mise à mort. Il affirme qu'il est "indispensable" de générer un modèle de la forme sporadique, inexistant à ce jour, aucune alternative cellulaire ne permettant selon lui d'étudier la propagation de la protéine.

Objectifs

La maladie de Charcot, est une maladie neurodégénérative qui touche les neurones du cerveau et de la moelle épinière responsables du mouvement. La maladie débute en moyenne à l’âge de 60 ans et est responsable d’une paralysie progressive, de troubles de la parole et de la déglutition, et de difficultés respiratoires aboutissant au décès en 2 à 5 ans. Il n’existe à ce jour aucun traitement de la maladie, et la recherche sur la maladie de Charcot a été marquée ces 20 dernières années par une multitude d’essais thérapeutiques négatifs. Ces résultats sont en grande partie liés à la faible connaissance des mécanismes à l’origine de la maladie, et à l’absence de modèles animaux fiables. Deux formes de la maladie existent, les formes héréditaires causées par des mutations génétiques représentent moins de 10% des patients, et les formes dites sporadiques qui représentent plus de 90% des patients et pour lesquelles l’origine de la maladie est inconnue. Un acteur semble toutefois jouer un rôle central dans la maladie : une protéine appelée TDP-43, qui s’accumule de manière anormale dans les neurones des patients atteints de la maladie. Parallèlement, cette protéine semble jouer un rôle dans la propagation de la maladie au sein du système nerveux en se propageant de neurone en neurone. Malgré les avancées réalisées dans la compréhension des mécanismes impliqués dans la maladie ces dernières années, l’absence de modèle animal reproduisant la maladie est une limite majeure. Des modèles animaux portant les mutations génétiques responsables de formes familiales existent mais ne représentent que moins de 10% des patients. Il est donc indispensable de générer de nouveaux modèles représentatifs des 90% des patients atteints de la forme sporadique pour avancer dans la compréhension de la maladie et faire émerger de nouvelles pistes thérapeutiques. L’objectif du projet est de répondre à l’absence de modèles animaux fiables dans la recherche sur la maladie de Charcot en générant un modèle animal de la forme sporadique (inexistant à ce jour limitant les progrès de la recherche) pour permettre la compréhension des mécanismes impliqués et appliquer des stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Si les souris développent une pathologie similaire à la maladie de Charcot chez l’Homme, alors elle pourra être étudiée sur un modèle fiable de la maladie pour identifier les mécanismes impliqués afin de mieux comprendre l'origine et la propagation de la maladie, et enfin permettre d’identifier de nouvelle cible thérapeutique.

Procédures

Pour l’ensemble des procédures, les animaux seront manipulés par des personnes qualifiées et formées. Au total, 36 souris subiront une injection intrathécale par semaine pendant 8 semaines (équivalence de la ponction lombaire chez l’Homme) sous anesthésie générale courte avec anesthésie locale. L’anesthésie générale et l’injection durent en moyenne 10 minutes. La procédure démarre par deux semaines d’acclimatation des animaux à leur nouvel environnement, ainsi que l’habituation aux tests comportementaux qui seront réalisés. Une semaine après chaque injection, et avant l’injection suivante, les animaux subiront des tests comportementaux et cognitifs. Ces tests sont au nombre de 3 et visent respectivement à évaluer la motricité, la force musculaire et la curiosité. La durée de ces tests est d’environ 30 minutes par souris (3 tests différents de 10 min chacuns avec des temps de récupération entre chaque). Un mois après la dernière injection, les animaux seront euthanasiés pour prélèvements post-mortem et études biochimiques et d’imagerie.

Impact sur les animaux

Une procédure modérée telle que l’injection intrathécale entraine peu de douleur car cette procédure est réalisée sous anesthésie générale avec anesthésie locale sur la zone de l’injection, et que les animaux recevront une injection d’analgésique pour couvrir une éventuelle douleur post-injection. Les animaux sont surveillés au réveil, et dans les premières heures suivant l’injection puis quotidiennement. Une évaluation de la douleur sera réalisée et des antalgiques setont administrés si toutefois une douleur est décelée. L’injection de protéines pathologiques ayant pour but de créer un modèle de la maladie, les animaux seront également surveillés quotidiennement. D’après notre expérience, pas ou peu de signes de mal être sont attendus car la maladie de Charcot chez l’Homme n’entraîne pas de troubles cognitifs ni de dépression, mais ces symptômes seront tout de même surveillés. En revanche, si notre modèle permet d’induire des symptômes semblables à la maladie chez l'Homme, il est probable que les souris du groupe expérimental présentent peu à peu une réduction de la mobilité et une perte musculaire progressive (entrainant une perte de poids). Pour ces raisons, nous suivrons l’apparition de symptômes éventuels à travers la surveillance quotidienne des animaux, la pesée bihebdomadaire à partir des premiers symptômes, ainsi que par l’utilisation de tests hebdomadaires d’évaluation de la fonction motrice des animaux. La grille de score des points limite s’attarde notamment sur la fonction motrice des animaux de façon à ce qu’ils soient euthanasiés avant qu’ils ne développent des symptômes trop sévères les empêchant de se déplacer correctement et donc de s’alimenter et de boire correctement. Enfin, les tests comportementaux réalisés pouvant engendrer un stress lié à l’isolement et à la contention des souris, une habituation 15 jours avant le début de la procédure sera réalisée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des 2 procédures pour exploration de la propagation de la maladie par des études biochimiques et histologiques.

Remplacement

Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle par un modèle cellulaire car à ce jour il n’existe pas de méthodes alternatives pour étudier le rôle de la protéine TDP-43 dans l’induction et la propagation de la maladie de Charcot. En effet la maladie met en jeu l’organisme entier et plus particulièrement le système nerveux central (cerveau et moelle épinière). Les modèles cellulaires ne permettent d’évaluer le mode d’action qu’au niveau moléculaire et cellulaire sans pour autant apporter des informations extrapolables à l’organe ou à l’organisme entier. Aussi, il n’existe pas de modélisation mathématique ou d’alternatives non animales dans ce domaine.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum tout en permettant l’obtention de résultats exploitables au niveau statistique. Ainsi, 36 animaux au maximum seront nécessaires à ce projet : 3 groupes de 12 animaux (groupe expérimental, contrôle sain, contrôle négatif), dans chaque groupe se distinguent 2 sous-groupes en fonction de la destinée des animaux (6 animaux pour analyses biochimiques et 6 animaux pour analyses histologiques), et chaque sous-groupe est constitué de 50% de souris mâles et 50% de souris femelles. Ainsi 36 animaux sont nécessaires pour avoir minimum 3 réplicas par sous-groupe et par sexe. De plus, un groupe de souris sera utilisé pour mettre au point le protocole de mise à mort et de dissection permettant ainsi d’améliorer le protocole et de diminuer le nombre d’animaux utilisés par lots car moins de perte étant donné que le personnel sera formé. Ce groupe de souris utilisera des animaux de l’animalerie n’ayant pas les caractéristiques qui sont voués à être sacrifiés dans tous les cas.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages aux normes suivant l’âge et le poids des animaux (4 souris par cage car ce sont des animaux sociaux), et les animaux évolueront dans un environnement enrichi (cabane, coton, rouleau de sopalin, etc…). Les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel de l’animalerie. La douleur susceptible d’être induite par les injections sera limitée car elles seront réalisées sous anesthésie générale courte et accompagnée d’une anesthésie locale par précaution. Les animaux seront surveillés au réveil, et dans les premières heures suivant l’injection puis quotidiennement. Une évaluation de la douleur sera réalisée grâce à une grille de score. L’injection a pour but de créer un modèle pathologique modéré. En revanche, si notre modèle permet d’induire une pathologie semblable à la SLA, il est probable que les souris du groupe expérimental présentent peu à peu une réduction de la mobilité et une perte musculaire progressive. Pour ces raisons, nous suivrons l’apparition de symptômes éventuels à travers la surveillance quotidienne des animaux, ainsi que par l’utilisation d’une grille de score et de points limites adaptés. La grille de score s’attarde notamment sur la fonction motrice des animaux de façon à ce qu’ils soient euthanasiés avant qu’ils ne développent des symptômes trop sévères les empêchant de se déplacer correctement. Par ailleurs, si moins de 8 injections sont nécessaires à l’induction de la pathologie elles seront réduites au strict minimum. Aussi, les tests comportementaux pouvant engendrer un stress lié à l’isolement, une habituation 15 jours avant le début des tests sera réalisée. Par ailleurs, un groupe de souris sera prévu pour mettre au point le protocole d'injections, de dissection/expérimentation. Ce groupe utiliseras des animaux de l’animalerie n’ayant pas les bons génotypes qui sont voués à être sacrifiés dans tous les cas. Ceci contribue à réduire le nombre d’animaux dans les autres groupes et permet une meilleure utilisation des animaux dans un soucis de réduction et de raffinement.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour l’étude des maladies humaines car l’organisation de son ADN et l’expression de ses gènes sont similaires à celles de l’Homme. La souris est donc un outil précieux dans la plupart des domaines de recherche médicale et permet d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacent à de nombreuses pathologies humaines. De plus, c’est un modèle facile à entretenir, bien décrit et documenté. C’est un modèle utilisé dans le monde entier permettant ainsi de comparer les résultats entre les laboratoires de recherches. Les souris seront âgées d’environ 4 mois, l’âge moyen pour avoir des animaux adultes et mature car la maladie de Charcot est une maladie qui touche des adultes.