Recherche fondamentale

50 chiens porteurs de tumeurs naturelles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie tuée à l'issue pour autopsie, dix réutilisés dans d'autres procédures et dix proposés à l'adoption. Ils reçoivent pendant environ six semaines des traitements hebdomadaires, jusqu'à sept prises de sang par jour, des biopsies répétées et une résection chirurgicale de la tumeur en fin d'étude. Le porteur reconnaît un risque de syndrome de libération de cytokines, avec fièvre, déshydratation et perte d'appétit. Il indique que ces chiens, issus d'éleveurs et fournisseurs agréés, sont transférés vers l'établissement pour être traités, et présente l'espèce cible comme "requise" pour démontrer l'efficacité d'un médicament vétérinaire.

Objectifs

Le cancer est un problème de santé mondial important qui possède un taux d’incidence et de mortalité en constante augmentation, aussi bien chez l’Homme que chez les animaux. Le nombre de traitements vétérinaires indiqués contre le cancer canin est très limité. Actuellement la première approche qui peut permettre de réduire la masse tumorale est la chirurgie. Mais elle peut se révéler inutilisable en fonction de la localisation de la tumeur, voire insuffisante en cas de présence de métastases. La chimiothérapie et la radiothérapie sont aussi des solutions utilisées en deuxième intention pour traiter le cancer. Mais ces solutions possèdent, elles aussi, leurs limites. En effet, ces méthodes sont, elles aussi, parfois inefficaces car certaines tumeurs sont dites chimiorésistantes ou radiorésistantes. De plus, ces types de traitements ont des effets secondaires importants. Ils nécessitent également un matériel adapté ainsi qu’une gestion spécifique des effluents et déchets radioactifs et chimiques générés (risque de pollution pour l’environnement). Il est donc important de développer une nouvelle option thérapeutique qui pourra traiter un plus grand nombre de tumeurs avec un mode d’administration et une logistique des déchets plus simple.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra l’évaluation précoce de l’efficacité et de l’innocuité de nouveaux traitements médicaux à visée anti-tumoral chez le chien. En fonction des résultats obtenus, ce projet pourrait conduire au développement d’un traitement antitumoral chez le chien. Cette nouvelle thérapie permettra à la fois de lutter contre le développement des tumeurs et de réduire les risques de développement de métastases. En raison de l’activité immunomodulatrice de ces traitements, un panel de tumeurs canines sont ciblées : ostéosarcome, sarcome des tissus mous, glioblastome, tumeurs mammaires…

Procédures

Les animaux seront traités régulièrement (environ une fois par semaine) avec un traitement par voie orale, par intraveineuse (IV), intratumorale ou sous-cutanée pendant environ 6 semaines. Les prélèvements prévus dans la procédure sont les suivants : - Prises de sang : jusqu’à 7 fois par jour, 10 fois par semaine pendant 6 semaines consécutives. Le volume prélevé ne pourra en aucun cas dépasser 7.5% du volume total circulant d’un animal sur 24h ou 15% sur 28 jours. Si le volume total prélevé sur 24 heures atteint 7.5%, la prochaine prise de sang ne pourra pas être réalisée dans les 7 jours suivants (pour laisser un temps de récupération). - Prélèvements d’urine par cystocentèse, ou sondage urinaire, jusqu’à une fois toutes les deux semaines. - Biopsies (punch : 2 à 4 mm de diamètre) de la tumeur, jusqu’à 3 fois sur la durée de l’étude. Pendant le temps des prélèvements, les animaux pourront recevoir des analgésiques ou pourront être anesthésiés ou tranquillisés pour une courte durée, afin de réduire la douleur, l’angoisse ou la souffrance de l’animal. La décision de l’analgésie, de l’anesthésie ou de la sédation dépendra de plusieurs facteurs comme : les prélèvements à réaliser, du comportement des chiens, de la facilité de manipulation. - La résection chirurgicale de la/les tumeur(s) mammaire(s) en fin d’étude sera réalisée sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Les produits candidats ont pour objectif d’activer le système immunitaire des animaux. Le principal risque associé, pourrait être une suractivation du système immunitaire, qui entrainerait un syndrome de libération de cytokines. Ce syndrome peut entraîner des symptômes d’intensité faible à sévère comme : de la fièvre, une déshydratation, de l’apathie, une perte d’appétit. Afin de pouvoir objectiver les effets secondaires à l’administration du traitement et adapter le suivi clinique de chaque chien, les chiens seront hébergés individuellement pendant 8 heures (avec contact visuel et olfactif) après l’administration du traitement. Afin d’évaluer l’efficacité et l’innocuité de ces nouveaux traitements, des prélèvements devront être réalisés (sang, urine, biopsies de la tumeur…) ainsi qu’une résection chirurgicale de la/des tumeur(s) en fin d’étude. Ils peuvent générer un stress et de l’inconfort : au moment du geste pour ceux réalisés vigile, ou en post-opératoire pour ceux réalisés sous anesthésie générale. Les contentions liées à ces gestes peuvent générer du stress chez les animaux. La réalisation de biopsies et/ou la résection chirurgicale de la/des tumeur(s) pourraient induire des saignements, des gonflements, une infection, des ulcérations, une altération voire une destruction des tissus traversés. L’anesthésie pourrait générer : un stress au moment de l’induction, de l’inconfort, de la nausée et du stress au moment du réveil. Dans le cas où l’efficacité du candidat ne serait pas suffisante, il est possible que la tumeur continue de se développer (augmentation de la taille et développement de métastases).

Devenir

Les animaux pourront être mis à mort en fin de procédure pour autopsie, prélèvements d’organes ou de tissus pour évaluer l’innocuité et/ou l’efficacité des produits testés. Si au cours de la procédure ou à la fin de la procédure, l’animal présente un état de santé dégradé et qu’il atteint des points limites sévères l’animal sera euthanasié. À la fin de la procédure si l’animal recouvre un bon état physique/clinique, il pourra être (sur décision du vétérinaire désigné) mis à l’adoption ou être inclus dans une autre procédure.

Remplacement

Des études précliniques avec des candidats ont déjà été réalisées in vitro et in vivo sur rongeurs, chiens sains, chats, et sur l’Homme. Ces tests ont montré des résultats favorables. Après cette première étape, le recours aux animaux ayant développé une tumeur est requis, afin de pouvoir évaluer l’efficacité et l’innocuité du candidat médicament chez la population cible. En effet, l’efficacité d’un produit vétérinaire anti-tumoral doit être démontrée sur l’espèce cible. Car les études d’efficacité nécessitent de travailler sur un organisme entier, mettant en jeu des interactions entre différents tissus/organes impliqués dans le métabolisme et le/les effets physiologiques et thérapeutiques du futur candidat médicament.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, seul le ou les composé(s) ayant les meilleurs profils pharmacocinétiques et pharmacodynamiques et la meilleure innocuité, seront testés sur les animaux présentant une tumeur. Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum lors des premières études exploratoires (jusqu’à 10 animaux par composé à tester soit 5 composés maximum). Ces études permettront de caractériser plus précisément les variabilités existantes inter-individus ainsi que les variabilités existantes entre les différents types de tumeurs incluses. Grace à ces informations, le nombre minimum d’individus le plus pertinent pourra être inclus dans les études suivantes. Pas d'étude biostatistique pour ce projet. Chaque chien sera son propre contrôle, c'est à dire que l'on comparera la tumeur avant/après ainsi que l'état clinique avant/après. Ceci permettra de réduire le nombre de chien inclus dans la procédure.

Raffinement

Des chiens présentant naturellement des tumeurs issues d’établissement éleveurs ou fournisseurs agréés seront inclus dans les études. Les animaux présentant des tumeurs (tumeurs mammaires dans un premier temps) seront alors transférés au sein de l’établissement utilisateur pour être traités. Afin de permettre un traitement le plus précocement possible, un chien seul peut être inclus dans la procédure. Dans ce cas, il sera mis en hébergement avec au moins un autre compagnon compatible durant cette période. Ce ou ces compagnons seront des chiens déjà présents au sein de l’établissement utilisateur et qui seront en période de repos entre deux études. Ils bénéficieront de zones de jeu avec interaction avec l’Homme. Les jouets présents dans les zones d’hébergement et dans les zones de jeu sont régulièrement changés pour favoriser la curiosité. Une période d’acclimatation systématique est mise en place. Si la durée n’est pas suffisante elle sera rallongée jusqu’à ce que les animaux soient aptes à entrer dans la procédure. Le personnel intervenant dans l’étude sera formé aux examens et prélèvements afin de travailler avec le plus d’expertise possible. Les animaux sont observés quotidiennement, ou plus si jugé nécessaire, ce qui permet de détecter tout signe comportemental anormal et/ou toute anomalie clinique non attendue. En cas de déviation de l'état normal d'un animal, le responsable de l’étude, le vétérinaire désigné ou le vétérinaire d'astreinte, décidera d'augmenter les fréquences d'observations, d'isoler l'animal et/ou d'envisager un traitement pour soulager l'animal. En cas de syndrome de libération de cytokines, un traitement avec des corticoïdes, une réhydratation et/ou un traitement symptomatique digestif seront prescrits pour diminuer les effets dus à ce syndrome. Un suivi clinique rapproché de l’animal sera également mis en place. Des points limites seront définis pour apporter des soins adaptés ou une exclusion de l’étude avec d’autres soins ou une euthanasie si nécessaire. Afin de limiter le stress lié aux actes (contention, traitements, prélèvements, …), ces actes seront travaillés sur les chiens en renforcement positif avec friandises et caresses lors de trainings pendant l’acclimatation puis pendant toute la durée de l’étude. La Structure du Bien Être Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.

Choix des espèces

Espèce cible de la pathologie investiguée. Les animaux utilisés seront des animaux ayant naturellement développés une tumeur. Une tumeur chez le chien peut se développer quel que soit l’âge de l’animal, bien que les animaux les plus âgés sont les plus souvent atteints (en particulier pour les tumeurs mammaires).

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des mises à jeun, un gavage, des prélèvements de sang et l'implantation chirurgicale d'une pompe osmotique, avec induction d'un diabète et d'une inflammation intestinale. Le porteur reconnaît une polydipsie, un poil hérissé, une léthargie, un dos courbé, une ataxie et des tremblements possibles. Il indique avoir utilisé des organoïdes intestinaux mais présente le recours à la souris comme nécessaire pour ces dialogues inter-organes.

Objectifs

L’intestin est directement en contact avec le bol alimentaire et les bactéries de la flore intestinale et assure donc un rôle de barrière sélective entre la lumière digestive et le milieu intérieur. Bien que l’hyper-perméabilité intestinale et le passage concomitant de produits bactériens dans le sang aient été proposés comme un des facteurs participant à l'inflammation chronique qui accompagne l'obésité et le diabète de type 2 (DT2), les mécanismes moléculaires à l’origine des défauts d’intégrité épithéliale lors de ces pathologies demeurent mal compris. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer si la perte d'action de l’insuline, une caractéristique du diabète, conduit indépendemment de l'obésité et de l'hyperglycémie, à une altération de la fonction barrière de l'intestin et une susceptibilité accrue à l'inflammation intestinale.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est la mise en évidence que la perte d'action de l'insuline contribue, indépendemment de l'obésité, à l'hyperperméabilité intestinal et au risque accru d'inflammation ou d'infection intestinales. Notre projet permettra l'identification dans l'épithélium intestinal des cibles cellulaires et des voies de signalisation dérégulées au cours de la résistance à l'insuline, ce qui est essentiel pour la conception de stratégies préventives et thérapeutiques.

Procédures

-1 lot d’animaux vigiles fera l’objet d’une mise à jeun (14h), de 6 à 7 contentions (45 secondes chacune), d’une administration orale de produit (1 minute chacune), de 2 prélèvements de sang caudal (30 secondes chacun), d’un prélèvement de sang mandibulaire (1 minute chacun) et de 2 à 3 injections de produit (45 secondes chacune). Une partie de ces animaux sera également placée sous anesthésie et analgésie pour la réalisation d’un acte chirurgical (implantation sous cutanée d'une pompe osmotique, 20 minutes). -1 autre lot d’animaux vigiles fera l’objet de 2 mises à jeun (4h et 14h), de 7 à 8 contentions (45 secondes chacune), de 2 administrations orale de produit (1 minute chacune), de 2 prélèvements de sang caudal (30 secondes chacun), d’un prélèvement de sang mandibulaire (1 minute chacun) et de 2 à 3 injections de produit (45 secondes chacune). Une partie de ces animaux sera également placée sous anesthésie et analgésie pour la réalisation d’un acte chirurgical (implantation sous cutanée d'une pompe osmotique, 20 minutes). -Tous les animaux seront placés sous analgésie et anesthésie profonde pour un prélèvement sanguin terminal unique (30 secondes par souris).

Impact sur les animaux

Les prélèvements, l’anesthésie, la contention le gavage et les injections sont des sources de stress pour les animaux. Certains actes peuvent induire une sensation de douleur chez l'animal : douleur de courte durée au site d’injection (piqûre de l’aiguille) ou encore les douleurs post-opératoire (implantation de la pompe) ou liées à l’inflammation intestinale. De plus, la chirurgie comporte un risque pour l'animal lié à l'anesthésie (réveil, dépression respiratoire, hypothermie). Les souris rendues diabétiques présenteront une polydipsie associée à une glycosurie. L’implantation des pompes osmotiques en sous cutanée peuvent entraîner localement une inflammation (rougeur, gonflement) ou une infection (écoulements). Concernant les procédures incluant l’induction d’une inflammation intestinale, l’infection par des entéropathogènes, ou l’induction d’un diabète, l’apparition de signes généraux de souffrances peut survenir : poil ébouriffé (ou hérissé), perte de poids, écoulement des yeux, léthargie, dos courbé, ataxie, tremblement.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés en vu de prélevements de sang et d'organes pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Dans ce projet, les modèles animaux seront développés dans le but d'obtenir des modèles de pathologies métaboliques (diabète) et inflammatoires (inflammation intestinale, infections entériques). Les dérégulations métaboliques et la réponse inflammatoire sont des phénomènes complexes faisant intervenir de nombreux dialogues inter-organes. Les animaux seront donc utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro. Ils permettent d'obtenir une représentation simplifiée de systèmes biologiques impossibles à étudier directement chez l'Homme. Cependant, nous avons utilisé des systèmes de culture tridimensionnelle à partir d'organoides intestinaux issus de souris diabétiques pour démontrer que la résistance à l'insuline altère certaines fonctions propres à l'épithélium intestinal.

Réduction

L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée. L'étude comprend au total 480 animaux. Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel approprié. La "significativité" des différences expérimentales sera évaluée par des tests statistiques adaptés à la comparaison de deux groupes ou plus. De plus des expérimentations ont préalablement été effectuées pour caractériser la réponse des cellules épithéliales intestinales à l'insuline à partir d'organoides intestinaux issus de souris dont l’intestin ne répond pas à l’insuline. Cette technique ne nécessite donc aucun traitement chez la souris. Elle permet également à partir d'une seule souris d'étudier plusieurs parties de l'intestin (duodénum, iléon et colon), et l'effet de plusieurs traitements, réduisant ainsi considérablement le nombre de souris.

Raffinement

La durée et dose des traitements seront réalisées selon les protocoles préétablis et maitrisés par notre équipe. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures (analgésiques, anesthésiques) afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. L’application des points limites établis (apparence, mobilité, comportement, changement de poids, suivi post-opératoire) pour chaque procédure de ce projet sera effectué.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour les études ayant attrait à la caractérisation de pathologies métaboliques et inflammatoires. Par ailleurs, le choix de cette espèce est motivé par la volonté de comparer les résultats de ce projet obtenus sur des modèles de perte d'action globale globale de l'insuline à ceux d'un autre projet obtenus sur des souris génétiquement modifiées, déficientes pour l’action de l’insuline spécifiquement au niveau intestinal. Les souris utilisées seront âgées de 12 à 14 semaines pour toutes les procédures. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal totalement mature.

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une lésion du cortex moteur puis une greffe de neurones sous chirurgie crânienne, des tests moteurs de préhension, d'équilibre et de marche, et une restriction alimentaire de seize heures avant certains tests. Le projet couple cette greffe à de l'activité physique et à un antioxydant, les retombées pour l'humain étant renvoyées au long terme. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne permet de reproduire un cerveau de mammifère et conclut au recours à la souris.

Objectifs

Du fait de la très faible capacité du cerveau à s’autoréparer, les traumatismes craniens sont dévastateurs. La lésion du cortex moteur est une caractéristique commune de nombreuses conditions neuropathologiques telles que les tumeurs, les lésions (traumatisme, accident vasculaire cérébral) ou les maladies neurodégénératives (sclérose latérale amyotrophique, ataxies scérébeleuses, maladies de Huntington, d'Alzheimer...). Afin de pallier les capacités de régénération limitées du cerveau adulte, il est nécessaire de développer des stratégies thérapeutiques. La transplantation neuronale a été explorée comme une approche potentielle permettant de rétablir les fonctions cérébrales en remplaçant les neurones perdus par de nouveaux neurones. Il est déjà démontré que des neurones issus de cellules souches, transplantés dans des cerveaux de souris, peuvent efficacement rétablir des connexions spécifiques après une lésion corticale. Une réparation des réseaux neuronaux est donc possible chez la souris, mais l'éfficacité de cette approche doit encore être améliorée avant de pouvoir être envisagée chez l'Homme. Par ailleurs, la pratique de l'activité physique et l'administration d'un antioxydant sont connus pour améliorer la réparation spontanée du cerveau. Dans cette étude, nous souhaitons coupler la greffe de neurones à une activité physique régulière des animaux et/ou à un traitement avec un antioxydant. Des tests de comportement permettront d'examiner l'effet sur la récupération motrice des animaux et de comparer l'effet de l'activité physique et de l'antioxydant.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra d'étudier l'effet de la combinaison de l'activité physique et d'un antioxydant sur la réparation des réseaux neuronaux après transplantation de nouveaux neurones. A plus long terme, les bénéfices attendus de ce projet sont le développement de thérapie chez l'Homme autour de l’activité physique ou d'un antioxydant couplé à la transplantation cellulaire afin d’améliorer la qualité et la fiabilité des transplantations et ainsi améliorer le traitement par greffe de cellules souches par la mise en place de thérapies adaptées.

Procédures

Sur animaux vigiles : une cinquantaine de pesées par animal, d'une durée d'environ 1 minute (une fois par semaine, sur toute la durée du projet); 7 sessions de différents tests de comportement moteur (test de préhension de nourriture, test d'équilibre, test de marche) : 1 semaine tous les deux mois (maximum 15 minutes par souris par jour durant 5 jours de test ). Sur animaux anesthésiés : intervention 1 : Lésion corticale traumatique légère : 1 fois (10 minutes par animal) - intervention 2 : Greffe de neurones corticaux moteurs : 1 fois (10 minutes par animal).

Impact sur les animaux

L’acte de pesée et les tests comportementaux sur animal vigile peuvent induire un léger stress très transitoire. Suite à l’anesthésie générale et la chirurgie cranienne, l’effet indésirable attendu est un inconfort transitoire au réveil. La lésion du cortex moteur entraine un très léger trouble de la préhension avec la patte avant gauche de l'animal. Une restriction alimentaire sera réalisée pendant environ 16 heures, le jour précedent le test de préhension de nourriture afin que les animaux soient motivés à récupérer les boulettes de nourriture.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet afin de récupérer le cerveau pour des études neuroanatomiques.

Remplacement

De nos jours, il n’est pas encore possible de modéliser un cerveau de mammifère in vitro ou in silico, qui nous permettrait d’étudier la transplantation de cellules souches neuronales et l'effet de l'activité physique.

Réduction

Nous avons réduit au maximum le nombre d'animaux nécessaires en expérimentation tout en s'assurant d'en avoir le nombre suffisant pour avoir une étude interprétable sur le plan statistique par l’utilisation de calcul de puissance.

Raffinement

Durant toute l’expérimentation, le bien-être des animaux sera respecté en réduisant au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou le stress. Les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (hébergement en groupe dans des locaux adaptés avec enrichissement du milieu adapté à l'espèce : matériel de nidification et tunnel). Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale avec analgésie et monitoring de la température corporelle. De plus, elles seront réalisées par un binôme compétent et expérimenté, permettant ainsi de réduire l’angoisse des animaux et de contribuer à leur bien-être. Un traitement antalgique sera poursuivi en postopératoire si l'état de l'animal le nécessite. Durant toute la procédure, les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien de leur état de santé (alimentation, apparence, comportement) et des « actions » seront mises en place en cas de « problème(s) » observé(s), avec la mise en place d’une grille de score, avec l’utilisation de points limites adaptés et gradés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance.

Choix des espèces

La souris est l'espèce la plus utilisée pour les modèles animaux dans le domaine des neurosciences. En effet, il est possible de mimer chez la souris les lésions du cortex moteur qui peuvent survenir chez l'Homme dans différentes situations (accident de la route, traumatisme crânien, AVC...). Nous utiliserons des souris âgées de 3 mois au début de cette étude. Nous souhaitons travailler sur des souris adultes matures ce qui correspond à l'âge où le développement biologique est passé, mais pas encore affecté par le vieillissement.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des mises à jeun, une biopsie, des administrations orales et injections répétées et jusqu'à quatorze prélèvements de sang à la queue, un test de tolérance à l'insuline pouvant provoquer une hypoglycémie prononcée. Le projet vise à décrire le rôle de l'insuline intestinale dans la prise de poids sous régime gras, le porteur affirmant que ce régime "n'entraîne pas de souffrances". Il indique avoir utilisé des organoïdes intestinaux mais présente le recours à la souris comme nécessaire pour ces dialogues inter-organes.

Objectifs

L’intestin est composé d’un épithélium simple, directement en contact avec le bol alimentaire et le microbiote et assure entre autres, un rôle de barrière sélective entre la lumière digestive et le milieu intérieur. L’hyper- perméabilité intestinale a été proposée comme un des facteurs participant à l'inflammation chronique de bas grade qui accompagne l'obésité, état inflammatoire qui favoriserait la prise de poids et certains désordres métaboliques associés (résistance à l'insuline, équilibre glycémique). Nos premiers résultats montrent que la perte d'action intestinale de l’insuline conduit à une altération de la fonction barrière de l'intestin chez la souris. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer si la perte d'action intestinale de l’insuline favorise ou accélère la la prise de poids et certains désordres métaboliques associés (résistance à l'insuline, équilibre glycémique) chez des souris soumises à un régime riche en graisse.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est la mise en évidence que la perte d'action de l'insuline et l'hyperperméabilité intestinale associée favorise ou accélère la prise de poids et l'altération de l'équilibre glycémique au cours d'un régime obésogène. Notre projet identifiera à la fois les cellules cibles impliquées et les voies de signalisation permettant l'action de l'insuline dans l'épithélium intestinal, ce qui est essentiel pour la conception de stratégies préventives et thérapeutiques.

Procédures

Tous les animaux feront l'objet d'une contention et d'une prélèvement par biopsie (30 secondes) - 1er lot d'animaux : 2 mises à jeun (14h et 6h), 4 contentions (30 secondes) pour un suivi pondéral, 1 à 2 administration orale de produit (1min chacune), 2 injections de produit (1 min chacune), 14 prélèvements de sang caudal (30 secondes chacun) - 2ième lot d'animaux : 2 mises à jeun (14h et 6h), 8 contentions (30 secondes) pour un suivi pondéral 1 à 2 administration orale de produit (1min chacune), 2 injections de produit (1 min chacune), 14 prélèvements de sang caudal (30 secondes chacun) -3ieme lot d'animaux: 2 mises à jeun (14h et 6h), 16 contentions (30 secondes) pour un suivi pondéral, 1 à 2 administration orale de produit (1min chacune), 2 injections de produit (1 min chacune), 14 prélèvements de sang caudal (30 secondes chacun). Tous les animaux seront placés sous analgésie et anesthésie profonde pour un prélèvement sanguin terminal unique (30 secondes par souris).

Impact sur les animaux

Aucun des modèles murins ne présente de phénotype dommageable à l’état basal et le regime gras n'entraine pas de souffrances. Les deux régimes offerts sont appétents et ne provoqueront pas de stress ou de trouble dans le comportement alimentaire des animaux. Il y a un stress lors de l’anesthésie, de la contention et des injections. L'animal peut avoir une sensation de douleur de courte durée au site d’injection (piqûre de l’aiguille). Le test de tolérance à l'insuline peut entraîner une hypoglycémie prononcée chez la souris.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés en vu de prélevements de sang et d'organes pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Dans ce projet, les modèles animaux seront développés dans le but de mimer certaines caractéristiques de pathologies métaboliques (diabète) et inflammatoires (inflammation intestinale, infections entériques). Les dérégulations métaboliques et la réponse inflammatoire sont des phénomènes complexes faisant intervenir de nombreux dialogues inter-organes. Les animaux seront donc utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro. Cependant, nous avons utilisé des systèmes de culture tridimensionnelle à partir d'organoides intestinaux pour démontrer que la perte d'action de l'insuline altère certaines fonctions propres à l'épithélium intestinal.

Réduction

L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée. L'étude comprend au total 360 animaux. Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel approprié. La "significativité" des différences expérimentales sera évaluée par des tests adaptés à la comparaison de deux groupes ou plus. De plus, pour caractériser la réponse de l’intestin à l’insuline, nous avons utilisé une technique in vitro qui ne nécessite pas de traitement sur animaux vigiles et qui permet à partir d’une seule souris d’étudier plusieurs parties de l’intestin (duodénum, iléon et colon), et l'effet de plusieurs traitements, réduisant ainsi considérablement le nombre de souris.

Raffinement

La durée sous régime et les tests métaboliques seront réalisés selon les protocoles préétablis et maitrisés. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Les deux régimes offerts sont appétents et ne provoqueront pas de stress ou de trouble dans le comportement alimentaire des animaux. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. L'euthanasie de l'animal se fait sous analgésie et anesthésie profonde. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive, des soins adaptés et l’application des points limites établis.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour les études ayant attrait à la caractérisation de pathologies métaboliques et inflammatoires. Seule cette espèce possède des modèles présentant une délétion spécifique du récepteur de l'insuline dans des tissus d’intérêt, permettant ainsi la caractérisation de l'action de l'insuline au cours de ces pathologies. Les souris utilisées seront âgées de 8 à 9 semaines à chaque début de procédure. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal totalement mature.

Une heure de course sur tapis roulant après trois jours d'habituation, avec des chocs électriques "légers et brefs" dès qu'elles s'arrêtent : des souris subissent cet exercice destiné à provoquer des lésions musculaires, que le porteur associe à un "inconfort musculaire important passager". 936 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des biopsies musculaires. Le projet cherche à savoir si l'inhibition du gène Usp28 améliore la réparation du muscle et pourrait traiter la dystrophie musculaire de Duchenne. Des souris mâles porteuses de la mutation de cette maladie, dont la faiblesse musculaire apparaît vers quatre mois, sont gardées trois mois après son apparition, dans une lignée que le porteur qualifie de "modèle bien établi et largement utilisé".

Objectifs

L'exercice physique peut provoquer des dommages musculaires, par exemple une déchirure ou une rupture de la structure contractile du muscle. Les cellules doivent alors réparer correctement ces dommages pour rétablir la fonction musculaire. Si elles ne le font pas, elles risquent de provoquer des lésions beaucoup plus importantes, voire des pathologies. D'autre part, une réparation efficace de ces lésions est la base de la construction du muscle par la pratique du sport. Nous avons précédemment découvert un gène particulièrement exprimé en cas de lésions musculaires. Notre étude préliminaire sur des cellules en culture suggère que l'inhibition de ce gène pourrait augmenter la réparation musculaire. Dans ce projet, nous examinerons donc le rôle de ce gène dans la réparation du muscle chez des souris vivantes. En outre, nous examinerons si la perte de ce gène (et donc l'augmentation de la réparation) peut être utilisée comme thérapie pour la Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD).

Bénéfices attendus

Si notre hypothèse s'avère correcte, il deviendrait nécessaire de développer un inhibiteur de ce gène pour favoriser la régénération du muscle et pour soigner la dystrophie musculaire de Duchenne ou contribuer à son traitement.

Procédures

1. Le programme d’exercice réalisé par les animaux est un modèle d’activité physique intense. Il s’agit d’une procédure qui induit des lésions musculaires pouvant provoquer un niveau d’inconfort musculaire important passager. Cet exercice est réalisé une seule fois, il comprend 3 jours de 15 à 20 min de course d’habituation sur tapis roulant suivi d’un jour de course de 60 min comparable à un exercice physique intense. L’animal reçoit des chocs électriques légers et brefs pour le motiver à courir s’il s’arrête. Si l’animal ne court pas pendant plus de 5 secondes le test est arrêté. 2.Les souris mâles porteurs de la mutation de la dystrophie musculaire de Duchenne présentent un phénotype de faiblesse musculaire léger à partir de l’âge de 4 mois. Ces animaux seront gardés durant 3 mois après l’apparition de ce phénotype.

Impact sur les animaux

Le programme d’exercice est une procédure semblable à une activité physique intense qui induit des lésions musculaires pouvant provoquer un niveau d’inconfort musculaire important passager. Les souris porteuses de la mutation responsable de la dystrophie musculaire de Duchenne présentent un phénotype de faiblesse musculaire à partir de l’âge de 4 mois. Cependant, la délétion de notre gène d'intérêt dans les muscles devrait réduire ce phénotype.

Devenir

Pour parvenir à des conclusions scientifiques solides avec le nombre minimal d'animaux utilisés, nous collecterons les biopsies musculaires de tous les animaux à la fin de chaque procédure. Par conséquent, nous ne réutiliserons pas, ne remplaçons pas et ne ferons pas adopter les animaux.

Remplacement

Des données préliminaires concernant le gène d'intérêt étudié ont été obtenues en culture cellulaire avec une expérience simulant un exercice physique. Cependant, pour prouver sa fonction réelle dans une situation complexe in vivo, nous devons utiliser des modèles animaux. De plus, la DMD ne peut pas être facilement modélisée in vitro avec les technologies actuelles. Puisque nous voulons valider le potentiel de ce gène en tant que cible médicamenteuse, ces expériences sur les animaux sont nécessaires.

Réduction

Nous collecterons tous les tissus musculaires et les échantillons de sang pertinents de chaque souris, ce qui réduira considérablement le nombre de souris utilisées. La puissance statistique a été utilisée pour calculer le nombre de souris nécessaire afin de déterminer si une différence statistiquement significative existe entre 2 ou plusieurs groupes. Nous avons 3 types d’analyses qui seront composées de 5 animaux pour 6 temps différents. Ces temps d’analyses ont été choisis pour les 2 procédures du projet en fonction de résultats obtenus dans une étude in vitro dans notre équipe ainsi que des études publiées par la communauté scientifique. Si au cours du projet certains de ces temps ne présentent pas de modification significative d’expression des gènes analysés pour le groupe d’animaux du 1er type d’analyse (expression des gènes), alors nous ne ferons pas les groupes d’animaux destinés aux 2 autres types d’analyses ce qui diviserait le nombre d’animaux par 3 sur les temps d’observation concernés.

Raffinement

Pour générer nos souris d’expérience nous utiliserons des mâles porteurs de la mutation responsable de la dystrophie musculaire de Duchenne que nous euthanasierons avant l’apparition du phénotype dommageable. Nous garderons les mâles porteurs de la mutation et de la DMD que pour les expériences de ce projet. Si les animaux venaient à présenter des troubles musculaires comme des difficultés à se déplacer avant la fin de l’expérience, nous leur mettrions alors de la nourriture en gel dans la litière de la cage. Les prélèvements de sang nécessaire au dosage de la créatine kinase qui est un indicateur de lésions tissulaires seront effectués au niveau du sinus retro-orbital sous anesthésie gazeuse. Les animaux seront mis à mort par élongation cervicale avant leur réveil pour éviter toute douleur dû à la technique de prélèvement.

Choix des espèces

Le programme d’exercice utilisé, modélisant une activité physique intense, est bien établi chez la souris. Nous utiliserons des souris jeunes adultes ou adultes (à partir de l’âge de 8 semaines) pour cet exercice car la maturation musculaire doit être achevée. De même, le modèle de souris pour l'étude de la DMD est un modèle bien établi et largement utilisé pour la recherche sur la dystrophie musculaire. Nous observons les souris de ce modèle et délétée pour notre gène d'intérêt longitudinalement à différents âges afin de suivre les modifications d’expression de nombreux gènes exprimés en son absence. Nous pourrons ainsi mettre en corrélation ces modifications avec la mesure de la créatine kinase qui est un indicateur de lésions tissulaires et surtout avec l’éventuelle disparition attendue des phénotypes de la DMD (de 1 mois à 12 mois maximum) à 6 âges différents : 3 avant l’apparition du phénotype et 3 après son apparition. Si le phénotype apparaît à 4 mois comme nous l’attendons, nous prélèverons les échantillons aux âges de 1, 2, 3, 4, 5 et 6 mois, sinon les 3 derniers âges de prélèvement seront décalés à l’apparition du phénotype au maximum à 10, 11 et 12 mois.

156 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur du sein leur est greffée sous la peau, puis elles reçoivent des injections intraveineuses de nanoparticules d'or et des séances de laser portant la tumeur à 41-43 °C, avec un prélèvement de sang intracardiaque terminal, les nécroses tumorales douloureuses déclenchant la mise à mort. Le porteur annonce espérer une "régression totale" des tumeurs et la "guérison des souris", bénéfices renvoyés à un éventuel passage en clinique. Il affirme qu'"aucune méthode alternative" n'est disponible pour cette étude de biodistribution et de toxicité.

Objectifs

Dans la lutte contre le cancer, une des stratégies thérapeutiques utilisées consiste à induire la mort des cellules cancéreuses, en ciblant notamment des récepteurs de la famille du TNF. Ce « suicide » cellulaire peut être activé à l’aide d’anticorps monoclonaux (Acm), ciblant des récepteurs membranaires. C’est ce qui est proposé dans ce projet où le greffage de ces Acm sur des nanoparticules d’or va permettre, suite à l’induction d’une hyperthermie induite par action d’un laser, d’augmenter leur activité cytotoxique. L’approche thérapeutique développée dans ce projet est basée sur des données expérimentales obtenues dans notre équipe qui démontrent notamment qu’une hyperthermie modérée sensibilise les cellules cancéreuses à la mort et que cette hyperthermie peut-être obtenue par excitation de nanoparticules d’or par un laser. : L'objectif de ce projet consiste donc à démontrer l’effet anti-tumoral de notre médicament dans des modèles de tumeurs mammaires chez la souris. Notre médicament est composé de nanoparticules d’or cylindriques sur lesquelles sont greffées des anticorps ciblant un récepteur membranaire, couplées à une molécule fluorescente. Une fois injecté aux souris, ce médicament présentera donc l’avantage de cibler les tumeurs exprimant le récepteur et de pouvoir être suivi par imagerie. De plus, la présence des nanoparticules d’or va permettre d’induire une hyperthermie modérée (41 à 43°C) grâce à un laser émettant dans le proche infrarouge, ce qui devrait en principe favoriser la mort des cellules tumorales. Afin de pouvoir proposer cette nouvelle thérapie en clinique, il nous faut maintenant déterminer l’effet anti-tumoral de cette thérapie dans des modèles de tumeurs chez la souris. Nous analyserons la toxicité de l’agent, sa bio-distribution et son efficacité thérapeutique dans des souris porteuses de tumeurs exprimant ou non le récepteur d’intérêt.

Bénéfices attendus

De nombreux travaux mettent en évidence l’intérêt de cibler les récepteurs de mort, cette thérapie étant en essai clinique dans certains cancers de l’Homme. D’autres travaux obtenus in vitro montrent que l’induction d’une hyperthermie peut augmenter l’activation du signal de mort, l’activation de nanoparticules d’or par un laser étant un des moyens d’induire cette hyperthermie ciblée. Ce nouvel agent combine toutes ces propriétés puisqu’il est composé de nanoparticules d’or sur lesquelles sont greffées des anticorps (Acm) ciblant un récepteur de mort et une molécule fluorescente nous permettant de détecter cet agent par imagerie. Les résultats obtenus in vitro nous encouragent à tester cet agent dans des modèles de tumeurs chez la souris. Nous nous attendons à visualiser la présence de cet agent, injecté chez la souris, uniquement sur les tumeurs exprimant le récepteur de mort. L’effet anti-tumoral de cet agent devrait être augmenté par l’induction de l’hyperthermie induite par le laser. Nous nous attendons à avoir la régression totale des tumeurs exprimant le récepteur de mort et donc la guérison des souris. A terme, cette thérapie pourra être proposée en clinique aux malades porteuses de cancer du sein résistantes aux différents traitements proposés actuellement.

Procédures

Les animaux recevront 1 injection en sous-cutané de cellules tumorales sous anesthésie gazeuse (en 5-6 secondes). Le traitement aura lieu une fois par semaine sur 4 semaines (4 injections au total), en IV sous anesthésie gazeuse. L’imagerie nécessitera une injection intrapéritonéale préalable (en 3-4 secondes), soit 7 injections. La stimulation laser localisée au niveau des tumeurs sera réalisée sur une durée de 5 à 10 minutes sous anesthésie gazeuse. Le prélèvement de sang en intra-cardiaque nécessitera l’injection intrapéritonéale de l’anesthésiant (injecté en 3-4 secondes) et ce prélèvement sera réalisé en moins de 1 minute. L’irradiation par laser des tumeurs aura lieu pendant 5 à 10 minutes, la durée exacte étant déterminée par mesure de l’hyperthermie modérée (41-43 °C) mesurée par la caméra thermique.

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales pour le développement d’une tumeur sous-cutanée au niveau des flancs de la souris n’est pas sensée induire d’inconfort notoire tant que le volume tumoral ne dépasse pas la taille de 2000 mm3 et que la tumeur ne gêne pas la motricité. Une diminution de mobilité des souris. La perte de poids engendrée par la réduction de capacité à se nourrir. Des nécroses peuvent apparaitre sur les tumeurs. Nous ne nous attendons pas à des atteintes pulmonaires. Le traitement localisé au laser (au niveau des tumeurs), qui aura lieu sous anesthésie à l’isoflurane, peut engendrer un peu d’irritation. Une potentielle déshydratation des yeux des souris.

Devenir

La croissance tumorale (point limite), ainsi que le prélèvement de sang final et des organes justifient la mise à mort des animaux à la fin de la procédure.

Remplacement

Toutes les expériences in vitro portant sur l’effet cytotoxique de l’agent théranostique associé ou non à une activation par laser ont été réalisées et ont montré l’effet désiré (synergie de l’induction d’apoptose spécifiquement dans les cellules exprimant le récepteur de mort). Pour aller plus loin dans la preuve de concept de l’utilisation de cet agent associé à l’induction d’une hyperthermie modérée comme traitement anti-cancéreux, l’utilisation des modèles de souris porteuses de tumeurs est nécessaire. Aucune méthode alternative n’est disponible pour réaliser cette étude. Ce projet nécessite la réalisation d’une étude de biodistribution et de toxicité, ainsi que l’évaluation du ciblage spécifique de la tumeur et de son potentiel antitumoral. Ce type d’étude n’est possible qu’avec des système complexes vivants. De plus, l’étude du rôle du système immunitaire dans l’approche thérapeutique proposée, et notamment sur les cellules tumorales murines exprimant le récepteur de mort humain, permettant de tester notre anticorps ciblant ce récepteur humain, n’est possible que dans des souris immunocompétentes.

Réduction

Nous avons réduit le nombre d’animaux au minimum, tout en respectant nos objectifs scientifiques. Pour augmenter cette réduction, nous implantons deux tumeurs à la fois sur les souris, une tumeur n’exprimant par DR4 (tumeur contrôle) et une tumeur exprimant DR4 (tumeur test). Cette double implantation évite de devoir utiliser un groupe supplémentaire afin de tester la spécificité de ciblage de nos anticorps (expérience de compétition en injectant une quantité 100 X plus importante d’Ac non marqué). Le nombre d’animaux est déterminé à priori par une analyse de puissance et représente le nombre minimal d’animaux permettant de produire des résultats statistiquement interprétables. En effet, des analyses de puissance statistique sur le logiciel G*Power ont été réalisées pour déterminer la taille d’échantillons minimum à utiliser. Le test de Wilcoxon est le plus approprié pour l’analyse de nos résultats. L’analyse de variance à un facteur peut être utilisée pour déterminer s'il existe des différences significatives entre les groupes. Des tests post-hoc, tels que le test de Tukey ou la correction de Bonferroni, seront utilisés pour identifier les différences spécifiques entre les groupes.

Raffinement

Une attention particulière sera apportée au bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés dans des locaux appropriés où ils bénéficieront du raffinement de rigueur. Les souris seront habituées aux gestes techniques (contention, injections…) avant l’expérimentation. La croissance tumorale sera mesurée tous les deux jours pour éviter l’apparition de tumeurs de taille excessives. En cas d’apparition de signes anormaux la fréquence de surveillance sera augmentée. Des nécroses peuvent apparaitre sur les tumeurs. En cas de nécrose non sèche, ou lorsque les nécroses sont sèches mais douloureuses à la palpation ou creuses, les souris seront euthanasiées. Si les nécroses sont sèches, non douloureuses et sans déformation ni signe d’inflammation, les souris seront surveillées quotidiennement et pourront être prise en charge avec l’utilisation d’un produit cicatrisant (alu spray). Une grille de score d’évaluation des points limites sera mise en place pour réduire la souffrance des souris utilisés. Différents paramètres seront observés pour limiter la douleur tels que : - Apparence physique (poils, oreilles, yeux, posture) - Perte de poids - Comportement / réponse aux stimuli - Volume tumoral - Nécrose tumorale - Déshydratation - Gêne à la mobilité L’addition du score de chaque critère donnera une note sur 21. Un score de 12 ou un critère atteignant 3 points entraînera la mise à mort des souris par dislocation cervicales après anesthésie à l’isoflurane.

Choix des espèces

Dans un premier temps, cette étude sera réalisée avec des souris immunodéficientes BALB/c Nude. Ces souris immunodéficientes nous permettront de réaliser des greffes de cellules humaines de cancer de sein (exprimant ou non le récepteur de mort). Ces dernières seront injectées en sous-cutané afin d’évaluer l’effet antitumoral des traitements que nous allons tester. Des souris BALB/c WT de fond génétique identique à des cellules cancéreuses mammaires de souris seront également utilisées pour montrer le rôle du système immunitaire dans l’efficacité antitumorale Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 10 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids suffisant (supérieur à 20g). Cela nous permettra la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire bien développé (BALB/c WT) ou du moins mature (BALB/c Nude).