Recherche fondamentale
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Modèle de valvulopathies associées à la Filamine A chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
2475 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Dès le deuxième jour après la naissance et jusqu'à douze mois, ils subissent des séances répétées d'échographie, d'IRM et d'électrocardiogramme sous anesthésie, ainsi que des injections intrapéritonéales toutes les 72 heures, pour étudier une valvulopathie cardiaque reproduite par une lignée génétiquement modifiée. Un second axe repose sur une déplétion en macrophages, que le porteur reconnaît pouvoir provoquer infections, perte de poids et baisse de mobilité. Après chaque procédure, les rats sont tués pour analyser l'atteinte des valves, et le porteur décrit le recours au modèle animal comme "primordial".
Objectifs
Le prolapsus valvulaire mitral (PVM) est l’une des pathologies cardiovasculaires les plus fréquentes, et est associé à un haut taux de morbidité et de mortalité. A l’heure actuelle, aucun traitement pharmacologique n’est disponible pour les patients porteurs d’un PVM, la seule option étant la chirurgie valvulaire mitrale, une approche thérapeutique très invasive. Notre projet a pour objectif d'analyser et d’identifier les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la survenue du PVM, mais aussi de la cardiomyopathie associée à cette maladie valvulaire que nous avons récemment décrite chez les patients. Ce projet s’appuie sur l’étude du modèle unique de rat généré dans l’équipe : le rat KI FlnA-P637Q.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques impliqués dans le développement et la progression du PVM, ainsi que l’identification de potentielles cibles thérapeutiques pour traiter les patients.
Procédures
Des approches d’imagerie (échocardiographie et IRM) ainsi que des électrocardiogrammes de surface sont réalisés. Ces approches non invasives sont réalisées, sous anesthésie, dès le jour 2 après la naissance jusqu’à 12 mois (nombre maximal par animal = 8). Des injections répétées toutes les 72h en intrapéritonéal chez les rats sont réalisées : entre 7 jours post naissance et 13 semaines, ainsi qu’entre les semaines 26 et 39.
Impact sur les animaux
Aucune nuisance ou effet secondaire n’est attendu lors de la réalisation de l’Axe 1. La déplétion en macrophages (Axe 2) peut être associée à des effets indésirables de type infection, perte de poids, réduction de la mobilité ou changement de comportement des animaux, même si les données de la littérature restent rassurantes. Ces potentiels effets indésirables seront suivis quotidiennement, et les animaux présentant des point limites seront sacrifiés et le protocole adapté au besoin.
Devenir
Après chaque procédure, les animaux sont sacrifiés afin de caractériser l’atteinte valvulaire, par différentes approches complémentaires (histologie, cytométrie, RNA-seq sur cellules triées)
Remplacement
La modélisation in vitro ou in silico de la pathologie valvulaire cardiaque est limitée. En effet, les valves subissent à chaque cycle cardiaque des stress mécaniques multiples (tension, pression, flux) et répétitifs, qu’il est impossible de modéliser. De plus, le retentissement sur le myocarde de la pathologie, ne peut lui non plus être modélisé in vitro ou in silico. Une approche de physiologie et pathophysiologie intégrée est donc nécessaire pour répondre aux questions auxquelles nous faisons face.
Réduction
Des analyses intermédiaires (comparaison des animaux KI FLNA-P637Q et WT par t-test ou test de Mann-Whitney) seront réalisées et permettront selon les résultats obtenus de réduire le nombre d’animaux par conditions.
Raffinement
Les rats sont hébergés en cages ventilées enrichies en tunnel et frisottis, avec un accès à l’eau et la nourriture en continue. Les procédures d’imagerie et d’ECG proposées sont non invasives et permettent de suivre un même animal longitudinalement. Elles sont réalisées sous anesthésies à l’isoflurane. Pour ce qui est du protocole pharmacologique, un suivi quotidien durant la phase de traitement sera effectué afin de répertorier l’apparition de points limites. Cette approche permettra de modifier/raffiner le protocole expérimental.
Choix des espèces
De nombreux processus et systèmes biologiques inter-régulés et intégrés sont décrits dans le PVM. Il est donc impossible de substituer ou modéliser par des approches in vitro ou ion silico l’ensemble de ces processus. Le recours au modèle animal est donc primordial. De plus, les potentielles cibles thérapeutiques pourront être testées sur le rat FlnA-P637Q qui récapitule la complexité des processus physiopathologiques en jeu. Rappelons que le modèle de rat est particulièrement bien adapté à l’exploration des valves, qui sont des tissus très petits et difficiles à imager sur les souris. Nos données préliminaires suggèrent la présence de la pathologie valvulaire dès 7 jours post naissance. Nous devons déterminer le stade précis où la pathologie est présente afin d’étudier les mécanismes initiateurs. De plus, l’évolution de la pathologie a un intérêt thérapeutique. Nous allons donc utiliser les rats entre la naissance et l’âge de 12 mois.
Stratégies thérapeutiques pour la compensation des effets dus à la perte de fonction du gène Fpr1
- Recherche fondamentale
- Oncologie
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau puis des injections intrapéritonéales de traitements par contention à l'état vigile, avec un suivi de la tumeur au pied à coulisse trois fois par semaine, pour étudier comment restaurer l'efficacité de la chimiothérapie dans des cancers du sein et colorectaux. Les points limites prévoient la mise à mort quand la tumeur atteint 250 mm², en cas de diarrhée prolongée, de perte de poids supérieure à 20 % ou d'automutilation. Le porteur affirme que la question "ne peut être abordée qu'in vivo" et revendique un usage de 540 souris respectueux du bien-être des animaux non-humains.
Objectifs
Les dernières années ont vu l'émergence du concept de l'activation du système immunitaire contre le cancer, qui à son tour détermine le succès à long terme des traitements anticancéreux. Nous allons étudier comment compenser la perte de fonction du gène Fpr1 pour restaurer l’efficacité de la chimiothérapie in vivo. Les modèles expérimentaux in vivo sont les seuls moyens d’approche possibles car la réponse immunitaire n’a pas lieu dans les modèles in vitro ou ex vivo. Ce projet vise à une compensation des défauts associés à la perte de fonction de FPR1, un facteur pronostique négatif pour la réponse aux traitements anti-cancéreux à base d’anthracyclines et oxaliplatine, afin d’orienter la conception de nouvelles stratégies thérapeutiques chez les patients atteint de cancer du sein ou colorectal.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à une compensation des défauts associés à la perte de fonction de FPR1, un facteur pronostique négatif pour la réponse aux traitements anti-carcéraux à base d’anthracyclines et oxaliplatine, afin d’orienter la conception de nouvelles stratégies thérapeutiques chez les patients atteint de cancer du sein ou colorectal. Nous préconisions que l’accomplissement de ce projet fournira des connaissances sur la régulation de la réponse immunitaire aux cancers pour la mise en place de stratégies thérapeutiques ciblées.
Procédures
Les animaux seront soumis a : - L’injection de cellules tumorales en sous cutané sur l’animal anesthésié par inhalation d’isofluorane - L’injection des traitements intra péritonéaux par contention de l’animal vigile - Un suivi de la croissance tumorale par contention de l’animal vigile à l'aide d'un pied à coulisse 3 fois par semaine
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis a : - Une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie - L’injection de traitements intra péritonéaux par contention de l’animal vigile - Un suivi de la croissance tumorale par contention de l’animal vigile à l'aide d'un pied à coulisse 3 fois par semaine Ces différentes manipulations pouvant entrainer du stress chez l’animal, tout sera mis en œuvre pour le limiter. Notamment, l’injection de cellules tumorales sera faite sous anesthésie sur le dos de l’animal afin de réduire les phénomènes de gêne que peut engendrer la croissance tumorale. Les injections de traitements et le suivi de la croissance tumorale seront effectuées par contention de l’animal vigile, technique parfaitement maitrisée par les expérimentateurs dans le but de limiter l’exposition des souris à des anesthésiques.
Devenir
Les souris seront euthanasiées dès l’atteinte des points limites suivants : lorsque les tumeurs atteindront 250 mm2, en cas de diarrhée prolongée (>4 jours); en cas de perte de poids supérieure à 20% du poids initial; comportement général anormale (prostration, auto-mutilation, perte de fourrure).
Remplacement
La question scientifique ne peut être abordée qu’in vivo car il n’est pas possible d’étudier l’implication du système immunitaire sur le développement du cancer dans des systèmes in vitro.
Réduction
Nous souhaiterons effectuer cette étude sur un total de 540 souris pour permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Notamment, les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Le modèle choisit est très bien documenté dans la littérature et les protocoles solidement établies au sein de notre laboratoire, permettant ainsi de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Nous utiliserons des souris transgéniques viables, fertiles, de taille normale et ne présentent pas d'anomalies physiques ou comportementales. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et/ou tunnels en cartons). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Il assure également une veille scientifique continue, évitant toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques : - Les souris âgées de 6 à 10 semaines seront utilisées dans cette étude. Afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé). Les paramètres étudiés étant le développement de la masse tumorale après injection de cellules cancéreuses ou l’apparition de lésions cancéreuses induites, une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l’expérimentation. Au sein de notre laboratoire, les protocoles expérimentaux d’induction tumorale sont bien établis. - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce.
Etude du rôle de la proteine FMRP dans un modèle murin de dégénérescences rétinienne.
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une cécité est provoquée en sept jours par injection de méthylnitrosourée, qui détruit les photorécepteurs, puis les souris subissent deux tests comportementaux visuels dont la nature n'est pas précisée et une électrorétinographie sous anesthésie, pour comparer des animaux sauvages et des animaux dépourvus de la protéine FMRP. En s'appuyant sur la littérature, le porteur affirme que cette perte rapide de la vue n'engendre ni anxiété ni signe de souffrance. Il décrit le modèle animal comme "indispensable" et renvoie une éventuelle thérapie génique chez l'homme au conditionnel.
Objectifs
Parmi les troubles de la vision, les maladies rétiniennes sont une cause importante de morbidité oculaire et de déficiences visuelles. Des études de population ont rapporté une prévalence des troubles rétiniens, en particulier des troubles de la dégénérescence rétinienne (DR), allant de 5,35 % à 21,02 % chez les personnes âgées de 40 ans et plus. La dégénérescence maculaire liée à l'âge, la rétinopathie diabétique et la rétinopathie pigmentaire sont les manifestations pathologiques les plus courantes de la DR qui conduisent à une cécité irréversible. Ces pathologies visuelles sont dues à l'apoptose des cellules neurales de la rétine ou des tissus de soutien adjacents, principalement en raison de dommages oxydatifs cumulatifs et prolongés. Bien que les manifestations cliniques de ces maladies aient été entièrement élucidées, il est clair que les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents restent à comprendre. Très récemment, un nouveau régulateur pivot de l'apoptose et de la réponse au stress oxydatif a été mis en évidence dans le tissu cérébral : la protéine FMR (FMRP). Dans la rétine, cette protéine est également connue pour être directement associée à des déficits fonctionnels rétiniens. Notre projet vise donc à mieux étudier le rôle de la FMRP dans les mécanismes de la DR. L'identification de nouveaux acteurs dans le processus de dégénérescence de la rétine nous permettra de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques et de nouvelles stratégies de prévention pour une meilleure prise en charge des patients. Actuellement il n’existe aucun traitement curatif de ces pathologies. Sur la base de ces résultats récents et de l'implication bien connue des mécanismes de stress oxydatif et d'apoptose dans la dégénérescence rétinienne, notre projet vise à mieux caractériser le rôle de la FMRP dans un modèle murin de dégénérescence rétinienne. La question est de mettre en évidence le rôle de FMRP, dans un modèle murin validé de DR, en comparant les résultats de souris sauvages (WT) versus des souris n'exprimant pas FMRP (KO FMR1).
Bénéfices attendus
Notre stratégie expérimentale (utilisation conjointe des souris KO FMR1 et d’un modèle validé de DR) vise à mieux comprendre le rôle de la FMRP dans les mécanismes de la DR, et donc de caractériser si FMRP est une bonne cible thérapeutique dans les DR. Des stratégies ciblées de thérapie génique pourront être envisageables chez l'homme sur la base de ces travaux.
Procédures
1/ Injection i.p (traitement unique), 2/Manipulation pour analyses comportementales (2 tests - 30 minutes) dans le but de caractériser les conséquences de la DR sur des comportements "visuels", et 3/Anesthésie pour l'étude de la fonction rétinienne (ElectroRétinoGraphie ou ERG) (anesthésie unique - 30 minutes).
Impact sur les animaux
Le modèle « MNU ou MethylNitrosoUrea» de DR utilisé est extrêmement utilisé et validé dans la littérature. Ce modèle va induire une mort spécifique des cellules de la rétine (photorécepteurs), entrainant une perte rapide (7 jours) de la vision chez la souris. Cette perte de la vision est similaire à celle retrouvée chez les patients atteints de DR. Une étude récente utilisant un modèle similaire de DR induite par le MNU a montré l’absence de comportement anxieux ou de souffrance 1 à 2 semaines après injection d et, ceux malgré la perte rapide des paramètres visuels (acuité etc…). Ainsi, dans notre schéma expérimental, la perte rapide de vision n’engendre pas de comportements anxieux ou manifestation comportementale de souffrance (douleur, prostration, hyperactivité etc..).
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort en fin de la procédure, et ce par dislocation cervicale. Ainsi, à chaque temps expérimental (Jour 1, 2, 3, 5 et 7 post-traitement), un lot d’animaux sera mis à mort directement après l'étude de la fonction rétinienne et ce, encore sous anesthésie.
Remplacement
Le modèle animal est fondamental dans notre cas, puisque l’étude de la DR ne peut se faire que sur un organisme vivant entier. Plusieurs niveaux de complexité sont nécessaires, impliquant des interactions entre différents types cellulaires et organes, qui ne peuvent être développés in vitro ou in silico. Dans le cadre de ce projet s’intéressant au rôle de FMRP dans les DR, le modèle animal reste indispensable dans la compréhension des interactions cellulaires au niveau de la rétine (neurones et cellules gliales). Bien que les expériences in vitro sur cultures cellulaires soient utilisées (lignées cellulaires de cellules rétiniennes : cellules de Müller), aucun modèle expérimental in vitro n’est à même de remplacer l’animal entier pour étudier la réponse et la communication cellulaire entre les différents acteurs de la DR.
Réduction
Notre objectif est d’obtenir une bonne robustesse de l’analyse statistique tout en réduisant le nombre d’animaux par lot. Ainsi, le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. Pour ce projet in vivo, il y a 5 temps expérimentaux (Jour 1, 2, 3, 5 et 7) avec 8 souris traitées et 8 souris non traitées par génotype (WT et KO FMR1) et par temps soit 32 x 5 = 160 souris au total. A chaque temps expérimental, l’ensemble des animaux seront analysés en comportement et fonction rétinienne (ERG). Puis la moitié des animaux sera mise à mort pour l’étude histologie (prélèvement des yeux) et l’autre moitié sera mise à mort pour les analyses de biologie moléculaire (prélèvement de rétines). Chaque expérience sera répétée trois fois pour une reproductibilité des résultats soit 480 souris au maximum pour 3 ans. Ainsi, nous obtiendrons pour chaque paramètre testé (comportement et ERG) 24 points expérimentaux par temps et par génotype ce qui est un minimum nécessaire pour déterminer la significativité statistique des résultats.
Raffinement
Une surveillance et une manipulation quotidiennes des animaux seront effectuées pendant la période d’acclimatation (15 jours) et d’expérimentation. Ces manipulations permettront de limiter le stress de l’animal lors du traitement (injection unique i.p). Par ailleurs, selon les données de la littérature, les animaux traités ne présenteront pas de phénotype autre que la perte de la vision. Les animaux seront hébergés en cage à cap standard au nombre maximum de 5 souris par cage. Nous disposerons dans les cages dès le début de l'expérience, des boules de coton compactées comme enrichissement du milieu. Par ailleurs, l’état général des animaux sera évalué quotidiennement durant toute la durée de l’expérience pour détecter tous signes éventuels de souffrance (3 points limites mis en place). On ne s’attend pas à avoir d’atteinte du point limite dans notre étude. Néanmoins une grille de score quotidienne sera tenue durant le temps d’expérimentation. Les animaux seront mis à mort s’ils présentent des signes de souffrance.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet, le modèle animal reste indispensable dans la compréhension des interactions cellulaires rétiniennes et leurs conséquences comportementales. Pour notre projet, l’utilisation de la souris est primordiale puis que le couple structure/fonction de sa rétine comme le processus de la DR sont proches de ceux observés chez l’homme. De même, l’existence d’un modèle murin KO FMR1 (disponible au laboratoire) va faciliter l’étude du rôle de FMRP dans la DR.
Evaluation de l’expression de différentes structures d’ARNm par imagerie non-invasive
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intramusculaires ou intraveineuses de formulations d'ARN messager, puis une injection intrapéritonéale d'un substrat luminescent avant plusieurs séances d'imagerie sous anesthésie, pour comparer six nanoparticules lipidiques et trois structures d'ARNm destinées à des vaccins anticancer et à la régénération tissulaire. Le porteur affirme qu'aucune méthode de remplacement fiable n'est disponible et que le recours à l'animal est "indispensable" pour tenir compte des interactions avec l'"organisme". Les souris sont tuées à la fin pour quantifier l'ARN dans les organes.
Objectifs
Le projet consiste en l'augmentation de l'efficacité de la vaccination anticancer par ARN et dans l’augmentation de l’efficacité de nos stratégies de régénération tissulaire à base d’ARNm. Nous voulons comparer différentes formulations et différentes structures d’ARNm. Les fins thérapeutiques sont la vaccination ARNm et la régénération tissulaire. Il n'existe pas de système permettant de modéliser l'interaction croisée des formulations d’ARNm de différentes structures avec l’organisme. De tels résultats ne peuvent pas être obtenus par des expériences in cellulo. C’est pour cette raison que l’utilisation de modèle animaux est indispensable pour évaluer l’impact des différentes formulations et structures d’ARNm sur la traduction des ARNm in vivo. Dans ce projet, nous allons tester des LNP :6 types de nanoparticules lipidiques (LNP) ainsi que 3 différentes structures d’ARNm pour maximiser l’expression de l’ARNm in vivo. L'optimisation des séquences d'ARNm et de leur formulation permettra de diminuer les quantités d'ARNm injectées et de réduire les coûts des vaccins.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de sélectionner pour chaque formulation la structure d’ARNm entraînant la plus forte expression in vivo après injection intramusculaire ou intraveineuse.
Procédures
Les souris vont recevoir des injections intramusculaires ou intraveineuses de formulations ARNm. Les souris recevront par voie intrapéritonéale le substrat de la luciférase avant imagerie à 6h, 24h et 48h. Les souris seront anesthésiées sous isofluorane (2%) durant les injections intramusculaire ou intraveineuse des formulations ainsi que durant l'injection intrapéritonéale du substrat de la luciférase.
Impact sur les animaux
Nous ne nous attendons pas à une douleur suite à l’injection des formulations mis à part la douleur induite lors de l'injection liée à l'aiguille. Nous prendrons en compte la douleur générée ar les injections intramusculaires.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour quantifier l'ARNm dans les organes où le signal a été détecté.
Remplacement
L’utilisation des modèles cellulaires a déjà démontré que certaines structures augmentent la traduction des ARNm. Cependant, des études sur l'animal entier sont nécessaires pour tenir compte des interactions de l'organisme avec les formulations et les ARNm de différentes structures. Etant donné la complexité des processus mis en jeu, aucune méthode de remplacement fiable n’est disponible.
Réduction
l’effectif des souris mis en oeuvre est limité au strict minimum permettant d’obtenir des résultats exploitables statistiquement. Les formulations seront évaluées par imagerie non-invasive, le suivi longitudinal permettra de diminuer le nombre d'animaux
Raffinement
les méthodes utilisées seront mises en oeuvre par du personnel formé (niveau chirurgie) et les points limites sont validés par le comité éthique local. Les formulations seront évaluées par imagerie non-invasive chez la souris.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris Balb/c car c'est ce modèle qui a été utilisé dans nos expériences précédentes de vaccination ARNm et de régénération tissulaire. Le modèle souris permet d'évaluer les capacités des formulations ARNm dans une espèce à cycle de vie court où les mécanismes immunitaires sont les mêmes que chez l'Homme mais à des échelles de temps compatibles avec un criblage de formulations et de structures ARNm. Des souris adultes (à partir de 8 semaines) ayant un système immunitaire mature seront utilisées.
Analyse de l’activité apoptotique spécifique d’un candidat médicament anticancéreux dans un modèle souris immunodéficient par imagerie de fluorescence quantitative
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
24 souris privées de système immunitaire vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de deux tumeurs sous la peau, une injection intraveineuse d'une sonde fluorescente et une injection intratumorale d'un candidat médicament anticancéreux ciblant le récepteur TLR3, suivies de séances d'imagerie sous anesthésie à 24, 48 et 72 heures. Le porteur affirme avoir déjà vérifié l'absence de toxicité et l'efficacité aux mêmes doses, et présente l'étude comme une preuve de concept destinée à préparer un essai clinique chez l'homme. Sur le remplacement, il conclut que "seul un modèle animal" permet d'observer l'apoptose dans un "organisme" complet.
Objectifs
=> RATIONNEL : Le TLR3 est un récepteur de l'immunité permettant au corps de se protéger des infections virales. Le concept du TLR3 comme cible anticancéreuse existe depuis près de 30 ans, même si son mécanisme exact n’est connu que depuis peu. L’activation de ce récepteur entraine une mort programmée, appelée apoptose, spécifique des cellules cancéreuses (pas des cellules normales), ainsi qu’une inflammation locale ayant un effet antitumoral. La conjugaison de ces deux mécanismes d’action induit une autovaccination à long terme contre la tumeur. Une nouvelle famille d’activateurs de ce récepteur a récemment été découverte (dont le candidat médicament de cette étude), homogène, actif, spécifique et très peu toxique. => BUT DU PROJET : L’objectif de cette étude est d’utiliser une sonde fluorescente afin de suivre le mécanisme d’apoptose cellulaire induit après administration du candidat médicament en injection locale, ainsi que sa spécificité pour les cellules tumorales exprimant le récepteur TLR3, in-vivo. Ce mécanisme sera regardé dans la souris par une analyse non invasive par imagerie de fluorescence sur tous les organes. Cette analyse quantitative au cours du temps sera effectuée grâce à un outil innovant de tomographie de fluorescence. Pour analyser la spécificité de l’apoptose des cellules tumorale exprimant le TLR3 (et non sur les organes ou tissus sains), induite par le candidat médicament, ce dernier sera injecté dans deux tumeurs (flanc-droit / flanc-gauche), avec les modèles exprimant le TLR3 sur un flanc et celui ne l’exprimant pas sur le flanc opposé. Chacune de ces tumeurs sera traitée par injection locale du candidat médicament à des doses connues comme efficaces dans ces modèles. Une injection a temps unique du candidat médicament sera effectuée, afin de suivre ses effets dans le temps. La sonde fluorescente marquant spécifiquement les cellules apoptotiques sera utilisée par injection intraveineuse 2h avant le premier point de cinétique, pour un signal durant jusqu’à 3 jours post-injection. Les analyses de fluorescence quantitatives sur l'ensemble du corps de l'animal (en 3D), seront effectuées sur animaux vivants sous anesthésie gazeuse respectivement à 24h, 48h et 72h après traitement. Afin de dissocier l’effet d'inflammation de l’effet d’apoptose induit par le candidat médicament, les souris utilisées ne posséderont pas de système immunitaire.
Bénéfices attendus
Cette étude, comprenant une seule procédure, permettra de déterminer le mécanisme d’action d’apoptose spécifique des tissus cancéreux du candidat médicament dans un modèle physiologique complet et d’en apprécier la spécificité par rapport aux organes et tissus sains. Il s’agit d’une étude de recherche translationnelle, de preuve de concept et prospective, permettant de poser les bases d’une étude clinique (dans des conditions d’injection locales), et de déterminer les meilleurs biomarqueurs d’engagement de la cible ainsi que d’en définir une première approche qualitative et cinétique.
Procédures
Trois injections sont prévues dans cette expérience : 1/ La greffe tumorale bilatérale sous-cutanée (sous anesthésie gazeuse) – env 5 minutes par souris 2/ L’injection de la sonde fluorescente en intraveineuse (sous anesthésie gazeuse) – env 5 minutes par souris. 3/ Le traitement en injection intratumorale et sous-cutané péri-tumorale (sous anesthésie gazeuse) – env 5 minutes par souris. A ceci, s’ajoute l’analyse de la fluorescence sur l'ensemble des organes et tissus des souris, qui est un acte non invasif et non douloureux, mais qui nécessite cependant l’immobilité complète de l’animal par une anesthésie sous isoflurane et une contention empêchant tout mouvement.
Impact sur les animaux
# Des effets indésirables pour les animaux pourraient venir des modèles ou des traitements en eux-mêmes => L'absence de toxicité et l’efficacité du candidat médicament ont déjà été analysée sur ces mêmes modèles aux doses utilisées dans cette expérience avec d’excellents résultats. # Les actes d’injection (sonde fluorescente et candidat médicament) induisent une douleur ainsi qu’un stress => une anesthésie gazeuse sera effectuée lors de ces actes. # L’analyse de fluorescence n’est pas un acte douloureux, cependant il nécessite l’immobilité complète de l’animalsous anesthésie gazeuse et une contention empêchant tout mouvement. # La croissance tumorale (pouvant durer env 2 à 3 semaines) peut induire de nombreux effets indésirables (nécrose, perte de poids, mobilité réduite, stress, comportement anormal…). => ici les tumeurs seront analysées à une très faible taille, ce qui devrait limiter la majorité de ces effets indésirables. Cependant, une grille de score basée sur nos expériences précédentes nous permettra d’anticiper toute souffrance des animaux. De plus, la moindre plaie interférant avec les mesures de fluorescence, aucune souris ayant des plaies ou signes de nécroses ne sera incluse dans ces expériences.
Devenir
Tous les animaux ne pouvant pas rentrer en analyse (absence de croissance tumorale, présence de plaies interférant avec l’analyse ou autre critère éthique), seront mis à mort. Tous les animaux analysés seront mis à mort après la dernière analyse. En effet, aucun de ces animaux ne pourra être réutilisé. Cette mise à mort s’effectuera par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse.
Remplacement
Seul un modèle animal permettra d’analyser des phénomènes d’apoptose indésirables au niveau des organes et tissus sains. Les preuves de concept in-vitro et ex-vivo de ce mécanisme d’action ont déjà été effectuées avec succès. A présent, un modèle préclinique complexe et physiologique est nécessaire pour permettre de poser les bases d’une étude clinique « first in human » (dans des conditions d’injection locale), et de déterminer les meilleurs biomarqueurs d’engagement de la cible ainsi que d’en définir une première approche qualitative et cinétique.
Réduction
Cette étude est menée dans un but prospectif. Ainsi l’utilisation de 5 souris par groupe et par modèle est considérée comme suffisant pour une validation de preuve de concept. Il est à noter que la greffe des deux tumeurs différentes (sur les deux flancs de la même souris), permet de réduire de moitié le nombre d’animaux nécessaires à cette étude sans compromettre les résultats scientifiques. Cette expérience s’effectue sur souris vivantes avec des analyses au cours du temps par des techniques douces d’imagerie, ce qui évite d’avoir à procéder à des actes chirurgicaux lourds ainsi qu’à des mises à mort de grands nombres d’animaux par des méthodes conventionnelles. Elle constitue en soit une réduction du nombre des animaux pour répondre à la question posée.
Raffinement
La mise en place d’une grille de score et d’une fréquence de surveillance des animaux adaptée à l’étude, permettra d'éviter toute souffrance animale. La surveillance des animaux sera effectuée deux fois par semaine avec une analyse scorée du comportement animal, du poids corporel et du volume tumoral. Les souris seront greffées sur chaque flanc en injection sous anesthésie gazeuse. Il est à noter que les deux modèles de tumeurs ont des comportements et temps de croissance très similaire. La très petite taille des tumeurs attendue dans cette étude devrait permettre à la fois une bonne analyse de la fluorescence ainsi qu’une souffrance et une gêne physique minimale pour l’animal. Cette expérience s’effectue par imagerie de fluorescence sur souris vivantes avec des analyses au cours du temps, ce qui évite d’avoir à procéder à de nombreux actes chirurgicaux et mises à mort d’animaux, avec des méthodes conventionnelles. Elle constitue en soi un Raffinement des méthodes pour répondre à la question posée. L’imagerie par fluorescence est une analyse « douce », non invasive et non douloureuse mais nécessitant l’immobilité de la souris pendant l’acquisition des données. Pour réaliser une analyse, l'animal est donc placé sous anesthésie gazeuse et est ensuite placé dans une cassette de contention pour éviter tout mouvement. Cette dernière est ensuite glissée dans la chambre noire de l’appareil. L’acquisition dure environ 5 minutes. De l’air chauffé circule dans l’appareil et permet de maintenir la température de l’animal. Ce temps court d’analyse, permet à l’animal une récupération rapide et autorise de répéter les acquisitions selon la cinétique décidée. Les animaux sont ensuite placés sur un plateau chauffant avec une lumière chauffante pour qu'ils se réveillent rapidement dans de bonnes conditions.
Choix des espèces
La souris est un modèle mammifère bien caractérisé pour les études pharmacologiques permettant de démontrer dans un modèle vivant que les organes et/ou tissus normaux ne sont pas touchés par ces mécanismes d’action pouvant induire une toxicité du candidat médicament. En plus d’être un modèle pertinent, la souris est un modèle de petite taille, facile à manipuler et génétiquement bien caractérisé. Qui plus est, il existe aussi de nombreux outils (souris sans système immunitaire, appareillage de fluorescence adapté...), qui permettent d'étudier précisément les différents mécanismes d’action de thérapies chez cette espèce. Une souche de souris sans système immunitaire sera utilisée pour analyser uniquement l’effet d’apoptose indépendamment des mécanismes du candidat médicament sur le système immunitaire qui pourraient interférer. De plus, s'agissant d'une souche de souris sans poils, l'acquisition de fluorescence s'en trouvera facilitée. Des souris sans système immunitaire de 7 semaines seront utilisées. A cet âge, les souris sont physiologiquement adultes (ce qui est nécessaire dans notre étude en terme d’assimilation, maturation des organes...) etc.
Evaluation de l’effet de nouveaux composés bioactifs issus d’un aliment colza biotransformé
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent par gavage quotidien du lait de vaches nourries au colza pendant huit jours, avant prélèvement de sang, de fèces et d'organes pour analyser le devenir des composés du colza. Le porteur indique que le gavage est une source de stress, réduite par une habituation préalable, et inscrit le projet dans une visée agronomique de valorisation du colza et d'autonomie protéique. Il affirme que l'absorption de ces métabolites ne peut être modélisée ni in vitro ni in silico.
Objectifs
Le colza est une plante oléoprotéagineuse produite majoritairement en France et en Europe. Historiquement, son utilisation en nutrition humaine (huile alimentaire) et animale (protéines de farine de colza) a été limitée en raison de sa teneur élevée en composés considérés comme antinutritionnels (acide érucique dans l'huile et glucosinolates dans les tourteaux notamment). L'avènement de génotypes dits « double zéro » depuis une quarantaine d’années, réduisant la teneur en composés antinutritionnels, a permis d’élargir son utilisation pour le marché des huiles alimentaires et comme source de protéines en nutrition animale. L'utilisation de cette plante dans la nutrition animale a pour objectif de remplacer tout ou partie du soja importé principalement d’Amérique du Sud et d’augmenter l’autonomie protéique de la France et de l’Union Européenne. Ce projet vise à étudier la biodisponibilité des métabolites issus d'un extrait de colza consommé par des vaches et retrouvés dans leur lait dans un modèle rongeur. 24 souris C57Bl6/J males seront utilisées pour mesurer l’absorption et la transformation métabolique des bioactifs du colza transférés dans le lait de vache. Pendant une semaine, quotidiennement un groupe de 8 souris recevra par gavage du lait issues de vaches ayant consommé du fourrage et des tourteaux de colza, un autre groupe de 8 souris recevra par gavage du lait issu de vaches nourris ayant reçu une alimentation mixte (tourteaux de colza, tourteaux de soja, céréales et fourrages) et le dernier groupe de 8 souris recevra du lait produit par des vaches ayant consommé uniquement du fourrage. Le sang des souris sera recueilli et le plasma sera utilisé pour des tests in vitro afin d’analyser les potentiels effets anti-oxydants des molécules d’intérêt du colza présentes dans le lait et absorbées par la souris. Les fèces seront également analysées afin de rechercher les composés métabolisés par les souris suite à l'absorption des différents laits grâce à des techniques de chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à promouvoir le colza avec des perspectives de durabilité, de santé animale et de santé humaine. Il évaluera la nature des bioactifs de colza et leurs dérivés métaboliques qui sont sécrétés dans le lait de vaches alimentées avec une base colza, le transfert de ces composés natifs et néoformés du lait au consommateur (modèle souris), et enfin l’impact santé chez le consommateur de lait en utilisant un modèle in vitro. Ce projet s’insère dans un projet plus large qui permettra in fine d’optimiser la production de lait enrichis en bioactifs de colza à potentiel santé pour le consommateur, en maitrisant les conditions agronomiques de production au champ et les conditions de transformation industrielle des graines de colza pour nourrir le bétail.
Procédures
Gavage intragastrique, 1 fois par jour pendant 8 jours (3 jours d'habituation + 5 jours d'expérimentation).
Impact sur les animaux
Le gavage peut être une source de stress pour les animaux. Afin de réduire ce stress au maximum les gavages seront réalisés par des manipulateurs expérimentés, et une canule de taille appropriée à l'animal sera utilisée.
Devenir
La procédure envisagée dans cette étude vise à gaver des animaux pendant 5 jours (acte expérimental 1, Gavage des animaux), prélever des fecès (acte expériemntal 2, Prélèvement de fèces) puis mettre les animaux à mort pour préléver sang et organes pour étudier les effets du composé testé (acte expérimental 3, Mise à mort des animaux et prélévement d'organes). le devenir est animaux est donc la mise à mort pour le prélèvement d'organes.
Remplacement
L'absorption de métabolites met en jeu de nombreux tissus et systèmes physiologiques qu'il n'est à l'heure actuelle pas possible de modéliser in vitro et in silico. De plus, les souris C57Bl6/J sont un modèle largement utilisé et reconnu pour les études sur le métabolisme.
Réduction
Le nombre d’animaux (8 par groupe) est nécessaire afin de collecter un volume suffisant de sérum pour réaliser les expériences in vitro. C'est également le nombre minimum d'animaux nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes pour les études de métabolomiques (recherche de métabolites dans le plasma par chromotagraphie liquide couplée à la spectrométrie de masse). Le nombre d'animaux requis est 8 animaux par groupe ce qui nous permettra d'obtenir des quantités de plasma nécessaires aux incubations in vitro et aux tests biologiques. Nous chercherons à mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre les 3 groupes à l'aide d’une analyse ANOVA et d’un test post-hoc corrigé du FDR (q
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cage de 4, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique et de matériel de nidification (bandelettes de papier kraft). Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Une crème anesthésique (lidocaïne/prilocaïne 5%) sera appliquée localement lors du perçage des oreilles pour identification et avant incision pour les prélèvements de sang à la queue et lors de la ponction cardiaque transthoracique. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à la fin du protocole. Les animaux seront manipulés régulièrement afin de réduire leur stress. Enfin une phase d'habituation au gavage sera réalisée pendant 3 jours avant le début de l'étude. Cette période d'habituation vise à diminuer le stress lié à la préhension et au gavage.
Choix des espèces
La souris est un mammifère qui possède un mode d’absorption et de métabolisme similaire à celui de l’être humain. De plus, les adipocytes et les hépatocytes utilisés dans les expérimentations in vitro sont d’origine murine d’où la nécessité d’utiliser du sérum de souris. Les animaux seront âgés de 9 semaines à réception et donc d'environ 10 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent à de jeunes adultes pesant environ 20 grammes, ce qui facilite la réalisation du gavage intragastrique, qui peut être délicat à réaliser chez des animaux plus jeunes.
Stratégies d’enrichissement cognitif en pisciculture pour améliorer le bien-être des truites arc-en-ciel
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
216 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont marquées par injection d'élastomère dans la nageoire puis soumises à des tests décrits comme anxiogènes, isolement en environnement nouveau, réactivité émotionnelle, préférence spontanée puis conditionnée pour les bulles et biais de jugement. Le porteur présente ce projet comme visant à améliorer le "bien-être" des truites d'élevage, tout en prévoyant leur mise à mort pour prélèvement de marqueurs immunitaires. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative puisque l'objectif est d'observer le comportement des poissons en vue d'une application en pisciculture.
Objectifs
La définition du bien-être animal proposée par l’ANSES en 2018 souligne l’importance que le bien-être doit garantir non seulement un bon état de santé physique de l’animal mais également un bon état de santé mentale, à savoir en minimisant les états mentaux négatifs et en favorisant l’émergence d’états mentaux positifs. L’état mental de l’animal dépend de la manière dont il perçoit, comprend et mémorise son environnement, et donc de la cognition en tant que telle. En élevage piscicole, les conditions d’hébergement sont encore relativement appauvries, limitant ainsi le répertoire comportemental accessible aux poissons, inhibant leurs besoins éthologiques et physiologiques et les stimulations sensorielles et cognitives. Dans ce contexte, nous nous intéressons à améliorer le bien-être de la truite arc-en-ciel, première espèce de poisson continental élevée en France et en Europe, via des stratégies d’enrichissement cognitif. Parmi d’autres types d’enrichissement environnemental, l’enrichissement cognitif s’avère prometteur et moins contraignant en termes de mise en place pour les éleveurs. Il permet de réduire l’imprévisibilité de l’environnement de l’animal et de le faire interagir avec celui-ci par l’utilisation de ses capacités cognitives. Ces interactions, basées sur l’anticipation d’évènements positifs et/ou négatifs de leur quotidien, procurent à l’animal une forme de contrôle sur son environnement, diminuant ainsi son caractère anxiogène. L’objet de ce projet est donc d’identifier des stratégies d’enrichissements cognitifs durables, efficaces et applicables en pisciculture afin de diminuer à long terme l’impact des facteurs de stress chez la truite arc-en-ciel et de faire évoluer les élevages piscicoles vers des systèmes plus respectueux des besoins de l’animal et de son bien-être. Le principe général de l'enrichissement cognitif étudié ici consistera à tester la valence d’un événement positif autre que l’alimentation, c'est-à-dire le bullage, sur le bien-être des truites au cours d’une première procédure. Leur préférence spontanée et acquise pour les bulles seront évaluées en ce sens, après une période de présence ou d’absence de bullage. Dans une deuxième procédure, il s’agira de conditionner les poissons à associer un signal neutre (lumière) à une expérience positive (bullage) et d’analyser les effets de cette prévisibilité des bulles sur le bien-être à court et à long terme des truites.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à étudier les effets d’un enrichissement cognitif à court et à long terme sur le bien-être des truites arc-en-ciel d’élevage, la finalité étant de l’améliorer. L’enrichissement cognitif permet de réduire l’imprévisibilité de l’environnement de l’animal et de le faire interagir avec celui-ci par l’utilisation de ses capacités cognitives. Ces interactions, basées sur l’anticipation d’évènements positifs et/ou négatifs de leur quotidien, procurent à l’animal une forme de contrôle sur son environnement, diminuant ainsi son caractère anxiogène. Lors d’une précédente expérimentation, qui visait à faire anticiper aux truites la distribution alimentaire, nous avons observé qu’elles avaient un fort attrait pour le stimulus prédicteur de cette distribution, à savoir des bulles dans le bassin, un stimulus que nous pensions jusqu’alors neutre. Le principe de l'enrichissement cognitif étudié dans cette nouvelle demande d’autorisation de projet consiste donc à tester la valence des bulles pour les truites et de leur faire anticiper les bulles comme potentielles vectrices d’émotions positives. Ce projet est de mise avec les consignes données par la commission Européenne lors de sa communication 236 du 12/05/2021 sur la nécessité de trouver des moyens d’améliorer le bien-être des poissons d’élevage et en particulier pendant la phase d’élevage pour ensuite les communiquer à la filière piscicole. Les résultats du projet seront ensuite communiqués à la filière piscicole sous forme de publications et d’une vidéo qui a pour but de sensibiliser les éleveurs ainsi que les étudiants en formation piscicole à différentes méthodes d’amélioration des conditions de vie des poissons en élevage.
Procédures
-Marquage par élastomères : la procédure consiste à marquer individuellement les poissons (n=24) en insérant l’aiguille d’une seringue (aiguille de 29 g et 0,2 mm de diamètre) contenant un élastomère entre les rayons de la nageoire dorsale, à 1 mm de la base de la nageoire, puis d’injecter de l’élastomère en silicone liquide jusqu’à ce que la marque soit visible, et enfin de laisser durcir du silicone dans la nageoire quelques secondes après l’injection. -Test de réactivité émotionnelle : le test consiste à introduire un individu dans un nouvel environnement séparé de ses congénères, ce qui représente une situation anxiogène pour l'animal, et vise à analyser la perception que l'animal se fait de cet environnement par analyse comportementale sur vidéo. Le poisson sera filmé pendant les 20 premières minutes. -Test de préférence spontanée : le test consiste à introduire un individu dans un nouvel environnement séparé de ses congénères, ce qui représente une situation anxiogène pour l'animal, et vise à analyser son éventuelle préférence spontanée ou non pour un compartiment avec des bulles. Le test durera 2 jours par poisson. -Test de préférence de place conditionnée : le test consiste à introduire un individu dans un nouvel environnement séparé de ses congénères, ce qui représente une situation anxiogène pour l'animal, et vise à analyser une préférence acquise (après plusieurs expositions du poisson) pour le compartiment présentant des bulles ou celui où il n’y en a pas. Ce test durera 3 jours par poisson. -Test de biais de jugement : le test consiste à introduire un individu dans un nouvel environnement séparé de ses congénères, ce qui représente une situation anxiogène pour l'animal, et vise à analyser ces capacités d’apprentissage associatif et le biais de jugement. La durée de ce test est de 10 jours par poisson.
Impact sur les animaux
Une procédure est classée en modéré et qui pourrait engendrer une nuisance concerne le marquage à l’élastomère qui pourrait éventuellement perturber la nage du poisson si mal réalisé. Le nombre de poissons à taguer avec des élastomères dans notre procédure est faible (n=24) et le fournisseur ne rapporte pas d’effets indésirables sur plusieurs tests et retours donnés par leurs recherches et clients. Aussi, l’entreprise certifie qu’il n’y a pas de composés dangereux pour la santé des poissons dans les élastomères, comme défini dans le OSHA Hazard Communication Standard 29 CFR 1910.1200. Les tests de comportements sont classés en léger.
Devenir
Les animaux à l’issue du marquage par élastomère seront gardés en vie, car nous avons besoin de marquer les poissons pour les reconnaître individuellement via les caméras qui seront immergées dans les bacs d’expérimentation, et ainsi de les différencier sur les vidéos. Ces poissons réaliseront ensuite un test de comportement, puis seront mis à mort. Tous les autres animaux à l’issue des tests de comportements seront mis à mort (procédure 1 et 2) pour des prélèvements de tissus (marqueurs de l'immunité innée).
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative à cette expérimentation animale puisque le but de cette étude est d’observer le comportement des poissons en réponse à la présence ou à l’absence d’un enrichissement cognitif dans l’optique d’une application future en élevage.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réfléchi pour permettre des analyses statistiques fiables. Pour la procédure 2 des poissons surnuméraires seront ajoutés dans les bacs d’élevage pour se rapprocher des conditions réelles en élevage mais également pour assurer une densité optimisant la stabilité hiérarchique des poissons au sein des bacs, mais ne seront pas compris dans la procédure. Pour la procédure 1, les 12 poissons par réplicat (n total =72) seront impliqués dans un test de comportement. La comparaison entre les 2 traitements de la procédure 1 et entre les 4 traitements de la procédure 2 seront analysées par des ANOVAs réalisées sur des modèles linéaires généralisés. Des interactions entre les facteurs explicatifs traitements et temps (début vs fin de l’expérimentation) seront également inclus dans le modèle pour expliquer les différentes variables mesurées. Si les données ne suivaient pas une loi normale des tests non-paramétriques de Mann-Whitney seront réalisés.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans les conditions optimales pour l’espèce (photopériode, qualité d’eau, densité, nourriture, enrichissement). Les traitements appliqués sont précisément des procédures d'enrichissement qui doivent améliorer le bien-être animal. Par ailleurs, les poissons seront simplement filmés et parfois manipulés pour les tests comportementaux ou pour des interventions de routine en élevage (pesées, transferts, suivi vétérinaire). Lorsqu'il y en a, les manipulations sont réalisées par du personnel compétent le plus rapidement possible pour limiter le stress. Les truites seront simplement mises en situation de test comportemental où elles seront filmées. Le stress induit par l'isolement social en environnement nouveau est inévitable puisque nous cherchons précisément à mettre en évidence les réponses émotionnelles des poissons. Par expérience, nous savons que ces tests d'isolement créent un stress aigu mais relativement modéré car le pic de cortisol reste bien en-deçà des niveaux atteints lors des procédures classiques induisant un stress aigu (confinement prolongé). La cortisolémie revient à un niveau basal après 2h. Il n’y aura aucune procédure douloureuse. La seule procédure pouvant engendrer de la douleur et qui sera surveillée de près est le marquage des poissons que nous avons besoin d’identifier pour les observations vidéo. Cette procédure sera réalisée sous anesthésie. (cf. procédure détaillée au paragraphe 4.2.1.). Les prélèvements de tissus n'auront lieu que sur un nombre limité d'animaux après mise à mort.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) est une espèce robuste dont l’élevage et la reproduction sont bien maîtrisés en pisciculture. Il s’agit d’une espèce d’intérêt agronomique puisqu’elle représente 95% de la production française piscicole en eau douce, ce qui la place en première espèce continentale élevée. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement diffusée dans la communauté scientifique (environ 50 000 références). Les animaux seront élevés et testés au stade d'alevinage (environ 140 jours après la fécondation) jusqu'au stade portion (1,5 an après la fécondation). L'application de l'enrichissement à un stade précoce a montré qu'elle était mieux assimilée et plus efficace compte tenu de la flexibilité comportementale des jeunes animaux. L'étude se poursuit jusqu'à 1,5 an après la fécondation pour évaluer les effets à long terme du traitement, et en montrer l'intérêt dans le cas d'une application en conditions piscicoles.
Etude du rôle de l’épigenèse dans le développement de cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
810 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent une immobilisation forcée de deux heures par jour pendant quarante jours, puis, sur leur descendance, une inoculation de tumeurs suivie de séances d'imagerie et de prélèvements sanguins. Le porteur indique que ce stress par contention est "susceptible de provoquer une angoisse persistante" et cherche à savoir si un traumatisme se transmet aux générations suivantes en favorisant la croissance tumorale. Il présente la mise à mort des animaux porteurs de tumeurs comme relevant d'un "but 3R" et affirme qu'aucune méthode alternative ne peut mimer ce processus.
Objectifs
Contexte scientifique : Notre projet a trait à l'étude du rôle du stress dans les cancers. Plus précisément, nous nous intéressons à la transmission de génération en génération du stress par des phénomènes qui ne sont pas dû au programme génétique mais à d'autres facteurs. Cet ensemble de phénomène s'appelle l'épigénétique. La démonstration a été faite qu'un stress chez la souris, peut se transmettre sur 2 générations grâce à ces mécanismes épigénétiques. En parallèle à cette démonstration de nombreuses équipes ont démontré que certains stress avaient une action promotrice sur le développement de tumeurs. Description des objectifs du projet : La question à laquelle nous souhaitons répondre est : est-ce que des informations environnementales stressantes peuvent être transmises d'une génération à la suivante et promouvoir la croissance tumorale ? Les retombées attendues sont importantes d'un point de vue scientifique puisque cette démonstration n'a pas été faite, mais aussi au niveau clinique pour la prise en charge des patients dont les ascendants ont subi des expériences traumatiques. Egalement dans la pratique même de l'expérimentation animal où ces paramètres environnementaux ne sont pas connus ni donc pris en compte. Nous nous proposons pour cela de faire suivre à des souris des expériences stressantes, puis de les mettre en accouplement et de réaliser sur leurs descendances des inoculations de cellules tumorales. La comparaison de ces mesures avec celles d'un lot de souris témoins dont les parents n'ont pas subi de stress devrait confirmer ou infirmer notre hypothèse de travail. La bonne santé des animaux sera évaluée tout au long de l'expérimentation selon la législation actuelle. Dans ce projet nous utilisons le minimum d'animaux nécessaire à notre démonstration. A ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives suffisamment prédictives pour mimer le processus que nous souhaitons étudier.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont très importants : en terme de connaissance en soi de ce processus qui n’a jamais été démontré mais aussi en ce qui concerne l’aspect clinique au niveau pronostique et thérapeutique pour la prise en charge des patients dont les ascendants ont subi des expériences traumatiques
Procédures
Stress par immobilisation des animaux (2h/j, 40j) Inoculation de tumeurs (1/animal, animaux anesthésiés) Suivi par imagerie de la croissance des tumeurs (5 imageries de 20 min/animal, animaux anesthésiés) Prélèvement de sang (3/animal, animaux anesthésiés)
Impact sur les animaux
Le stress par immobilisation des animaux est par nature susceptible de provoquer une angoisse persistante chez ces souris.
Devenir
Les animaux utilisés auront des tumeurs. Dans un but 3R, il est nécessaire de les euthanasier.
Remplacement
A ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives suffisamment prédictives pour mimer le processus complexe que nous étudions et semblables à celle de l’homme. Nous ne pouvons pas remplacer l'utilisation des animaux par des tests in vitro ou in silico car le mécanisme que nous étudions est trop complexe pour être modélisé sans expérimentation chez la souris. A ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives suffisamment prédictives pour mimer le processus complexe que nous étudions et semblables à celle de l’homme. Nous ne pouvons pas remplacer l'utilisation des animaux par des tests in vitro ou in silico car le mécanisme que nous étudions est trop complexe pour être modélisé sans expérimentation chez la souris.
Réduction
Afin de restreindre le nombre d’animaux, nous combinerons nos lots témoins. De plus, le nombre d’animaux a été défini d'un point de vue statistique afin de réduire leur nombre. Nous avons déterminé via des tests statistiques qu'un lot de 10 souris par groupe était nécessaire pour avoir des données statistiquement exploitables à la fin de l'étude
Raffinement
En matière de raffinement : le bien-être de nos animaux sera pris en compte dès leur naissance jusqu’à leur mort : hébergement en cages collectives, enrichissement de l'environnement et points limites précoces adaptés à chaque protocole et/ou situation nous permettant de prendre les décisions qui s’imposent face à la souffrance ou l’inconfort de nos animaux.
Choix des espèces
Pour cette étude seront utilisés des souris NSG et NSG-beta ADR B2_KO. Nous utiliserons ces souris dont la forte immunodépression nous permettra de greffer des cellules tumorales humaines. Les souris invalidées pour l'expression du récepteur de l'adrénaline nous permettrons de voir l'implication de cette molécule dans le processus étudié. Stress des parents : Pour les mâles, la spermatogenèse étant un processus continu nous stresserons de jeunes adultes de 4 à 7 semaines, soit une semaine après le début de la fertilité. F1 : xénogreffes : Les souris NSG seront incluses dans le protocole expérimental à l'âge de 8-10 semaines. C'est cet âge adulte qui est la référence au niveau international.
Effet d’actifs d’origine 100% naturel sur l’homéostasie glucidique chez des souris mâles Ob/Ob
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
48 souris ob/ob, prédisposées à l'obésité et au diabète, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prises de sang hebdomadaires et plusieurs tests de tolérance au glucose et à l'insuline par gavage, avant mise à mort pour prélèvement du foie, du pancréas et d'autres tissus. Le porteur teste des extraits végétaux présentés comme "d'origine 100 % naturel" et n'attend "aucune nuisance" hormis chez les témoins. Il affirme être "contraint" d'utiliser des modèles animaux, l'homéostasie du glucose ne pouvant selon lui s'étudier in vitro.
Objectifs
Les objectifs principaux de la recherche sur le diabète de type 2 sont donc doubles : d’une part de mieux élucider les mécanismes impliqués dans l’apparition de la maladie et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les enjeux principaux de la recherche sur le diabète de type 2 sont donc doubles : d’une part de mieux élucider les mécanismes impliqués dans l’apparition de la maladie et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Chaque semaine un prélèvement de sang (25microlitres) sera réalisé pour mesurer la glycémie, la triglycéridémie et la cholestérolémie des souris. Deux tests de tolérance au glucose seront réalisés au jour 7 et 21. Au cours de ces tests, deux prélèvements de 20 microlitres de sang pour la mesure d’insuline au temps 0 et 30 minutes. Une mesure de glycémie sera effectuée à partir d’une micro-goutte de sang (1-2 microlitres) au temps 0, 15, 30, 60 et 120 minutes après le gavage oral. Un test de tolérance à l'insuline sera réalisé au jour 25. Au cours de ce test, une mesure de glycémie sera effectuée à partir d’une micro-goutte de sang (1-2 microlitres) au temps t0 t+30, t+60, t+90, t+120, t+150 et t+180 minutes pour évaluer la glycémie.
Impact sur les animaux
Les souris ob/ob développent de l'obésité et du diabète. A l'exception des souris contrôles recevant la solution véhicule. Les autres souris devraient voir leur homéostasie glucidique s'améliorer sans nuisances ou effets indésirables attendus.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à l'issu de la procédure. Afin d'explorer les mécanismes anti-diabétiques de la metformine et des extraits végétaux, nous recolterons le foie, le pancréas le tissu adipeux gonadal, le muscle soléaire et le sang. Des analyses métaboliques,histologiques, biochimiques et transcriptomiques seront réalisées sur ces échantillons.
Remplacement
L’homéostasie glucido-lipidique est un processus physiologique complexe, impliquant l’action combinée d’une multitude d’organes. Il est donc actuellement impossible d’étudier la physiopathologie du diabète d’une façon intégrale ex vivo ou in vitro et nous sommes malheureusement contraints d’utiliser les modèles animaux.
Réduction
Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en œuvre. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude. Les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations.
Raffinement
Enfin, les procédures ont été réfléchies pour réduire au maximum le stress et les souffrances des souris soumises aux expérimentations. La cage sera enrichie par des frisottis ou une petite maison en carton.
Choix des espèces
Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé depuis longue date pour caractériser les mécanismes impliqués dans la mise en place de l’insulino-résistance et du diabète. Il existe deux modèles murins de diabète de choix largement utilisés : les souris Db/Db et Ob/Ob. Ces modèles sont intéressants car ils possèdent les 3 stades de l’évolution du diabète observé chez l’homme : une phase très précoce ou les animaux sont normo-glycémiques et normo-insulinosensibles, une phase de 4 à 6 semaines ou l’insulino-résistance progresse mais est compensée par une sur-production pancréatique d’insuline, une troisième phase définie par une défaillance de la fonction pancréatique et l’établissement du diabète. Les souris seront âgées de 6 semaines au début du protocole. Il n’est pas possible d’obtenir des souris plus jeunes chez Charles River. Nous souhaitons initier le traitement des souris Ob/Ob à un âge très précoce lorsque les souris sont encore normo-glycémiques et normo-insulinosensibles. La littérature montre que l’insulino-résistance s’installe progressivement chez ces souris entre 6 et 10 semaines et les souris sont diabétiques après 12 semaines. Notre hypothèse est que l’apport en extraits végétaux permettra de retarder l’apparition du diabète ou d’en atténuer la sévérité.
Calibrage des réponses lymphocytaires contre le microbiote par les cellules épithéliales intestinales
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
804 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une biopsie de phalange pour génotypage, des injections intrapéritonéales et un traitement induisant une inflammation intestinale, avant mise à mort et prélèvements. Le porteur décrit les effets attendus de cette inflammation, diarrhée sanglante, prolapsus rectal, amaigrissement rapide et prostration, et prévoit une mise à mort au-delà de 20 % de perte de poids. Il indique que des organoïdes intestinaux ont déjà servi mais affirme que la complexité d'un "organisme entier" impose le recours à l'animal.
Objectifs
Un dérèglement de la pysiologie de l’épithélium intestinal constituant la muqueuse intestinale, est la base du développement de maladie inflammatoire chronique de l’intestin. Comprendre comment s’établit cette inflammation chronique de l’intestin représente donc un enjeu majeur de santé publique. Cette inflammation est due à une réaction incontrôlée des lymphocytes qui attaquent la flore microbienne (microbiote) contenue dans l’intestin. Etant en première ligne face au mille milliards de bactéries contenues dans l’intestin, les cellules épithéliales intestinales jouent un rôle pivot dans la régulation de la réponse immunitaire. Grâce aux différents capteurs de motifs microbiens qu’elles possèdent, elles sont capables d’alerter les lymphocytes. Alors que ces lymphocytes ne devraient pas réagir contre le microbiote, ils se mettent à l'attaquer. Ce qui amène à l'inflammation intestinale. En ce sens, les cellules épithéliales représentent une sentinelle régulatrice de premier plan alertant le système immunitaire. Aujourd’hui, nous essayons de comprendre comment les cellules épithéliales intestinales calibrent et transmettent les informations du microbiote aux lymphocytes dans l’intestin en condition physiologique et pathologique. Nous analyserons l’impact de l’absence de molécules potentiellement impliquées dans ce calibrage dirigé par des cellules sentinelles insoupçonnées que sont les cellules épithéliales intestinales. Ainsi, pour y parvenir, nous éliminerons l’expression de molécules que nous supputons être impliquées. Ces molécules « candidates » se basent sur des études précédentes. Ces ablations moléculaires seront spécifiques, conditionnelles et inductibles. Elles cibleront soit les cellules épithéliales intestinales ou les lymphocytes. Nous analyserons l’impact sur les cellules épithéliales, sur les lymphocytes et sur la composition du microbiote. En effet, les réactions des lymphocytes contre le microbiote peuvent altérer la composition du microbiote. Après avoir déterminé l’impact en condition physiologique nous analyserons l’impact en condition pathologique dans des modèles murins établis couramment utilisés. Pour ce projet nous tablons sur l’utilisation de 804 souris réparties en 6 procédures. Chaque procédure sera optimisée pour répondre à différentes questions simultanément limitant significativement le nombre total de souris du projet.
Bénéfices attendus
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin telle la maladie de Crohn ou la rectocolique hémorragique provoquent un inconfort douloureux chronique pour les patients et peut malheureusement amener à des cancers intestinaux, en particulier le cancer colorectal. Ce cancer est le deuxième cancer le plus fréquent en France. . Cette étude mettra en lumière des nouvelles pistes thérapeutique à envisager. Notamment ce projet précisera le rôle clé joué par des médiateurs moléculaires et microbiens dans la promotion de ces maladies inflammatoires chroniques de l’intestin.
Procédures
- Récolte des fécés: procédure non invasive et rapide (2 fois) - Biopsie de la phalange distale pour génotypage et identification des différentes lignées (manipulation faite sur souris de 7 à10 jours. Du fait de la faible innervation de ce tissu à cet âge, il est supputé que cette intervention et non douloureuse. - Injections intra-péritonéales (injection à l'aide d'une seringue). Une simple contention sera requise. - Traitement dans l'eau de boisson pendant une durée maximale de 9 semaines (procédé non invasive et aucun problème de prise hydrique n'est observée).
Impact sur les animaux
La majorité des souris utilisées dans ce projet ont été décrites dans d’autres études. Ces animaux ne présentent aucun phénotype macroscopique et physiologique particuliers impactant leur bien-être. Le cas échéant en ce qui concerne, les nouvelles lignées crées dans ce projet ou les souris entrées en procédures invasives (traitement générant une inflammation intestinale) une inspection minitieuse et régulière sera établie. L’inflammation intestinale amène à des problèmes d’hydratation consécutifs à une forte diarrhée. Elle génère des problèmes de transit telle la diarrhée. Cette diarrhée dans certains cas peut s’accompagner de sang. La douleur abdominale peut aussi entraîner des prostrations longues, un isolement anormal de l’animal, et une absence de toilettage. Des rectoprolapses devront être aussi surveillés. Un amaigrissement rapide de l’animal est tout autant un signe de l’inflammation intestinale à scruter.
Devenir
Les animaux seront mis à mort et divers prélèvements seront effectués pour analyses.
Remplacement
Les hypothèses avancées dans ce projet se basent sur des études préliminaires issues d’un précédent projet. De plus, beaucoup des assertions avancées ici ont été également étudiées et confirmées in vitro grâce à l’établissement d’organoïdes intestinaux (modèle d’intestin in vitro). Néanmoins, ce système in vitro bien que pratique et informatif ne récapitule pas toutes les complexités d’interactions spatio-temporelles, moléculaires, microbiennes et cellulaires intervenant dans un organisme et demande donc une étude à l’échelle d’un organisme entier.
Réduction
Des études statistiques adéquates seront effectuées en nous basant des observations des précédents projets et de nos expertises acquises. Dans toutes les procédures, divers paramètres seront analysés. Ce qui diminue grandement le nombre de souris du projet. Pour réduire encore le nombre d’animaux plusieurs personnes expérimentées de l’équipe seront en charge de récolter, de préparer les tissus et les cellules pour les analyses. Ce travail de collégial est mis en place pour optimiser et permettre d’obtenir des données expérimentales les plus exploitables et fiables possibles. Ce qui évitera d’avoir à répéter des expériences. En effet, la préparation des intestins est délicate et on peut facilement perdre des échantillons (mort cellulaire) en travaillant trop lentement. En outre, pour éviter de faire naître des souris pour rien, les expériences seront réfléchies et construites de telle sorte à pouvoir utiliser à la fois des mâles et des femelles. Les MICI touchent avec la même incidence l’Homme, qu’il soit mâle ou femelle.
Raffinement
Le modèle d’élimination génique conditionnelle et inductible visant des cellules ciblées spécifiques permet de diminuer les effets non voulus d’une délétion précoce, ubiquitaire ou voire constitutive d’un gène. En ce sens les choix du modèle génétique utilisé est un raffinement. Un contrôle 3 fois par semaine sera effectué pendant toute la durée de l’expérimentation. Néanmoins, un suivi tous les jours sera effectué lorsque les souris rentrées en procédure amenant à de l’inflammation intestinale. Lors de ces expériences, nous augmenterons le nombre de bâtonnets de coton dans la cage pour permettre au souris d’établir un environnement plus cocooning et confortable. Ayant en tête que les souris sont des animaux sociaux, pour éviter toute souffrance psychologique, nous tâcherons à organiser nos groupes pour éviter de laisser une souris seule isolée dans une cage. La présence de rectoprolapses (sortie anormal du rectum par l'anus) ou la présence de diarrhée accompagnée de sang ou la perte de poids supérieure à 20% du poids initial et/ou une prostration longue limitant la prise alimentaire des souris impliqueront une mise à mort. Les tissus seront prélevés pour analyses. Si ces points limites ne sont pas atteints mais cependant nous observons, de fécès molles non accompagnées de sang, une prostration courte n’empêchant pas les mouvements et les interactions sociales de l’animal et une perte de poids inférieur à 20%, nous disposerons d’un gel hydratant et nous humidifierons quelques croquettes dans la cage pour favoriser l’hydratation et la prise alimentaire des souris. Nous passerons alors 2 fois par jour visiter les souris pour s’assurer qu’une aggravation dramatique n’est pas lieu dans la journée. Si un des points limites décrits auparavant apparaît l’animal sera mis à mort. Le cas échéant, il est tard et la logistique matériel et humaine nous permettant de tuer les souris pour analyses le jour même n’est pas disponible, nous disposerons d’un gel hydratant et nous humidifierons quelques croquettes dans la cage pour favoriser l’hydratation et la prise alimentaire des souris et les souris seront mises à mort et analysées le lendemain matin. En plus des observations faites par les expérimentateurs, une observation quotidienne des animaux par les zootechniciens informés des signes attendus augmentera la vigilance et une détection précoce des signes de mal-être et permettra une intervention précoce.
Choix des espèces
L’ensemble des outils pour ce genre d’études sont développés chez la souris. Par ailleurs, son système immunitaire intestinal est extrêmement bien caractérisé. Enfin, les processus inflammatoires intestinaux décrits chez la Souris sont souvent conservés et similaires à ceux observés chez l’Homme. Cette ressemblance fait du modèle murin un modèle adéquat. Les animaux seront traités dès le sevrage. Le système immunitaire de l’intestin se mature rapidement à partir du sevrage. Pour s’assurer du rôle de nos molécules candidats sur la maturité de l’intestin, il est donc judicieux de commencer le traitement au moment du sevrage.
Influence des mécanismes de contrôle qualité du génome mitochondrial sur le vieillissement pathologique cardiaque sur souris.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
634 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Vieillies jusqu'à vingt-quatre mois, elles subissent l'implantation chirurgicale d'une puce télémétrique sous la peau, un enregistrement cardiaque avec test de stress, puis des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant deux mois pour tester des molécules. Le porteur indique que ces injections répétées sur des souris âgées peuvent provoquer des douleurs, prises en charge par paliers d'antalgiques jusqu'à l'euthanasie au point limite. Il affirme que les organoïdes et les cardiomyocytes issus de cellules souches ne permettent pas d'étudier l'arythmie sur un cœur entier.
Objectifs
Au cours du vieillissement, on observe dans la population un nombre plus important de maladies du cœur, telles que les arythmies cardiaques, l’ensemble étant grevé d’un coût humain et sociétal majeur. Bien que le lien entre vieillissement et pathologies du système cardiovasculaire soit certainement multifactoriel, de nombreux travaux suggèrent l’implication d’une dysfonction des mitochondries. Ces organites cellulaires possèdent leur propre ADN, l’ADN mitochondrial (ADNmt) et jouent le rôle de centrale énergétique de nos cellules. Au cours du vieillissement, nos tissus contiennent quelques cellules présentant une perte d’activité des mitochondries, du fait de l’accumulation de mutations de l’ADNmt. A l’aide d’un modèle de souris qui accumule ces mutations de l’ADNmt de manière accélérée dans le cœur et les muscles squelettiques, nous avons pu montrer qu’au-delà d’un seuil critique, ces cellules déficientes ont un impact pathologique sur la fonction du cœur, générant des arythmies cardiaques. Le projet que nous souhaitons développer a deux objectifs principaux. Le premier est d’étudier l’influence de ces cellules déficientes en activité mitochondriale sur d’autres maladies cardiaques au cours du vieillissement. Le deuxième est de moduler deux mécanismes de contrôle qualité de l’ADNmt chez ces souris afin de ralentir l’accumulation de mutations de l’ADNmt et donc retarder voire prévenir la survenue de leurs troubles cardiaques, ouvrant ainsi la voie à des approches thérapeutiques qui seront peut-être applicables chez l’homme.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre d’apporter de nouvelles connaissances sur l’influence des mitochondries sur le développement de troubles cardiaques au cours du vieillissement, qui sont un véritable problème de santé publique. De plus il devrait permettre de déterminer si l’utilisation de molécules destinées à moduler le contrôle-qualité de l'ADN mitochondrial peut s’avérer bénéfique pour la santé humaine en ce qui concerne les maladies cardiovasculaires, en conduisant à une meilleure santé des mitochondries, et donc en retardant l’apparition de troubles fonctionnels du cœur. Certaines des molécules que nous souhaitons tester sont déjà utilisées dans des études cliniques dans d’autres contextes, et de ce fait, si nous observons un effet positif sur la survenue de troubles cardiaques, l’utilisation de ces molécules pourrait être rapidement transférée à l’homme.
Procédures
Dans une première série d'expériences, les animaux vont subir une chirurgie sous anesthésie et analgésie pour implanter une puce télémétrique sous la peau (durée de l'intervention: 15 minutes) afin de mesurer l'électrocardiogramme (ECG). Sept jours après chirurgie, la mesure de l'ECG sera réalisée 24h en cage, puis 10 minutes pendant un test de stress. Dans une deuxième série d'expériences, les animaux vont subir une injection intrapéritonéale (durée de l'intervention: 1 minute) quotidiennement pendant 2 mois pour tester le potentiel de molécules sur les arythmies cardiaques.
Impact sur les animaux
Pour l’échocardiographie, aucune nuisance n’est à prévoir, les souris étant anesthésiées à l’isoflurane pendant la procédure. Pour la télémétrie, les souris vont subir une chirurgie, sous anesthésie (isoflurane) et analgésie (buprénorphine), placées sur un tapis chauffant (37°) pour éviter l’hypothermie. Un délai de 7 jours entre cette opération et les mesures d’ECG permettra aux souris de récupérer. Pendant cette période, les souris seront controlées deux fois par jour pour jauger une éventuelle douleur liée à l’opération ou une perte de poids. La mesure d’ECG de 24h en cage n’entrainera pas de nuisance. En revanche, les souris seront observées pendant les 10 minutes de test de stress, et seront retirées au moindre signe d’inconfort. Enfin, la répétition d’injections intrapéritonéales des molécules à tester sur 60 jours sur souris âgées (de 16 mois à 18 mois et 22 à 24 mois) pourrait entrainer des douleurs, que nous évaluerons par une grille se score. En cas de douleur légère, du paracetamol sera administré dans l’eau de boisson, en continu. Par ailleurs, si des signes comportementaux indiquent une douleur modérée, un anti-douleur plus puissant et à action plus longue sera administré en sous-cutané et du gel en contenant sera placé dans la cage pour la nuit. Enfin, si des signes comportementaux indiquent une douleur ou un inconfort important, la souris sera euthanasiée (point limite).
Devenir
Tous les animaux prévus dans le projet (634) seront euthanasiés en fin d'expérience.
Remplacement
Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle par un modèle in vitro, car nous voulons étudier l’influence physiologique de cellules déficientes en activité mitochondriale sur la fonction du cœur entier, et les modèles d’organoïdes 3D ou cardiomyocytes issus de cellules souches pluripotentes induites humaines ne permettent pas d’une part d’avoir un taux de mutations de l’ADN mitochondrial suffisant, du fait de l’élimination de ces mutations par contrôle qualité mitochondrial dans ces conditions. De plus, l’analyse de l’ECG par télémétrie requiert une phase de stress qui ne peut être reproduite in vitro. Enfin, la souris K320E-Twinkle est modèle de vieillissement tissulaire unique, le seul qui permette d'étudier l'impact des mosaïques tissulaires mitochondriales sur ce processus de manière tissu-spécifique.
Réduction
Nous réduisons au minimum le nombre d'animaux à utiliser pour obtenir des résultats exploitables au niveau statistique. De plus, seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Ainsi nous allons utiliser les mêmes souris pour les échocardiographies et la télémétrie et 192 souris seront utilisées sur deux protocoles expérimentaux. En raison de l'âge avancé des animaux au moment des expérimentations, nous savons par expérience sur notre projet précédent qu'un nombre non négligeable d'animaux doit être euthanasié en raison de points limites. Pour ne pas mettre en péril le projet, tout en restant sur un nombre minimal d'animaux par procédure, nous avons inclus 20% d'animaux en plus pour chaque groupe. Pour obtenir des résultats exploitables sur le plan statistique, nos expériences solides de ces méthodes Omics nous impose d'utiliser au minimum 15 souris/groupe expérimental pour la métabolomique.
Raffinement
Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la SBEA, les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets (maisons, copeaux, papier…). Les animaux sont surveillés quotidiennement par le personnel compétent. En cas de plaie décelée, du Dermaflon ou du Cothivet sont utilisés pour favoriser la cicatrisation. En cas de douleur légère décelée chez les animaux, du paracetamol sera administré dans l’eau de boisson, en continu. Par ailleurs, si des signes comportementaux indiquent une douleur modérée, un anti-douleur plus puissant et à action plus prolongée sera administré en sous-cutané et du gel en contenant sera placé dans la cage pour la nuit. Enfin, si des signes comportementaux indiquent une douleur ou un inconfort important, la souris sera euthanasiée (point limite).
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour les maladies humaines et l’étude du vieillissement pathologique, car l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme. De plus, la disponibilité de souris génétiquement modifiées permet d'étudier finement les mécanismes sous-tendant la pathogenèse de ces maladies. Dans le présent projet, la souris K320E-Twinkle est modèle de vieillissement tissulaire unique, le seul qui permette d'étudier l'impact des mosaïques tissulaires mitochondriales sur ce processus de manière tissu-spécifique. Les animaux seront utilisés à des âges tardifs, car le développement des mosaïques mitochondriales dans le cœur est un processus qui prend des mois. Pour déterminer l'âge auquel les expériences seront réalisées, nous nous basons sur de précédentes publications. Nous avions observé les premières mosaïques mitochondriales à 12 mois et des arythmies cardiaques significatives à 18 mois. Ainsi les souris les plus jeunes utilisées le seront à 12 mois, et nous prévoyons des analyses sur des animaux allant jusqu’à 24 mois.
Rôle d’une protéine de la chromatine dans le développement de tumeurs
- Recherche fondamentale
- Oncologie
168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales, un suivi hebdomadaire de la croissance des tumeurs par bioluminescence et une épilation sous anesthésie, avant mise à mort à l'atteinte de points limites ou à six mois. Le porteur relie ce travail aux tumeurs cérébrales de l'enfant et à des protéines d'origine rétrovirale, en attendant des retombées thérapeutiques présentées comme "très prometteuses". Il affirme que le modèle cellulaire in vitro ne reproduit pas le microenvironnement tumoral et qu'une validation sur "organisme entier" est "impérative".
Objectifs
Toutes les cellules de notre organisme partagent le même patrimoine génétique (notre ADN) mais l’expriment de façon différente selon le tissu auxquel elles appartiennent. L’ensemble de mécanismes biologiques impliqués dans cette régulation de l’expression des gènes est regroupé sous le terme « épigénétique ». Les bases moléculaires de ce processus se retrouvent au sein d’une structure très complexe qui permet l’empaquetage et la compaction de nos gènes dans le volume limité du noyau cellulaire. Les acteurs épigénétiques regroupent l'ensemble des facteurs qui contrôlent l’accès à la molécule d’ADN. Les tumeurs cérébrales de l’enfant sont au second rang des cancers pédiatriques par leur fréquence après les leucémies. L’absence de traitement efficace se traduit par une espérance de vie inférieure à 2 ans pour les enfants qui développent ces tumeurs. On retrouve dans 30 % des tumeurs cérébrales de l’enfant une mutation dans un gène qui code pour pour une protéine impliquée dans la régulation épigénétique de l'expression des gènes. Bien que cette mutation ait été directement impliquée dans la tumorigénèse, le mécanisme moléculaire sous-jacent reste à établir. Au cours de l'évolution, notre génome a intégré de nombreuses séquences d'ADN d'origines virales, qui sont en quelques sortes des "cicatrices" d'infections passées de notre espèce par des rétrovirus. Ces séquences rétrovirales constituent une large part de notre ADN. Bien que celles-ci soient épigénétiquement réprimées dans nos cellules dans les conditions physiologiques, elles peuvent être réveillées par des facteurs environnementaux. Cette activation peut ainsi conduire à l’expression de protéines rétrovirales qui peuvent être pathogènes, mais peuvent aussi acquérir une fonction physiologique bénéfique pour l’homme. Nos résultats préliminaires, obtenus in vitro à partir de cellules tumorales en culture, montrent que le facteur épigénétique muté dans les tumeurs cérébrales de l'enfant est nécessaire à l'expression de certaines protéines rétrovirales. Notre objectif est de montrer in vivo chez la souris que ces protéines ont une fonction protectrice qui agit contre la prolifération et la migration des cellules cancéreuses en favorisant le potentiel inflammatoire des cellules cancéreuses et leur interaction avec les cellules immunitaires.
Bénéfices attendus
Nos résultats représentent une piste très prometteuse dans la compréhension du cancer du cerveau chez l'enfant. Par ailleurs, la capacité des cellules cancéreuses à former des métastases, par dissémination à distance de leur site d’apparition, est la principale cause de mortalité chez les patients développant une tumeur solide. Si nous parvenons à montrer que certaines protéines rétrovirales ont une fonction anti-oncogénique, nous ouvrirons la voie au développement de nouvelles thérapies dans la recherche contre le cancer dans sa globalité, qui cibleraient spécifiquement les protéines rétrovirales endogènes.
Procédures
L'ensemble des souris de ce projet (168) subira une injection de cellules tumorales à l'age de 6 semaines (PE1), suivit d'une mesure de la bioluminescence pour suivre la croissance tumorale 1 fois par semaine, pendant 5 semaines (au minimum), 4 mois (au maximum) ou jusqu'à l'apparition d'un des points limites mis en place. Les injections des cellules tumorales se feront par voie intraveineuse ou sous-cutanée dans le flanc de l’animal. Les souris seront anesthésiées par voie gazeuse à l'isoflurane. Lors de l’anesthésie, un gel ophtalmique pourra être appliqué sur l’oeil afin d’éviter tout dessèchement de la cornée. Pour la mesure de bioluminescence, la D-luciferin sera injectée par voie intrapéritonéale. Les injections se feront dans la salle reservée aux souris sauvages. Dix minutes après l’injection l’animal sera placé dans l’imageur bioluminescent pour l’acquisition des images. L’imageur est construit avec système d’anesthésie gazeuse interne qui utilise le gaz isoflurane. Les souris seront épilés car le pelage noir de la souche C57BL/6 atténue l'émission de photons. Pour le processus d'épilation, les souris seront anesthésiées et une crème d'épilation sera appliquée.
Impact sur les animaux
Le seul phénotype dommageable attendu est l'apparition de tumeurs. Les souris seront suivies cliniquement quotidiennement et des points limites appliquées pour éviter toutes souffrances liées au phénotype.
Devenir
Toutes les souris agées de 6 semaines utilisées lors de la PE1 (168) suivront ensuite la PE2. Les souris seront suivies 1 fois par semaine pendant 5 semaines, au minimum, 4 mois au maximum après l'injection, tout le long de la PE2. Toutes les souris de la PE2 (168) seront sacrifiées à l'atteinte des points limites définis dans la PE1 le cas échéant, ou à l'age de 6 mois au plus tard.
Remplacement
Nos résultats préliminaires effectués dans des cellules en culture montrent que les protéines p53 et H3.3 sont nécessaires à l’expression de certaines protéines rétrovirales dans le génome murin. Nous faisons l’hypothèse que ces protéines ont une fonction protectrice qui agit contre la prolifération et la migration des cellules cancéreuses. Les mécanismes épigénétiques étant très dynamiques mais surtout tissus et individus spécifiques, il est impératif de valider l’ensemble de nos conclusions au sein d’un organisme entier. Le modèle de cellules tumorales en culture in vitro ne reproduit pas toutes les étapes de la tumorigenèse in vivo, car il ne tient pas compte du microenvironnement tumoral et donc ne pourra pas apporter le niveau d'information requis. Ces caractéristiques ne peuvent être récapitulées que par un modèle d'étude in vivo, à savoir dans notre étude, par injection de cellules tumorales dans des souris saines.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux, le projet se déroulera en 2 étapes. La première étape (18 souris) sera une étude pilote de la tumorigénicité du modèle cellulaire utilisé qui permettra de mettre au point les meilleurs conditions expérimentales pour le développement des tumeurs (optimisation du nombre de cellules, site d'injections). L'étape 2 permettra de tester l'hypothèse de travail dans les conditions expérimentales définie lors de l'étude pilote, en réduisant le nombre d’animaux au minimum (15 souris utilisées pour chacune des 10 conditions expérimentales) tout en garantissant des résultats statistiquement analysables (tests non-paramétriques de Mann-Whitney U et de Kruskal-Wallis H, pour les comparaisons de 2 groupes ou de plus de 2 groupes, respectivement). Le nombre total de souris expérimentales sera de 168. Par ailleurs, notre étude pourra se développer de manière qualitative si l'expérience s'avère concluante, nous pourrons ainsi prélever les tumeurs primaires et les métastases afin de les étudier par immunohistochimie ou séquençage d'ARN.
Raffinement
Les souris seront hébergées en cohorte afin de conserver l’interaction sociale. Toutes les lignées utilisées étant modifiées afin qu’elles expriment de façon constitutive la luciférase, nous mesurerons les différences de croissance tumorale par des techniques non-invasives. Les tumeurs émettront un signal luminescent, qui sera détecté par imagerie afin de monitorer la taille des tumeurs primaires ainsi que la progression métastatique de celles-ci. Nous suivrons quotidiennement l'état des souris après injection des lignées tumorales afin de détecter tout effet dommageable, entre 5 semaines et 4 mois après l'injection. Comme point limite, les animaux seront mis à mort en cas de douleur évidente suivant les critères d’arrêt suivants : perte de poids supérieure à 20%, tableau de scoring de la douleur niveau 3 observé*, nécrose des tumeurs, taille des tumeurs atteignant 1 cm3, détection de métastases dissiminées. *Le tableau de scoring évoluera la douleur selon les critères suivants : (1) poids corporel ; (2) apparence physique ; (3) signes cliniques mesurables (température corporelle, fréquence cardiaque et fréquence respiratoire) ; (4) modifications du comportement non provoqué ou (5) après stimulation ; (6) aspect du site d’injection. Un certain nombre de point sera donné à chacune des 6 catégories selon des variables précises. Un score sera attribué en fonction du nombre total de point obtenu.
Choix des espèces
Nous avons choisi une approche de génomique fonctionnelle pour laquelle la souris est particulièrement bien adaptée (possibilité d'utiliser des lignées transgéniques, temps de génération court, génôme connu, outils moléculaires). De plus, nos résultats préliminaires in vitro ont été obtenus dans des lignées cellulaires murines. D'autre part la souris possède 99% d'identité de gènes avec l'homme, et les mécanismes cellulaires à l'oeuvre et impliquant les variantes d'histones dont H3.3 sont conservés. La séquence protéique de H3.3 est 100% identique entre la souris et l'homme. Pour les expériences d’injection, nous avons choisi des fibroblastes embryonnaires de souris pour éviter tout rejet des cellules après injections. Nous utiliserons des souris adultes de 6 semaines pour l'injection des cellules tumorales, car il est important pour notyre hypothèse de travail que les souris aient un système immunitaire mature. En outre, l'utilisation de souris adultes mais jeunes permettra un suivit de la croissance tumorale jusqu'à 4 mois après l'injection le cas échéant sans dépasser un age maximum de 6 mois. En effet tous les animaux de cette étude seront mis à mort à l'age de 6 mois au plus tard le cas échéant (si aucun des points limites décrits n'est atteint).