Recherche fondamentale

250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de tumeurs mammaires 4T1, elles passent des examens d'IRM sous anesthésie, les effets indésirables déclarés se limitant au développement de la tumeur. L'objectif est de concevoir et valider des agents de contraste ciblant la nétrine-1 pour détecter plus tôt le cancer mammaire métastatique. Le porteur décrit très brièvement les procédures et affirme que l'étude préclinique ne peut se faire que sur un "organisme vivant entier".

Objectifs

Le projet a pour objectif la conception et la validation de nouveaux agents de contraste qui ciblent spécifiquement la nétrine-1, pour le diagnostic précoce du cancer mammaire de type métastatique.

Bénéfices attendus

Les bénfices de ce projet concerne la possiblité d'une détection précoce du cancer mammaires pour une prise en charge plus rapide et plus éfficace

Procédures

les animaux passeront des examens d'imagerie non invasive in vivo d'IRM

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont liés au développement de la tumeur 4T1. Une grille descoring a été établie et des points limites ont été définis.

Devenir

à l'issue de chaque procédure les animaux seront euthanasiés par disclocation cervicale

Remplacement

le modèle animal souris est fondamental dans notre cas, puisque l’étude préclinique en particulier ne peut se faire que sur un organisme vivant entier.

Réduction

le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. Pour ces procédures expérimentales, la stratégie d’observation des animaux retenue est l’observation des animaux et l’imagerie in vivo. La bonne connaissance de l’état clinique normal de la souche de souris utilisée nous permettra d’observer précisément et d’interpréter rigoureusement les signes cliniques de souffrance des animaux. Les souris seront observées chaque jour de la semaine et les critères comportementaux et tumoraux pris en comptes pour l’évaluation du pallier de douleur (point limite) sont présentés dans les procédures. Les mêmes animaux seront utilisés pour les différents temps du suivi. Cette approche permet de réduire de façon notable le nombre d’animaux nécessaires à 10 par groupe pour en avoir 5 de taille homogène, nombre nécessaire permettant l’obtention d’une étude avec des souris homogènes en taille de tumeurs par stade de développement tumoral. Des tests t non paramétriques avec correction de Welch seront utilisés pour comparer les valeurs obtenues pour les différents lots de souris (n=5).

Raffinement

les animaux sont observés scrupuleusement afin de respecter leur bien-être et d’éviter au maximum la douleur au moment de l’expérimentation. Des points limites prédictifs ont été mis en place. Durant les acquisitions d’imagerie les animaux seront anesthésiés

Choix des espèces

La souris est une espèce animale classiquement utilisée pour les études de tumorigénèse, de progression tumorale et métastatique de par la relative faible durée des expérimentations (quelques semaines), ainsi que par la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la croissance de tumeurs primaires et de métastases issues de cellules cancéreuses. Les tumeurs mammaires métastatiques 4T1 étudiées sont spécifiques du modèle murin. 5 - 6 semaines, stade où les bourgeons mammaires ne sont pas complètement développés et où les conditions hormonales de la souris sont adéquates pour la croissance tumorale.

1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont injectées dans la patte sous anesthésie, puis elles reçoivent un traitement par injection intrapéritonéale trois fois par semaine, l'implantation dans la patte pouvant gêner son usage et provoquer une nécrose cutanée. L'objectif est de comprendre le rôle de la protéine NLRP3 dans les lymphocytes T CD8 et la réponse antitumorale, recherche fondamentale rattachée à l'immunothérapie anti-PD1 à laquelle seuls 20 % des patients répondent. Le porteur affirme que le recrutement des cellules au site tumoral ne peut être étudié in vitro et que la souris est la seule espèce transgénique disponible.

Objectifs

NLRP3 est une protéine largement décrite pour son rôle dans l’inflammation. L’inflammation va impacter alors d’autres cellules de l’immunité appelées lymphocytes T CD8. Il y a quelques années, nous avons démontré que NLRP3 possède des fonctions dites non-canoniques, c’est-à-dire indépendantes de l’inflammasome notamment dans les lymphocytes T CD4. Les cellules T CD8 ont beaucoup de caractéristiques communes aux lymphocytes T CD4. Nos données préliminaires obtenues in vitro, laissent penser que NLRP3 est présent dans les lymphocytes T CD8. Au regard de ces résultats, nous souhaitons aujourd’hui comprendre le rôle de NLRP3 dans la biologie des lymphocytes T CD8 et l’effet sur la réponse immunitaire anntitumorale. Pour discriminer les effets dépendants de l’inflammation et de NLRP3 endogène aux CD8, nous avons croisé des souris CD8cre avec des souris NLRP3flox nous permettant d’obtenir des souris dans lesquelles seuls les CD8 sont déficients pour NLRP3. Ainsi, en comparant les cellules T CD8 infiltrant les tumeurs des souris C57Bl6, NLRP3 totalement déficientes pour NLRP3 et CD8cre x NLRP3flox, nous pourrons déterminer comment la déficience en NLRP3 impacte la biologie de lymphocytes T CD8 et la réponse immunitaire anti-tumorale.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont les suivants : - A l’heure actuelle aucune étude n’a évalué le rôle de NLRP3 dans les lymphocytes T CD8. Cette étude permettra d’apporter des connaissances nouvelles. - L’immunothérapie par anti-PD1 est une stratégie thérapeutique de plus en plus utilisée en cancérologie humaine. Malheureusement seul 20% des patients répondent à cette thérapie. Cette étude pourrait permettre d’évaluer si le ciblage de NLRP3 pourrait être une alternative ou un complément pour réactiver les lymphocytes CD8 antitumoraux et améliorer la réponse immunitaire antitumorale. Plusieurs études ont tenté de décrire le rôle de NLRP3 dans la tumorigenèse et la réponse immunitaire antitumorale. Dans toutes ces études, seules les fonctions de NLRP3 dépendantes de l’inflammasome et de l’IL-1b ont été explorées. Grâce à notre étude, nous pensons pouvoir affiner les résultats de la littérature en dissociant les effets de NLRP3 dans ses fonctions canoniques et non canoniques

Procédures

Les animaux recevront une injection de cellules tumorales en sous cutanées dans la patte sous anesthésie générale à l’isoflurane. Puis 3 fois par semaines, les animaux, vigiles, recevront un traitement par injection intrapéritonéale. Nous profiterons de cette manipulation pour mesurer la taille des tumeurs grâce à un pied à coulisse. En fin d’expérience, es animaux seront mis à mort par dislocation cervicale sous anesthésie générale à l’isoflurane.

Impact sur les animaux

Les tumeurs seront induites en sous cutanées dans la patte. En effet, il a été observé que le recrutement des cellules immunitaires était de meilleur qualité à ce site d’injection. De ce fait, une des nuisances pouvant être observée est une difficulté à se servir de la patte en question. Une autre nuisance qui pourrait être observée est la formation de nécrose cutanée. Afin de limiter ces nuisances, les souris seront observées tous les 2 jours et les points limites tiendront compte de ces effets indésirables.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience car nous étudierons les cellules immunitaires présentes dans les tumeurs, rate et ganglions.

Remplacement

Nous avons déjà réalisé un certain nombre d’expériences in vitro pour caractériser les différences entre les CD8 issus de souris C57Bl6 et les CD8 déficients pour NLRP3. Ceci nous a permis d’identifier des marqueurs d’intérêt et phénomènes à explorer in vivo. Malheureusement, le recrutement au site tumoral et l’implication dans la réponse immunitaire antitumorale ne peuvent pas être appréhendés in vitro à l’heure actuelle car ce sont des mécanismes trop complexes qui font intervenir plusieurs acteurs cellulaires et moléculaires. Une fois que nous aurons obtenus les résultats de cette étude chez la souris, le décryptage des mécanismes moléculaires mis en œuvre sera réalisé in vitro.

Réduction

Dans un souci de réduction, les expériences ne seront réalisées que 2 fois et par des personnes parfaitement formées aux gestes permettant d’optimiser la reproductibilité. De plus, chaque expérience de croissance tumorale sera accompagnée d’une analyse de l’infiltrat immunitaire afin de récolter un maximum d’informations sur les mêmes souris sans avoir besoin de recommencer les expériences.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. Ils seront suivis 3 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (la fréquence de surveillance sera bien entendu augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux). Des critères d’interruption de l’étude ont été mis en place dans le cas où un animal monterait des signes de souffrance.

Choix des espèces

Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales transgéniques disponibles pour l’expérimentation. Enfin les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Des animaux de 6 à 8 semaines seront utilisés car leur système immunitaire est mature à cet âge.

70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont injectées sous la peau, puis une partie reçoit des traitements par gavage cinq jours par semaine et par injection intrapéritonéale deux fois par semaine, la tumeur pouvant atteindre 1 000 mm³. Le porteur décrit une gêne légère par geste dont l'accumulation devient modérée, et cherche à confirmer in vivo que bloquer le facteur CTGF limite l'agressivité tumorale dans le cancer du rein. Les retombées cliniques annoncées, de nouvelles combinaisons de médicaments, restent au conditionnel, et le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les interactions entre compartiments cellulaires.

Objectifs

Les tumeurs du rein sont très riches en vaisseaux sanguins. Une des stratégies thérapeutiques est de bloquer la formation de ces vaisseaux par des traitements anti-angiogéniques. Malheureusement, les patients développent des résistances au traitement et la maladie progresse inéluctablement. Notre équipe cherche à comprendre les mécanismes moléculaires qui expliquent l’apparition de résistance chez les patients atteints de cancer du rein à cellules claires. Nos résultats in vitro montrent que les cellules libèrent des molécules en réponse au traitement. Parmi ces molécules, nous avons identifié le facteur de croissance des tissus conjonctifs (CTGF), et nous avons montré que CTGF participe à l’agressivité tumorale. Par conséquent, nos résultats suggèrent que le ciblage de CTGF pourrait représenter une stratégie thérapeutique innovante. Nous souhaitons confirmer in vivo que bloquer CTGF permettrait de limiter l’agressivité tumorale voir induire la mort des cellules tumorales. Cette étude nous permettra de conclure sur la pertinence de l’utilisation d’un anticorps anti-CTGF dans le traitement du cancer du rein à cellules claire métastatique.

Bénéfices attendus

La validation de nos résultats in vitro sur un modèle in vivo nous permettrait dans l’avenir de développer des stratégies thérapeutiques ciblant CTGF dans le traitement des RCC. Cette démarche fondamentale et translationnelle permettra d’améliorer l’efficacité des drogues par l’identification de nouvelles stratégies thérapeutiques / biomarqueurs de résistances. Un transfert vers la clinique avec de nouvelles voies thérapeutiques incluant des combinaisons innovantes de médicaments serait l'accomplissement de ce projet.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à des injections sous-cutanées de cellules tumorales (une injection par souris). Ces souris seront divisées en 2 groupes. Un groupe ne subira aucun traitement, seul un suivi de la croissance tumorale sera réalisé. Pour le second groupe, lorsque la tumeur atteindra un volume suffisamment important, des traitements seront administrés aux souris en gavage et/ ou en injection intrapéritonéal. Le traitement par gavage sera réalisé 5 fois par semaine et le traitement en intrapéritonéal 2 fois par semaine. Ces injections, que ce soit de cellules tumorales ou du traitement administré, ne dureront que quelques secondes chaque fois. Le traitement par gavage, réalisé à l’aide d’une canule de gavage est également une procédure très rapide. Enfin, aucune autre intervention ne sera réalisée sur l’animal vigil ou endormi. Les souris seront monitorées quotidiennement afin d’assurer une bonne gestion de la douleur. Chacune des souris de ce projet sera suivie à l’aide d’une fiche de score adaptée à son traitement puis mise à mort à la fin de la procédure expérimentale ou si l’animal atteint un point limite. Si aucun point limite n’est rencontré, les traitements auront lieu durant 4 à 5 semaines jusqu’à atteindre un volume tumoral de 1000 mm3.

Impact sur les animaux

En ce qui concerne les injections sous-cutanées de cellules tumorales ainsi que les gavages sont associés à une gêne voir douleur de type légère. Ces actes expérimentaux ne nécessitent cependant aucune anesthésie. Ces cellules tumorales ne metastasent pas. Les animaux seront mis à mort suffisamment tôt afin d'éviter l'apparition de nécroses au niveau des tumeurs. Néanmoins, s'agissant d'un protocole impliquant i) l'injection de cellules tumorales, et ii) des traitements par gavage (5 jours /7) et en intrapéritonéal (2 fois par semaine), qui, individuellement, vont générer une douleur légère et du stress mais dont l’accumulation par animal entraine une nuisance globale modérée.

Devenir

Le prélèvement des tumeurs nécessitera la mise à mort des souris.

Remplacement

Aucune méthode alternative ou modèle in vitro n’existe pour mimer les interactions qui existent entre les différents compartiments cellulaires (endothelial, epithelial, stromal, etc).

Réduction

Avant de passer au modèle in vivo, toutes nos expériences ont été préalablement validées in vitro. Nous avons également effectué une large recherche bibliographique. Les effectifs ont été choisis afin d’obtenir des résultats significatifs avec le nombre de souris minimum. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous nous baserons sur les données de la littérature et sur nos résultats antérieurs pour les doses administrées de composés pharmacologiques. Le nombre minimum de souris est établi à 10 par groupe pour être statistiquement significatif (en nous basant sur le fait que les traitements expérimentaux induiront une diminution de la prise/croissance tumorale d’au moins 20%). Enfin, nous utiliserons un test statistique paramétrique (test Anova) afin de pouvoir réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de données statistiquement exploitables statistiquement.

Raffinement

Pour limiter la douleur modérée que notre procédure expérimentale pourrait induire, nous avons établi une grille d’observation visant à définir les points limites précoces à partir desquels l’expérience sera arrêtée et qui indique les mesures que nous prendrons à l’apparition des premiers signes de douleur ou de perte de poids. D'autre part, en plus du personnel de l’animalerie, un suivi sanitaire tri-hebdomadaire puis 5/7 jours (à partir du début des traitements) sera réalisé par les membres de l’équipe (expérimentateurs) à l’aide d’une feuille de score adaptée au modèle (Annexe 1). La fréquence de ces examens sera intensifiée en fonction des symptômes relevés sur un animal jusqu'à la disparition du problème ou la mise à mort de l'animal.

Choix des espèces

Les modèles murins sont les modèles les plus répandus pour étudier l’effet de drogue ou traitement par anticorps sur la croissance tumorale. Notons également que cette espèce est facilement manipulable. Dans ce projet, nous utilisons des souris immunodéficientes ce qui nous permettra d’utiliser des modèles humains de RCC. Les souris utilisées seront de jeunes femelles adultes agées de 7 à 8 semaines.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont implantées dans le tronc cérébral, l'injection étant pratiquée sur des souriceaux de deux jours, puis des médicaments sont administrés avant une mise à mort par dislocation cervicale pour prélever les tumeurs. Le porteur situe le projet face aux tumeurs du tronc cérébral de l'enfant, cancer au taux de survie proche de zéro, l'objectif immédiat restant de valider une nouvelle lignée tumorale et l'association de deux médicaments. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne reproduit la complexité observée in vivo et que cette souche de souris immunodéficiente ne peut être remplacée.

Objectifs

Les tumeurs du tronc cérébral sont actuellement les cancers les plus mortels chez l’enfant, avec un taux de survie proche de zéro. La découverte et la validation de nouveaux traitements des tumeurs du tronc cérébral permettront de faire un pas important pour soigner les enfants souffrant de ce cancer, toujours incurable en 2021

Bénéfices attendus

Démontrer que la nouvelle lignée de tumeur du tronc cérébral forme des tumeurs chez la souris NGS et que ces cellules constituent un bon modèle d'étude pour mieux comprendre le développement de la tumeur et pour tester des médicaments. Démontrer que l’association de deux nouveaux médicaments bloque la formation de tumeur chez la souris.

Procédures

Implantation de cellules tumorales en intracrânien dans le tronc cérébral. Administration de médicaments.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales utilisées dans ce projet sont de classe modérée avec la greffe de cellules tumorales dans le tronc cérébral et la formation de tumeur dans le cerveau. Dans certaines conditions du projet, des agents anticancéreux seront administrés aux animaux afin d’évaluer la sensibilité des cellules tumorales à cette nouvelle thérapie. La plupart des manipulations sur les animaux seront réalisés sous anesthésie générale.

Devenir

Les 320 souris de ce projet seront euthanasiées par dislocation des vertèbres cervicales afin de procéder au prélèvement des tumeurs et leur analyse pas des arppoches moléculaires et histologiques.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et/ou moléculaire de notre objet d'étude. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de cette souche de souris immunodéficience. Les conclusions recherchées ne peuvent être obtenues par des modèles alternatifs d'étude in vitro, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, l’interactivité et la diversité des compartiment stromales et tumorales en action in vivo chez la souris.

Réduction

Le test statistique utilisé sera le test l’ANOVA (test très généralement utilisé pour ces études). D’après la littérature scientifique, le nombre d’animaux nécessaire par lot pour détecter 50% de différence inter-lots avec 50% d’écart type intra lots est de 10.

Raffinement

Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse infligées aux animaux. Les souris seront hébergées en animalerie A2, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques par du personnel qualifié. Ces animaux sont hébergés en cages de type 2L à raison de 5 souris par cage. Les conditions d’hébergements sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu en l’occurrence des nids de « woodwoll » (Safe, France). En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Le score limite est de 12. Au-delà, l’animal sera euthanasié sans attendre (cf. grille jointe en annexe). En tenant compte de ces points limites adaptés et conformément au paragraphe 3 de l’annexe VIII de la directive 2010/63 CE, nous proposons comme classement pour l’ensemble de nos procédures le degré modéré. Les critères prépondérants ainsi que les mesures conservatoires en fonction du score de cette grille sont détaillés dans les procédures (cf. paragraphe 4).

Choix des espèces

1. La souche de souris NSG est appliquée dans la recherche sur le cancer en raison de sa capacité à développer le processus étudié du fait de sa forte immunodépression. 2. La capacité d’extrapoler les résultats. 3. L’expérience d’utilisation des chercheurs demandeurs. 4. L’existence des équipements nécessaires à l’étude. 5. La pertinence des installations de l’Animalerie. Pour le modèle intracrânien de gliome, l’injection de cellules dans les souris sera réalisée au deuxième jour après la naissance. À cet âge, une injection intracérébrale est faisable sans procédures chirurgicales, ce qui réduit considérablement la souffrance animale. Il est aussi important que le cerveau soit à un stade de développement précoce pour être proche du microenvironnement présent chez les enfants atteints de gliomes du tronc cérébral.

768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une hépatite aiguë leur est induite par injection de concanavaline A, puis leur sang est prélevé par voie rétro-orbitale avant une mise à mort par dislocation cervicale, pour tester des molécules inhibitrices de la mort cellulaire programmée. Le porteur qualifie la dose de concanavaline A de "sans danger" en s'appuyant sur l'absence de mortalité rapportée, alors que la procédure vise précisément à déclencher une atteinte hépatique aiguë. Il affirme que la culture d'hépatocytes ne suffit pas et que cette étude préclinique est une étape "indispensable" avant des essais chez l'homme.

Objectifs

Le foie est un organe vital assurant des fonctions essentielles de détoxification et de stockage. Tout dysfonctionnement de cet organe majeur a des conséquences graves sur la santé, allant jusqu’à engager le pronostic vital. A ce jour, il n’existe pas de réelles solutions thérapeutiques, hormis chirurgicales, pour traiter les insuffisances hépatiques aigues. Notre projet vise à réaliser des essais précliniques de molécules candidates pour réduire l’hépatite aigue induite par la concanavaline A

Bénéfices attendus

Ce projet devrait aboutir à la mise en place de nouveaux traitements des hépatites auto-immunes basés sur l'utilisation de nouvelles petites molécules inhibitrices de nécrose régulée.

Procédures

Le dépôt d'un gel anexthésiant (Xylocaïne 2%) au coin de l'oeil avant le prélèvement de sang par voie rétro-orbitale permet de limiter la douleur. Le prélèvement de sang réalisé par un expérimentateur expérimenté est rapide et la souris est immédiatement euthanasiée par dislocation des cervicales.

Impact sur les animaux

La dose de Concanavalin A de 10 mg/kg est reconnue comme sans danger pour les souris C57Bl6/J (aucune mortalité à 12 h ou 18 h de traitement, Ye T et al., Cell Physiol Biochem 2018, 46 : 1241-1251).

Devenir

Tous les animaux (768) sont gardés en vie après la procédure "Traitement par les inhibiteurs et la concanavalin A". Tous les animaux (768) sont mis à mort après la procédure "Prélèvement du sang par voie rétro-orbitale".

Remplacement

S’il est vrai que certaines questions peuvent être abordées grâce à la culture d’hépatocytes, celles posées dans notre projet nécessitent une étude à l’échelle systémique. En effet, les processus de mort que nous cherchons à étudier mettent en jeu les différents types cellulaires du foie, des cellules circulantes et même d’autres organes comme la rate. Ce sont donc des processus complexes non modélisables in vitro. Enfin, cette étude préclinique est une étape pré-requise indispensable avant de futures études cliniques chez l’homme.

Réduction

Le nombre de souris engagées dans ces expériences a été réduit au minimum pour permettre une validation des résultats statistiques.

Raffinement

L'étude a été raffinée au mieux en privilégiant un traitement de courte durée permettant à la fois la mesure des paramètres d'évaluation de l'hépatite et limitant le développement de douleurs et malaises induits par le traitement. Enfin, nous avons anticipé l'étude de tous les organes pertinents (2) qui permettront une étude complète de la pathologie et des molécules pour un maximum d'informations.

Choix des espèces

Cette espèce permet de modéliser ce qui se passe dans une pathologie sur des temps raccourcis à l’échelle de vie de cette espèce. Elle permet d’étudier les phénomènes en cinétique de la physiopathologie et de tester l’effet de petites molécules chimiques pour la prévention et/ou thérapie de la pathologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (au moins 8 semaines d’âge et poids corporel supérieur à 20 g) pour avoir des animaux avec une fonction hépatique normale et pour étudier une pathologie qui affecte surtout les adultes.

410 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 150 reproductrices euthanasiées à six mois et 260 produites transférées vers un autre projet déjà autorisé. Cette demande porte sur le seul élevage d'une lignée à phénotype dommageable, dont les individus développent des plaies dorsales et une perte de poil à partir de six mois, sans autre intervention. La souffrance déclarée tient donc à la lignée génétiquement modifiée elle-même, produite pour étudier le rôle de l'enzyme KDM6B dans le diabète de type 2. Le porteur affirme que la souris est le "modèle de référence" de l'obésité et du diabète et qu'aucune méthode sans animaux vivants ne peut remplacer ces procédures.

Objectifs

L’inflammation est reconnue comme un déterminant majeur de la mise en place du diabète de type 2 (DT2) et de ses complications cardiovasculaires. L’inflammation est notamment conduite par une activation de certaines cellules du système immunitaire (monocytes circulants et des macrophages tissulaires). La susceptibilité à développer un diabète de type-2 et de souffrir des complications cardiovasculaires semble être également associée à des facteurs environnementaux. Des études récentes suggèrent que ces facteurs environnementaux se traduisent par une modification de l’expression des gènes (notamment inflammatoires) par des mécanismes dit épigénétiques (modification de l’expression d’un gène sans modification de sa séquence génétique). L’enzyme KDM6B (Histone Lysine Demethylase 6B) est impliquée dans ses modifications épigénétiques. L'objectif du projet est de définir les conséquences de l'invalidation de KDM6B spécifiquement au niveau des macrophages, sur l’inflammation et l’homéostasie glucidique chez des souris.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait démontrer l'importance des modifications épigénétiques dans la mise en place et le développement du diabète de type 2 et dans ses complications. Ce projet de recherche fondamental a pour objectif de définir les conséquences de l'invalidation de KDM6B spécifiquement au niveau des macrophages, sur l’inflammation et l’homéostasie glucidique chez des souris. A terme, moduler l'activité de KDM6B pourrait être proposé comme une nouvelle approche thérapeutique pour contrôler l'inflammation afin d'atténuer le risque de diabète de type 2.

Procédures

Cette demande d'autorisation de projet est uniquement une demande pour l'élevage d'une lignée à phénotype dommageable. En effet, les souris KDM6b MKO et WT peuvent développer des plaies au niveau du dos à partir de l'âge de 6 mois : perte de poil et lésions cutanées. Avant l'âge de 6 mois, les animaux ne présentent pas de phénotype dommageable. Les animaux ne subirront pas d'intervention.

Impact sur les animaux

La lignée murine KDM6B MKO est une lignée à phénotype dommageable. En effet, les souris KDM6b MKO et WT peuvent développer des plaies au niveau du dos à partir de l'âge de 6 mois : perte de poil et lésions cutanées. Avant l'âge de 6 mois, les animaux ne présentent pas de phénotype dommageable.

Devenir

Les 150 animaux en accouplement seront euthanasiés à l'age de 6 mois. Les animaux produits par les accouplements seront utilisés pour créer les groupes expérimentaux d'un autre projet déjà autorisé.

Remplacement

Afin de prouver l'implication de la protéine KDM6B, dans le développement du diabète de type-2, la stratégie d'invalidation génique dans des cellules spécifiques comme les macrophages a été utilisée. Ces souris sont actuellement disponibles. De plus, la souris est le modèle de référence dans l'étude de l'obésité et du diabète Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants. Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés sera réduit à son maximum. 150 souris seront placées en accouplement : à raison de 5 accouplements en parallèle à renouveler tous les 6 mois durant 5 ans : 3 souris (1 mâles + 2 femelles) x 5 accouplements x 10 semestres = 150. 260 animaux seront produits afin d'être utilisés dans un autre projet déjà autorisé.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés et ont un accès ad libitum a la nourriture. Les conditions de température et d'hygromètrie sont controlées et monitorées tous les jours. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (8h-20h). Pour s’assurer du « bien être » des souris, elles bénéficieront de coton et de « maisons » en carton afin de les occuper et afin qu’elles puissent se construire un « nid ». Les souris seront sous surveillance journalière. Les points suivants seront considérés comme points limites : 1. Tout dérèglement physiologique aboutissant à une incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire 2. Modification du comportement caractéristique d'une douleur intense, une détresse ou une souffrance (absence de locomotion, pelage hérissé et/ou terne, prostration, dos vouté) 3. Anomalies pouvant entrainer une douleur intense, une détresse ou une souffrance : ulcères, tumeurs, fractures... 4. Apparition de plaies/lésions au niveau du dos.

Choix des espèces

Le modèle murin est utilisé dans ce projet car les modèles génétiques utilisés ont déjà été validés chez la souris. Les souris sont faciles à manipuler et la présence du centre d’explorations fonctionnelles sur le site permet d’utiliser ce modèle dans de bonnes conditions d’élevage. Les animaux seront mis en accouplement à partir de l'age de 56 jours qui est l'age de maturité sexuelle des souris.