Recherche fondamentale

14 562 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des candidats médicaments, le plus souvent par gavage, puis passent des tests comportementaux avant un prélèvement de sang et de cerveau, dans des modèles d'autisme obtenus par lignées mutantes ou par activation immunitaire des mères. Le porteur indique que les effets attendus se limitent à des crampes abdominales ou une sédation, et justifie l'effectif par ce qui est "classiquement utilisé en expérimentation animale". Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet de modéliser ces troubles et que le recours à la souris est "nécessaire".

Objectifs

Les troubles du spectre autistique (TSA) sont des troubles neurodéveloppementaux caractérisés par des déficits dans trois domaines: 1) des troubles dans les interactions sociales ; 2) des déficits du langage et de la communication et 3) des comportements limités ou répétitifs. Il devient de plus en plus évident que les causes des troubles du spectre autistique (TSA) sont dues à la fois à des facteurs génétiques et environnementaux. Les études animales fournissent des modèles translationnels importants pour élucider des facteurs génétiques ou environnementaux spécifiques qui contribuent aux déficits comportementaux liés aux TSA. Par exemple, de nombreux modèles murins d'activation immunitaire maternelle ont démontré que l'infection virale et bactérienne maternelle modifie le comportement de la progéniture, entraînant des phénotypes de type TSA. D’autre part, des souris mutantes transgéniques (BTBR T+ Itpr3 tf /J) et des souches consanguines (BALB/cByJ) ont été utilisées pour étudier les contributions génétiques possibles aux comportements de type TSA. Ces comportements comprennent des niveaux réduits d'interactions sociales réciproques, un manque de sociabilité typique de l'espèce et des niveaux significativement plus élevés d'auto entretien répétitif. L’objectif de ce projet consiste : 1) d'étudier l'effet de nouveaux candidats médicaments dans un modèle murin d'autisme (soit BTBR soit BALB/cByJ) et 2) la mise en place d’un modèle d’autisme par activation du système immunitaire innée (injection de Poly I:C) chez la souris et étude de l’effet de nouveaux candidats médicaments dans ce modèle.

Bénéfices attendus

A ce jour, il n’existe aucun traitement médicamenteux pour les TSA. Les études animales précliniques reposent sur des modèles de rongeurs bien validés pour faciliter la compréhension des mécanismes et ainsi améliorer sa prise en charge. Ainsi, ces modèles animaux peuvent être utiles pour identifier d’une part les contributions génétiques possibles aux comportements de type TSA et d’autre part le lien entre l’inflammation et l’autisme afin de tester de nouveaux candidats médicaments.

Procédures

La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes régulières dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués sous anesthésie générale, à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Les administrations (molécule de référence, candidats médicaments...) sont réalisées une seule fois avant le test. Le mode et le nombre d’administrations des solutions sont déterminés en fonction des caractéristiques pharmacologiques des produits. La voie orale (gavage) est généralement privilégiée pour administrer le ou les produits étudiés parce que c’est celle qui sera prescrite chez l’homme. Le cas échéant (produit destiné à être administré par d’autres voies chez l’homme, ou biodisponibilité nécessitant un autre mode d’administration) les voies intrapéritonéales, sous cutanée, intraveineuse ou intranasale peuvent être choisies L’administration de nouveaux candidats médicaments peut entraîner certains effets indésirables tels que les crampes abdominales ou la sédation qui peuvent apparaître après administration. Ainsi pour vérifier une éventuelle toxicité et en limiter les risques, les animaux sont suivis après injection. L’état général des animaux est évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint, à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Devenir

A la suite des administrations des produits (molécule de référence, candidats médicaments et véhicule), l’ensemble des animaux passent en tests. Ensuite, les animaux seront soumis à un prélèvement de sang et de cerveau (sous anesthésie générale), juste avant la mise à mort. Ces prélèvements permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques.

Remplacement

A ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives pour modéliser les TSA. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire pour l’étude de la physiopathologie et l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Le nombre total d’animaux utilisés pour une étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables ; ceci afin d'éviter de multiplier les expériences. Il correspond à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des locaux appropriés et dans des cages contenant des enrichissements conformément aux standards réglementaires. Leur état sanitaire sera évalué quotidiennement selon notre grille de surveillance. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l’expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Le répertoire comportemental des souris correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle de souris et la maladie humaine fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur cette maladie dans toute sa complexité. Les lignées utilisées sont : C57Bl/6 J, BALB/cByJ, BTBR T+ Itpr3 tf /J (BTBR) 1- Effet de nouveaux candidats médicaments dans le modèle murin d’autisme chez les souris BTBR et BALB/cByJ 4-10 semaines au moment du test. Les molécules développées sont destinées à des adultes. 2- Mise en place d’un modèle d’autisme par activation du système immunitaire innée (injection de Poly I:C) chez la souris et étude de l’effet de nouveaux candidats médicaments dans ce modèle 6-12 semaines au moment du test. Les molécules développées sont destinées à des adultes.

32 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq jours d'injections pour désactiver la signalisation thyroïdienne dans leur tissu adipeux brun, la moitié étant ensuite exposée à 4 °C pendant 72 heures avant un prélèvement de sang sous anesthésie et la mise à mort, pour distinguer l'action centrale et périphérique des hormones thyroïdiennes. Le porteur indique n'attendre aucun effet délétère des injections et que le froid abaisse la température corporelle durant les premières heures. Il affirme qu'aucun modèle in vitro n'est adapté et qu'une alternative cellulaire exigerait 128 animaux contre 32 ici.

Objectifs

Le tissu adipeux brun (TAB) est capable d’utiliser les lipides et le glucose pour les transformer en chaleur (thermogenèse). Ce processus est dépendant des hormones thyroïdiennes (HT). Il était jusque-là établi que les hormones produites par la thyroïde passaient dans le sang pour jouer leur rôle directement dans le TAB, (action périphérique). Mais des études montrent que l’administration d’HT dans le cerveau des souris active directement le TAB (action centrale). Cela suggère que le cerveau est la cible principale des HT, ce qui bouscule ce qui était précédemment établi. Ces résultats restent encore controversés. A court terme, l’objectif de ce projet est donc d’arriver à distinguer la part de l’action centrale et périphérique des HT pour ses fonctions métaboliques dans le TAB afin de tirer au clair les données contradictoires jusqu’alors publiées. Pour cela, nous utilisons une lignée mutante murine qui ne dispose plus de signalisation thyroïdienne spécifiquement dans le TAB. L’utilisation de cette lignée a mis en évidence de nombreux indices suggérant que le froid déclencherait la multiplication des cellules du TAB (afin d’augmenter la quantité de chaleur produite par le tissu) ainsi que la production de lipides (mécanisme appelé lipogenèse, nécessaire pour alimenter la thermogenèse du TAB), mais pas chez les souris mutantes. Cela suggère que ces mécanismes seraient contrôlés par les HT directement dans le TAB, et pas dans le cerveau. Ainsi, cette étude pose la question suivante : l’altération de signalisation thyroïdienne dans le TAB empêche t-elle une lipogenèse et prolifération efficaces, du TAB ? Actuellement, notre modèle murin est le seul à permettre la distinction entre l’effet central et périphérique des hormones, grâce à la spécificité tissulaire des mutations induites.

Bénéfices attendus

Ce projet présente deux bénéfices principaux. Premièrement, il viendra confronter les données publiées dans la littérature qui suggèrent que la cible des HT est le cerveau (qui médie ensuite les effets aux autres tissus) et non pas les tissus périphériques comme il était jusque-là pensé. La démonstration ou la réfutation de ces découvertes sont primordiales afin de comprendre comment les HT régulent le métabolisme et la dépense énergétique. Egalement, il est d’intérêt sociétal de trouver des innovations aux moyens de prévention/traitement de l’obésité et le TAB a dès sa découverte suscité un engouement particulier pour sa capacité à utiliser lipides et glucides et ainsi consommer des calories . Les HT participent au contrôle de la thermogenèse du TAB, puisque des souris hyperthyroïdiennes ont une forte activité du TAB, résultant en une plus grande dépense énergétique et une plus faible susceptibilité à l’obésité et aux désordres métaboliques qui lui sont associés. Toutefois, l’injection d’HT ne peut pas être considérée comme une option viable à ces problématiques puisqu’elle va également avoir des effets métaboliques sur le cœur ou les os, déclenchant des effets secondaires tels que la tachycardie ou l’ostéoporose, par exemple. Il est ainsi crucial de comprendre comment les HT régulent spécifiquement la thermogenèse du TAB, et notamment le métabolisme des lipides, afin de, à plus long terme et avec les progrès de la pharmacologie, concevoir de nouvelles molécules ne stimulant que les activités métaboliques des HT sur le TAB tout en s’affranchissant des effets secondaires néfastes.

Procédures

Les animaux vigiles seront injectés en intrapéritonéal quotidiennement pendant 5 jours avec un produit permettant d’induire la mutation de la signalisation thyroïdienne dans le TAB) via une contention manuelle. Pour réduire le stress généré par cette technique, les animaux seront préalablement contentionés manuellement sans injection, tous les jours pendant une semaine afin de les accoutumer à l’expérimentateur et à la contention. La moitié des effectifs seront ensuite exposés à 4°C pendant 72h, une température à laquelle les animaux arrivent à maintenir leur température corporelle (données publiées et données du laboratoire). Durant cette exposition, les groupes sociaux et un enrichissement de la cage seront maintenus pour faciliter le maintien de la température corporelle. Au bout de 48h au froid, une injection intrapéritonéale unique sera réalisée sur tous les animaux (avec un marqueur de prolifération des cellules), un geste auquel ils auront été accoutumés précédemment. Pour finir, un prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie profonde puis les animaux seront mis à mort pour prélèvement des tissus d’intérêts.

Impact sur les animaux

Aucun effet délétère à l’injection du produit utilisé pour induire les mutations dans le TAB n’a jusque-là été observé aux doses utilisées ici . Ce protocole et ces doses ont été déterminées sur les recommandations de la bibliographie, en réduisant les doses préconisées aux doses minimales mises au point dans notre laboratoire permettant l’induction des mutations dans notre modèle murin. De la même manière, aucun effet délétère n’a été observé par une injection unique du produit utilisé pour marquer les cellules prolifératives) aux doses utilisées fréquemment dans notre laboratoire. Cette dose a été choisie sur la base des données bibliographiques ayant définies cette dose comme étant la dose la plus faible permettant le marquage de toutes les cellules prolifératives. Nous savons que l’exposition au froid fasse diminuer la température corporelle des souris les 4 premières heures avant de revenir proche de la normale au bout de 8h . De plus, les souris mutantes défendent leur température corporelle de la même manière que les animaux non-mutants à 4°C pendant 72h en présence de nourriture dans la cage. Les animaux mutants tendent à consommer légèrement plus de nourriture que les animaux contrôles pour défendre de manière similaire leur température corporelle . La présence de nourriture permet aux souris de palier à la baisse de température, c’est pourquoi des méthodes de facilitation d’accès à la nourriture seront mises en place. De la même manière, tout le matériel nécessaire à la réalisation d’un nid sera maintenu.

Devenir

Cette étude vise à comprendre le rôle des HT dans la prolifération et la lipogenèse du TAB en réponse au froid. Pour cela plusieurs prélèvements terminaux doivent être réalisés. En effet, l’entièreté du TAB doit être analysé pour mesurer les paramètres questionnés. Egalement, une quantité importe de sang doit être prélevée afin de contrôler le taux d’hormones thyroïdiennes circulant, une étape incontournable pour contrôler la pertinence de notre modèle transgénique.

Remplacement

Ce projet nécessite de manière incontournable l’utilisation d’animaux puisqu’elle vise à comprendre le rôle des HT spécifiquement dans le TAB . Aucun modèle in vitro n’est adapté pour répondre aux questions posées. Notamment, une lignée cellulaire provenant du TAB ne répond que très peu aux HT et cette réponse est très différente comparée au tissu in vivo. Une autre alternative in vitro a mis en évidence une limitation puisque dans nos conditions, un très grand nombre d’animaux serait nécessaire pour cette étude (nombre d’animaux estimé à 128, contre 32 en utilisant les animaux entiers). Par ailleurs, la lipogenèse (production de lipides, que nous étudierons dans cette expérience) est un processus impliquant directement plusieurs organes, notamment le foie, dont le métabolisme est lui-même contrôlé par le cerveau. Enfin , l’observation de la lipogenèse et de la prolifération est étudiée en réponse au stimuli principal en conditions physiologiques, à savoir une exposition au froid. Le froid est détecté par les récepteurs sensoriels présents à la surface de la peau. Aucun modèle non-animal n’est capable de récapituler cette complexité multi-organes ni de répondre directement au froid. L’étude de processus métaboliques impliquant nécessairement plusieurs organes en réponse à un stimuli environnemental implique l’utilisation d’animaux.

Réduction

Les études préliminaires réalisées dans le cadre de ce projet nous permettent d’affirmer que 6 animaux par groupe sont suffisants pour détecter une différence de lipogenèse et de prolifération . Néanmoins, la quantité de TAB étant limitée (30mg) l’utilisation de ce tissu peut être délicate. Egalement, un des points limites peut être atteint lors de l’exposition au froid. En ce sens, le groupe d’animaux par groupe est augmenté à 8, toutefois, l’expérience sera d’abord réalisée avec 6 animaux : si aucun point limite n’est atteint et que les extractions aboutissent et répondent aux questions posées, les 2 animaux restants par groupe ne seront pas utilisés. Si un problème technique est rencontré, les animaux supplémentaires pourront être utilisés. Ainsi, nous utilisons le nombre minimal d’animaux en prévoyant une marge pour s’adapter aux limitations techniques que nous pouvons rencontrer. De cette manière, nous ne préovoyons pas de répétition d’expérience. Par ailleurs, la procédure a été optimisée afin d’en tirer le plus d’information possible, à savoir la lipogenèse et la prolifération en réponse au froid, afin de ne pas avoir à dupliquer cette exposition et ne pas utiliser plus d’animaux. Enfin, plusieurs tissus seront prélevés, puisqu’ils pourront être utilisés à posteriori afin de regarder les effets d’une exposition au froid sur ceux-ci, sans avoir à exposer d’autres animaux.

Raffinement

Les souris seront élevées et hébergées par groupe de 3-4 animaux par cage en milieu enrichi pour favoriser la nidation (coton de nidation, feuille de papier, bois à ronger), et ce même pendant l’exposition au froid. Nos expériences précédentes montrent une température des animaux plus faible les 8 premières. Ainsi, pendant cette première phase, les animaux seront surveillés toutes les heures afin de détecter le plus rapidement possible des comportements anormaux. Ensuite, les animaux seront surveillés la journée toutes les 4h, soit quatre points de surveillance quotidiens. En dehors de l’exposition au froid, les animaux seront surveillés et pesés tous les jours. La souffrance des animaux est évaluée au comportement, comportant entre autres la prostration, le pelage et la posture. Egalement, les animaux seront aussi pesés lors des visites (tous les jours) et pendant l’exposition au froid (deux fois fois par jour) afin de contrôler l’absence de perte de poids significative, définissant un point limite de l’expérience. Une attention particulière sera également portée à l’aggressivité entre les animaux. Si de l’aggressivité ou des blessures résultantes sont détectées, les animaux blessés/responsables seront écartés et les blessures soignées à la Vétédine. Les animaux blessés ne seront pas exposés au froid, ou retirés du froid afin de permettre une cicatrisation optimale de leur blessure.

Choix des espèces

Les récepteurs des hormones thyroïdiennes de la souris sont très similaires à ceux de l’homme et chez ces deux espèces les hormones thyroïdiennes stimulent la dépense énergétique. Comprendre comment les hormones thyroïdiennes stimulent ce processus chez la souris apportera donc de précises indications sur les mécanismes présents chez l’Homme et pourront, à terme, être utilisés pour développer de nouveaux composés pharmacologiques afin d’augmenter la dépense énergétique et ainsi lutter contre l’obésité et les désordres métaboliques qui lui sont associés. Ce modèle est aussi le plus utilisé de nos jours pour ce genre d’études ce qui nous permet d’une part de comparer directement nos résultats avec ceux publiés dans la littérature, et d’autre part de les comparer avec les résultats obtenus précédemment dans notre groupe. Nous nous intéressons à la régulation de la physiologie du TAB chez l’adulte, les souris utilisées auront donc entre 2 et 4 mois. Les animaux ne sont pas utilisés au-delà car le tissu adipeux brun tend à décroître avec l'âge.

18 000 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils passent un test de mémoire en labyrinthe en Y après administration de candidats médicaments ou de molécules mimant la maladie d'Alzheimer (scopolamine) ou la schizophrénie (MK-801), avant un prélèvement de sang et de cerveau. Le porteur indique que les effets attendus se limitent à l'inconfort des injections et à une possible sédation, et justifie l'effectif par ce qui est "classiquement utilisé en expérimentation animale". Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'évaluer les fonctions cognitives et que le recours à l'animal est "nécessaire".

Objectifs

Le test d’alternance spontanée en labyrinthe en Y est utilisé pour évaluer l'état des fonctions cognitives des rats et des souris dans des modèles expérimentaux. Le comportement normal d’un animal se caractérise par des alternances de visites des bras. Une alternance est définie comme une visite consécutive des 3 branches. Un animal avec une mémoire de travail intacte (donc des fonctions corticales préfrontales intactes), se souviendra du bras précédemment visité et montrera une tendance à entrer dans un bras moins récemment visité. Un déficit mnésique se caractérisera par un pourcentage d’alternance proche de 50% (visites au hasard). Le projet présenté ici a pour objectif la mise en place d’un test de mémoire « le test d’alternance spontanée en labyrinthe Y » chez le rongeur (rat/souris) pour : 1) étudier les effets potentiels induits par un médicament candidat sur les fonctions cognitives ; 2) tester l’efficacité de médicament candidat sur les déficits cognitifs induits soit par une molécule amnésiante tel que la scopolamine (l’administration de scopolamine induit des changements de connectivité cérébrale observés dans la maladie d’Alzheimer, elle est donc utilisée comme modèle pharmacologique de la maladie d’Alzheimer chez le rongeur) soit par un antagoniste non compétitif du récepteur du N-méthyl-D-aspartate tel que le MK-801 (le dysfonctionnement des récepteurs NMDA est maintenant bien connu dans la schizophrénie, le MK-801 est donc utilisé comme modèle pharmacologique de la schizophrénie chez le rongeur).

Bénéfices attendus

La compréhension des déficiences fonctionnelles et des processus pathologiques est d'une importance vitale afin de développer des thérapies efficaces. En utilisant le comportement exploratoire naturel des rongeurs, le labyrinthe d’alternance spontanée en labyrinthe Y permet d’évaluer la mémoire de travail spatiale à court terme. Le protocole de test du labyrinthe en Y est simple et nécessite des ressources minimales. Il peut également être appliqué pour étudier la mémoire à court terme dans des modèles de rongeurs âgés.

Procédures

La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Lors de l’administration d’un nouvel agent thérapeutique, différents effets indésirables peuvent être observés : inconfort dû à l’injection, des effets secondaires dus aux produits (comme la sédation par exemple)

Devenir

Pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux seront soumis à la fin de l’étude à un prélèvement sanguin et de cerveau.

Remplacement

A ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives permettant d’évaluer les fonctions cognitives. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Il correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne et d’erreurs standard de la moyenne (SEM). La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles.

Raffinement

Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Les animaux seront pesés et leur état général quotidiennement évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle animal et la maladie humaine fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur cette maladie dans toute sa complexité. Les lignées de souris utilisées (selon les protocoles) sont : C57Bl/6 J ou SWISS. D'autres lignées de souris peuvent également être utilisées (C57Bl/6 N, BALB/c, DBA/2, BTBR.....) Les lignées de rats utilisées (selon les protocoles) sont : Wistar et Sprague-Dawley. D'autres lignées de rats peuvent également être utilisées (SHR) 5 -52 semaines au moment du test. Les molécules développées sont destinées à des adultes et personnes âgées.

54 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent trois formulations à doses croissantes, jusqu'à 100 mg/kg, en injection unique puis pendant cinq jours, avec des prélèvements de sang à la mâchoire sur animal éveillé puis un prélèvement terminal au cœur, pour fixer la dose maximale tolérée en vue d'un dossier d'autorisation de mise sur le marché. Le porteur indique qu'il est probable que les animaux présentent des effets indésirables et fixe des points limites tels que convulsions, détresse respiratoire ou automutilation. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit l'effet de l'"organisme entier" sur les molécules et qu'il est "indispensable de recourir à l'animal de laboratoire".

Objectifs

L'objectif de ce projet est de déterminer la dose maximale tolérée de trois formulations différentes. Chaque formulation sera administrée à la dose de 10, 50 et 100 mg/kg.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont de déterminer la dose maximale tolérée pour les trois formulations testées aprés une administration unique ou une administration répétée pendant 5 jours. La classe thérapeutique du principe actif est Neurologie, le but étant de déterminer les doses cibles pour les futures études de toxicologie demandées par les autorités pour un dépôt de dossier AMM.

Procédures

- Les animaux auront une simple administration en période 1 puis aprés une période de repos d'au moins 3 jours, ils auront une administration répétées pendant 5 jours (administrations Intra péritonéale en période 1 et 2). - Les prélèvements seront de 3 prélèvements par animal en période 1 juste aprés administration à 30min, 2h et 6h. Puis les animaux auront une période de repos d'au moins 3 jours. En période 2, les animaux auront également 3 prélèvements aux même temps aprés la cinquième et dernière administration. Volume maximal prélevé: 60 µl Les prélèvements se font sur animal vigile (microsampling à la veine mandibulaire) ou sous anesthésie (prélèvement terminal en intra-cardiaque).

Impact sur les animaux

Le but étant de déterminer une dose maximale, il est fort probable d'avoir des signes d'effets indésirables sur les animaux. Les animaux seront observés au minimum deux fois par jours pour un prise en charge rapide de l'animal si besoin. Les points limites ou points d'arrêt anticipés sont: - Immobilité prolongée de l'animal, décubitus - Suffocation, convulsion, détresse respiratoire - Apparence physique dégradée, absence de toilettage (ex : poil ébouriffé ou souillé) - Changements majeurs de comportements (ex : automutilation, agitation intense...)

Devenir

Les animaux seront euthanasiés conformément aux bonnes pratiques vétérinaires et à la réglementation en vigueur. Suite à cette procédure, des tissus (coeur, cerveau, poumons, reins, foie, rate, pancréas, muscle et tube digestif) seront collectés pour analyse

Remplacement

Le but de ce projet est de déterminer une dose maximale tolérée. La classe thérapeutique des formulations testées: neurologie. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire les effets de l'organisme entier sur les molécules, il est indispensable de recourir à l'animal de laboratoire.

Réduction

Dans ce projet, 54 animaux seront inclus (27 male et 27 femelle). Les animaux seront répartis en 9 groupes de 6 animaux. C'est le nombre d'animaux minimal requis pour avoir des résultats interprétables.

Raffinement

Durant toute la phase expérimentale, les animaux seront hébergés par groupe de 6 dans une même cage comprenant de la litière et du matériel d'enrichissement (ex: nid, bois à ronger). Un suivi quotidien (2 fois par jour à minima) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires (observation de l'état de santé général, comportement de l'animal....).

Choix des espèces

La souris est l'espèce utilisée dans ce projet. Cette espèce est bien décrite et caractérisée dans la littérature et son utilisation est conseillée (OECD) pour les essais de produits pharmaceutiques. La souche C57BL6 est particulièrement utilisée dans le domaine de la neurologie. Jeune adulte. Stade de developpement requis pour ce type d'étude

1000 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont inoculés avec des trypanosomes, prélevés chaque jour d'une goutte de sang à la queue puis exsanguinés sous anesthésie, une partie des souris étant exposée aux piqûres de mouches tsé-tsé pour étudier la transmission. Le porteur indique que l'infection peut rendre les animaux moribonds ou prostrés, le poil hérissé, et décrit des points limites déclenchant une euthanasie précoce. Il affirme que ces souches parasitaires ne peuvent pas être maintenues in vitro et que l'hôte vivant reste nécessaire pour tester molécules et vaccins.

Objectifs

L’objectif de ce projet est donc d’amplifier des souches sanguicoles de trypanosomes (Trypanosoma brucei gambiense, Trypanosoma evansi, Trypanosoma brucei brucei, Trypanosoma congolense, Trypanosoma vivax) conservées en azote liquide, par passage sur souris et rats afin de a) produire des souches en quantité massive pour production d’antigènes parasitaires nécessaires aux tests de dépistage type ELISA et pour des études de caractérisation du protéome, du transcriptome et du secrétome des trypanosomes dans l’objectif de développer de nouvelles molécules afin de proposer des tests diagnostiques plus sensibles et spécifiques, b) réaliser des stabilats cryoconservés de trypanosomes pour entretien de notre cryothèque, c) réaliser des repas sanguins infectants de glossines (sur souris balb/c et génétiquement modifiées) pour étudier les modalités de la transmission vectorielle des trypanosomoses africaines humaine et animale, d) tester des molécules candidates afin de mettre au point un traitement contre les trypanosomes humaine et animale et d’étudier l’efficacité de certaines d’entre elles pour développer un vaccin anti-maladie. e) évaluer l’importance de la localisation des parasites dans le derme au cours de l’infection en fonction de l’espèce de trypanosome et valider sa valeur diagnostique.

Bénéfices attendus

Notre unité de recherche développe des approches multidisciplinaires visant à améliorer la compréhension des mécanismes infectieux dans les maladies induites par des protozoaires parasites de la famille des trypanosomatidae (les trypanosomes). Ces maladies transmises par des vecteurs (glossines essentiellement) sévissent dans des zones rurales pauvres des pays africains et constituent un obstacle majeur à l’installation humaine et au développement de l’élevage et de l’agriculture avec un fort impact socio-économique pour des populations déjà fortement appauvries. Des moyens de lutte existent, basés sur la lutte anti-vectorielle et l’utilisation d’outils diagnostiques et de traitements curatifs, mais bien qu’utilisés de façon raisonnée et intégrée, ils montrent de plus en plus leurs limites (chimiorésistances développées par les populations d’insectes et les parasites par exemple). Nos travaux s’inscrivent dans un souci d’amélioration des outils diagnostiques existants (amélioration et développement de tests de dépistages), d’identification de molécules ayant une action curative ou préventive, de mise au point d’un vaccin efficace pour protéger les populations humaines et animales et enfin, d’amélioration des outils de la lutte anti-vectorielle.

Procédures

Injections et prélèvements sanguins sur animaux anesthésiés. 40 rats et 300 souris seront inoculés une fois avec des souches de trypanosomes (dans certains cas une immunosuppression sera, au préalable, réalisée par injection), un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé quotidiennement sur 2 à 10 jours maximum et une exsanguination sous anesthésie profonde sera ensuite réalisée. 210 souris seront inoculées une fois avec des souches de trypanosomes, un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé quotidiennement sur 2 à 10 jours maximum, une anesthésie par injection d’un mélange anesthésique sera ensuite réalisée suivi d’un repas de glossines de 10 minutes. 240 souris seront immunisées trois fois à deux semaines d’intervalle, puis seront inoculées une fois avec des souches de trypanosomes, un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé quotidiennement sur 2 mois maximum et une exsanguination sous anesthésie profonde sera ensuite réalisée. 30 souris seront inoculées une fois avec des souches de trypanosomes, 90 souris seront inoculées une fois avec des souches de trypanosomes et une fois avec la molécule à tester et 30 souris seront inoculées une fois avec la molécule à tester. Sur ces 150 souris un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé quotidiennement pendant 10 jours. 60 rats seront inoculés une fois avec des souches de trypanosomes un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé avant l’inoculation et quotidiennement pendant 10 jours, un prélèvement de peau à 2 endroits différents sera réalisé deux fois à J4 et J10 après l’inoculation.

Impact sur les animaux

Les animaux infectés voient une parasitémie se développer dans leur sang, les nuisances vont de l'asymptomatisme à un changement d’apparence physique tel que le poil hérissé pendant plus de 3 jours, avec un aspect général moribond ou un état de prostration. Les inoculations peuvent provoquer du stress chez les animaux.

Devenir

L'ensemble des souris et rats seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de récolter les parasites ou le sérum des animaux.

Remplacement

Les souches parasitaires que nous utilisons ne peuvent pas être maintenues in vitro, elles sont extracellulaires et se développent dans le sang de leur hôte, voire dans le derme. Ils entretiennent avec l’organisme hôte des relations étroites de nature cellulaires et chimiques nécessaires à leur développement et il nous est impossible de les reconstituer en utilisant des milieux artificiels même complémentés. De même, les mécanismes de transmission à la glossine nécessitent également l’utilisation du modèle animal. Les « tests de molécules à visées thérapeutiques et vaccinales », bien que nous mettions en place des tests in vitro et ex vivo visant à étudier leurs effets sur les cellules de l’hôte, nécessitent l’hôte pour avoir une vue d’ensemble des mécanismes complexes mis en jeu lors d’une infection. La mise en évidence de parasites dans le derme ne peut se vérifier que par le mode in vivo.

Réduction

Les animaux utilisés sont reduits au strict minimum.

Raffinement

L'espériencce des utilisateurs a permis la définition de points limites qui permettent grâce au suivi quotidien des animaux et de leur parasitémie, de procéder à l'euthanasie précoce d'un animal qui commence à présenter des signes de malêtre.

Choix des espèces

Les souris et les rats sont des espèces classiquement utilisées pour la multiplication des souches de trypanosomes africains. Elles développent une infection comprise entre 3 et 10 jours post-infection en moyenne en fonction de la souche parasitaire utilisée. Le cas échéant, des souris génétiquement modifiées pourront être utilisées pour l’étude des interactions hôtes/pathogènes/vecteur. Les rats sont utilisés lorsque la quantité de parasites à produire est plus importante (cas de la production d’antigènes parasitaires). Des souris et des rats adultes seront utilisés afin d’optimiser la quantité de parasites à produire ou de sérum à récolter.

Six cochons femelles de 20 à 25 kg vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, chaque animal reçoit six incisions d'au moins huit centimètres sur le thorax pour comparer deux colles chirurgicales, avec de la buprénorphine en cas de douleur au réveil. Le porteur indique que les tissus sont prélevés après euthanasie pour analyser la cicatrisation. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit l'inflammation et la cicatrisation d'une plaie et qu'il est "indispensable de recourir à l'animal entier".

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer la réponse inflammatoire locale ainsi que le processus de cicatrisation d'une plaie aprés l'application de deux colles chirurgicales différentes utilisées pour des sutures cutannées.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus pour ce projet sont de suturer des plaies superficielles de façon simple et atraumatique. Les colles chirurgicale favorisent l'hémostase locale, renforcent les sutures et assurent l'adhésion tissulaire.

Procédures

Dans ce projet, six porcs femelles de 20-25 kg seront incluses. Aprés une période d'acclimatation d'une semaine, les animaux seront anesthésiés de manière générale ( "pig cocktail" 0.1 mg/kg). Six plaies superficielles seront faites au niveau de la zone thoracique de chaque animal. Les plaies seront des incisions linéaires, verticales, 3 à gauche et 3 à droite d'au moins 8 cm de longueur.La durée d'intervention sera inferieure à une heure par animal. La manipulation des animaux et la réalisation des plaies seront faites par un personnel expérimenté et formé conformément à la réglementation en vigueur. En cas de douleur suite à la réalisation des plaies, lors du réveil des animaux suite à l'anesthésie générale, il sera possible d'administrer de la Buprénorphine (0.1 mg/kg) en intra musculaire toutes les 6 à 8 h si nécessaire.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sont les problèmes de cicatrisation. Apparition d'hématome, ou infection au niveau de la plaie.

Devenir

A la fin de cette procédure, tous les animaux seront euthanasiés pour prélever les site d'application pour l'analyse des tissus

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire une réponse à l'inflammation ou un processus de cicatrisation au niveau d'une plaie, il est indispensable de recourir à l'animal entier. L'animal ne peut pas être remplacé.

Réduction

Six animaux sont prévus dans ce projet. C'est le nombre minimal d'animaux requis par les textes reglementaires pour avoir des résultats interprétables et significatifs.

Raffinement

Les animaux seront hégergés individuellement à partir de l'acclimatation jusqu'à la fin de la phase animale. Cet hébergement en individuel est nécéssaire pendant l'acclimatation à cause du risque de bagarre car il faut éviter le contact entre les animaux (chevauchement) ce qui pourrait fausser les résultats de l'étude. Une attention particulière sera portée aux animaux pour avoir un enrichissement du milieu adapté pour éviter l'ennui: contact visuel et olfactif entre congénères, surface suffisante de l'hébergement, présence de jouets... Un suivi quotidien (voir plusieurs fois par jour) sera mis en place permettant l'observation générale des animaux.

Choix des espèces

La réponse de l'inflammation et le processus de cicatrisation entre l'espèce porcine et humaine sont trés proche et quasi similaire. Espèce de choix pour ce type d'étude. Jeune adulte Entre 8 -10 semaines Poids entre 20-25 kilos Le collagène dermique et le contenu élastique de la peau du porc sont équivalents à l’homme.

600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier des syndromes d'hypercroissance liés au gène PIK3CA. Une partie est gavée pendant deux mois avec un inhibiteur, d'autres reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules mutées, plusieurs lignées génétiquement modifiées étant entretenues en parallèle. Le porteur indique que les souris de maintien de lignée restent en vie, celles des procédures étant tuées pour exploration anatomique et histologique. Il affirme que ces syndromes ne peuvent pas s'étudier in vitro, hors de leur environnement, et que la souris est le seul animal chez qui la protéine PIK3CA a été mutée.

Objectifs

Meilleur compréhension de la physiopathologie des syndromes d'hypercroissance dysharmonieux. Nous souhaitons maintenant : 1-Étudier l’effet de la mutation PIK3CA dans chaque tissu de l’organisme (graisse, muscle, os, vaisseaux lymphatiques, vaisseaux artériels, vaisseaux veineux et les nerfs) en utilisant des modèles génétiques appropriés. 2- Tester l’efficacité d'un inhibiteur dans chacune des conditions. 3- Comprendre la physiopathologie de ces syndromes.

Bénéfices attendus

Meilleur compréhension de la physiopathologie des syndromes d'hypercroissance dysharmonieux. Identification des tissus sensibles à une inhibition pharmacologique.

Procédures

Au cours de la procédure 2, un gavage sera effectué par un technicien expérimenté et le plus petit volume possible sera administré aux souris (50ul). Le gavage débutera à la semaine 6 de vie pendant 2 mois. Les animaux seront gavés soit par le véhicule soit par l'inhibiteur de PIK3CA. Les sondes de gavages sont les dernières arrivées sur le marché, en silicone, ultra souples et non traumatisante pour l’animal. Au cours de la procédure 3, des cellules de différents types de tissus portant une mutation PI3KCA seront injectées en sous cutanée chez des souris immunodéficientes. Cette injection sera réalisée par un technicien expérimenté, chez des souris anesthesiées et un injectant le plus petit volume possible.

Impact sur les animaux

1-Le gavage quotidien qui débutera à la semaine 6 de vie et sera effectué pendant 2 mois. Les animaux seront gavés soit par le véhicule soit par l'inhibiteur de PIK3CA. 2- Injection sous cutanée de cellules mutées PIK3CA chez des souris immunodéficientes (une injection unique).Nous n'attendons aucun effet indésirable lié au gavage ou à l'injection sous cutanée.

Devenir

Procédure 1: maintien de lignée, donc souris maintenues en vie Prodédures 2 et 3: animaux sacrifiés pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Dans un contexte de recherche physiopathologique sur lces syndromes d'hypercroissance, les expérimentations in vivo ne peuvent en aucun cas être remplacées par des expériences in vitro, où les cellules sont sorties de leur environnement. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas utilisables dans ce contexte car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu. Les résultats obtenus avec des modèles murins peuvent tout au mieux être complétés par des expériences in vitro.

Réduction

La taille des groupes utilisés (n-25), minimum nécessaire et suffisant pour l’obtention de résultats significatifs, en utilisant des tests statistiques adaptés, qui satisfait à l’objectif de réduction du nombre d’animaux exposés aux procédures expérimentales.

Raffinement

Ce protocole est peu invasif puisque le gavage sera réalisé sur des souris mises dans des conditons de calme, par un technicien expérimenté et le plus petit volume possible sera administré aux souris (50ul). Le gavage débutera à la semaine 6 de vie pendant 2 mois. Les animaux seront gavés soit par le véhicule soit par du BYL719. Les sondes de gavages sont les dernières arrivées sur le marché, en silicone, ultra souple et non traumatisante pour l’animal. Aucun prélevement ne sera effectué chez les souris. A priori l'inhibiteur de PIK3CA devrait améliorer le phénotype des souris. Nous injecterons également 1 million de cellules en sous cutanée chez des souris. Ces injections seront réalisées chez des souris anesthésiées (injection intrapéritonéale de Kétamine (128 mg/kg)/Xylazine (6,4 mg/kg)), par un technicien expérimenté et le plus petit volume possible sera administré aux souris (50ul).

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction et elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques et que de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). La souris est le seul animal pour lequel la protéine PIK3CA a été mutée Jeunes souris de 6 semaines car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée.