Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
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- Système urogénital
les bases neurales de l’espace chez le macaque
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 macaques rhésus vont être utilisés, maintenus en vie à l'issue et réutilisés pour la reproduction, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Déjà porteurs d'un implant crânien, ils subissent deux chirurgies du crâne sous anesthésie puis une quarantaine de séances d'enregistrement par électrodes intracrâniennes, sous restriction hydrique, pendant qu'ils naviguent dans un environnement de réalité virtuelle. Le porteur indique que les chirurgies peuvent provoquer une léthargie, une dissociation passagère et une douleur postopératoire, et que le contrôle de l'eau peut engendrer un inconfort. Il affirme que le macaque rhésus est le seul modèle doté d'un système visuel proche de celui de l'humain, justifiant le recours au primate.
Objectifs
Ce projet est le prolongement d'un autre projet pour obtenir des données manquante sur deux individus et vise à déterminer la base neuronale de la navigation, dans les structures corticales en connexion avec de l'hippocampe : les cortex rétrosplénial et cingulaire postérieur. Ces zones cérébrales sont des aires touchées de façon précoce dans les maladies neurodégénératives telle que la maladie d’Alzheimer et leur perturbation entraine des déficits de la navigation spatiale et de la mémoire épisodique chez l’homme. Des études d’imagerie ont montré qu’une hypoactivité localisée dans ces cortex est un signe précurseur précoce associé aux démences. Toutefois, à cause de la faible probabilité d’accident vasculaire cérébraux dans ce cortex, il y a très peu d’études cliniques décrivant les fonctions associées à ce cortex, ni d’études électrophysiologiques. Ainsi, le fonctionnement neuronal de ces aires sont encore très peu connus chez l’homme, malgré que, ces aires, avec l’hippocampe, aient un rôle essentiel dans la mémoire. Afin de comprendre quelles sont les propriétés fonctionnelles des cellules nerveuses dans ces régions chez le primate, nous effectuerons des enregistrements neuronaux pendant que des primates non humains naviguent dans un environnement en réalité virtuelle et effectuent des apprentissages spatiaux. Le dispositif virtuel permet un contrôle expérimental de l'entrée visuelle sensorielle et une caractérisation fine des facteurs qui influent l’intégration visuo-spatiale et mnésique dans cette zone. Ainsi, nos expériences renseigneront sur la plasticité neuronale ayant lieu dans cette région, et si une stimulation de cette zone permet d’améliorer la mémoire.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de caractériser les propriétés fonctionnelles des cellules neuronales au sein du cortex cingulaire postérieur, et du cortex rétrosplenial, qui sont tous deux impliqués dans la mémoire spatiale et la navigation. Nous déterminerons comment les cellules représentent l'espace visuo-spatial et la nature de leur rôle dans la mémoire grâce à un protocole qui permet leur stimulation pendant des tâches comportementales. En apportant des données neuronales fines, les résultats pourront expliquer pourquoi les atteintes de cette région entrainent des désorientations topographiques et des pertes mnésiques. Ce projet vise à documenter le rôle fonctionnel du cortex postérieur cingulaire et rétrosplénial pour lesquels il y a aujourd'hui que très peu de données.
Procédures
Les animaux sont soumis à deux chirurgies effectuées sous anesthésie générale, visant respectivement à permettre l'accès au cerveau par la mise en place d'une petite craniotomie au sein de l'implant dont les animaux sont déjà équippés, et une chirurgie de désimplantation qui permet de retirer cet implant. Les animaux seront soumis à une quarantaine de sessions d'enregistrement au cours desquelles des électrodes intracrâniennes seront descendues au sein des zones ciblées à raison de 3à 4 séances par semaine. les sessions d'enregistrement serontalternées avec des sessions d'entrainement, pour que le comportement des animaux soit optimal. Les animaux seront aussi soumis à 2 examens d'imagerie sous anesthésie générale après la craniotomie; .
Impact sur les animaux
Les chirurgies peuvent induire au réveil une léthargie et une dissociation mentale passagère, et une douleur post-opératoire qui sera maitrisée par la prise d'analgésique. L’animal est équipé d’un implant crânien qui permet d’enregistrer des données neuronales dont les bords présentent un risque infectieux. L’utilisation du contrôle hydrique peut engendrer un inconfort.
Devenir
Les animaux seront réutilisés à des fins de reproduction.
Remplacement
L’utilisation du modèle primate non-humain apparait essentiel pour la réalisation de cette étude de recherche fondamentale, utilisant des approches d’électrophysiologie et de pharmacologie. Phylogénétiquement, ce modèle d’étude pré-clinique est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle. Ainsi, les informations obtenues seront plus facilement comparables transposables et identifiables à une application chez l’humain. De plus, des taches comportementales variées peuvent être réalisées par ces animaux permettant ainsi l’étude d’un large spectre de comportements complexes. De plus notre projet porte sur la caractérisation du comportement de navigation grâce à une stimulation visuelle, pour lequel, le macaque rhésus est le seul modèle expérimental doté d’un système visuel très proche du nôtre. Aucun autre modèle animal ne présente ces caractéristiques. Par ailleurs, cette approche d’électrophysiologie telle que décrite dans le projet ne peut être à ce jour réalisée chez l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit à la valeur minimale permettant d’atteindre une significativité et reproductibilité des observations. De fait, nous réaliserons les enregistrements chez deux animaux afin de voir si les résultats obtenus chez l'un sont reproduits chez l'autre. Etant donné la nature des aires cérébrales intervenant précocement dans le traitement des informations visuelles, nous pensons qu'il n'est pas nécessaire de récolter des données chez plus de 2 animaux. Les deux animaux concernés par cette DAP sont déjà implantés, mais la récolte des données neuronales et la stimulation neuronale n'ont pas pu avoir lieu.
Raffinement
Notre méthodologie expérimentale a été planifiée afin de minimiser l’impact de notre étude sur la santé et le bienêtre des animaux. Les douleurs engendrées par les chirurgies seront prises en charge par un antiinflammatoire et un agent morphinique pendant au moins trois jours et jusqu’à ce que les signes de douleur disparaissent. La craniotomie réalisée chirurgicalement au sein de la chambre d’enregistrement sera la plus petite possible à l’intérieur de la chambre d’enregistrement, minimisant ainsi le possible risque d’infection. Les enregistrements seront effectués avec des microélectrodes laminaires fuselées à faible diamètre pour ne pas créer de lésion significative au niveau de la structure cérébrale d’intérêt, et pour augmenter le nombre de neurones récoltés à chaque enregistrement et réduire le nombre de sessions au minimum. La douleur éventuelle induite par le passage de l’électrode sera contrôlée par une anesthésique pulvérisée sur la dure mère. Les imageries réalisées au préalable nous permettront de cibler avec précision les régions cérébrales à enregistrer et nous indiquerons comment positionner l’électrode pour être le plus efficace possible dans la collection de données électrophysiologiques et métaboliques. Le poids de l’animal sera contrôlé de façon quotidienne, afin que le contrôle hydrique n’engendre pas de perte de poids significative. En dehors des sessions comportementales qui seront réduites le plus possible, les animaux seront hébergés dans un environnement social avec accès à de grandes volières incluant du matériel de fourrage et de multiples formes d’enrichissement. Pour favoriser des interactions sans stress excessif entre l’animal et l’expérimentateur, les animaux sont entrainés à la technique d’association positive entre un son (clicker), une action, et une récompense alimentaire. De plus, la mise en place de points limites précoces nous permet un suivi régulier du stress des animaux.
Choix des espèces
Certaines des aires cérébrales et comportements qui font l’objet de nos expériences ne sont pas exprimés chez le rongeur tels que le cortex cingulaire postérieur qui n'a pas d'équivalent histologique chez le rongeur. Le singe rhésus possède une organisation du système visuel (Fovéa, stéréospie, champ visuel binoculaire large), alliée à un développement du néocortex correspondant, similaire à celui de l'homme.
Etude de l’impact du dysfonctionnement de la connectivité neuronale cérébelleuse sur l’ataxie de Friedreich
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
498 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger à modéré. Une partie subit une chirurgie lourde du crâne de deux heures et demie, pose d'une fenêtre crânienne et injection de virus dans le cervelet, d'autres passent des tests de coordination motrice, pour étudier l'ataxie de Friedreich sur un modèle de souris privé d'une protéine. Le porteur reconnaît une douleur postopératoire possible après la chirurgie du crâne, mais qualifie les tests comportementaux de non invasifs et non stressants. Il affirme qu'il n'est pas possible de reproduire en culture des réseaux neuronaux aussi complexes, justifiant le recours à la souris.
Objectifs
L’ataxie de Friedreich (AF) est une maladie neurodégénérative caractérisée par la perte progressive des neurones sensoriels. Elle mène à l’apparition de symptômes ataxiques, comme la perte de coordination des mouvements volontaires, mais affecte aussi d’autres organes comme le cœur et le pancréas. L’AF peut être déclenchée par plusieurs facteurs et est due à un déficit de la protéine frataxine (FXN) dans tous les tissus. Un modèle murin a été créé pour comprendre la maladie. Les résultats de nos collaborateurs et de notre laboratoire montrent que le modèle murin utilisé présente les symptômes de l’ataxie et peut donc être un bon modèle pour notre projet. Le projet va se diviser en plusieurs parties. En premier lieu, nous allons caractériser le comportement de ces souris à plusieurs temps, en utilisant des tests non douloureux et sans stress pour les animaux. En parallèle, nous caractériserons les cellules du système nerveux impliquées dans l’évolution de la maladie. La deuxième partie du projet vise à pratiquer de l’imagerie in vivo afin de visualiser l’activité du cervelet. Ceci nous permettra d’observer d’éventuels changements dans les réseaux neuronaux de façon directe chez les animaux. Ceci sera fait avant et après apparition des symptômes. Le dernier axe visera à utiliser les données d’imagerie obtenues précédemment afin de moduler les circuits neuronaux du cervelet par des approches chimiogénétiques. Cette approche consiste à injecter sous anesthésie différents types de récepteurs qui pourront être activés par un composé qui sera distribué dans l’eau de boisson des animaux. Ceci est dépendant des données obtenues précédemment, et notre approche sera adaptée au cours du projet. Nous espérons ainsi compenser les déficits comportementaux et obtenir des données fondamentales pour mettre en place le développement d’une thérapie. Ce projet présente donc deux intérêts majeurs, qui sont en premier la récolte de données fondamentales indispensables à une meilleure compréhension de la maladie, afin que la communauté scientifique puisse en bénéficier, et l’avancée vers un développement d’une thérapie pour traiter les patients atteints de l’AF.
Bénéfices attendus
Ce projet combine plusieurs techniques afin d’obtenir des données les plus complètes possibles sur ce nouveau modèle. En effet, bien que plusieurs modèles aient déjà été générés par le passé, notre modèle murin est celui qui est le plus proche génétiquement de ce qu’il se passe chez le patient, car il présente une quantité de la protéine Frataxine très basse dans tout le corps, dès le développement de l’embryon. Nos approches combinées de comportement, biologie moléculaire et microscopie vont permettre d’avoir une vue d’ensemble des événements responsables de l'évolution de la maladie. Ce projet permettra d'isoler des pistes pour mettre en place un traitement. Nous pourrons partager ces données avec l’ensemble de la communauté scientifique afin que d’autres travaux puissent utiliser ces connaissances et progresser dans la recherche fondamentale et pré-clinique. Ce projet comprenant un axe d’études comportementales, il n’est pas possible de se passer du modèle animal. De plus, il n’est pas possible à l’heure actuelle de reproduire en culture des réseaux neuronaux complexes comme ceux que nous allons étudier. Des projets de culture cellulaire ont toutefois débuté dans l’équipe à partir de ce modèle pour répondre à d’autres questions biologiques. De plus, les techniques utilisées pour ce projet pourront être déclinées sur d’autres modèles. Les mécanismes sous-jacents de l’AF sont en cours d’étude et de nombreux éléments ne sont pas encore compris. Ce projet va permettre de rassembler une quantité de données non négligeable dans la compréhension de la maladie.
Procédures
Les animaux seront soumis aux procédures suivantes : -Tests comportementaux pour la caractérisation neurologique à 3, 6, 9, et 12 mois. 80 animaux au total (10 témoins et 10 mutants par temps). Les tests effectués visent à évaluer la coordination générale des animaux, et ne sont pas invasifs ni stressants. Comme pour toutes les procédures de comportement, les animaux seront habitués à l’expérimentateur pendant plusieurs sessions avant le début des tests. Les tests ont une durée comprise entre 30 secondes et 5 minutes, et une période de repos est prévue entre chaque test. Au total, chaque souris passe au maximum 15min à être évaluée en comportement. Les tests comportementaux seront répétés à 4 temps différents. -Imagerie in vivo à 40j et 150j. 48 animaux au total. Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale unique pour l’implantation d’une fenêtre crânienne et l’injection de virus codant pour des récepteurs activables chimiquement. L’intervention dure 2.5h par souris, et se fait sous anesthésie générale avec suivi vétérinaire quotidien pendant les 10 jours suivant l’intervention. -Modification chimiogénétique des circuits neuronaux cérébelleux par injection de virus codant pour des récepteurs activables chimiquement. 240 animaux au total, injectés à 40j et 150j -80 animaux injectés avec le virus codant pour les récepteurs, activés chimiquement via un produit dans l’eau de boisson (CNO) -80 animaux injectés avec le virus codant pour les récepteurs, qui ne seront pas activés chimiquement -40 animaux injectés avec un virus ne codant pas pour les récepteurs -20 animaux injectés avec le virus codant les récepteurs et traités au CNO -20 animaux injectés avec le virus non codant, traités également au CNO Les 4 premiers groupes seront utilisés pour les tests de comportement décrits précédemment, ainsi que des études histopathologiques. Les 2 derniers groupes seront utilisés pour des études protéomiques. Tous ces animaux seront soumis à l’intervention d’1h décrite précédemment, avec le même suivi vétérinaire.
Impact sur les animaux
Les données recueillies par nos collaborateurs et notre laboratoire montrent que notre modèle murin de l'AF ne présente pas de symptômes ataxiques avant 9 mois. A partir de 4 à 5 mois, des symptômes légers d’incoordination motrice commencent à apparaître. Les tests comportementaux ne sont pas invasifs ni stressants, et ne causent donc aucun dommage aux animaux. La procédure chirurgicale d’injection et d’implantation de fenêtre crânienne est une chirurgie lourde, et les mesures d’anesthésie et analgésie nécessaires ont été prises en amont. Il est toutefois possible que les animaux soient soumis à de la douleur post-opératoire pendant les jours suivant la procédure. Les traitements pharmacologiques pour les animaux concernés se fera via l’eau de boisson, et n’apportera donc aucun stress pour les animaux. Lors des sessions de microscopie, la tête des animaux sera immobilisée sur une courte période de 30min maximum par souris, pour assurer une acquisition optimale des images.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort pour prélever des tissus. Ces prélèvements seront utilisés pour plusieurs types d’analyses moléculaires et histologiques. Il est en effet indispensable de déterminer l’évolution du taux des protéines d’intérêt à plusieurs temps lors de l’étude.
Remplacement
Ce projet comprenant un axe d’études comportementales, il n’est pas possible de se passer du modèle animal. De plus, il n’est pas possible à l’heure actuelle de reproduire en culture des réseaux neuronaux complexes comme ceux que nous allons étudier. Des projets de culture cellulaire ont toutefois débuté dans l’équipe à partir de ce modèle pour répondre à d’autres questions biologiques.
Réduction
Toutes les procédures ont été conçues pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, sans compromettre la fiabilité des résultats. Les analyses statistiques ont été prévues en amont pour déterminer les tailles d’effectifs adéquates. De plus, afin de minimiser le nombre d’animaux, les mêmes individus seront utilisés pour les analyses comportementales, histologiques, moléculaires et biochimiques. Tous les animaux sont réutilisés d’un autre projet de notre laboratoire dont l’un des axes vise à étudier le comportement néonatal des souriceaux. Ces 2 projets sont donc complémentaires et permettront l’obtention de données sur toute la durée de vie des animaux. Des animaux des 2 sexes seront utilisés car l’Ataxie de Friedreich affecte de manière égale les mâles et les femelles. Ceci nous permet de générer moins d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront habitués à l’expérimentateur avant le début des manipulations pour minimiser leur stress. Nous utiliserons des méthodes de contention peu stressantes, comme des tunnels ou le fait de simplement prendre les souris dans la paume de la main au lieu de les prendre par la queue. De plus, nous effectuons un marquage de couleur à la base de la queue avec une encre légère non toxique afin de différencier plus facilement les souris sans avoir besoin de contention pour les identifier lors du comportement. Pour la prise en charge de la douleur per-opératoire, nous avons mis en place un protocole analgésique complet, comprenant plusieurs molécules, avec la vétérinaire référente de la structure. Pour éviter au maximum de séparer les animaux lors de la phase post-opératoire, nous allons tester un système séparateur de cage qui permettrait aux animaux de se voir, se sentir et d’avoir des contacts sociaux réduits afin qu’ils soient moins stressés lors de cette période critique du projet. Pendant cette période, de l’enrichissement supplémentaire sera fourni pour prévenir toute apparition de comportement stéréotypique, marqueur de souffrance. De plus, un suivi vétérinaire sera effectué quotidiennement pendant 10j, avec une grille de score adaptée et plusieurs types d’analgésiques disponibles pour prévenir toute douleur post-opératoire. Des points limites adaptés à cette chirurgie ont été mis en place afin de prévenir toute souffrance. Ceux-ci comprennent notamment l’évaluation de la consommation d’eau et de nourriture, le toilettage et les mouvements de chaque animal. L’administration de molécules pharmacologiques sera faite via l’eau de boisson, qui sera sucrée pour en masquer le goût. Ceci permettra un traitement sans aucune manipulation supplémentaire, ce qui ne stressera pas les souris.
Choix des espèces
La souris est actuellement l’animal de laboratoire sur lequel nous disposons des plus nombreux outils génétiques et moléculaires pour travailler. Ce nouveau modèle va permettre de raffiner l’étude de l’AF car il s’agit du premier modèle disponible qui présente une perte de FXN dans le corps entier. Plusieurs stades de la vie adulte ont été choisis pour ce projet, afin d’avoir une vision globale de la progression de la maladie. La caractérisation neurologique par tests comportementaux se fera à 3, 6, 9 et 12 mois. A 3 mois, les souris ne présentent pas encore de symptômes, mais il est possible que des dégradations neuronales soient déjà en cours. Les 3 stades suivants nous permettront de relier l’évolution des symptômes avec l’état de dégradation du système nerveux central. Pour les expériences d’imagerie in vivo, les animaux seront opérés à 40j puis observés à 70j pour la partie pré symptomatique. Pour la partie post symptomatique, ils seront opérés à 150j et observés à 180j. comme précédemment, ceci nous permet de mesurer les paramètres d’intérêt avant et après l’apparition de la maladie, pour déterminer la gravité des changements qui ont lieu.
Altération de l’activité corticale et maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, une partie sous anesthésie sans réveil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré modéré. Elles subissent une chirurgie du cerveau, reçoivent des injections pendant sept jours et passent des tests comportementaux, dont un conditionnement par la peur, pour étudier les altérations précoces de la mémoire dans la maladie d'Alzheimer. Le porteur qualifie le conditionnement par la peur de peu stressant en s'appuyant sur des projets antérieurs, et reconnaît un inconfort modéré et une perte de poids possible après la chirurgie. Il affirme qu'aucun modèle in silico ne reproduit le cerveau entier et que seule la souris réunit les critères recherchés.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie progressive, mortelle et est la cause principale de syndrome démentiel et en représente au moins deux tiers des cas la plus courante. MA commence bien avant le stade démentiel par l’apparition de troubles cognitifs donc le diagnostic précoce est un objectif important pour la recherche préclinique et clinique sur la MA. Il peut représenter une fenêtre thérapeutique critique où les interventions peuvent être initiées avant que ne se produise un déclin cognitif sévère. Une accumulation de peptide bêta-amyloïde (Aß) dans le cortex préfrontal est corrélée à un oubli rapide. Ensable, ils constituent un symptôme précoce de la MA qui peut être détecté par des mesures d'évaluation cognitive expérimentale et clinique bien avant l'apparition d'une démence sévère. En effet, les déficits d'apprentissage et de mémoire sont parmi les premiers symptômes rapportés par les familles de patients. Aβ a des effets sur les signalisations impliquées dans la régulation des diverses formes de plasticité corticale et donc la formation de la mémoire. L'objectif de notre projet actuel est d'aboutir à une meilleure compréhension des processus neurobiologiques qui sous-tendent les mécanismes sous-jacents de la formation de mémoire altérée aux premiers stades de la maladie. Nous proposons d'explorer les altérations corticale en tant que marqueur précoce de l'oubli anormal dans la MA.
Bénéfices attendus
La diagnose précoce de la maladie d`Alzheimer est l'étape la plus importante dans l'identification : i) de l'altération cérébrale initiale et par conséquent ii) des thérapies possibles. L'oubli précoce pourrait représenter une cible pour des études précliniques visant à prévenir ou retarder l'apparition de formes plus sévères de la MA. Notre projet vise à relier l'oubli précoce aux changements moléculaires responsables de l'altération de l'activité corticale en offrant une nouvelle voie pour l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Les animaux subissent les interventions chirurgicales (< 40 min) réalisées sous anesthésie, pour lesquelles ils reçoivent un traitement analgésique et des soins appropriés. Ils sont soumis à une tâche comportementale classe de sévérité modère. La tâche comportementale se compose de deux épreuves, l'apprentissage de la mémoire associative et le rappel (chaque épreuve dure 6 à 7 minutes). Ils reçoivent également des injections pendant 7 jours.
Impact sur les animaux
Les animaux subissent un ou deux brèves procédures chirurgicales sous anesthésie. Les effets indésirables potentiels de ces procédures sont un inconfort modéré, une perte de poids potentielle et un risque d'infection. Les autres procédures expérimentales de ce projet comprennent des tests comportementaux : conditionnement par la peur (CdP) et procédure sans reveil. Le conditionnement par la peur peut être un événement stressant pour les souris. Afin de réduire le stress, nous gardons le groupe d'animaux en cage, ce qui leur permet d'exprimer leur comportement social naturel et nous permet de suivre le toilettage mutuel et la nidification des animaux après l'exécution de la tâche. Les projets précédents qui ont utilisé cette tâche comportementale ont montré que les animaux expriment leur comportement naturel dans les 15 minutes qui suivent la tâche, ce qui signifie que cette procédure n'entraîne pas une augmentation significative du niveau de stress. Le test est également effectué dans une pièce différente, avec des odeurs différentes de celles de la cage, afin de désactiver le lien entre la cage d'origine et l'événement redoutable.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés et leurs tissus récupérés pour les analyses post-hoc.
Remplacement
Le projet porte sur l'étude des mécanismes qui sous-tendent la mémoire dans le néocortex et leur changement dans MA. Pour mener à bien notre étude, nous aurions besoin d'un modèle : i) complexe et intact, ii) adapté à la réalisation de tests cognitif, iii) pour lequel il existe déjà des tests comportementaux validés dans la littérature scientifique, iv) qui se prête facilement à la modification de son génome, v) possédant un néocortex, vi) adapté aux approches expérimentales invasives. En accord avec la Directive Européenne et le principe des 3Rs, nous avons réfléchi à nos expériences afin d'intégrer les approches alternatives si possibles. A notre connaissance, seuls les modèles mammaliens, et plus particulièrement la souris, répondent à tous ces critères. Bien que des tests comportementaux simples soient possibles chez des espèces moins sensibles, ces animaux ne possèdent pas la structure cérébrale ciblée et par conséquent ne sont pas adaptés à l'objet de notre étude. Les études humaines ne sont pas adaptées à notre question scientifique car des tests invasifs sont nécessaires pour détecter et analyser les neurones et leur altération dans MA. Les modèles in silico actuellement disponibles ne permettent pas la modélisation au niveau du cerveau entier. Pour toutes ces raisons, et malgré notre réflexion, le recours à l'animal est malheureusement nécessaire.
Réduction
Afin de ne pas utiliser plus que le nombre minimal d'animaux nécessaire, nous avons estimé, sur la base des études précédentes, le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre une signification statistique (stratégie : études antérieures au sein de l'équipe et étude bibliographique). Nous sommes très attentifs à l’objectif de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés. Pour cette raison nous proposons d'adopter une stratégie expérimentale permettant une analyse précoce de nos données au fur et à mesure (c.à.d. les expériences réalisées au fur et à mesure sur de petits lots de 4-6 animaux). Cela nous permettra de modifier la taille de l'échantillon si nécessaire selon les premiers résultats obtenus. L'utilisation de ces petits groupes permettra également de repérer rapidement les problèmes potentiels de la procédure et de modifier notre approche si nécessaire pour le lot suivant. Approche statistique : Selon les caractéristiques de nos données (normalité, variance, cohérences avec les critères de chaque test), nous appliquons les tests statistiques. Selon les caractéristiques de nos données certains tests supplémentaires seront effectués.
Raffinement
i) Surveillance quotidienne. ii) Vérification de l'état de l'animal (avant chaque manipulation) selon les critères généraux ainsi que les signes cliniques spécifiques à la manipulation. iii) Manipulation quotidienne des animaux avant les expériences pour réduire le niveau de détresse. iv) Mécanismes d'intégration des nouvelles techniques de raffinement : formation régulière des expérimentateurs, consultation de sites éducatifs tels que NC3R. vii) Adaptation des conditions d’hébergement : animaux maintenus dans des cages collectives avec l'enrichissement et le matériel pour la nidification.
Choix des espèces
Nous utiliserons la souris car nous voudrions exploiter certains modèles transgéniques impliquant la production d’amyloïde beta. À ce jour, la souris est la seule espèce mammalienne pour laquelle il est possible, d'une manière routine, de modifier le génome et pour laquelle les modèles créés ont été caractérisés au niveau comportemental et moléculaire. Selon les données précédemment rapportées et les données sur le développement de la pathologie, nous les utilisons à l'âge auquel les animaux commencent à développer les premiers signes de la maladie avant l'apparition de la maladie grave.
Impact des mutations du gène Kcnk3 sur la fonction ventriculaire droite consécutive à un banding de l’artère pulmonaire
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures dont la souffrance est déclarée pour partie légère et pour partie sévère. Une insuffisance cardiaque droite leur est provoquée par la pose d'un clip serrant l'artère pulmonaire sous anesthésie, avant un suivi par échographie puis une mise à mort pour analyse du cœur et des poumons. Le porteur indique que cette chirurgie conduit à un essoufflement à l'effort et à de la fatigue, sans détailler la surveillance de la douleur au-delà d'un analgésique postopératoire. Il qualifie le recours à l'animal d'"indispensable", les cellules cardiaques adultes ne pouvant selon lui être maintenues en culture.
Objectifs
Chez le patient atteint d'hypertension artérielle pulmonaire, le déclencheur de la transplantation ou de la mort du patient est le développement d'une insuffisance ventriculaire droite. Cependant les mécanismes moléculaires responsables de cet état pathologique sont peu connus. L'objectif de ce projet est déterminer comprendre les mécanismes moléculaires de l'insuffisance cardiaque droite.
Bénéfices attendus
Chez le patient atteint d'hypertension artérielle pulmonaire, le déclencheur de la transplantation ou de la mort du patient est l’état du ventricule cardiaque droit. Ce projet nous permettra comprendre comment se met en place l'adaptation cardiaque puis l’insuffisance cardiaque droite, ce qui représente un enjeu majeur pour soutenir la fonction cardiaque des malades atteints d’HTAP. A l’heure actuelle les mécanismes responsables du développement de l’insuffisance cardiaque droite sont mal connus c'est pourquoi nous allons induire une insuffisance cardiaque droite chez le rat afin d'étudier les mécanismes mis en jeu.
Procédures
Pour la animaux du groupe Banding de l'artère pulmonaire: Sous anesthésie gazeuse (isofluorane) les rats subiront la chirurgie de banding de l'artère pulmonaire (durée de la chirurgie 20-40min), puis une échocardiographie sera réalisée 4 semaines post-chirurgie. Les animaux contrôles subiront la mème procédure chirurgicale sans la pose du clip autrou de l'artère pulmonaire (20-30 min). Leur fonction cardiaque sera également suivie par échocardiographie. A la fin de la chirurgie, puis toutes les 24 heures pendant 3 jours un analgésique sera injecté au rat en sous cutané. Les rats sont laissés sur la couverture chauffante jusqu’au réveil complet. Des prélèvements de sang (200 µL) (durée du prélevement 5min) seront réalisés à la fin de la procédure expérimentale.
Impact sur les animaux
Comme décris précédement, la chirurgie de Banding de l'artère pulmonaire conduira au développement d'une insuffisance cardiaque droite. Les effets secondaires importants et les atteintes cardiaques (essouflement à l'effort, fatigue) conséquences de la mise en place de l'insuffisance cardiaque droite.
Devenir
Euthanasie de tous les animaux pour analyses post-mortem sur le coeur et les poumons.
Remplacement
L’objectif de recherche est d’étudier et de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la dysfunction ventriculaire droite induite par banding de l'artère pulmonaire. Le recours à des animaux est indispensable et se justifie par la nécessité d’étudier la fonction cardiovasculaire dans un contexte physiologique et physiopathologique. Il se justifie par l’impossibilité d’obtenir des lignées de cellules cardiaques adultes (les cellules cardiaques ne se divisent pas), par le fait que les cellules cardiaques ne conservent pas un phénotype stable et ne survivent pas au-delà de 24h après isolement cellulaire. Il se justifie également par l'impossibilité de simuler ex vivo la mise en place de l'insuffisance cardiaque droite qui est un processus multifactoriel complexe.
Réduction
Afin de réduire encore le nombre d’animaux utilisés, les animaux sont mis à mort en fin d'expérimentation après un dernier bilan (cathétérisme) de leur fonction cardiaque, et les tissus prélevés sont partagés afin de minimiser encore le nombre d'animaux utilisés. Plusieurs approches expérimentales seront utilisées par différents expérimentateurs sur le même animal afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Des expériences de biochimie et de biologie moléculaire à partir des différents tissus collectés et des études sur cellules isolées seront effectuées afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Le test statistique adéquat permet de bien définir le nombre d’animaux nécessaires à cette étude.
Raffinement
Toutes les procédures seront pratiquées en utilisant des anesthésiques et des analgésiques. De l'enrichissement (rouleau, coton) sera ajouté dans les cages des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux ne subissent aucun stress. La procédure conduira à une insuffisance cardiaque droite, les animaliers surveilleront quotidiennement l'apparition de points limites précoces, notamment la perte de poids.
Choix des espèces
Les rats sont des modèles standards de maladies cardiovasculaires. Ils présentent une anatomie vasculaire et des caractéristiques hémodynamiques similaires à celles de l’homme. De plus notre équipe travaille en routine avec des modèles expérimentaux utilisant des rats pour l’étude de maladies vasculaires pulmonaires. Nous avons donc l’expérience et le matériel adapté pour travailler avec le rat. Jeune adulte (6 à 8 semaines, 100-200g). A ce stade de développement (pleine phase de croissance) l’induction de l’hypertension artérielle pulmonaire est plus rapide, et chez l'homme la pathologie se développe chez les jeunes aldultes.
Effet d’une infusion centrale chronique d’hormones thyroïdiennes sur l’expression de l’hibernation chez le hamster syrien mâle
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
219 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélèvements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque hamster est hébergé seul seize semaines en conditions hivernales, exposé au froid à 8 °C pour entrer en hibernation, et subit deux chirurgies, la pose d'un capteur de température puis d'une pompe diffusant des hormones, la moitié des animaux étant en plus castrés. Le porteur indique que des injections pratiquées pendant la torpeur peuvent provoquer une douleur aiguë et le réveil de l'animal, et que la castration peut entraîner une hémorragie et des douleurs supplémentaires. Il affirme que l'hibernation met en jeu l'organisme entier et qu'aucun moyen de substitution ne permet de la modéliser, justifiant le recours au hamster syrien.
Objectifs
L’hibernation est une adaptation physiologique et comportementale qui permet la survie de l’espèce pendant les périodes saisonnières défavorables (en hiver : température extérieure basse et pénurie des ressources alimentaires). Tout au long de l’hibernation, afin d’économiser de l’énergie, l’animal va réaliser des cycles d’éveil/sommeil, alternant entre des phases actives avec une température corporelle à 37°C et des épisodes de torpeur, caractérisés par un endormissement profond associé à une hypothermie corporelle sévère. La température corporelle s’ajustant sur les températures extérieures froides de l’hiver peut descendre à 5°C. Des travaux antérieurs suggèrent que les hormones thyroïdiennes du cerveau seraient impliquées dans ces processus d’hibernation. Nous allons vérifier cela chez une espèce hibernante : le hamster syrien.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet concernent les connaissances obtenues en recherches fondamentales sur le système nerveux central, le métabolisme ainsi que sur la biologie d'un animal hibernant.
Procédures
Les hamsters syriens seront hébergés seul pendant 16 semaines dans des conditions où les jours sont courts comme en hiver mais également exposés au froid afin d'obserser les comportements hibernatoires des animaux. Les animaux subiront deux actes chirurgicaux à 2 semaines d'intervalle. Le premier acte durera moins d'une heure 1 h pour l'insertion d'un capteur télémétrique de température corporelle, permettant le suivi à distance de l'hibernation des animaux. Le deuxième acte, d'une durée de 2h30 maximum pour la mise en place d'une mini-pompe diffusant des hormones. Ils seront exposés au froid (8°C) pour entrer en hibernation. Lors d'utilisation de pompe rechargeable, des injections transcutanées sont réalisées en phase de torpeur (animaux profondément endormis). Une castration est ajoutée à la première chirurgie pour la moitié des animaux. L'évolution de l'hibernation des animaux est surveillée pendant 6 semaines environ.
Impact sur les animaux
Lors des chirurgies, l’anesthésie générale peut induire une hypothermie, de la sécheresse occulaire et une légère déshydratation. Au niveau du site d’incision, il y a des risques de douleur, d’inflammation et d’infection de la plaie. Une perte de poids légère (inférieure à 5%) sur 24h est attendue, mais devrait être transitoire. Elle pourrait se maintenir en cas de complications post-chirurgicales (inflammation, infection, douleur). L’insertion de la pompe sous la peau du dos pourrait éventuellement gêner la motricité de l’animal (encombrement, frottements) si celle-ci est trop proche du cou ou des membres antérieurs. Dans le cas d'utilisation de la pompe rechargeable, lors d'un épisode de torpeur, des injections transcutanées sont réalisées et peuvent induire une douleur aigüe légère et son réveil. La castration peut induire une hémorragie et de douleurs supplémentaires.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort pour prélèvements en fin d'expérience.
Remplacement
L’expérience doit être réalisée sur l’animal entier. Les processus impliqués dans l’hibernation font intervenir l’ensemble de l’organisme, aussi est-il impossible, en l’état actuel de nos connaissances, de réaliser une telle étude sur des organes isolés. Aucun moyen de substitution ne permet de modéliser les différentes étapes de l’hibernation et les processus liés à chaque étape ni les relations entre les organes périphériques et le cerveau.
Réduction
Le nombre d'animaux (8 par groupe) a été calculé pour obtenir des résultats statistiquement robustes et de faible variance pour comparaisons inter-groupe.
Raffinement
Pour éviter les agressions dans les jours courts comme en hiver, les animaux seront hébergés en cages individuelles enrichies avec de la frisure de nidation et un bâton à ronger. Lors des chirurgies, les animaux bénéficieront d'une anesthésie générale et d'analgésiques locaux. La température corporelle sera maintenue à l’aide d’un tapis chauffant. Un anti-inflammatoire non stéroïdien sera administré en post-chirurgie. La longueur du cathéter entre la canule et la pompe est tout particulièrement ajustée afin de pas gêner le hamster syrien dans ses mouvements. Des points limites ont été établis afin de soustraire l'animal à la souffrance.
Choix des espèces
Le modèle animal choisi est le hamster syrien (Mesocricetus auratus) car c’est un animal hibernant. Les animaux sont des adultes mâles (entre 3 et 9 mois ; poids corporel moyen 120 g) car notre expérience requiert qu’ils soient sexuellement matures et ce sexe nous permet de voir facilement si le système reproducteur de l'animal est activé ou inhibé grâce à la taille des testicules.
Infection à Bacillus cereus sensu lato : nouvelles thérapies et réponses de l’hôte chez le nouveau-né dans un modèle murin.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 975 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux de deux jours sont infectés par la bactérie Bacillus cereus puis traités par injection, et sont tués au bout de 48 heures avec les mères, susceptibles d'avoir été contaminées. Le porteur indique que l'infection provoque une baisse d'activité, une pâleur, puis le rejet par la mère et l'absence d'alimentation, la survie des animaux étant le critère suivi. Il affirme avoir déjà testé les composés in vitro mais conclut à la nécessité de vérifier l'effet dans un modèle d'infection vivant.
Objectifs
L’identification d’un nombre croissant de cas d’infections dues aux bactéries du groupe Bacillus cereus sensu lato, pathogène opportuniste (ne causant en général pas de maladie chez les personnes en bonne santé) présent dans l’environnement, représente un problème majeur en santé publique. Il s’agit de la 3ème cause d’intoxications alimentaires dans le monde (Autorité Européenne de Sécurité des Aliments : EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ). EFSA J, 2016), et de plus en plus de travaux font aussi état d’infections fatales chez le nouveau-né prématuré. Le traitement antibiotique de référence contre ces infections à Bacillus cereus consiste en une association vancomycin/aminoglycoside. Cependant, la recherche d’un traitement plus simple et moins lourd à mettre en place serait un plus dans la prise en charge de ce type d’infections. Ce projet devrait permettre de répondre à la question de l’EFSA et de l’ANSES (Agence Nationale de Sécurité Sanitaire de l'Alimentation de l'Environnement et du Travail) sur les risques en santé publique, des bactéries du groupe Bacillus cereus et permettre la mise au point de nouveaux traitements contre ce type d’infection.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est la recherche de nouveaux traitements contre les infections à Bacillus cereus. S’il existe un traitement antibiotique de référence contre ce type d’infection chez le nouveau-né prématuré, la découverte d’un traitement plus simple et moins lourd à mettre en place constituerait une avancée significative dans le traitement de ces infections.
Procédures
Aucune intervention ne sera effectuée sur les femelles gestantes avant, pendant ou après mise bas. Les souriceaux de 2 jours seront infectés par voie intrapéritonéale, puis, une heure plus tard, traités par injection par voie intrapéritonéale. Le temps nécessaire à l'infection ou au traitement, par voie intrapéritonéale, n'excéde pas 10 secondes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux seront ceux liés à l'infection en général, à savoir principalement chez les souriceaux, baisse de l'activité, pâleur, pouvant aboutir au rejet par la mère et à l'absence d'alimentation, visualisée par l'absence de lait dans l'estomac. Nous utiliserons des doses infectantes déterminées dans un précédent projet. Les animaux infectés seront traités avec les composés chimiques sélectionnés et la survie des animaux sera suivie au cours du temps et comparée avec des animaux traités avec une solution saline.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort au bout des 48 heures de la procédure, les souriceaux ayant été infectés et/ou traités avec différents composés chimiques et les femelles gestantes après mise bas ayant pu être contaminées par les souriceaux infectés.
Remplacement
Les différents composés étudiés ont été testés in vitro sur des cultures de Bacillus cereus et les concentrations minimales inhibitrices déterminées pour chaque composé actif contre cette bactérie. Nous devons maintenant vérifier que cet effet observé sur des bactéries en culture se retrouve dans un modèle d’infection in vivo. Dans un souci de remplacement et de raffinement, des tests de toxicité sur cellules nous ont permis de déterminer les doses de chaque composé n'entrainant pas de mort cellulaire. Ce sont ces doses qui seront utilisées dans ce projet.
Réduction
Nous utiliserons un nombre d'animaux le plus restreint possible nous permettant d'obtenir des résultats statistiquement significatifs. Ce nombre sera calculé en tenant compte de nos résultats d'un précédent projet. Il pourra être réduit encore en fonction des résultats obtenus.
Raffinement
En termes de raffinement, afin de garantir le bien-être des souris, celles-ci seront hébergées dans un environnement enrichi (igloo et baguette en papier). Également, ce projet fait suite à un précédent projet au cours duquel les doses infectantes ont été déterminées. Après infection et après traitement avec les composés, les animaux seront surveillés quotidiennement (aux temps 2 heures post infection et 1, 2, 4, 6, 8, 24 et 48h post traitement) par les responsables du projet et par le personnel animalier, permettant de détecter toute apparition de signes de souffrance durables non reliés à l’infection et pouvant être dus à une mauvaise injection. Le cas échéant, les animaux concernés seraient immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Le modèle souris est largement décrit dans la littérature comme modèle de l'infection in vivo. De plus, les systèmes de défense contre les bactéries pathogènes sont très conservés de la Drosophile aux Mammifères, et en particulier, les réponses cellulaires de l'hôte vis-à-vis du pathogène sont très similaires entre la souris et l'homme. Ce modèle est celui que nous avons utilisé dans nos études précédentes dans un modèle de bactériémie à Escherichia coli chez la souris, dans un modèle murin de bactériémie induite au cours d'une pneumonie à Staphylococcus aureus et dans un modèle d’infection à Pseudomonas aeruginosa. Plus précisément, ce modèle d'infection chez la souris C57Bl/6JRj nouveau-née est celui que nous avons utilisé par ailleurs dans l'étude de l'infection à Bacillus cereus chez le nouveau-né prématuré. Les animaux utilisés seront des souriceaux nouveau-nés de 2 jours, afin de coller au plus prés aux cas d'infections fatales observées en clinique chez le nouveau-né prématuré.
Spécification et prolifération cellulaires dans la gonade embryonnaire de souris
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Des femelles gestantes reçoivent une injection dans l'abdomen, parfois précédée de deux gavages destinés à inactiver des gènes, puis sont tuées quatre heures plus tard pour disséquer les embryons et prélever leurs gonades, elles aussi mises à mort. L'objectif est de comprendre les mécanismes de la différenciation sexuelle des gonades chez l'embryon, une recherche fondamentale. Le porteur affirme qu'aucune culture in vitro ne reproduit ce processus de développement et présente la souris comme un modèle "essentiel".
Objectifs
A l’heure où les différences entre les sexes sont reconnues comme des facteurs majeurs dans l’incidence ou l’évolution de nombreuses pathologies, il est surprenant que nous ayons une connaissance très partielle des bases moléculaires et cellulaires de la différenciation sexuelle. Chez l’homme (et la souris) l’appareil génital comprend différents organes, dont les gonades qui sont les organes producteurs des cellules sexuelles ou gamètes. Les spermatozoides sont produits par le testicule chez l’ homme et les ovocytes sont produits par les ovaires chez la femme. Selon le sexe de l’embryon, différents gènes sont activés et vont permettre aux gonades de se développer en testicules chez le futur petit garçon ou en ovaires chez la petite fille, ce qui va initier tout le développement sexuel de l’individu. Des défauts dans la formation des gonades aboutissent à des anomalies du développement sexuel avec des symptômes allant de l’absence de gonades à une inversion de sexe. Les signaux contrôlant la formation et la prolifération des différents types cellulaires qui composent les gonades embryonnaires, ovaires et testicules, demeurent largement inconnus. Cette connaissance est un prérequis pour élucider les mécanismes de développement des gonades et donc pour mieux comprendre l’origine des anomalies du développement sexuel. Notre objectif est de comprendre les mécanismes qui contrôlent la formation des lignages cellulaires du testicule et de l’ovaire embryonnaire. Nous analyserons des lignées de souris porteuses de mutations dans des gènes impliqués dans la différenciation gonadique pour déterminer le statut de différenciation et l’état de prolifération des populations cellulaires gonadiques. Au-delà des nouvelles connaissances sur les mécanismes moléculaires de la différenciation sexuelle, nos travaux contribueront à clarifier l’étiologie de certaines anomalies du développement sexuel et à améliorer leur prise en charge.
Bénéfices attendus
A l’heure actuelle, on constate que la plupart des maladies a une incidence et une sévérité qui dépend du sexe de l’individu. Le gène responsable du développement masculin a été découvert il y a plus de 30 ans (gène Sry) mais on ne connait toujours pas à l’heure actuelle, les premières étapes du développement ovarien. Étant donné notre ignorance de ces mécanismes, les cliniciens ont des difficultés à aider les familles dans leur choix pour ou contre une gonadectomie de leur enfant atteint d’anomalies du développement sexuel. Les gonadectomies sont recommandées dans les cas où l’anomalie du développement sexuel s’accompagne d’un risque accru de développer des tumeurs gonadiques. Comprendre les mécanismes de différenciation sexuelle et les pathologies associées représentera une aide inestimable pour soutenir les familles dans leur décision.
Procédures
Des femelles gestantes seront injectées une seule fois dans la cavité abdominale avec un produit qui permet de suivre la prolifération cellulaire puis mises à mort 4 heures après l’injection pour disséquer les embryons et analyser leurs gonades. Dans d’autres cas les femelles seront d’abord soumises à l’administration d’un produit par gavage oral (pour inactiver des gènes spécifiquement dans les gonades embryonnaires) à deux reprises à 24 heures d’intervalle puis à l’injection du produit qui permet de suivre la prolifération cellulaire avant d'être mises à mort 4 heures après l’injection pour disséquer les embryons et analyser leurs gonades. Aussi bien l’injection que le gavage oral sont réalisées en 20 à 30 secondes maximum.
Impact sur les animaux
Les injections dans la cavité abdominale sont utilisées en routine au laboratoire. La nuisance possible est une douleur légère et brève au site d’injection. Le gavage oral est utilisé en routine au laboratoire et nous possédons l’expertise requise pour cette expérimentation. Les doses de solution de gavage ont été déterminées pour n’induire aucun effet indésirable lié directement à l’ingestion. L'administration de produits par gavage a une durée totale de 20 à 30 secondes maximum. Dans de rares cas liés au manque d'expertise de l'expérimentateur, le gavage oral peut résulter en un étouffement dans les minutes suivant l'administration (2 minutes). Après une observation attentive de l'animal immédiatement après le gavage, tout signe de suffocation entraînera la mise à mort immédiate de l'animal par dislocation cervicale. A ce jour, nous n'avons jamais rencontré ce problème.
Devenir
Toutes les femelles gestantes traitées seront mises à mort afin de prélever les embryons aux stades embryonnaires précoces nécessaires aux analyses. Tous les embryons prélevés seront mis à mort afin de procéder à la dissection de leurs gonades pour analyse.
Remplacement
La gonade est formée d’une diversité de cellules qui ont toutes un rôle essentiel pour le déterminisme sexuel. De plus la différenciation des gonades est un processus très dynamique. A l’heure actuelle, nous ne sommes pas capables de reproduire in vitro les conditions nécessaires à la formation des organes reproducteurs. Par conséquent, l'emploi d’un modèle animal comme la souris récapitulant fidèlement toutes les étapes complexes de ce processus de développement chez le mammifère est donc essentiel. Cependant si de nouvelles conditions de culture satisfaisantes sont développéess, nous les utiliserons dans la perspective de remplacer les souris par ces nouvelles technologies.
Réduction
Afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs nous avons besoin de 20 embryons par expérience (histologie et analyses quantitatives) et par génotype. Toutefois pour réduire le nombre de souris utilisées, nous analyserons les gonades par lots de trois réplicats pour l’histologie et cinq réplicats pour les analyses quantitatives. Si nous obtenons des résultats statistiquement significatifs, nous ne ferons pas les réplicats supplémentaires.
Raffinement
La qualité de la contention, l’usage d’un matériel autoclavable permettent d’assurer un gavage et une injection intra-péritonéale efficaces et rapides, limitant le stress et la douleur imposés à l’animal par la procédure. Le personnel a été formé pour cela. Les solutions à administrer sont maintenues à la température corporelle de 37°C pour éviter tout inconfort de la femelle. Ces mesures sont accompagnées de la mise en place d’un protocole d’observation permettant de déceler précocement tout inconfort des animaux durant les expériences et de proceder à la mise à mort en cas de comportement anormal. Les souris sont hébergées dans des cages contenant 2 à 3 congénères au total dans lesquelles sont placés systématiquement différents types d'enrichissements permettant à l'animal de se faire un nid à l'abri de la lumière (igloo en papier mâché, carrés de ouate ou de tissu compressé), et de ronger (baguettes de papier mâché, morceau de bois, coton). Enfin, nous utilisons un sytéme raffiné qui permet la mutation du gène d’intérêt uniquement dans la gonade embryonnaire et uniquement après administration du produit par gavage oral.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme le modèle de choix, en raison de similarités génétiques et physiologiques avec l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Nous avons tous les outils à notre disposition et déjà au point pour pouvoir étudier la fonction des gènes d'intérêt dans les gonades de souris. Les femelles gestantes seront mises à mort à différents moments de la gestation couvrant tout le développement des gonades embryonnaires: jour 10.5 (début de la différenciation gonadique), jour 11.5 (détermination du sexe gonadique et début de la différenciation des lignages cellulaires en fonction du sexe), jour 12.5 (début de la formation du testicule et de la différenciation des cellules mâles productrices de testostérone), jour 13.5 (initiation de la division des ovocytes chez la femelle), jour 14.5 (différenciation gonadique établie), jour 17.5 (fin de la différenciation gonadique embryonnaire).
Développement d’un nouveau biomatériau naturel poreux pour une médecine régénérative en vue de traiter les communications bucco-sinusiennes
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une perte de substance du palais leur est infligée sous anesthésie pour créer une communication entre la bouche et les sinus, comblée par un biomatériau à base de collagène et de lysat plaquettaire, avec un suivi de trois semaines par scanner avant mise à mort au 21e jour. Le porteur reconnaît des douleurs postopératoires, des difficultés à s'alimenter, des risques d'infection, de nécrose et une mortalité pouvant atteindre 5 %. Il affirme qu'il n'est pas possible de se passer d'animaux et présente ce modèle comme un préalable à des essais chez l'humain.
Objectifs
Les communications buco-naso-sinusiennes (CBS) sont fréquentes en cancérologie, d'origine iatrogène de la tête et du cou et peuvent être causées par la chirurgie et/ou la chimiothérapie. Elles se manifestent sous forme de fistules entre la cavité orale et les sinus maxillaires ainsi que les fosses nasales.Ces communications peuvent entraîner des symptômes tels que des infections récurrentes des sinus, une obstruction nasale, des douleurs faciales et des écoulements nasaux persistants. Les traitements actuels sont souvent invasifs et présentent un risque élevé d'échec. Pour résoudre ce problème, nous proposons un nouveau biomatériau sec, poreux et bioactif fabriqué à partir de collagène de types I et de lysat plaquettaire. Ce biomatériau a pour objectif de fermer complètement les CBS tout en libérant des molécules bioactives qui favorise la réparation tissulaire (facteurs de croissance, des cytokines...) Le but se ces travaux d'évaluer l'efficacité de ce biomatériau sur des animaux dans le cadre du traitement des CBS. Il vise à offrir une solution thérapeutique supplémentaire aux CBS de petite ou moyenne taille, en particulier celles qui sont récidivantes et réfractaires au traitement par lambeaux. L'utilisation de ce biomatériau plutôt que d'un lambeau permettrait d'éviter la morbidité associée (séquelles du site donneur) et de raccourcir la durée de l'opération. Cela améliorerait la qualité de vie des patients, en particulier ceux qui doivent porter des plaques palatines obturatrices à vie en raison de CBS persistantes. Les approches utilisant des biomatériaux bioactifs d'origine naturelle, comme celle que nous proposons, représentent une alternative de choix pour combler ce vide thérapeutique.
Bénéfices attendus
- Prouver l’efficacité des biomatériaux pour la régénération tissulaire in-vivo - Perfectionner le modèle animal de CBS chez le rangeur (rats)
Procédures
L'induction de la communication bucco-sinusienne et la mise en place des biomatériaux seront réalisées sur l'ensemble des rats (60) sous anesthésie générale, avec une durée estimée de 60 minutes. Chaque rat sera placé allongé sur le dos sur un tapis chauffant, avec la bouche maintenue ouverte à l'aide d'un élastique placé sur les incisives maxillaires. La procédure consistera en la création d'une perte de substance palatine, conformément à la méthode décrite dans la littérature. Cette perte de substance sera ensuite comblée avec nos biomatériaux sélectionnés, soit l'aérogel de collagène et de lysat plaquettaire, soit l'aérogel de collagène seul, à l'exception du groupe contrôle. Lors de l'application des aérogels, une pression douce sera exercée avec une compresse jusqu'à obtention de l'hémostase. Un suivi de 3 semaines sera effectué, avec une observation hebdomadaire par scanner (micro-TDM) sous anesthésie générale, pour une durée estimée inférieure à 15 minutes. Ceci permettra d'évaluer la régénération tissulaire induite par nos biomatériaux dans les groupes traités et de la comparer à la régénération spontanée du groupe contrôle. Enfin, après une anesthésie générale, tous les rats seront euthanasiés au 21e jour ce qui prendra quelques secondes. Les cadavres des rats seront ensuite transférés au service de zootechnie expérimentale pour la dissection, et des analyses histologiques seront réalisées sur les échantillons.
Impact sur les animaux
Douleurs : Il est possible que des signes de douleur postopératoire apparaissent en raison des incisions chirurgicales, de la manipulation tissulaire et des lésions tissulaires pendant la chirurgie. Ces douleurs peuvent avoir des effets négatifs sur le bien-être général des animaux, tels que des problèmes de comportement tels que l'anxiété, la dépression ou l'agressivité. /Difficultés alimentaires : Des difficultés à s'alimenter peuvent survenir en raison de douleurs ou d'inconfort buccal, des modifications anatomiques de la cavité buccale et des sinus qui affectent la fonction de mastication et rendent l'ingestion des aliments moins efficace./Infection : Il est possible que des infections se développent au site de la communication bucco-sinusienne ou de la réparation subséquente avec l'aérogel./ Mauvaise cicatrisation : Il est possible que la réparation avec l'aérogel ne soit pas efficace et que la communication bucco-sinusienne persiste ou se reforme. /Effets secondaires systémiques : L'utilisation de l'aérogel pour la réparation de communications bucco-sinusiennes chez les rats peut entraîner des effets secondaires systémiques, tels que des modifications du poids corporel, du métabolisme ou d'autres paramètres physiologiques. Réaction immunitaire : Il est possible que certains animaux développent une réaction allergique à l'aérogel, ce qui pourrait entraîner des symptômes tels que de l'inflammation, des rougeurs, des démangeaisons ou une nécrose tissulaire. /Mortalité : Il est possible que des animaux décèdent en raison de complications liées à la procédure de réparation avec l'aérogel, telles que des infections, des complications chirurgicales ou des réactions inattendues (risque estimé inférieur à 5%).
Devenir
Mise à mort nécessaire pour examen histologique (évaluation biointégration, biodégradation, formation osseuse, présence d'ostéoradionécrose).
Remplacement
Il n'est pas possible de se passer d'animaux pour ce projet. En effet, avant de pouvoir mettre en place les premiers essais cliniques chez l'Homme, il est nécessaire de vérifier l'efficacité du nouveau biomatériau dans une étude préalable sur modèle animal. Une seule formulation de mousse composé de collagène et de lysat plaquettaire parmi 3 formulations de départ sera évaluée, car l’évaluation in-vitro (culture cellulaire 3D) a montré son fort potentiel
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit par une analyse statistique optimale établie en fonction des résultats attendus, ainsi que le choix de modèles animaux et de protocoles déjà validés dans la littérature.Le critère de jugement principal est le taux de rats présentant un succès. Un succès est défini comme une régénération de plus de 50% de la surface. En utilisant un plan de A’Hern sous les hypothèses alpha=5%, puissance=85%, p0=25% et p1=55%, il est nécessaire de randomiser 20 rats dans chaque bras expérimental. Un ratio 1:1:1 sera utilisé pour la randomisation, le bras contrôle étant uniquement présent pour valider les hypothèses. Au total 60 rats (bras contrôle : n=20 / bras expérimental 1: n=20 / bras expérimental 2 : n=20) seront randomisés dans cette étude. Le critère principal est le taux de rats présentant un succès (cf. section critère de jugement principal).Il sera présenté par bras sous la forme de nombre, pourcentage et intervalle de confiance à 95% selon une distribution binomiale exacte.
Raffinement
La totalité des procédures effectuées seront réaliser par un personnel qualifié composé de concepteur de projet et d’applicateur de procédure expérimentale ainsi de chirurgiens ORL Un entrainement sur des cadavres de rats sera effectué afin de permettre aux opérateurs de se familiariser et raffiner la procédure chirurgicale. Le bien-être animal sera raffiné par une optimisation de la gestion de la douleur (buprenorphine). Les animaux seront surveillés avec attention (comportement, prise alimentaire) et seront pesés de manière hebdomadaire durant toute l'expérience. Les difficultés à l'alimentation seront surveillées et la prise alimentaire sera facilitée par les antalgiques et un accès à l'eau et à de l'alimentation molle (croquettes ramollies). Elle sera supplémentée par des compléments hypernutritifs en cas de perte de poids. Les cages seront de taille adaptée. Le change sera effectué 2 fois par semaine. Un enrichissement environnemental dans les compartiments sera réalisé avec mise en place de cachettes, de papier, coton pour réaliser des nids. Des points limites seront respectés pour éviter toute souffrance excessive. L'ensemble du personnel est qualifié et compétent en matière d'expérimentation animale, et l'animalerie possède l'agrément et le plateau technique nécessaires. A noter que les animaux ne pourront pas être réutilisés car l’évaluation de la régénération tissulaire nécessitera une autopsie.
Choix des espèces
Bien que les modèles animaux ne puissent reproduire précisément la physiologie ou l'anatomie humaine, le rat se distingue en tant que modèle animal particulièrement avantageux pour notre étude. Il présente une combinaison d'atouts significatifs, tels que son coût abordable, sa robustesse et sa facilité d'entretien. Notre sélection s'est orientée vers la race Wistar Han, avec des mâles âgés d'environ 7 à 9 semaines, pesant entre 251 et 275 grammes. Toutes les expérimentations animales seront rigoureusement conduites au sein d'une installation de Zootechnie agréée. Cette décision repose sur des études préalables similaires à notre approche de recherche, qui ont été précédemment publiées.
Effet cardioprotecteur de la clusterine dans l’ischémie/reperfusion myocardique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
189 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 165 dans des procédures de gravité sévère et 24 opérées puis tuées sans reprise de conscience. Elles subissent une chirurgie d'infarctus par ligature d'une artère coronaire, avec des douleurs post-opératoires possibles pendant plusieurs jours, puis des injections et des prélèvements de sang répétés. Le projet teste l'effet protecteur de la clusterine après un infarctus, sur des souris génétiquement modifiées et leurs congénères. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne modélise l'ischémie-reperfusion et que seul un système intégré in vivo reproduit la pathologie.
Objectifs
L’objectif de notre projet est d'étudier l'effet protecteur de la clusterine au cours de l'infarctus. La clusterine est une molécule capable de neutraliser les signaux de danger libérés par les cellules mortes au cours de l'infarctus. Nous utiliserons pour cela un modèle de souris déficientes en clusterine et leurs congénères contrôles. Nous utiliserons un modèle d'infarctus chez la souris, nous permettant d'étudier l'effet de la clusterine sur la taille d'infarctus après 7 jours. Nous étudierons également la cinétique de libération dans le sang de la clusterine et des signaux de dangers qu'elle neutralise, les niveaux d'expression de clusterine et des marqueurs de l'inflammation dans le tissu cardiaque ainsi que le rôle protecteur de la clusterine in vitro sur des cellules isolées de coeur de souris.
Bénéfices attendus
L’infarctus du myocarde aigu est aujourd’hui une cause majeure de mortalité et morbidité dans le monde.. Malgré les progrès réalisés ces dernières années dans la prise en charge précoce de l’infarctus du myocarde, qui a permis de diminuer considérablement la mortalité aigue grace à la revascularisation, il existe toujours un risque élevé pour les patients de développer une insuffisance cardiaque dans le long terme. L’arsenal thérapeutique disponible actuellement a permis des progrès cliniques mais la morbi-mortalité reste élevée (50 % de mortalité à 5 ans) et les traitements ne sont pas curatifs. A ce jour, le remodelage du myocarde après un infarctus constitue un problème majeur de santé publique en France et il apparait indispensable de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Cela nécessite de mieux comprendre les mécanismes qui régissent l’altération de la fonction cardiaque post-infarctus à partir de modèles expérimentaux qui reproduisent les différentes composantes de la pathologie humaine. Ceci est un gage d’une meilleure transposition vers la clinique dont le besoin de nouveaux traitements est urgent. Le but du présent projet est de démontrer que la clusterine pourrait constituer une stratégie thérapeutique prometteuse et originale pour le traitement de l'infarctus du myocarde.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d'infarctus du myocarde par ligature coronaire. La durée totale de l’intervention est d'environ 60 min, dont 15 min entre l’intubation oro-trachéale et l’accès au coeur, 30 min de ligature coronaire et 15 min pour la fermeture du thorax. 3 injections iv (dans la veine caudale) de clusterine (avant la ligature coronaire, à J2 et à J3) et/ou 1 injection de molécules neutralisées par la clusterine (avant la ligature coronaire) seront réalisées. 4 prélèvements de sang seront réalisés (avant l’occlusion, à H4, H24 et J7).
Impact sur les animaux
Au cours de la procédure chirurgicale, les nuisances ou effets indésirables (qui seront surveillés) sont l’hypotension et le refroidissement corporel pouvant causer un stress modéré. Après la chirurgie thoracique (thoracotomie), d’éventuelles douleurs post-opératoires modérées pendant plusieurs jours au niveau des nerfs intercostaux pourront avoir une incidence sur le bien être des animaux. Ces douleurs pourront être réduites par injection d’analgésiques.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux sous anesthésie profonde pour récupérer les tissus cardiaques pour les analyses de protéines et ARN, pour l'analyse de la taille d'infarctus et l'isolement des cardiomyocytes.
Remplacement
Le développement des pathologies est un processus complexe et intégré qui est mieux reproduit dans un modèle animal. Par exemple, les lesions d'ischémie-reperfusion myocardique mettent en jeu, entre autres, des systèmes hormonaux, neuro-humoraux, des adaptations des systèmes circulatoire, rénal, central si bien que seul un système intégré in vivo permet de reproduire toutes les composantes. Ainsi, le remplacement d'animaux ne sera pas possible dans cette étude car actuellement, il n’existe pas de méthode alternative ni de modélisation possible pour l’ischémie-reperfusion myocardique. De plus, les études in vivo répondent mieux au potentiel thérapeutique de la cible même si elles ne présagent pas des résultats qui vont être obtenus dans d’autres espèces ou en clinique.
Réduction
Dans le respect de la règle des 3R, nous réduirons le nombre d'animaux à maximum 12 souris par groupe. Ce nombre est basé sur notre expérience. C’est le nombre minimal qui permet d’assurer la robustesse des résultats pour évaluer au mieux le rôle de protéines dans l'ischémie-reperfusion myocardique , sans qu’il soit excessif en terme d’animaux à inclure. Une analyse statistique des résultats sera ainsi réalisée. Seules les expériences indispensables seront réalisées et il n’y aura pas de répétition inutile d’expérience. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous réaliserons toute une série de collecte de données sur une même souris: prélèvement sanguin, histologie, expression génique et protéique.
Raffinement
Nous raffinerons cette étude par un hébergement des animaux selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. Les animaux sont élevés avec une attention particulière (passage du personnel minimum 2 fois/jour et observation de l'état général). Les manipulations sont réduites au minimum afin de limiter le stress des animaux. La souffrance de l’animal sera réduite au maximum ou supprimée par l’utilisation d’anesthésique avant la chirurgie et d’analgésique à différents temps (avant la chirurgie, après la chirurgie et si l'animal montre des signes de douleurs). Notre objectif est d’offrir aux animaux la meilleure qualité de vie possible et de garantir que toute nuisance ou souffrance due aux procédures scientifiques soit détectée et réduite le plus rapidement possible. Une période d’acclimatation d’au moins 7 jours sera respectée après réception des animaux. Pour éviter tout stress, les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur : - dans des cages aux normes suivant leur âge et leur poids - en groupe social au sein de l’animalerie - en leur mettant à disposition un enrichissement du milieu (cabannes, tunnels, papier, coton pour la confection de nids). Une grille d’évaluation des points limite sera mise en place pour évaluer l’état de l’animal après la chirurgie et mettre en évidence un éventuel point limite. La décision de garder en vie les souris sera prise par le responsable du projet en concertation avec la structure de bien-être animal (SBEA). La mise à mort sera réalisée par un protocole adapté en vue des prélèvements post-mortem.
Choix des espèces
Le modèle d’infarctus du myocarde chez la souris est parfaitement maitrisé au laboratoire et mime le développement de la pathologie humaine. Il existe dans cette espèce une grande disponibilité d’outils d’étude biologiques nécessaires à l'évaluation de la cardioprotection. La souris est ainsi un excellent modèle pour la maladie humaine, car l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme. De plus, une partie du projet utilisera des souris génétiquement modifiées (CLU). C'est le seul modèle animal disponible qui présente une déficience en CLU. Les souris génétiquement modifiées sont des outils précieux dans la plupart des domaines de recherche médicale et permettent d'étudier des mécanismes cellulaires et moléculaires. Nous utiliserons des souris de 3-4 mois (jeunes adultes) pour réaliser les interventions chirurgicales de manière optimale chez des animaux matures et pour éviter la sensibilité accrue à l'ischémie-reperfusion liée au vieillissement.
MOTORHEAD
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après la pose d'un implant sous anesthésie, elles subissent une restriction d'eau à un millilitre par jour et une contention tête fixée trente minutes par jour pendant environ trente jours, avant d'être tuées pour un contrôle du cerveau. Le projet étudie les bases cérébrales du choix entre exploration et exploitation, le porteur mettant surtout en avant la visibilité internationale attendue. Il affirme que ces mécanismes ne s'étudient que chez l'animal vigile en situation de choix, sans modèle in vitro possible.
Objectifs
La prise de décision est un processus crucial qui régit chacun de nos comportements les plus évolués. Tandis que nous apprenons de notre environnement et prenons des décisions sur la base de ces connaissances, nous conservons également la capacité d’adapter notre comportement face aux modifications soudaines de l’environnement. Cette adaptation serait favorisée par l’équilibre entre les comportements d’exploitation (c'est-à-dire l'utilisation des connaissances déjà disponibles pour obtenir un gain connu) et ceux d’exploration (c'est-à-dire la recherche d’options plus favorables). Cette hypothèse résulte des études cognitives menées chez l'homme, les primates non humains et les rongeurs. L’objectif général de ce projet est d’étudier les mécanismes cérébraux responsables de la transition entre comportements d’exploitation et d’exploration chez la souris. De nombreuses structures corticales et sous-corticales pourraient participer à ce phénomène. En particulier, des recherches récentes proposent que le cortex moteur secondaire (M2) des rongeurs constitue un nœud critique permettant le contrôle flexible des actions volontaires. Ce constat est étayé par la spécificité de cette structure ayant un rôle démontré dans les comportements flexibles. Ce projet vise donc à éclairer le rôle du M2 pour décider quand explorer ou quand exploiter l'environnement. Pour cela, nous utiliserons l’imagerie cérébrale des structures d’intérêts lorsque la souris est soumise à un test comportemental permettant de quantifier les comportements d’exploitation et d’exploration. Enfin, nous testerons le rôle causal des connexions neuronales identifiées pendant l'exploration et l'exploitation en effectuant des manipulations sélectives des différentes voies sous-corticales.
Bénéfices attendus
Cette étude est avant tout un projet de science fondamentale visant à comprendre les principes neuronaux permettant l’adaptation de la prise de décision dans des environnements changeants. Ce champ de recherche est en effet devenu un domaine extrêmement compétitif au niveau international, et pourtant n'est que faiblement représenté en France. Ce projet améliorera significativement la visibilité internationale de la recherche académique française et placera le porteur en position de force pour réévaluer les rôles complexes des régions motrices et leur connexions aux régions corticales. Au-delà de cet aspect fondamental, ce projet possède une forte composante translationnelle. En effet, l'accent mis sur l'exploitation-exploration des actions volontaires est central dans les neurosciences cognitives, en particulier pour la recherche sur les primates humains et non humains. En outre, l'incapacité à résoudre efficacement le compromis exploitation-exploration est une caractéristique frappante de plusieurs troubles mentaux.
Procédures
1) Anesthésie chimique sans chirurgie pour la procédure 1 d'implantation. Elle sera realisée une seule fois par souris, pour une durée maximale d'une heure. 2) Restriction hydrique (1 ml/ jour) et contention « tête-restreinte » (30 min/jour) pendant environ 30 jours consécutifs.
Impact sur les animaux
1) Anesthésie chimique sans chirurgie pour la procédure 1. 2) Restriction hydrique (1 ml/ jour) et contention « tête-restreinte » (30 min/jour) pendant environ 30 jours consécutifs. Ces nuisances sont indispensables pour l’imagerie biphotonique et motiver les souris à la tâche expérimentale.
Devenir
A l’issue des procédures les animaux sont mis à mort. Il est nécessaire de réaliser des contrôles histologiques ou des expériences d’immunohistochimie sur les cerveaux fixés afin de valider les coordonnées des sites d’injection des virus et des sites d'enregistrement.
Remplacement
L’étude des mécanismes de la prise de décision est un enjeu sociétal et économique majeur des neurosciences modernes, comme le relèvent de nombreuses situations humaines inadaptées (prise de risque, addiction au jeu, compulsivité, troubles psychiatriques). Par définition, ces mécanismes ne peuvent être étudiés que chez des animaux vigiles confrontés à une situation de choix. Dès lors, aucun des modèles in vitro ne peut être utilisé ici. Par ailleurs, les mêmes mécanismes comportementaux (transition exploitation / exploration) sont en jeu chez les primates humains, non-humains, et les rongeurs, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez le rongeur à l’espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques en jeu dans la prise de décision et permettra de jeter les bases d'études plus appliquées.
Réduction
La nature innovante des méthodes utilisées (imagerie biphotonique chronique, et optogénétique chronique), ainsi que la qualité de la mise en œuvre des procédures (basée sur une expertise reconnue de l’expérimentateur) permettront de réduire significativement le nombre des animaux. En effet, certains tâches dans les procédures mettent en jeu des techniques non invasives et non douloureuses qui seront réalisées de façon quotidienne pendant le comportement chez le même animal. Ces techniques modernes permettent donc de façon intrinsèque de réduire dramatiquement le nombre d'animaux utilisés, avec une qualité de mise en pratique assurant la reproductibilité des expérimentations entre les laboratoires. Par ailleurs, afin de réduire autant que possible les erreurs statistiques qui pourraient être le résultat d'un nombre insuffisant d'animaux, tout en limitant le nombre d’expériences et donc d’animaux, la taille de nos groupes expérimentaux est définie par l’utilisation de tests statistiques pairés sur la base des données préliminaires déjà obtenues (moyenne et ecart-type) afin de satisfaire les conditions statistiques de puissance et de significativité (puissance (beta) de 0.8 et un seuil de significativité (alpha) de 0.05).
Raffinement
Les compétences techniques et expérimentales du porteur du projet sont reconnues internationalement, comme prouvé par la qualité élevée des financements obtenus faisant suite à une évaluation exhaustive du projet par de multiples comités d’expert scientifique du domaine scientifique, et garantissent la qualité des procédures expérimentales et de leur raffinement (habituation des animaux, optimisation du comportement et des techniques d’enregistrement, points limites, …). Le projet ne comprend pas de chirurgies. Cependant, la procédure d’implantation, bien que non invasive et non douloureuse se fera malgré tout sous anesthésie générale avec une couverture antalgique qui agira dès le réveil de l’animal et qui sera maintenue si l’animal montre des signes de souffrance. La procédure d’anesthésie a été raffinée et permet d'être rapidement inversée par l’injection d’une solution de réveil, permettant ainsi d’éviter au maximum les problèmes et inconforts liés à une anesthésie pharmacologique. Les animaux ne sont jamais isolés mais maintenus en groupe sociaux (5 par cage avec nourriture adaptée et enrichissement : nid, maison et tunnel) et manipulés/habitués quotidiennement par le même expérimentateur. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée (2 fois par jour) après la restriction hydrique. Des points limites spécifiques suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux : 1) Déshydratation (persistance au test de pli) et/ou perte de poids supérieur à 25 % du poids mesuré au jour 1 avant restriction ; 2) Infection de l’implant (plaie purulente, rougeur, tuméfaction, abcès) ; 3) Qualité de l'implant (perte ou dégradation) ; 4) Neurologie (tremblements, ataxie marquée, tête penchée, crises convulsives). Ces points sont vérifiés deux fois par jour selon un tableau de suivi simplifié (absence/présence) permettant la mise en place de mesures rapides et ciblées (et d’arrêt si nécessaire) si ces points sont observés, respectivement : 1) arrêt immédiat de la restriction hydrique et sortie du protocole le temps nécessaire pour une prise de poids ; 2) analgésie générale (Buprenorphine) pendant 3 jours ; 3 et 4) euthanasie immédiate.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des Vertébrés. L’organisation du système central de cette espèce est assez proche de celle de l’homme, les propriétés du néocortex de la souris ont de nombreuses similitudes avec le néocortex des autres mammifères, y compris les humains. Par ailleurs, les mêmes mécanismes comportementaux qui nous intéressent ici (transition exploitation / exploration) sont en jeu chez les primates humains, non-humains, et les rongeurs, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez le rongeur à l’espèce humaine sans avoir recours à des primates non-humains. Les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris seront donc largement transférables à l'homme, et permettront de mieux comprendre les mécanismes synaptiques en jeu dans la prise de décision en général tout en jetant les bases d'études plus appliquées chez les humains. Le projet sera réalisé sur des animaux de 6 semaines ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stables le temps de nos protocoles, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection.
Etude des mécanismes évolutifs des grenouilles aquatiques de la famille des Pipidae
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
Xénopes : 40
40 xénopes et 314 autres amphibiens vont être utilisés, gardés en élevage et réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent deux injections sous-cutanées d'hormones pour induire la reproduction, geste pouvant provoquer une blessure ou une réaction cutanée. Le projet étudie les mécanismes évolutifs de grenouilles aquatiques, les femelles étant induites à pondre de nombreuses fois sur une vie longue. Le porteur affirme que la fécondation in vitro est la seule méthode pour obtenir des embryons en nombre, tout en indiquant explorer des lignées cellulaires pour éviter des mises à mort.
Objectifs
L’évolution des espèces met en jeu des mécanismes qui agissent à des niveaux biologiques différents : génétiques, cellulaires, comportementaux etc Notre projet cherche à mieux comprendre certains de ces mécanismes qui sont à l’œuvre chez les amphibiens, un groupe d’animaux vertébré comme l’homme. Un aspect central des recherches pour ce projet porte sur la génétique des amphibiens, la génétique de leur développement embryonnaire et l'écologie moléculaire en particulier au travers de l'étude des microbiomes d'amphibiens. Ces sujets sont développés depuis plusieurs années dans le laboratoire et font l’objet de collaborations scientifiques internationales.
Bénéfices attendus
Les travaux réalisés devraient permettre de mieux comprendre les mécanismes génétiques de l'évolution des amphibiens anoures, et de comprendre l'impact de l'environnement sur leurs caractéristiques génétiques. Cette étude devrait permettre de mieux comprendre les mécanismes évolutifs liés aux changements du nombre de chromosomes chez ces amphibiens.
Procédures
L'intervention consistera en deux injections sous-cutanées dans la région dorsale et postérieure du tronc avec contention de l'animal vigile. La durée de chaque procédure d'injection est d'environ une minute. Les deux injections doivent être réalisées à 72h d'intervalle.
Impact sur les animaux
La procédure d'injection sur l'animal vigile en contention peut entraîner une blessure de l'animal avec l'aiguille, avec possibilité de saignement. Une réaction cutanée ou systémique à l'injection de la solution d'hormone peut également appararaître.
Devenir
Les animaux adultes seront maintenus en élevage.
Remplacement
Pour notre projet, l’utilisation d’animaux vivants revêt un caractère de stricte nécessité car la reproduction induite par fécondation in vitro constitue la seule méthode pour élever les espèces étudiées, obtenir des embryons et des têtards à développement synchrone, de stade précis, et en nombre suffisant pour satisfaire aux analyses statistiques, et étudier les éventuelles barrières de reproduction entre ces espèces. Des méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux ne sont donc pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En revanche nous explorerons la possibilité d'obtenir des lignées cellulaires des différentes espèces étudiées afin d'avoir une source de matériel biologique ne nécessitant pas l'euthanasie d'animaux.
Réduction
La réalisation de notre projet implique notamment l'injection d'hormone chez des femelles xénopes adultes pour la production d’ovocytes afin d’obtenir des embryons. Pour réduire à son minimum le nombre d’animaux utilisés, nous prenons en compte que i) Les femelles, ayant une période reproductive longue (15 ans), peuvent être induites à pondre de nombreuses fois; ii) les testicules des mâles euthanasiés disséqués pour la fécondation in vitro sont utilisés pour plusieurs expériences et par plusieurs expérimentateurs minimisant ainsi le nombre de mâles mis à mort; iii) nous réalisons des fécondations naturelles évitant le sacrifice du mâle à chaque fois que c'est possible.
Raffinement
Dans le but de réduire la douleur, souffrance ou angoisse, nous utilisons des conditions d’élevage conformes à la directive 2010/63/UE et à la STE123. Nous appliquons des points limites stricts et spécifiques aux amphibiens. L’utilisation des femelles et des mâles se fera par roulement tous les quatre mois permettant le renforcement positif lors des manipulations. Nos conditions d’élevage sont régulièrement améliorées en fonction de nos connaissances sur l’écologie et la biologie de nos espèces mais aussi en fonction des connaissances sur le bien-être, le comportement et l’éthologie des espèces aquatiques qui se diffusent dans la communauté scientifique.
Choix des espèces
Le xénope est un organisme modèle important pour l’étude du développement des vertébrés. Il occupe une place phylogénétique clé (vertébré tétrapode non-mammifère). Nous disposons des génomes pour les deux espèces (X.tropicalis et X.laevis) et l’analyse montre d’importantes similitudes avec le génome humain : 79% des gènes identifiés dans des maladies humaines ont leurs orthologues chez le xénope. Par ailleurs, ces espèces sont faciles à élever et à maintenir en laboratoire et des pontes peuvent être obtenues à demande. X. tropicalis est diploïde avec un temps de génération plus court que X. laevis. Tout comme le poisson zèbre, le xénope fait partie d’une sélection de modèles pour lesquels les approches de génomique fonctionnelle sont couramment utilisées. Nous utilisons des animaux aux stades adultes car c'est le seul stade de développement permettant leur reproduction sexuée. La reproduction induite par fécondation in vitro constitue la seule méthode pour élever les espèces étudiées, obtenir des embryons et des têtards à développement synchrone, de stade précis, et en nombre suffisant pour satisfaire aux analyses statistiques, et étudier les éventuelles barrières de reproduction entre ces espèces.
Pharmacocinétique et étude de toxicité d’une prodrogue cytotoxique de Vinblastine administrée par voie sous-cutanée
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Ayant reçu sous anesthésie gazeuse une prodrogue de vinblastine sous la peau du dos, ou de la vinblastine dans la veine de la queue, des souris BALB/c sont ensuite tuées pour l'analyse de leurs organes ou de leur sang, certaines après une ponction cardiaque sous dose létale de pentobarbital. 108 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Il s'agit de fixer la dose maximale tolérée de la prodrogue, en testant jusqu'à quatre doses croissantes sur des groupes de quatre souris, soit la dose "la plus élevée qui produira l'effet souhaité sans entrainer d'effets indésirables inacceptables". Parmi les nuisances attendues, le porteur ne cite que le stress de l'anesthésie et des pesées et une gêne ou une inflammation au point d'injection, sans rien dire des effets des doses les plus fortes.
Objectifs
L’administration de médicaments anticancéreux par voie sous-cutanée est actuellement limitée par leur faible solubilité, leur viscosité et leur toxicité au niveau du site d’injection (irritations voire nécroses cutanées). Nous proposons dans ce projet une nouvelle approche permettant d’administrer efficacement par voie sous-cutanée des chimiothérapies anticancéreuses déjà présentes sur le marché. Nous avons en effet développé une technologie innovante qui consiste à coupler un agent de chimiothérapie existant, la Vinblastine, à une succession de molécules pour le rendre soluble et injectable par voie sous-cutané. L’objectif de cette étude est d’étudier la toxicité et la distribution dans l'organisme de cette prodrogue de Vinblastine administrée par voie sous-cutanée (SC), comparativement à la Vinblastine seule, administrée en intraveineuse (IV). L’étude de toxicité a pour objectif de déterminer la dose maximale tolérée (DMT, dose la plus élevée qui produira l’effet souhaité sans entrainer d’effets indésirables inacceptables) par voie SC de la prodrogue de Vinblastine, et de vérifier qu’elle n’induit pas de toxicité au niveau du site d’injection. L’étude de pharmacocinétique permettra de vérifier qu’il est possible d’avoir une exposition au principe actif comparable à la voie intraveineuse, et donc une efficacité thérapeutique similaire.
Bénéfices attendus
L’objectif de cette étude est de démontrer l’innocuité de la prodrogue polymère de Vinblastine administrée par voie sous-cutanée (SC) et de comparer son profil pharmacocinétique à celui de la Vinblastine libre administrée en intraveineuse (IV). De tels résultats permettraient d’envisager la délivrance des principes actifs anticancéreux par voie sous-cutanée, qui seraient à la fois efficace, confortable pour le patient et bien moins couteuse dans son utilisation que les chimiothérapies actuelles.
Procédures
Chaque souris recevra une seule injection de la prodrogue polymère par voie sous-cutanée sous anesthésie gazeuse (sévofluorane 3%) dans la région dorsale préalablement rasée ou de la Vinblastine libre en intraveineuse sous anesthésie gazeuse (sévofluorane 3%). Cette intervention durera environ 10 minutes, anesthésie comprise. Certaines souris subiront également un prélèvement sanguin terminal effectué par ponction cardiaque après injection d’une dose léthale d'anesthésique de pentobarbital, un anesthésique puissant, et la mise à mort de l'animak sera confirmée par élongation cervicale. Cette intervention durera environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances suivantes sont attendues : - L'anesthésie par cage à induction qui pourrait entrainer un stress de l'animal avant endormissement. - Les injections de la vinblastine en intraveineuse dans la veine de la queue et de la prodrogue en sous-cutané, qui pourraient causer une gène ou une inflammation au niveau du site d'injection - Les pesées qui peuvent entrainer un stress chez l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort, afin de prélever les organes et la zone d'injection pour des études histologiques afin de vérifier l’absence de toxicité systémique et de toxicité locale aigue (procédire 1) ou pour effectuer des prélèvements sanguins terminaux (procédure 2).
Remplacement
Les médicaments, durant leur transport dans l’organisme, vont interagir avec les éléments du système immunitaire et être soumis à une métabolisation (hépatique, rénale, …) qui peut provoquer l’apparition de métabolites pouvant être plus ou moins actifs voire toxiques. Cette chaine de phénomènes complexes ne peut pas être modélisée ou mimée in vitro. Il est donc nécessaire de mener ces études sur des animaux vivants pour reproduire tous ces processus et évaluer la toxicité et la fraction de substance active qui arrive dans le sang.
Réduction
Les études préliminaires in vitro ont permis le criblage de différentes formulations dont une seule sera testée in vivo, permettant ainsi une réduction du nombre d’animaux nécessaires dans cette étude. Une planification statistique minutieuse permet aussi de réduire le nombre d’animaux tout en préservant la validité statistique de l’étude. La DMT de la prodrogue sera déterminée en testant des doses croissantes de prodrogue à partir de la dose équivalente à la DMT par voie IV de la molécule libre (connu dans la littérature) car la prodrogue polymère est censée avoir une DMT supérieure à celle de la molécule libre. Quatre doses seront testées au maximum, nous nous arrêterons avant si la DMT de la prodrogue est atteinte. Le dimensionnement des groupes a été déterminé par un test de puissance (erreur de 5% et puissance de 80%) qui permet de mettre en évidence une perte de poids de 10% avec une variabilité de 10% avec 4 animaux par groupe. La DMT du principe actif libre, bien décrite dans la littérature, ne sera testée qu’à deux doses maximum pour tenir compte de la variabilité inter-souche. Pour la pharmacocinétique de libération du principe actif, une seule dose sera testée pour déterminer quelle est la prodrogue qui permet une libération optimale du principe actif dans le sang. La prodrogue polymère et la molécule libre seront administrées à une dose équivalente permettant leur détection pendant 48 à 72 heures, afin de pouvoir comparer la cinétique de la molécule libre et de la prodrogue. Nous cherchons à mettre en évidence une augmentation du temps de présence de la molécule dans l'organisme. Le nombre d’animaux nécessaire (erreur 5%, puissance 90%) a été évalué à 4 animaux par groupe. L’analyse statistique des données sera effectuée avec un test non-paramétrique.
Raffinement
Dans notre laboratoire, les animaux en provenance des centres d'élevage sont pris en charge dès leur arrivée (environ 8 jours avant le début de l'expérimentation), jusqu'à l'euthanasie. Le bien-être animal sera respecté : -Conditions d’hébergement adaptées : nourriture et eau à volonté, température constante de 20°C et mise en place d’un cycle jour/nuit inversé par période de 12 heures. -Temps d’acclimatation de 8 jours avant toute procédure -Souris hébergées en groupes (6 par cage) -Enrichissement des cages : dômes (Plast Hut) et cotons prédécoupés spécifiques (Cell Nest) -Définition des points limites et évaluation quotidienne des signes de douleurs (difficultés respiratoires, prostration, atonie, défaut d’alimentation, isolement, ou tout autre signe physique tel que la position des oreilles ou des vibrisses). La définition exacte des points limites se trouve dans une grille des scores de la douleur, qui évalue le bien-être animal sur chacun de ces points et décrit la conduite à tenir en fonction de l’état de l’animal (par exemple augmentation de la fréquence du suivi, utilisation d’analgésique…). De plus, toutes les procédures se feront sous anesthésie pour éviter toute forme de douleur.
Choix des espèces
Pour la réalisation de nos études, nous utiliserons des souris BALB/c. Les souris BALB/c sont un bon modèle car elles sont blanches et permettent de suivre plus facilement les apparitions de nécroses ou d’irritations au niveau cutané. Les premières études ayant été réalisées sur cette souche, cela nous permettra aussi de comparer les résultats. Nous utiliserons des souris jeunes adultes de 7-10 semaines qui ont un système immunitaire mature et des fonctions physiologiques bien établies.